一种用于生物发酵系统的产物收取方法

专利名称：一种用于生物发酵系统的产物收取方法
技术领域：
本发明涉及到一种用于生物发酵的产物收取方法。更为具体地，本发明为一种方法，该方法用于从生物发酵容器中取出培养液，通过层析从培养液中分离生物发酵产物并且将剩余的培养液成分回送至该生物发酵容器。
背景技术：
生物发酵是用于可再生资源的生物催化转换的重要技术。通过生物发酵的手段所产生的微生物产物包括氨基酸、乙醇和抗生素。少数化学物质的生物发酵生产以及商业化已经有所报道(W.Crueger and A.Crueger，BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology，Sinauer AssociatesSunderland，MA.，pp 124-174(1990)；B.Atkinson and F.Mavituna，Biochemical Engineering andBiotechnology Handbook，2nded.；Stockton PressNew York，pp243-364(1991))。然而，同合成方法相比较，生物催化方法经常受困于几个众所周知的限制。这些限制包括1)相对较小的产品范围；2)低产量、滴度以及产率；以及3)从水溶液中回收和纯化产物的难度。
一种生物催化方法的产率可能受到积累的产物多种方式的干扰。在生物化学水平，产物积累的反馈性抑制可由于抑制效应(可能是可恢复的)或者毒性效应(可最终杀死微生物体或者使其生物催化成分不可逆地失活)而限制产率。在细胞生理学上，积累的产物可对生长速率产生不良影响。化学和物理影响(副产物的积累；pH改变)亦可干扰该生物催化剂的产率。
由于1)由于同该生物催化剂进一步作用而降解，2)环境条件或者3)从该系统中不受控制地除去(即，通过蒸发)，生物催化方法的产物还有可能丢失。
尽管代谢工程本身可解决其中一些限制，整合入的上游代谢工程(即，产物合成)以及下游生物加工工程(即，产物的分离和方法设计)对于从工业生物发酵中实现巨大价值是至关重要的。
产物原位收取(ISPR)方法是一个技术家族，该方法中，在该生物发酵过程的至少一部分时间，处于生物发酵(生物发酵产物或者其它的特定副产物)中的某种靶分子在合成时被取出(综述见Chauhan etal.，Chem Tech 2726-30(1997)；以及Freeman et al.，Biotechnology111007-1012(1993))。由于包括基于不同的挥发性、溶解度、大小、密度、电荷或者特定元件(或者这些方法的组合)在内的多种分离原理可被用于ISPR，因此ISPR技术具有广泛的应用性。多种ISPR技术已被引入生物催化方法，这些方法基于Amberlite XAD树脂，连续沉淀，反应性溶剂萃取，继之以同步萃取和回萃取(back extraction)，以及一种抽提性中空纤维膜反应器(Lye et al.，Trends inBiotechnology 17395-402(1999))。
ISPR在生物发酵中的成功应用的一个关键在于如何以提高产率的省时且价格低廉方式将分离技术应用于大规模工业方法。一个显著地影响生物发酵回收的产率和纯化系统的生物工程因素是方法操作的模式。该领域的技术人员明了，对于一种纯粹的分批工艺，依赖连续分离的方法较为省时和廉价。
U.S.6,114,157展示了高效廉价地使用ISPR技术所面临的挑战。该专利描述了一种用于提高4-羟苯甲酸(PHB)的生物发酵总产量的ISPR方法。经遗传工程处理的大肠杆菌在该生物发酵期间产生PHB。对于该生物发酵的至少一部分，该生物发酵培养液以向上的方向通过了一个阴离子交换珠床。除尽了PHB的生物发酵培养基随后返回该生物发酵容器。该过程每十分种使全部体积的培养物通过珠循环一次，无需更换培养基。当该阴离子交换珠饱和，终止该生物发酵，并且从该树脂中以酸性乙醇或者含氯化钠的水/乙醇混合物提取PHB。
尽管U.S.6,114,157披露了生物发酵产物的ISPR分离，培养基重复循环返回该生物发酵容器，但是该方法的效率受限于其依赖于膨胀床吸收。膨胀床吸收并非一个连续的过程，该过程需要“上样和洗脱”的策略，这意味着更多的时间以通过多步骤过程进行分离产物。因此该方法对于大规模的商业应用并不省时和廉价。例如，吸收珠在进行洗脱之前需要一次水洗，并且可能还会需要在每次重新使用之前以磷酸缓冲液进行再调节。U.S.6,114,157披露了一种膨胀床吸收物，该床吸收物约等于该生物发酵容器体积的一半。在工业实践中，这将显著地抬高商业投资。进一步，树脂和洗脱剂的低效使用将显著增加大规模商业应用的成本。特别是，相对于所回收的产物量，用于洗脱产物的乙醇的体积很大，这些乙醇将在该膨胀床的再生期间逐渐地挥发。该洗脱还需要等摩尔量的三氯乙酸，这是一种昂贵的添加剂。另外，使用具有高呼吸速度的微生物进行的生物发酵不能使用膨胀床吸收来进行产物分离，这是因为膨胀期间在该膨胀床中的溶解氧含量很低。这对于微生物体的存活有严重的损害。除了使用膨胀床吸收所带来的限制以外，U.S.6,114,157没有对分离中性电荷的产物的方法过程进行描述，对于这种产物离子交换的方法通常无效。
一种在加工或者生产规模上(比较于分析或者制备规模)具有可操作性并且省时廉价的ISPR分离技术为模拟移动床(SMB)层析。这一技术为一种连续的层析过程，该过程依赖于逆流层析以完成分离(Levan，M.D.In Perry’s Chemical Engneers’Handbook，7thEdition；p.16-60；Perry，R.H.，D.W.Green，and J.O.Maloney(Eds.)；McGraw-HillNew York；(1997))。该技术被广泛认为是一种节省溶剂的高效技术(U.S.4,851,573，column 11)。SMB层析的操作原理在U.S.2,985,589中有所描述。SMB层析的应用现在已是一种用于生产规模的应用的成型技术。其它的加工层析方法包括，横向流层析和径向层析，但不限于这些。但是，根据目前的实践，加工层析方法不能选择性地分离生物发酵产物并且将其它的培养基成分重新循环入生物发酵容器。这是由于驱动层析分离所需的洗脱剂的一部分会在该生物发酵容器中积累，降低其容积。尽管在生物发酵的持续时间可被延长以增加产率，但连续的培养基置换提高了用于大规模生产的成本。当该生物发酵培养基含有昂贵的辅因子或生物催化剂生长所需的其它成分时尤为如此。
因此，需要解决的问题为缺乏生物加工工程改造方法以在不添加新鲜培养基或者积累洗脱剂于生物发酵容器之中的情况下选择性地除去在生物发酵反应期间产生的干扰性的目标分子。在理想的情况下，该生物加工工程改造方法应当1)除去导致该生物过程的毒性抑制或者反馈抑制的目标分子，2)对从ISPR的生物发酵容器取出的培养基的置换加以改善，以及3)防止洗脱剂在该生物发酵容器中的积累。这样一种工艺应会极大地增强生物加工过程的性能，提高该生物催化剂的总生产速率。其结果是获得了较高的资本生产力并且可能获得较高的反应产量。
发明概述本发明在此提供了一种用于某生物发酵系统的产物收取方法，该方法包括a)从含有目标分子的生物发酵溶液中除去(在该生物发酵的至少一部分时间)生物催化剂的至少大部分；b)从步骤a)中产生的无生物催化剂溶液之中除去一部分水；c)任选在步骤b)之前或者之后从无生物催化剂溶液中除去该目标分子之外的其它成分；加入以物质通过层析介质1)通过步骤b)或c)所产生的无生物催化剂溶液以及2)一种洗脱剂；e)从该层析介质释放的无生物催化剂溶液的第一个级分中回收该目标分子；f)任选从该无生物催化剂溶液的第二个级分以及从该层析介质所释放的无目标分子溶液中除去非水性洗脱剂；g)任选在步骤e)或f)之后将在步骤b)中从无生物催化剂溶液中除去的水加入至该无生物催化剂和无目标分子的溶液，所加入的量适于回送入生物发酵系统；以及h)将来自于步骤d)、e)、f)或g)的无生物催化剂和无目标分子的溶液回送入生物发酵系统。
当该目标分子在除水步骤的温度下所具有的蒸气压高于水时，产物由本发明的一个备择的实施方案进行收取。这一备择的实施方案防止了该目标分子在通过加工层析之前的过早蒸发。
在该方法中所使用的洗脱剂可为从生物发酵中除去的水或者混合有非水性洗脱剂的水。该非水性洗脱剂为短链的醇或者丙酮。在该方法中从无生物催化剂溶液中除去的水在优选的情况下为50-80％。本发明选择性地从生物发酵系统中收取任何目标分子。本发明的一个实施方案选择性地收取1，3-丙二醇。
另外，本发明的一个实施方案为一种系统，该系统用于根据本文描述从一种生物发酵系统中原位收取目标分子。该系统包括a)一种生物催化剂分离装置，该装置用于从含有目标分子的一部分生物发酵溶液中除去生物催化剂的至少大部分；b)一种除水装置，该装置从通过a)装置在步骤a)中所产生的无生物催化剂溶液中除去一部分水；c)任选在步骤b)之前或者之后的除去装置，该装置从通过b)的除水装置所产生的无生物催化剂溶液中除去该目标分子或水之外的其它成分；d)一种加工层析装置，除水装置b)或去除装置c)所产生的浓缩无生物催化剂溶液以及一种洗脱剂通过了该层析；e)一种目标分子回收装置，该装置用于从层析装置d)中释放的第一个级分中回收大部分目标分子；f)任选的一种非水性洗脱剂除去装置，该装置从d)的加工层析装置所释放的第二个级分中除去非水性洗脱剂；g)一种加水装置，该装置用于将通过b)所产生的水加入产生自e)或f)的无生物催化剂和无目标分子的溶液，所加入的量适于回送入生物发酵系统；以及h)一种培养基再循环装置，该装置用于将来自于d)、e)、f)或g)的无生物催化剂和无目标分子的溶液回送入生物发酵系统。该系统可被加以改进以在该目标分子在除水步骤的温度下所具有的蒸气压高于水的情况下收取产物。
附图、生物保藏物以及序列表的简述

图1为一个方法流程示意图，该图显示了元件的优选排列，这些元件用于实现目标分子回收以及无生物催化剂和无目标分子的溶液再循环进入该生物发酵容器。
图2为一个方法流程示意图，该图以一种备选的实施方案显示了本发明，该备选实施方案用于在该目标分子在除水步骤的温度下所具有的蒸气压高于水的情况下收取产物。
申请人已经遵循布达佩斯条约完成了以下生物保藏保藏者识别参考 保藏号保藏日大肠杆菌 ATCC PTA-4216 2002年4月9(Escherichia coli)RJ8n 日本文所使用的“ATCC”指的是位于10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-1109，U.S.A.的美国典型培养物保藏中心。“ATCCNo.”为ATCC的保藏物的编号。
所列出的保藏物将会在所示的国际保藏中心中保持至少三十(30)年并且将会根据披露该保藏物的专利的授权而为公众所用。一种保藏物的可用性质并不成为通过僭越政府法令所保障的专利权而实施本发明的许可。
申请人根据专利申请中的标准核苷酸和氨基酸序列表示法的规则(Annexes I and II to the Decision of the President of the EPO，published in Supplement No.2 to OJ EPO，12/1992)、37 C.F.R.1.821-1.825及附录A和B(对含有核苷酸和/或氨基酸序列的申请公开的要求)、世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)、及EPO和PCT的序列表要求(管理条例的5.2和49.5(a-bis)条，及208部分和附录C)。根据IUPAC-IYUB标准，这些序列描述对应于核苷酸序列含有单字母编码，对于氨基酸序列含有三字母编码，该标准描述于Nucleic Acids Research 133021-3030(1985)以及BiochemicalJournal 219(No.2)345-373(1984)，这些文献在此引为参考。
SEQ ID NO1为质粒pSYCO103的核苷酸序列。
发明详述申请人已经解决了所述的问题。本发明提供了一种生物加工工程溶液，该溶液允许在生物发酵期间通过产物原位收取进行目标分子的选择性加工层析收取并且将剩余的无生物催化剂培养液再循环回到该生物发酵容器中。通过使用该系统的培养液作为层析洗脱剂的至少一部分来源以及对培养基的再循环，本发明简化了整个生物加工过程，降低了对更换培养基的需求，削弱了反馈抑制或毒性作用对该生物催化剂的影响，并且/或者防止了洗脱剂在该生物发酵容器中的积累。
本发明降低了从用于工业或者商用生物发酵培养液中分离目标分子的成本，并且通过除去干扰性的目标分子而提高了该生物发酵系统的产率。本发明利用了相对简便的单位并且可以进行相对容易的维持。受益于本发明的组件体积可在实验室规模到商业规模之间变动，流速范围从低至每小时几毫升到每小时数千加仑。
本申请人的发明可用于改善任何使用生物催化剂的或者需要简化产物回收过程的生物发酵过程的产率，所述的生物催化剂产生的产物由于反馈抑制或者毒性而干扰该生物发酵，或者由于产物降解、环境条件或从该系统中的非受控消除而有所丢失。
在本申请中，除非特地申明，否则使用以下的缩写和定义“产物收取方法”指的是一种方法，通过该方法该生物发酵系统的一部分在该生物发酵的至少一部分时间被从该生物发酵容器中取出以用于选择性的产物收取。该产物或者目标分子随后从该培养液中选择性地收取。
“产物原位收取”被缩写为ISPR。本发明中，在一个分立的加工回路中外部进行ISPR。该培养基的一部分通过该加工回路进行特异地循环以用于产物收取。在替代的情况下，ISPR可直接在该生物发酵容器内进行。
“生物发酵系统”或者“生物发酵”指的是一种系统，该系统通过使用某种生物催化剂催化从底物到产物的反应。该“生物催化剂”起始或者改变从底物到产物的化学反应的速率。该生物催化剂可以是完整的微生物、分离的酶或者它们的任意组合。出于本申请的目的，“微生物”还包括来自于昆虫、动物或者植物的细胞。
“培养液”或者“培养基”指的是一种液体溶液，该溶液含有用于培养微生物的营养物。该培养液还可额外含有生物催化剂、生物催化剂所产生的目标分子、代谢中间物以及其它培养基成分，例如盐、维生素、氨基酸、辅因子以及抗生素。
“目标分子”指的是任何经生物催化产生的产物，该产物通过使用本文所描述的方法而被选择性地从该生物发酵系统中收取。该分子可以是该生物催化剂所天然产生的某种化合物，或者非天然的基因可经过遗传工程而进入微生物，从而这些基因在该生物发酵系统中功能性表达。在这一上下文中，“目标分子”还可指该生物发酵系统的任何副产物，这些副产物可能需要从该生物发酵系统中选择性地收取以消除反馈抑制和/或使生物催化活性最大化。
“无生物催化剂溶液”指的是从该生物发酵系统中收取的培养液，该培养液中至少已经除去了大部分的该生物催化剂物质。该无生物催化剂溶液可为一种渗透液(通过将该生物发酵培养液通过某种膜而产生)或者上清。在无生物催化剂溶液中的成分可包括该生物催化剂所产生的目标分子、代谢中间物以及其它培养基成分，例如盐、维生素、氨基酸、辅因子以及抗生素。
“无生物催化剂和无目标分子的溶液”指的是从该生物催化系统中收取的培养液，其中的培养液已经除去了至少大部分生物催化剂和无目标分子。任选存留于该无生物催化剂和无目标分子的溶液的成分可含有含量显著降低的目标分子，以及代谢中间物和其它培养基成分，例如盐、维生素、氨基酸、辅因子以及抗生素。
“层析介质”指的是任何被用作为层析系统的一部分的材料，该层析介质用于在输入的上样流中分离成分，该输入的上样流由一种洗脱剂以及一种无生物催化剂溶液组成。
“体积产率”指的是在给定的体积每单位时间下一个生物发酵容器中所产生的目标分子的量，其单位为克/(升小时)(缩写为g/(Lhr))。该测量值由该生物催化剂的比活性以及该生物催化剂的浓度所决定。该值通过滴度、运行时间以及该发酵容器的工作体积进行计算。
“滴度”指的是目标分子的浓度，其单位为克/升(缩写为g/L)。
尽管下文通过一种从无生物催化剂的溶液中有效分离目标分子的加工层析来对本发明进行描述，但在本发明中多种层析分离方法在加工或者生产的规模上(同分析或者制备规模相比)是可操作的。本发明的这些备选方案包括，模拟移动床(SMB)层析、横向流层析或者径向层析，但不限于这些，这些层析方法用于从该生物发酵培养液中选择性地分离该目标分子。
参照图1，在一个优选的实施方案中，生物发酵容器(1)设置有一个培养液再循环回路，该回路包括有一个横向流过滤单位(2)、一个除水单位(4)以及一个加工层析(9)。该设置允许从该生物发酵容器(1)中收取培养液并且将该培养液通过该横向流过滤单位(2)。生物催化剂和一部分培养液回送到该生物发酵容器(1)，而通过该横向流过滤单位(2)而产生的无生物催化剂溶液在该除水单位(4)中进行浓缩。经浓缩的无生物催化剂溶液(5)随后通过该加工层析(9)，使用在该除水单位(4)中所产生的水洗脱剂(6)。这一层析分离将大部分的目标分子(7)同剩余的浓缩无生物催化剂溶液分离。该无生物催化剂和无目标分子的溶液(8)通过回送到该生物发酵容器(1)而进行再循环。
参照图2，在上文所披露的本发明的一个备选的实施方案中，本发明经过改进而在该目标分子在除水步骤(4)所使用的温度下具有高于水的蒸气压的情况下收取产物。生物发酵容器(1)设置有一个培养液再循环回路，该回路包括有一个横向流过滤单位(2)、一个除水单位(4)以及一个加工层析(9)。该设置允许从该生物发酵容器(1)中收取培养液并且将该培养液通过该横向流过滤单位(2)。生物催化剂和一部分培养液回送到该生物发酵容器(1)，而通过该横向流过滤单位(2)而产生的无生物催化剂溶液直接进入该加工层析(9)，使用在该除水单位(4)中所产生的水洗脱剂(6)。层析分离将大部分的目标分子(7)同剩余的无生物催化剂溶液分离。该无生物催化剂和无目标分子的溶液(8)随后在该除水单位(4)进行浓缩，该浓缩在该溶液回送到该生物发酵容器(1)之前进行。
技术人员明白地意识到，在该目标分子在除水步骤所使用的温度下具有高于水的蒸气压的情况下，该方法改进对于防止该目标分子在通过该加工层析之前先期蒸发是必要的。同样地，如果反向渗透被用作为除水方法并且在该生物发酵所产生的目标分子在该除水步骤所使用的温度下具有高于水的蒸气压的情况下，这一备选的实施方案也是必需的。对该基本发明的改动是可被预期的。这些实施方案中的多种将在下文进行讨论。
该无生物催化剂溶液从该生物发酵容器(1)中进行收取并且在再循环进入该生物发酵容器之前通过本发明的加工流的速率对于将该目标分子在该生物发酵容器中的浓度维持在该生物催化剂的反馈抑制或者毒性阈值之下是关键性的。用于测定维持该循环速度的方法为技术人员所熟知。
本发明的具体方面在下文更为详尽地进行讨论。
生物发酵培养液的分离当培养液从该生物发酵容器(1)中被取出时首先进行了固体(即生物催化剂)同液体的分离。这一分离产生了一种无生物催化剂溶液，同时使得生物催化剂物质以及一部分上清回送到该生物发酵容器(1)。多种固液分离方法可供使用，这些方法包括，横向流过滤、离心和闭端过滤，但不限于这些。使用传统的过滤也是可能的，进行该传统过滤时将一种生物相容性滤器辅助单位置于该生物发酵容器(1)中。
横向流过滤单位(2)将一个输入流分离成为两个输出流。该无生物催化剂溶液(或者渗透液)是穿过膜的流出液体的一部分。第二个输出流含有被该膜所阻挡的生物催化剂的细胞物质以及上清。这第二种输出流被立即回送到该生物发酵容器(1)。
用于横向流过滤的特定的膜取决于需从该输入流中除去的颗粒的大小。典型的大小应为常用于微过滤和超滤的大小，其孔大小约为0.2微米或者更小。优选的膜包括纤维素膜、聚酰胺膜、聚砜膜以及聚偏二氯乙烯膜。
除膜的选择之外，还必须仔细考虑温度、压力以及污垢污染的综合影响以确保横向流过滤单位的成功操作。在给定的加工流pH下的化学相容性以及膜稳定性也是一些因素。这些条件可由该领域的技术人员方便地进行最优化。
无生物催化剂溶液的过滤在该产物收取方法中可以使用一种任选而附加的过滤(3)，该过滤通过第二阶段的横向流过滤单位进行，该过滤单位具有选择性更强的膜或者具有更小的孔径。这种任选的过滤从该无生物催化剂溶液中除去其它成分，例如蛋白质、蛋白片段、二价盐、一价离子或者有机物。使用第二阶段过滤单位可能延长层析吸收剂的寿命。
温度层析技术人员熟知，输入的上样物的温度可影响分离。一种热交换器可任选加入除水单位。这种热交换器应会辅助层析分离和蒸发，由此而使该过程在恒定和可预知的速率下进行。
除水蒸馏、反向渗透、蒸气重压缩或者简单的蒸发可被用于从该无生物催化剂溶液中除去水(4)。在一个优选的实施方案中，该除水步骤应从该无生物催化剂溶液中除去约50到80％的水，从而产生一种无生物催化剂溶液，同经过从该生物发酵容器(1)中进行的收取后所起始产生的溶液相比该溶液明显更为浓缩。这种浓缩的无生物催化剂溶液应含有目标分子。该溶液还应含有其它的培养基成分(例如，盐、维生素、氨基酸、辅因子、抗生素以及代谢中间物)，这些成分最终被送回该生物发酵容器(1)。作为该生物发酵的副产物而形成的痕量挥发物在其沸点接近或者低于水的情况下可从该无生物催化剂溶液中除去。
通过层析介质而进行的目标分子的公离几乎任何类型的目标分子都可通过使用本发明而从某种生物发酵溶液中进行层析分离。本发明可适应分离中性和带电的目标分子、具有小分子直至大型分泌蛋白的分子量的目标分子以及手性分子。对目标分子的高度选择性分离通过将该无生物催化剂溶液通过该加工层析(9)而进行。一种优选的目标分子为生物加工的1，3-丙二醇(US5,686,276)。
在所有的情况下，该目标分子从该无生物催化剂溶液中的分离典型地依赖同层析介质或者吸收剂之间的分子相互作用。吸收剂包括，活性碳、沸石、多聚中性树脂、壳聚糖珠、离子交换树脂以及固定化的复合材料，但不限于这些。对具体的吸收剂的选择应取决于多种因素，这些因素为该领域的技术人员所熟知。这样的因素包括，目标分子的电荷、目标分子的大小、吸收和解吸收的速率、同表面的化学和物理作用、该吸收剂的稳定性(例如，沸石同液体中的盐交换离子)以及该吸收剂的生物毒性，但不限于这些。还应考虑的包括具体的应用和目标分子、培养基稳定性、层析的方法以及该加工过程和单位的规模。
在一个优选的实施方案中，在该目标分子并非比水挥发性高的情况下，第一种级分(含有该目标分子和层析洗脱剂)被从该层析介质中释放。目标分子的分离基于目标分子对于该层析介质的亲和性而进行。该目标分子结合/形成复合体的可逆性通过该目标分子同该无生物催化剂溶液中的其它溶质相比较具有不同的迁移率而实现。这样实现了从吸收剂中的简便洗脱。洗脱条件应包括同吸收条件所使用的相同范围的温度和压力。从该层析中所回收的目标分子-洗脱剂混合物随后通过该领域所熟知的方法进行(例如，蒸馏)。
在替代的情况下，分离可能并非通过目标分子同该层析介质的亲和性而产生。例如，一些同吸收剂之间无相互作用的目标分子可首先从层析中释放，而无生物催化剂溶液中的其它成分可能由于其同吸收剂的亲和性而具有较长的持留时间。该洗脱剂以及稀释的无生物催化剂和无目标分子的溶液的混合物作为第二级分而从层析中释放。
层析洗脱以及“培养基再循环”在本发明的一个优选的实施方案中，加入该层析中的洗脱剂为通过除水单位(4)所产生的水。由于除水单位降低了该无生物催化剂溶液中的水含量的约50-80％，上加入该层析的无生物催化剂溶液在溶质上同刚从生物发酵容器(1)中收取的无生物催化剂溶液相比更为浓缩。当水洗脱剂随后被加入至这种浓缩溶液中时，所产生的总体水含量并不高于刚从生物发酵容器(1)中收取的无生物催化剂溶液。
使用从除水单位(4)中收集的水作为层析洗脱剂可以带来众多方法上的优点。这一“培养基再循环”技术直接降低了在以额外的新培养基替代从该ISPR生物发酵容器(1)中收取的无生物催化剂溶液的情况下的成本。这可以使剩余的培养液成分，例如盐、维生素、氨基酸、辅因子、抗生素和代谢中间物(减去了纯化的目标分子)被回送到该生物发酵容器(1)。
进一步，由于该无生物催化剂溶液先经浓缩而后进行再水化，该培养基再循环过程并不增加该生物发酵容器中(1)的总体积。这样消除了对洗脱剂在该生物发酵容器(1)中积累的顾虑，该积累很大程度上改变了发酵的培养液组成并且/或者降低该生物发酵容器(1)的容积。
该培养基再循环过程还可被用于从该生物发酵容器(1)中除去水。该生物发酵在补料分批的模式下运行时特别有用，该模式下进行某种溶于水中的底物的递增添加。由此而维持了该生物发酵容器(1)中的整体水平衡。
最后，从该除水单位中收集的水作为层析洗脱剂的再利用减少了该系统中的操作单位的数量。具体来说，水再利用消除了对适于进入该发酵系统的无菌水源的需求。由于水再利用避免了构建工业化水处理和纯化设施，操作的成本被进一步降低，如果洗脱剂被释放出该环境，该水处理和纯化设施是必需的。
在本发明的一个备选的实施方案中，某种非水性的洗脱剂(例如短链的醇，乙醇或者丙酮)可被用于(单独或者同水一起)层析。从该层析释放物中回收的目标分子-洗脱剂混合物随后通过本领域所熟知的方法进行提纯(例如蒸馏)。从加工层析(9)中释放的含有洗脱剂和稀释的无生物催化剂和无目标分子的混合物的第二种级分可通过多种分离装置(例如闪蒸或者填装的吸收剂基床)以除去非水性洗脱剂。该非水性洗脱剂可经再循环进入该层析介质，而经浓缩的无生物催化剂和无目标分子的溶液可任选以水进行再水化并且随后作为“培养基再循环”回送到该生物发酵容器(1)。
生物发酵本发明可适应于多种生物发酵方法，特别是适于大规模工业加工的方法。本发明可以使用分批、补料分批或者连续的方法进行实施，但在优选的情况下在补料分批的模式下进行实施。
计算和比较分批方法和连续方法在加工经济学上的差异是可行的。使用标准的一组条件，同分批方法相比较，连续的系统在产率方面效率高出70倍/在吸收剂和洗脱剂消耗上连续系统降低了8倍(表1，撷自Rossiter et al.，“Continuous Process SeparationChiral& Chromatographic with CSEPTMand ISEPTM；Advanced SeparationTechnologies.Prep 97 Meeting，Washington，D.C.；p12(1997)”)。
分批和分批补料生物发酵经典的分批生物发酵为一种封闭的系统，其中培养液组成在该生物发酵的起始被设置并且在该生物发酵期间并不进行人工的改动。因此，在该生物发酵起始时，该培养液被接种以所需的微生物或者生物体，并且该生物发酵的过程中不对该系统进行进一步的添加。但是，在典型的情况下，“分批”生物发酵是针对碳源的添加的分批，并且通常在控制诸如pH和氧含量这样的因素上采取措施。在分批系统中，该系统的代谢物和生物物质的组成稳定地提高直至该生物发酵被终止。在分批培养物中细胞温和地通过一个静止对数期进入一个高生长的对数生长期，最终进入稳定期，在该期生长速度减低或者被终止。如果不进行处理，处于稳定期的细胞将最终死亡。处于对数期的细胞通常负责最终产物或者中间物的大部分的产生，此时该产物同生产相关联。
标准分批系统的变化为补料分批系统。本发明在优选的情况下使用了一种生物发酵的标准批次加入方法。补料分批生物发酵含有一种典型的分批系统，其例外在于底物随着该生物发酵的进行而被递增加入。当分解代谢物可对细胞的代谢产生抑制的情况时，以及在需要在培养基中含有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中测定实际的底物浓度是困难的，因此在可测量因素的变化的基础上进行估计，该可测量因素的例子如pH、溶解氧以及诸如CO2这样的废气的分压。分批和补料分批生物发酵是常用的并且在本领域中为人熟知(Brock，T.D.；BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，2nded.；Sinauer AssociatesSunderland，MA(1989)；或者Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.36227(1992))。
连续生物发酵在一个连续的生物发酵系统中，一种确定的生物发酵溶液被连续加入一个生物反应器中，并且等量的生物发酵溶液同时被收取以用于加工。连续的生物发酵通常将该培养物维持在稳定的高密度下，在该密度下细胞主要处于对数期生长。该方法允许对影响细胞生长或者终产物浓度的一种因素或者任何数量的因素进行调节。例如，某种方法以固定的速率维持某种限制性的营养物质并且允许所有其它的参数被调节，该限制性的营养物质的例子如碳源或者氮水平。在其它的系统中，影响生长的多种因素可被连续地改变，此时根据培养基浊度而测定的细胞浓度保持恒定。连续的系统力求在稳态生长条件下进行操作并且对细胞的损失进行平衡，该损失由于随着该生物发酵系统中的细胞生长速率而对生物发酵溶液进行的收取而导致。为连续的生物发酵过程而调节营养物质和生长因子的方法以及用于使产物的形成速度最大化的技术在工业微生物学中是为人所熟知的(Brock，上文)。
生物催化剂该生物催化剂可以为完整的微生物或者处于分离的酶催化剂形式。完整的微生物细胞可被用作为生物催化剂而无须任何诸如透化这样的预处理。或者，这些完整的细胞可通过本领域的技术人员所熟悉的方法进行透化(例如，以甲苯、去污剂或者冻融进行处理)以提高物质扩散进入和离开细胞的速率。
经质粒pSYCO103转化的大肠杆菌菌株RJ8n被用作为1，3-丙二醇的生物生产的生物催化剂。
RJ8n含有(a)一组三个内源基因，每个基因具有一个使其失活的突变，该组基因的组成为(i)glpk，一种编码甘油激酶的基因，(ii)gldA，一种编码甘油脱氢酶的基因，以及(iii)tpiA，一种编码丙糖磷酸异构酶的基因，RJ8n还含有(b)至少一种编码非特异性催化活性的内源基因，该活性足以将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。质粒pSYCO103(SEQ ID NO1)含有一组七个外源基因(i)编码甘油脱水酶的三个基因(E.C.4.2.1.30)，(ii)编码一种脱水酶反应因子的两个基因(WO 01/12833 A3)(iii)一种编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(E.C.1.1.1.8)以及(iv)一种编码甘油-3-磷酸酶的基因(E.C.3.1.3.21)。
除上文所提及的大肠杆菌菌株之外，可用于本发明的微生物还可包括，细菌(如肠道细菌埃希氏菌和沙门氏菌，例如芽孢杆菌、不动杆菌、链霉菌、甲基细菌、红球菌以及假单胞菌；蓝细菌(如红细菌和Synechocystis)；酵母(例如啤酒糖酵母、接合糖酵母、克鲁维氏酵母、假丝酵母、汉森酵母、德巴利氏酵母、毛霉菌、毕赤氏酵母以及拟酵母)；丝状真菌(例如曲霉菌和节从孢)和藻类，但不限于这些。技术人员还应了解，本发明还可被应用于对来自昆虫、植物和动物的细胞的培养。
该酶类生物催化剂可被固定化于一种聚合物基质中(例如，藻酸盐、角叉胶、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺凝胶(PAG)颗粒)或者固定化于某种可溶或者不溶的支持物之上(例如硅藻土)以辅助该生物催化剂的回收和再利用。用于将生物催化剂固定化于聚合物基质或者可溶或者不溶的支持物之上的方法已被广泛地报道并且为该领域的技术人员所熟知。
培养条件适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法为微生物领域或者生物发酵科学领域中的人士所熟知(Bailey，J.E.and Ollis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，2ndEdition；McGraw-HillNY(1986))。根据用于所需的功能性基因表达的微生物的具体要求，必须对于适当的培养基、pH、温度以及通氧、微需氧或者厌氧条件的要求加以仔细考虑。
培养基和碳底物大规模的微生物生长和功能性基因表达可以使用广泛的简单或者复杂的碳水化合物、有机酸和醇以及饱和的烃。本发明中的生物发酵培养基必须含有适当的碳底物，该底物的选择根据该生物催化剂的需求进行。适当的底物可包括单糖(例如葡萄糖和果糖)、二糖(例如乳糖或者蔗糖)，寡糖和多糖(例如淀粉或者纤维素或其混合物)或者来自可更新的给料(例如奶酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜和大麦芽)的未经纯化的混合物，但不限于这些。该碳底物还可为单碳底物(例如二氧化碳、甲醇或者甲烷)。
除适当的碳源之外，生物发酵培养基必须还含有适当的矿物质、盐、辅因子、缓冲液以及其它成分，这些成分为该领域的技术人员所熟知(Bailey，J.E.and Ollis，D.F.，Biochemical EngineeringFundamentals，2ndEdition，PP383-384和620-622；McGraw-HillNY(1986))。这些添加物适于该生物催化剂的生长并且可促进产生该生物发酵产物所必需的酶学途径。对于本发明，上文所描述的碳源和其它成分被同目标分子进行分离并且回送到该生物发酵容器。
最后，表达某种用于工业的产物的功能性基因可通过具体的生长条件(例如，氮、磷、硫、氧、碳或者包括无机小离子在内的痕量微营养物质的形成及其量)进行调控、抑制或者去抑制。对功能性基因的调控可通过特定的调控分子(例如非必需(安慰)诱导物)的存在与消失而进行，这些调控分子被加入培养物中，并且在典型的情况下并不被认作为营养物或者能量源。生长速度也可为基因表达中的一个重要的调控因素。
实施例本发明在下文的实施例中进行进一步的定义。尽管这些实施例指出了本发明的一些优选的实施方案，但这些实施例的给出应被理解为仅仅是阐释性的。通过上文描述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下可对本发明做出多种变化和修改以使其适应于不同的应用和条件。
缩写的含义如下“h”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升，“g”指克，“kg”指千克，“atm”指大气压。
通用方法适于细菌培养物的维持和生长的材料和方法为本领域所熟知。适用于以下的实施例的技术的描述见Manual of Methods for GeneralBacteriology；Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg andG.Briggs Phillips，eds.，American Society for MicrobiologyWashington，D.C.(1994)或者见BiotechnologyA Textbook ofIndustrial Microbiology；Brock，T.D.，2nded.；SinauerAssociatesSunderland，Massachusetts(1989)。
实施例2展示了稳态过程的计算机模拟，该模拟使用来自AspenTechnology，Inc.，Cambridge，MA的AspenplusTM软件10.1释放版进行。AspenplusTM并不具有用于加工层析的特异的单位操作。使用EXTRACT模块(block)进行模拟移动床(SMB)加工层析的建模，该模块一般被用于逆流液-液萃取。十二烷被用作为液相之一以对固相进行模拟。液-液平衡常数的设置见表2，该设置根据分批层析实验的结果进行，只有一处例外。具体为，用于水和十二烷的液-液平衡常数分别被设定为任意高和任意低的值。
实施例1对比例(无培养基再循环)本实验出于比较的目的进行实施以展示在不进行培养基再循环的情况下的体积产率。
使用葡萄糖作为底物运行一个批次加入生物发酵系统以产生1，3-丙二醇。经质粒pSYCO103转化的大肠杆菌菌株RJ8n在该生物加工中被用作为生物催化剂。
大肠杆菌菌株RJ8n(ATCC PTA-4216)含有(a)一组三个内源基因，每个基因具有一个使其失活的突变，该组基因的组成为(i)glpk，一种编码甘油激酶的基因，(ii)gldA，一种编码甘油脱氢酶的基因，以及(iii)tpiA，一种编码丙糖磷酸异构酶的基因，RJ8n还含有(b)至少一种编码非特异性催化活性的内源性基因，该活性足以将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。质粒pSYCO103(SEQ ID NO1)含有一组七个外源基因(i)编码甘油脱水酶的三个基因(E.C.4.2.1.30)，(ii)编码一种脱水酶反应因子的两个基因(WO 01/12833 A3)(iii)一种编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(E.C.1.1.1.8)以及(iv)一种编码甘油-3-磷酸酶的基因(E.C.3.1.3.21)。
使用本领域已知的成分和方法而制备一个10升工作体积的生物发酵容器。使用本领域已知的成分(例如，水、盐、酵母抽提物)和方法而制备培养基。使用本领域已知的方法在摇瓶中制备接种物。
在接种之后使发酵运转68小时。通过每两个小时对样品进行分析并且基于10g葡萄糖/L的目标对葡萄糖溶液加入速度进行调整，从而对葡萄糖进行控制。
为避免过度充满该发酵容器，在接种之后40h从该发酵容器中取出3.44L培养液。
该发酵容器的体积产率通过测量该发酵容器中的1，3-丙二醇滴度并且计算在发酵容器中液体体积加上被取出的液体体积下产生滴度时所产生的1，3-丙二醇量而进行计算，该1，3-丙二醇滴度的测量通过液相色谱进行。
1，3-丙二醇可通过将该培养基直接进行高效液相色谱(HPLC)分析而进行鉴定。在本发明的一个优选的方法中，发酵培养基通过离子缓和分配色谱(ion moderated partition chromatography)(IMP)进行，该色谱中使用0.01N的硫酸作为流动相并且在恒溶剂方式下进行。在所有这些实施例中，3G的浓度通过HPLC来进行测定。
为进行1，3-丙二醇的定量，将一个Shodex HPLC柱(SH101糖柱，300mm×8mm)配备以一台Waters 715自动收样器，Waters温控模块(设温度为50℃)，Waters 410折光率检测仪以及Waters 486UV检测仪(波长＝210nm)。流动相为0.005摩尔的硫酸，处于0.5mL/min的恒溶剂流中。使用新戊酸作为内标。在这些条件下，1，3-丙二醇在25.9分钟被洗脱。
最大的体积产率为15.85kg/m3/yr，该产率在接种后41.85小时后被观测到。该体积产率通过将所产生的1，3-丙二醇的量(滴度乘以发酵容器中和被取出的总培养液体积)除以所产生的培养液的总体积并进一步除以自接种起的时间加上18小时(用于批次之间的转变)。在接种之后41.85小时，1，3-丙二醇的滴度为108.25g/L，培养液体积为6.168L。
对剩余成分回送到该生物发酵容器的模拟通过从生物发酵容器中收取无催化剂培养基并且向该发酵容器中加入一种物流(构成培养基)，从而模拟本发明对于进行生物发酵容器的操作以产生1，3-丙二醇的影响，该物流近似于应从该分离系统中返回该生物发酵容器的物流的组成。
该生物发酵容器、培养基和接种物的制备同上文对比例。
构成培养基的制备构成培养基使用正常的生物发酵容器培养基配料和方法进行制备，其例外在于1)省略了酵母抽提物，2)所有其它的非水成分的浓度降低50％，以及3)加入了15g/L的甘油和10g/L的葡萄糖。消毒后对该培养基的添加物，例如抗生素，亦在正常配料浓度的50％水平。
发酵在接种后24h开始，从该生物发酵容器中收取1L/min的全细胞培养液并将该液通过一种横向流过滤单位。该横向流过滤单位由一个Pellicon-2微型支持器(Millipore公司目录号#XX42PMINI)组成，该支持器含有一种Pellion PLC系列再生纤维素膜(Millipore公司目录号##P2C01MV01)。该膜的面积为0.1m2并且其标定的分子量限制为1000千道尔顿。从该横向流过滤单位中收取20mL/min的无生物催化剂溶液，而细胞物质和剩余的培养液被送回该生物发酵容器。
在开始进行无生物催化剂物流的收取的同时，18.5mL的构成培养基被加入该生物发酵容器。为避免对该生物发酵容器的过度充满，3.2L的全细胞培养液在接种之后38.28h被从该生物发酵容器中取出并且2.65L在接种之后46.81h被取出。
在52.8小时该发酵容器中的滴度为75.7g/L，该生物发酵容器中的培养液的体积为8.3L。在接种之后52.8h有2018g的1，3-丙二醇在从横向流过滤单位中收取的无生物催化剂物流中被收集。培养液的总体积为8.3+3.2+2.65＝14.15L。由此，所产生的1，3-丙二醇的总体积为75.7×14.15+2018＝3089g。在接种之后52.8h的体积产率为27kg/L/yr。由于该生物发酵容器中抑制性目标分子浓度降低的原因，该产物形成速率增加了70％。
实施例2具有培养基再循环的AspenplusTM计算机模拟在本实施例中进行了一种稳态计算机模拟，以根据该模拟中存在的化合物的已知物理性质来预测物质流量。
构建了一种AspenplusTM模拟以对细胞分离步骤、除水步骤以及SMB加工层析进行模型构建。生物发酵培养液加入物质组成被预设含有9.606％的1，3-丙二醇(目标分子)、4.73％的干细胞、0.48％的葡萄糖、0.961％的甘油、0.048％的乙酸、0.169％的磷酸钾以及平衡的水。该生物发酵的细胞分离步骤除去了5％的上清液体作为无生物催化剂溶液并且将细胞和该上清的剩余物回送入该生物发酵容器。将该无生物催化剂溶液加入一种过程至过程(process-to-process)热交换器，该热交换器在约0.196atm下工作。将离开该热交换器的液体和蒸气分开。该液体是该加工层析的主要加入物。离开该热交换器的蒸气主要为水并且被压缩至约0.2562atm并加入该过程至过程热交换器的另一侧，该蒸气在该侧冷凝。该冷凝物被用作为SMB加工层析的洗脱剂的主要成分。该洗脱剂的平衡物为从离开加工层析的产物流分离出的水。
该加工层析被建模作为一种50理论平板SMB(50 theoreticalplate SMB)，其中新的吸收剂被加入平板1并且洗脱剂被加入平板50。液体加入物在平板12，目标分子流被从平板37收取。从平板37中收取的富含目标分子的物流中的水被同有机物进行分离并且同来自于过程至过程热交换器的冷凝物合并以组成用于该加工层析的洗脱剂。在平板1中离开层析的液体为无生物催化剂和无目标分子的溶液。该溶液同来自于细胞分离步骤的细胞和液体合并并且随后回送到该生物发酵容器以进行培养基再循环。选择流的结果见表3。
表2十二烷相中的液体活性系数同水相中的活性系数的比值
表3
对比例不具有培养基再循环的AspenplusTM计算机模拟在本例中，进行了与实施例2相同的一种稳态计算机模拟；但是本例中无培养基再循环。在实施例2中1，3-丙二醇从该生物发酵容器中收取的净速度为0.455kg/sec。构建了一个模拟程序用来模拟相同的1，3-丙二醇从生物发酵容器中的收取速度，但是无生物催化剂溶液中的培养液成分(除1，3-丙二醇之外的)通过以相同的速度添加新的(非循环的)培养基来进行补充。
构建了一种AspenplusTM模拟程序以对细胞分离步骤以进行模型构建。生物发酵培养液加入物质组成被预设含有9.606％的1，3-丙二醇(目标分子)、4.73％的干细胞、0.48％的葡萄糖、0.961％的甘油、0.048％的乙酸、0.169％的磷酸钾以及平衡的水。该生物发酵培养液的细胞分离步骤以4.512kg/sec除去了上清液体以作为无生物催化剂溶液，并且将细胞和该上清的剩余物回送入该生物发酵容器。这一无生物催化剂溶液流含有0.455kg/sec的1，3-丙二醇以及4.057kg/sec的除1，3-丙二醇之外的培养液成分。因此必须以4.057kg/sec(或者350,525kg/d)的速度向该生物发酵容器中添加新培养基以维持该生物发酵容器中的其它培养液成分的浓度。
序列表<110>纳幕尔杜邦公司<120>一种用于生物发酵系统的产物收取方法<130>CL1813 PCT<150>US 60/285,555<151>2001-04-21<160>1<170>Microsoft Office 97<210>1<211>13543<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>质粒<400>1tagtaaagcc ctcgctagat tttaatgcgg atgttgcgat tacttcgcca actattgcga60taacaagaaa aagccagcct ttcatgatat atctcccaat ttgtgtaggg cttattatgc120acgcttaaaa ataataaaag cagacttgac ctgatagttt ggctgtgagc aattatgtgc180ttagtgcatc taacgcttga gttaagccgc gccgcgaagc ggcgtcggct tgaacgaatt240gttagacatt atttgccgac taccttggtg atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct300tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta360gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg420
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1.一种在生物发酵系统中使用的产物收取方法，该方法包括a)在生物发酵的至少一部分时间从一部分含有目标分子的生物发酵溶液中收取至少大部分生物催化剂；b)从步骤a)所产生的无生物催化剂溶液中除去一部分水；c)任选在步骤b)之前或者之后从该无生物催化剂溶液中除去目标分子之外的成分；d)加入以下成分通过层析介质1)由步骤b)或者c)所产生的无生物催化剂溶液，以及2)一种洗脱剂；e)从该层析介质释放的无生物催化剂溶液的第一个级分中回收该目标分子；f)任选从该层析介质释放的无生物催化剂和无目标分子溶液的第二个级分中除去非水性洗脱剂；g)任选将在步骤b)中从无生物催化剂溶液中收取的水加入至步骤e)或者f)之后的无生物催化剂和无目标分子溶液之中，所加入的量适于向该生物发酵系统的回送；以及h)将来自于步骤d)、e)、f)或者g)中任意步骤的无生物催化剂和无目标分子溶液回送入该生物发酵系统。
2.一种在生物发酵系统中使用的产物收取方法，该方法包括a)在生物发酵的至少一部分时间从一部分含有目标分子的生物发酵溶液中收取至少大部分生物催化剂，该目标分子比水挥发性高；b)任选在步骤c)之前从步骤a)所产生的无生物催化剂溶液中除去目标分子之外的成分；c)加入以下成分通过层析介质1)步骤a)或者b)的无生物催化剂溶液，以及2)一种洗脱剂；d)从该层析介质释放的无生物催化剂溶液的第一个级分中回收该目标分子；e)从该层析介质释放的无生物催化剂和无目标分子溶液的第二个级分中除去一部分水；f)任选，在步骤e)之前或者之后从该层析介质释放的无生物催化剂和无目标分子溶液的第二个级分中除去非水性洗脱剂；以及g)将来自于步骤e)或者f)中的无生物催化剂和无目标分子溶液回送入该生物发酵系统。
3.权利要求1或者2的产物收取方法，其中该洗脱剂含有分别通过除水步骤b)或者e)所产生的水。
4.权利要求3的产物收取方法，其中该洗脱剂含有水和非水性洗脱剂的混合物。
5.权利要求4的产物收取方法，其中该非水性洗脱剂为一种短链醇或者丙酮。
6.权利要求3的产物收取方法，其中该洗脱剂为水。
7.权利要求1的产物收取方法，其中大约50-80％的水被从步骤(a)的无生物催化剂溶液中除去。
8.权利要求1的产物收取方法，其中在步骤(g)中添加的适量的水使该无生物催化剂和无目标分子溶液的水含量恢复至大约等于在步骤(b)之前的无生物催化剂溶液中的水含量。
9.权利要求1的产物收取方法，其中在步骤g)中添加的适量的水使该无生物催化剂和无目标分子溶液的水含量恢复至低于在步骤(b)之前的无生物催化剂溶液中的水含量。
10.权利要求2的产物收取方法，其中大约50-80％的水被从步骤(e)的无生物催化剂和无目标分子溶液中除去。
11.权利要求2的产物收取方法，其中在步骤(g)中添加的适量的水使该无生物催化剂和无目标分子溶液的水含量恢复至大约等于在步骤(c)之前的无生物催化剂溶液中的水含量。
12.权利要求2的产物收取方法，其中在步骤g)中添加的适量的水使该无生物催化剂和无目标分子溶液的水含量恢复至低于在步骤(c)之前的无生物催化剂溶液中的水含量。
13.权利要求1的产物收取方法，其中该目标分子为1，3-丙二醇。
14.一种系统，该系统用于在目标分子的生物发酵的至少一部分时间进行原位产物收取，该系统包括a)一种生物催化剂分离装置，该装置用于从一部分含有目标分子的生物发酵溶液中收取至少大部分生物催化剂；b)一种除水装置，该装置用于从a)的生物催化剂分离装置中产生的无生物催化剂溶液中除去一部分水；c)任选在步骤b)之前或者之后的一种除去装置，该除去装置从由b)的除水装置产生的无生物催化剂溶液中除去目标分子或水之外的成分；d)一种加工层析装置，由b)的除水装置或者c)的除去装置所产生的无生物催化剂溶液和一种洗脱剂通过该装置；e)一种目标分子回收装置，该装置从d)的加工层析装置所释放的第一个级分中回收该目标分子；f)任选的一种非水性洗脱剂除去装置，该装置从d)的加工层析装置所释放的第二个级分中除去非水性洗脱剂；g)一种加水装置，该装置将b)产生的水加入至e)或者f)所产生的无生物催化剂和无目标分子溶液之中，所加入的量适于向该生物发酵系统的回送；以及h)一种再循环装置，该装置将来自于d)、e)、f)或者g)中的无生物催化剂和无目标分子溶液回送入该生物发酵系统。
全文摘要
本发明涉及到一种生物加工过程溶液，该溶液用于一种产物收取方法，该方法用于一种生物发酵。本发明披露了一种方法，该方法用于在生物发酵的至少一部分时间从该生物发酵容器中取出一份培养液，收取生物催化剂和水，使用水作为洗脱剂通过层析从所取出的培养液中分离生物发酵产物，并且将该培养液的剩余成分回送入该生物发酵容器。该加工层析允许进行该目标分子的高选择性分离，防止了对该生物发酵的反馈抑制。
文档编号C12M1/12GK1503846SQ02808578
公开日2004年6月9日 申请日期2002年4月22日 优先权日2001年4月20日
发明者A·E·维尔金斯, A E 维尔金斯, D·J·罗维, 罗维 申请人:纳幕尔杜邦公司