酪氨酸连接方法
【专利摘要】本发明提供了制备包含多肽(或蛋白质)的式(I-A)或(I)的缀合物的方法，所述多肽(或蛋白质)含n个酪氨酸单元，其中n是大于或等于1的整数，其分散于具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(A1)和酸末端(A2)(氨基或氨基酸末端可以是至少一个酪氨酸单元)并具有等于或大于10,000道尔顿的重均分子量(10kDa)的氨基酸链中，其中所述缀合物包含m个如式(I-A)或(I)中描述的酪氨酸缀合物(被修饰的酪氨酸残基)，其中m至少为1且小于或等于n，其中X、Lg、L和R如本文所定义。
【专利说明】酪氨酸连接方法
发明领域
[0001 ] 本发明提供了酪氨酸连接方法和用于形成含酪氨酸的多肽缀合物的交联剂。
[0002]背景
[0003]缀合已经广泛用于优化生物学活性蛋白质的性质，诸如蛋白质/肽疗法、抗体-药物缀合物、疫苗、组织选择性靶向载体、分子诊断试剂和蛋白质核酸缀合物。传统的缀合方法利用基于赖氨酸的共价连接，由于在表面上的赖氨酸丰富，该方法难以达到均一性。其它的典型方法基于半胱氨酸缀合。然而，半胱氨酸是罕有的氨基酸，且通常以二硫化物形式存在，并且游离的半胱氨酸能潜在地导致二硫键混杂。
[0004]酪氨酸是更好的供选择的缀合位点。它们比赖氨酸更罕有，且它们不全部曝露于表面。近来已经报道了少量用于酪氨酸连接的方法，诸如烯丙型烷基化、重氮偶联和曼尼希-型偶联。参见，例如，I Am Chem Soc, 128,1080-1081 (2006):T Am Chem Soc, 127,3718-3723(2005):和 Bioconiugate Chem,19,153-157 (2008))。
[0005]Ban, H.等最沂在 T Am Chem Soc, 132,1523-1525 (2010)中描述了酪氨酸连接方法。然而，使用该公开的方案(磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)观测到的主要产物最可能是在赖氨酸处形成脲。该公开内容中的LC-MS与所预计的酪氨酸连接产物不一致。
[0006]概述
[0007] 申请人:已经发现在酪氨酸连接中使用Tris缓冲液代替PBS在短的时间内提供了所期望的酪氨酸连接产物。
[0008]在本发明的一个实施方案中，提供了用于制备包含多肽(或蛋白质)的式(1-A)的缀合物的方法，所述多肽(或蛋白质)含η个酪氨酸单元，其中η是大于或等于I的整数，其分散在具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(Α1)和酸末端(Α2)(氨基或酸末端可以为所述至少一个酪氨酸单元)且具有等于或大于10，000道尔顿(IOkDa)的重均分子量的氨基酸链
【权利要求】
1.制备包含多肽的式(1-A)的缀合物的方法，所述多肽含η个酪氨酸单元，其中η是大于或等于I的整数，其分散于具有多肽的氨基末端(Α1)和酸末端(Α2)、并具有等于或大于10，000道尔顿的重均分子量的氨基酸链
2.制备包含多肽的式(I)的缀合物的方法，所述多肽含η个酪氨酸单元，其中η是大于或等于I的整数，其分散于具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(Α1)和酸末端(Α2)、且具有等于或大于10，000道尔顿的重均分子量的氨基酸链
3.制备包含多肽的式(I)的缀合物的方法，所述多肽含η个酪氨酸单元，其中η是大于或等于I的整数，其分散于具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(Α1)和酸末端(Α2)、且具有等于或大于10，000道尔顿的重均分子量的氨基酸链
4.权利要求1、2或3的方法，其中所述Tris缓冲液是含三(羟基甲基)-氨基甲烷、硼酸和乙二胺四乙酸的TBE缓冲溶液。
5.权利要求1、2或3的方法，其中所述Tris缓冲液是含三(羟基甲基)氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸的TAE缓冲溶液。
6.权利要求1、2或3的方法，其中所述Tris缓冲液包含亲核性胺。
7.权利要求6的方法，其中所述亲核性胺是甲胺或二乙胺。
8.前述权利要求中任意一项的方法，其中所述多肽是抗体。
9.权利要求1、2、3、4、5、6或7的方法，其中所述多肽是抗原肽。
10.权利要求1、2、3、4、5、6或7的方法，其中所述多肽是载体蛋白。
11.权利要求10的方法，其中所述载体蛋白是白喉或破伤风毒素、或其类毒素或突变体。
12.权利要求11的方法，其中所述载体蛋白是CRM197白喉毒素突变体。
13.权利要求2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任意一项的方法，其中R是多糖。
14.权利要求13的方法，其中所述多糖是含5-7个葡萄糖单糖单元的葡聚糖。
15.权利要求14的方法，其中所述葡聚糖是具有6个葡萄糖单糖单元的凝胶多糖。
16.包含多肽的式(1-A)的缀合物，所述多肽含η个酪氨酸单元，其中η是大于或等于I的整数，其分散于具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(Α1)和酸末端(Α2)、且具有等于或大于?ο, 000道尔顿的重均分子量的氨基酸链(-^ww中；
17.权利要求16的缀合物，其中所述多肽是抗体。
18.权利要求16的缀合物，其中所述多肽是抗原肽。
19.权利要求16的缀合物，其中所述多肽是载体蛋白。
20.权利要求19的缀合物，其中所述载体蛋白是白喉或破伤风毒素或其类毒素或突变体。
21.权利要求20的缀合物，其中所述载体蛋白是CRM197白喉毒素突变体。
22.包含多肽的式(I)的缀合物，所述多肽含η个酪氨酸单元，其中η是大于或等于I的整数，其分散于具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(Ai)和酸末端(Α2)、且具有等于或大于10,000道尔顿的重均分子量的氨基酸链
23.权利要求22的缀合物，其中所述多肽是抗体。
24.权利要求22的缀合物，其中所述多肽是抗原肽。
25.权利要求22的缀合物，其中所述多肽是载体蛋白。
26.权利要求25的缀合物，其中所述载体蛋白是白喉或破伤风毒素或其类毒素或突变体。
27.权利要求26的缀合物，其中所述载体蛋白是CRM197白喉毒素突变体。
28.权利要求22、23、24、25、26或27中的任意一项的缀合物，其中R是多糖。
29.权利要求28的缀合物，其中所述多糖是含5至7个葡萄糖单糖单元的葡聚糖。
30.权利要求29的缀合物，其中所述葡聚糖是具有6个葡萄糖单糖单元的凝胶多糖。
31.权利要求22的缀合物，其中所述缀合物具有以下结构:
32.权利要求22的缀合物，其中所述缀合物具有以下结构:
33.包含多肽的式(I)的缀合物，所述多肽含n个酪氨酸单元，其中n是大于或等于I的整数，其分散于具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(Α1)和酸末端(Α2)、且具有等于或大于10，000道尔顿的重均分子量的氨基酸链
34.权利要求33的缀合物，其中所述多肽是抗体。
35.权利要求33的缀合物，其中所述多肽是抗原肽。
36.权利要求33的缀合物，其中所述多肽是载体蛋白。
37.权利要求36的缀合物，其中所述载体蛋白是白喉或破伤风毒素或其类毒素或突变体。
38.权利要求37的缀合物，其中所述载体蛋白是CRM197白喉毒素突变体。
39.权利要求33、34、35、36、37或38中任意一项的缀合物，其中R是多糖。
40.权利要求39的缀合物，其中所述多糖是含5至7个葡萄糖单糖单元的葡聚糖。
41.权利要求40的缀合物，其中所述葡聚糖是具有6个葡萄糖单糖单元的凝胶多糖。
42.权利要求33的缀合物，其中所述缀合物具有以下结构:
43.权利要求33的缀合物，其中所述缀合物具有以下结构:
44.式(Ib)的缀合物
45.权利要求44的缀合物，其中R是多糖。
46.权利要求45的缀合物，其中所述多糖是含5至7个葡萄糖单糖单元的葡聚糖。
47.权利要求46的缀合物，其中所述葡聚糖是具有6个葡萄糖单糖单元的凝胶多糖。
48.包含多肽的式(1-A)的缀合物，所述多肽包含η个酪氨酸单元，其中η是大于或等于I的整数，其分散于具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(A1)和酸末端(A2)、且具有等于或大于10，000道尔顿的重均分子量的氨基酸链
49.权利要求48的缀合物，其中所述多肽是抗体。
50.权利要求48的缀合物，其中所述多肽是抗原肽。
51.权利要求48的缀合物，其中所述多肽是载体蛋白。
52.权利要求51的缀合物，其中所述载体蛋白是白喉或破伤风毒素或其类毒素或突变体。
53.权利要求52的缀合物，其中所述载体蛋白是CRM197白喉毒素突变体。
54.包含抗体或抗体片段的式(Xa)的缀合物，所述抗体或抗体片段包含至少一个下式的缀合的酪氨酸残基
55.包含多肽的式(I)的缀合物，所述多肽含n个酪氨酸单元，其中η是大于或等于I的整数，其分散于具有所述蛋白质或多肽的氨基末端(Ai)和酸末端(Α2)、且具有等于或大于10, 000道尔顿的重均分子量的氨基酸链
56.权利要求55的缀合物，其中所述多肽是抗体。
57.权利要求55的缀合物，其中所述多肽是抗原肽。
58.权利要求55的缀合物，其中所述多肽是载体蛋白。
59.权利要求58的缀合物，其中所述载体蛋白是白喉或破伤风毒素或其类毒素或突变体。
60.权利要求59的缀合物，其中所述载体蛋白是CRM197白喉毒素突变体。
61.权利要求55、56、57、58、59或60中任意一项的缀合物，其中R是多糖。
62.权利要求61的缀合物，其中所述多糖是含5至7个葡萄糖单糖单元的葡聚糖。
63.权利要求62的缀合物，其中所述葡聚糖是具有6个葡萄糖单糖单元的凝胶多糖。
64.权利要求55的缀合物，其中所述缀合物具有以下结构:
65.权利要求55的缀合物，其中所述缀合物具有以下结构:
66.包含抗体或抗体片段的式(Xb)的缀合物，所述抗体或抗体片段包含至少一个下式的缀合的酪氨酸残基
67.根据权利要求22至43或权利要求55至66中任意一项的缀合物，其用于药物中。
68.药物组合物，其包含根据权利要求22至43或权利要求55至66中任意一项的缀合物以及可药用载体。
69.在哺乳动物中提高免疫应答的方法，其包括将根据权利要求22至43或权利要求55至66中任意一项的缀合物或根据权利要求68的药物组合物施用于哺乳动物。
【文档编号】A61K39/00GK103764171SQ201280033961
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年7月5日 优先权日:2011年7月8日
【发明者】R·阿达莫, M·艾伦, F·贝蒂, E·达尼埃利, 胡琦颖 申请人:诺华股份有限公司