呈递所希望的肽序列的结构的制作方法

专利名称：呈递所希望的肽序列的结构的制作方法
技术领域：
本发明涉及提供具有改良性质如结合性质或其它性质的结合分子的方式和方法，以及这些新的结合分子。
本发明还涉及在其所有多方面用途中应用这些分子的方法。
在现代生物工程学中，一种最有前途并在许多情况中得以验证的应用依赖于蛋白质分子对各种物质和/或靶的亲和性。蛋白质结合分子(proteinaceous binding molecules)已经用于从混合物中纯化物质，用于针对广泛物质的诊断分析中以及用于制备药物等。典型地，已经使用天然发生的蛋白质分子如免疫球蛋白(或者免疫球蛋白超家族的其它成员)以及受体和酶。衍生自这些分子的肽也已经使用。
应用现有的(修饰的)天然分子当然仅提供了有限的进化所赋予这些分子的性质资源。这是这些分子未应用于其作用所达的全部范围的原因之一。另外，由于进化总是导致天然存在的结合分子的不同功能之间的调和，因此这些分子对于所设想的用途而言不是最佳的。典型地，本领域已经开始针对改变现有(修饰的)结合分子的结合性质而努力。在如噬菌体展示(单链)抗体的技术中，几乎可以获得任何结合特异性。然而，这些结合区域都存在于相同的邻近序列中。因此，结合区域及其邻近序列(context)通常还不是最佳的，限制了蛋白质结合分子在本领域中的应用。
本发明提供了一种通用邻近序列(versatile context)以呈递希望的亲和区。本发明提供了一种结构邻近序列(structural context)，其基于已经鉴别的共有结构元件(称为核心结构)设计，以产生众多结合蛋白。目前这个所谓的共有核心已经作为一种新的蛋白质分子而产生，其可以拥有一或多个希望的亲和区。
这种蛋白质结构不依赖于任何氨基酸序列，而是仅依赖于共有的结构元件。其可以通过提供不同的氨基酸序列和/或序列中的氨基酸残基以适应于指定的应用。其也可以适合被展示的特定亲和区的需要。本发明因此还提供了结构邻近序列和亲和区的文库，用于组合而获得一种适于所希望目的的最佳蛋白质结合分子。
因此本发明提供了一种合成的或重组的蛋白质分子(proteinaceous molecule)，其包含一个结合肽和一个核心，所述核心包含一个包含至少5个链的β-桶，其中所述β-桶包含至少两个β-折叠，其中至少一个所述β-折叠包含三个所述链及其中所述结合肽是连接所述β-桶中两个链的一种肽，及其中所述结合肽在其天然邻近序列之外(said binding peptide is outside its natural context)。我们已经在从半乳糖苷酶至人(及例如骆驼)抗体的所有种类的分子范围内的许多蛋白质中鉴别了这种核心结构。自然界显然已经设计了这种结构元件用以呈递希望的肽序列。现在我们产生了这个核心的分离形式，以及仍具有相同或相似结构元件的这一核心的许多变体。这些新的结构可以用于所有使用其它结合分子的应用中，甚至可以用于超出本文所阐述的那些应用之外的应用中。包含由一个亲和区(希望的肽序列)和两个β-折叠形成的一个β-桶的结构是本发明蛋白质结合分子的最基本形式(蛋白质(proteinaceous)是指其本质上是氨基酸序列，但可以存在所有种类的侧链和/或基团，当然这是可能的，因为氨基酸序列对于设计空间方向相同并可以呈递肽亲和区的非蛋白质性质的其它分子的结构不很相关；空间方向是重要参数)。本发明还揭示了最佳的核心结构，其中根据希望目的不太稳定的氨基酸由更稳定的氨基酸置换(反之亦然)。当然，包括其它取代或者甚至与现有结构完全不相关的氨基酸序列，同样因为重要参数是空间分子方向。根据本发明优选应用比基本结构更先进的核心结构，因为结合性质和结构性质可以设计得更好及具有更可预期的价值。因此本发明优选提供一种蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少5个链，其中至少所述折叠包含3个所述链，更优选本发明提供了一种蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少6个链，其中至少两个所述折叠包含3个所述链。其中每个所述折叠包含3个链的所述β-桶在足够稳定的同时提供足够的变化可能性以适应特定目的的核心/亲和区(结合肽)。当然也可以发现每个折叠包含较少链的核心的合适特性。因此一个折叠仅包含两个链的变体属于本发明的范围。在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了一种蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少7个链，其中至少一个所述折叠包含4个所述链。或者，本发明提供了一种蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少8个链，其中至少一个所述折叠包含4个所述链。在另一个实施方案中，本发明提供了一种蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少9个链，其中至少一个所述折叠包含4个所述链。在核心结构中，有一个天然展示亲和区的较开放的一侧(more open side)和一个存在连接序列的较闭合(more closed side)的一侧。优选地，至少一个亲和区位于所述较开放的一侧中。
因此本发明提供了一种蛋白质分子，其中所述结合肽连接所述桶的开放一侧上的所述β-桶的两个链。尽管希望的肽序列(亲和区)的位置可以在两个链之间的任何部位，但优选希望的肽序列连接所述桶的两个折叠。因此本发明提供了一种蛋白质分子，其中所述结合肽连接所述桶的至少两个β-折叠。尽管一个亲和区可能就足够了，但优选存在更多的亲和区以产生更好的结合分子。优选地，这些区域的排列是使得能协同结合(例如均在所述桶的开放一侧上)。因此，本发明提供了一种蛋白质分子，其包含至少一个进一步的结合肽。实际上一个成功的核心元件具有三个亲和区和三个连接区。本发明的一个优选实施方案是分离形式的这个核心。然而，由于本发明结合分子的通用性，因此所述桶的不太开放一侧上的连接序列也可以用作亲和区。通过这种方式获得非常小的双特异性结合分子。因此本发明提供了一种蛋白质分子，其包含至少4个结合肽。本文中“双特异性”是指结合分子具有与两个靶分子(相同或不同)结合的可能性。核心中的各个链优选由单个开放阅读框架编码。连接各个链的环可具有任何类型的构型。并非不适当地限制核心的通用性，优选地这些环连接核心的相同一侧上的链，即所述核心的闭合一侧或开放一侧上的链(a)的N末端连接链(b)的C末端。环可以连接同一β-折叠中的链或者与反向β-折叠交叉的链。连接所述核心中各个链的优选排列在实施例和附图中给出，尤其在

图1中示出。所述核心中的链可以是彼此相关的任何方向(平行或反平行)。优选所述链的构型如图1所示。
已经阐明本发明的一个目的是使结合分子的结合性质和结构性质(例如在不同环境(温度，pH等)的稳定性，抗原性等)均最佳化。这通过以下步骤进行获取至少一个本发明的核酸(编码本发明的蛋白质结合分子)，并突变编码的结构区或亲和区或者二者，并测试是否获得具有希望的结合性质和结构性质的分子。因此本发明提供了一种鉴别具有改变的结合性质的蛋白质分子的方法，所述方法包括在本发明蛋白质分子核心产生一个变化，并从所述蛋白质分子中选择具有结合性质改变的蛋白质分子，本发明还提供了鉴别具有改变的结构性质的蛋白质分子的方法，包括在本发明蛋白质分子核心产生一个变化，并从所述蛋白质分子中选择具有结构性质改变的蛋白质分子。这些改变在性质上可以多种多样，例如是翻译后修饰。本领域技术人员可以设计其它相关突变。
正如所阐述的，突变典型通过突变所述编码核酸及在合适的系统中表达所述核酸而产生，所述表达系统可以是细菌，真核细胞或者甚至是无细胞系统。当选择时，当然可以使用所述选择系统之外的其它系统。
本发明还提供了生产编码本发明蛋白质结合分子的核酸，如生产编码能展示至少一个希望的肽序列的蛋白质分子的核酸的方法，包括提供编码至少第一个和第二个结构区的一个核酸序列，所述第一个和第二个结构区由编码所述希望的肽序列的核酸序列分隔或者由可以插入这个序列的一个区域分隔，突变编码所述第一个和第二个结构区的所述核酸以获得编码能展示至少一个希望的肽序列的所述蛋白质分子的一个希望的核酸。本发明优选提供了展示一种希望的肽序列的一种方法，包括提供编码至少两个β-折叠的核酸，所述β-折叠形成一个β-桶，所述核酸包含一个区域以插入编码所述希望的肽序列的一个序列，插入包含希望的肽序列的一个核酸序列，并表达所述核酸，从而通过上述方法获得所述β-折叠。本发明进一步提供了新的结合分子在目前结合分子涉及的所有领域中的应用，如从混合物中分离物质，所述混合物典型地为复杂的生物学混合物如体液或分泌液如血液或乳汁，或者血清或乳清。
当然本领域技术人员清楚制药学应用和诊断学应用。在诊断学应用中，标记可以附于本发明分子上。在制药学应用中，本发明分子可以偶联其它部分。在这两种情况中，这可以是化学偶联或者通过重组融合。在本领域中已经就常规的结合分子而详细描述了诊断学应用和制药学应用。对于本发明新的结合分子，本领域技术人员无需进一步解释。定向形式的基因治疗是许多实例之一，其中本发明的结合分子被提供在基因输送载体上(基因输送载体可以是病毒(腺病毒，逆转录病毒，腺伴随病毒或慢病毒等)或非病毒(脂质体等)的载体)。本领域熟知被输送的基因。
基因输送载体也可以编码输送于靶位的本发明结合分子，其可能与一种毒性部分融合。本领域也熟知毒性部分与结合分子的缀合物，并包括本发明新的结合分子的缀合物。
详细描述本发明在以下描述中得以更详细的阐述。
本发明涉及蛋白质的设计，构建，生产，筛选及应用，所述蛋白质含有参与分子结合的一或多个区域。本发明还涉及具有人工结合结构域的天然发生的蛋白质，具有额外的结构成分及具有一或多个人工结合位点的重塑天然发生的蛋白质，具有一或多个人工结合位点去除一些元件(结构或其它元件)的重塑天然发生的蛋白质，具有一或多个结合位点含有标准化核心结构基序的人工蛋白质。所有这些蛋白质均称为VAP(Versatile Affinity Protein，通用亲和性蛋白质)。本发明进一步涉及根据本发明方法鉴别的新VAP并将含有相似核心结构的天然发生的蛋白质上的结合位点转移。在转移之前希望将这种天然发生的蛋白质3D模型化或诱变，以通过选择的VAP上存在的亲和区而恢复或保证抗原结合能力。另外，如本发明的描述，本发明涉及使用选择的VAP纯化，去除，掩饰，释放，抑制，刺激，捕捉选择的配体的方法，所述选择的配体能由选择的VAP结合。
配体结合蛋白含有一个(推定的)分子结合位点的许多天然发生的蛋白质包含两个功能不同的区域实际展示的结合区及一或多个被包裹在分子结合位点或口袋(pocket)周围的区域，本文中称为支架(scaffold)。这两个区域的功能、结构、组成及物理性质不同。支架结构保证整个蛋白质的稳定三维构象，及作为实际识别区的垫脚石(steppingstone)。
可以区别两组功能不同的配体结合蛋白质。这种区别基于存在遗传可变或不可变的配体结合区。一般地，不可变配体结合蛋白质在该物种细胞的结合口袋中含有固定数目、固定组成及不可变的氨基酸序列。这种蛋白质例如是所有的细胞粘着分子，例如N-CAM和V-CAM，酶家族，例如激酶和蛋白酶，及生长因子受体家族，例如EGF-R，bFGF-R。相反，遗传可变的配体结合蛋白质在活性遗传改组、突变或重排机制的控制下，使生物体或细胞改变结合袋中及或者结合袋周围的氨基酸的数目、组成和序列。这些的实例是抗体的所有类型的轻链和重链，B细胞受体轻链和重链及T细胞受体α、β、γ和δ链。野生型支架的分子构造可以在很大程度上变化。例如，含有DNA结合分子的锌指含有与抗体完全不同的支架(针对氨基酸成分和结构)，尽管这两种蛋白质均能与特异性的靶结合。
支架及配体结合结构域通过免疫获得的抗体表达可变的(推定的)抗原结合结构域的配体结合蛋白质已经示出在研究配体结合蛋白质中具有重要价值。产生配体结合蛋白质的传统方法是使用动物免疫系统。该系统参与保护机体抵抗外源物质。机体识别、结合及清除这种外源的高度多样化的物质的一种方式是产生抗这些分子的抗体。免疫系统能选择并增殖识别抗原的抗体产生细胞。这种方法也能通过主动免疫法而模仿。在一系列免疫之后，可以形成识别并结合抗原的抗体。具有不同亲和区的抗体的可能数目超过1040个，所述不同亲和区可由于遗传重排和突变而形成。然而，实际上免疫系统只筛选及优化较少数目的抗体类型。针对正确的抗体生产细胞的分离及随后这些细胞的无限增殖化，或者直接克隆选择的抗体基因，可以保留抗原-抗体对以在将来(商业及非商业)使用。
以此方式获得的抗体的应用仅限于有限的应用。动物抗体的结构与在人体中发现的抗体不同。将动物产生的抗体导入人体内例如医学应用，几乎确实引起不利于导入的抗体作用的免疫应答(例如HAMA反应)。因为其不允许以商业目的主动免疫人体，因此以这种方式不能或很少能获得人抗体。由于这些不利因素，已经揭示了避免产生动物特异性抗体的方法。一个实例是除去小鼠免疫系统及在该小鼠体内导入人免疫系统。在免疫后产生的所有抗体均是人源的。然而，使用动物还有两个重要缺点。首先，生态学研究人员，研究人员，公众舆论和政府部门密切关注动物的照管(animal care)。免疫属于痛苦和紧张性操作，必须尽可能地预防。其次，免疫不总是产生抗体或者不总是产生包含所需特征如结合强度、抗原特异性等的抗体。原因可以多种多样免疫系统恰巧错过这种推定的抗体；最初形成的抗体表现是毒性或有害的；最初形成的抗体也识别动物特异性分子及因此破坏产生这种抗体的细胞；或者所述表位不能由免疫系统定位(mapped)(这可以有一些原因)。
其它方式获得的抗体如上所述，可清楚知道免疫程序可导致配体结合蛋白质形成，但其应用是受限的，不可改变的及不可控制的。本发明使用细菌产生抗体片段的方法(Skerra and Pluckthun，1988；Better et al.，1988)提供了新的强有力的工具以避免应用动物及免疫程序。已经示出克隆的抗体片段(构架，亲和区及这些组合)可以在人工表达系统中表达，可以在体外调节和产生识别(推定的)特异性靶位的抗体及衍生物(Fab，VL，VH，scFv和VHH)。新的有效选择技术及改良的简并(degeneration)策略指导巨大的人工(人)抗体片段文库的产生。这种文库潜在地含有可结合一或多个选择的配体的抗体片段。这些推定的配体特异性抗体可以通过筛选及选择程序提取(retrieve)。因此，特异性靶位的配体结合蛋白可以工程化及提取而不用使用动物免疫。
其它免疫球蛋白超家族衍生的支架尽管大多数精力和努力放在产生及优化天然产生的或复制的人抗体衍生的文库上，但其它支架也已经被描述作为一或多个配体结合结构域的载体是成功的支架。基于天然发生的抗体的支架的实例涵盖了小抗体(Pessi等，1993)，Camelidae VHH蛋白(Davies and Riechmann，1994；Hamers-Casterman等，1993)及可溶的VH变体(Dimasi等，1997；Lauwereys等，1998)。已经用于亲和区插入的两个其它天然发生的蛋白质也是免疫球蛋白超家族的成员T细胞受体链(Kranz等，WO.Patent 0148145)及纤连蛋白结构域-3区(Koide US Patent 6,462,189；Koide等，1998)。本发明人发现所述两个T细胞受体链均可以具有三个亲和区，而研究者描述的纤连蛋白区只有两个区。
非免疫球蛋白衍生的支架除了免疫球蛋白结构域衍生的支架之外，也已经研究了含有非免疫球蛋白结构域的支架。所有研究的蛋白质均只含有一个蛋白质链及1-4个亲和相关区。Smith及其同事(1998)报道了使用knottins(一组小型二硫键蛋白质)作为支架。他们成功产生了一个基于具有7个突变的氨基酸的knottins的文库。尽管所述蛋白质的稳定性和长度极佳，但可以随机化的氨基酸数目及亲和区的奇异点较少使knottin蛋白质不是非常有用。Ku和Schultz(1995)在细胞色素b562的四螺旋束(four-helix-bundle)结构中成功导入两个随机区域。然而，选择的结合物(binder)示出以微摩尔Kd值结合而不是所需的纳摩尔或者甚至更好的范围。已经使用的另一种构架属于蛋白质的酶抑制剂(tendamistat)家族。McConnell和Hoess(1995)论证了来自唐德链霉菌(Streptomyces tendae)的α-淀粉酶抑制剂(74个氨基酸β-折叠蛋白)可以作为配体结合文库的支架。两个结构域示出接受简并的区域并发挥配体结合功能。结合物的大小和性质示出酶抑制剂作为配体模拟物(称为mimetopes)可以发挥非常好的功能。这个选项现已经加以利用。Lipocalin蛋白也示出是最大4个亲和区的成功支架(Beste等，1999；Skerra，2000 BBA；Skerra，2001 RMB)。Lipocalins参与小分子如类维生素A、花生四烯酸及一些不同类固醇的结合。每个lipocalin均具有一个识别并结合一或多个特异性配体的特化区域。Skerra(2001)使用lipocalin RBP和lipocalin BBP在配体结合结构域的部位导入可变区。在构建一个文库并连续筛选后，研究人员能分离并定性一些独特的结合物，其与选择的配体具有纳摩尔特异性。目前未知在细菌或真菌细胞中怎样产生有效的lipocalin。lipocalin的大小(大约170个氨基酸)对VHH链(大约100个氨基酸)而言相当大，其对工业应用而言也太大。
核心结构开发在商业性工业应用中，非常感兴趣使用单链肽而不是多链肽，因为这种肽在生产过程中低成本高效率。可用于工业应用的一个实例是VHH抗体。这种抗体非常稳定，可具有高度特异性及相对较小。然而，所述支架已经演变为对免疫依赖功能而非工业应用是最佳的。另外，在一个抗体库(pool)中存在非常多样的构架区库阻碍了模块优化(modular optimisation)方法的使用。因此基于VHH蛋白质的有利的稳定性设计一种新的支架。
使用3D建模和对比模拟软件(comparative modeling software)设计一种支架，其符合通用亲和性蛋白质(VAP)的需要。然而，目前还不能计算所有可能的蛋白质结构，蛋白质稳定性和其它特点，因为这将花费几个月的时间经计算机计算。因此，我们通过使用展示技术测试了最有希望的在实验室中经计算机设计的支架，所述展示技术如噬菌体展示等。在这种方式中，可以在相对短时间内筛选大量支架。
免疫球蛋白样(Ig样)折叠在自然界非常普遍。许多蛋白质，尤其在动物王国中，在属于这个类别的蛋白质中均具有一个折叠区。回顾含有Ig样折叠的蛋白质的功能及在特殊蛋白质中这个Ig样折叠的功能，显然大多数这些结构域(如果不是全部)均参与配体结合。含有Ig样折叠的蛋白质的一些实例是V-CAM，免疫球蛋白重链可变结构域，免疫球蛋白轻链可变结构域，免疫球蛋白恒定区，T-细胞受体，纤连蛋白，呼肠孤病毒(reovirus)外壳蛋白，β-半乳糖苷酶，整合素(integrin)，EPO-受体，CD58，核酮糖羧化酶，desulphoferrodoxine，超氧化物等，生物素脱羧酶及P53核心DNA结合蛋白。大多数Ig样折叠的分类可得自SCOP数据库(Murzin A.G等，1995；http//scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop)及得自CATH(Orengo等，1997；http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath_new/index.html)。SCOP将这些折叠分类为全部是β蛋白，具有一个免疫球蛋白样β夹层(sandwich)，其中所述夹层含有2个片层中的7个链，尽管含有该折叠的一些成员具有额外的链。CATH将这些折叠分类为主要是β蛋白，具有一个如免疫球蛋白样折叠中的一个类夹层的结构，指定代码为2.60.40。在结构数据库如CE(Shindyalov等1998；http//cl.sdsc.edu/ce.htm)，VAST(Gibrat等，1996；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml)和FSSP(Holm等，1998；http//www.ebi.ac.uk/dali/fssp)中，使用相似的分类。
使用Cn3D(NCBI；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml)，InsightII(MSI；http//www.accelrys.com/insight)及其它结构观察器的软件将来自不同蛋白质的这些折叠投影，示出Ig样折叠具有不同的亚结构域。所述结构的投影示意图示于图1。在所述折叠的中心观测到最保守的结构，称为核心。该核心结构的长度几乎不变化并具有相对保守的空间制约(constrain)，但发现其序列和氨基酸组成可有很大程度变化。在核心的两侧，均存在亚结构域。这些称为连接环(connecting loop)。这些连接环非常易变，因为其在氨基酸容量，序列，长度和构型方面均可变化。所述核心结构因此被认为是这些蛋白质中最重要的结构域。形成核心的β-元件的数目可在7-9之间变化，尽管6个链的核心结构也可以是重要的。核心的所有的β元件均排列在两个β-折叠内。每个β-折叠均由反平行方向的β-元件构成。观测到的一个β-折叠中β-元件的最小数目为3个元件。观测到的一个β-折叠中β-元件的最大数目是5个元件，尽管不能排除可以具有更高数目的β-元件。连接环连接所述桶一侧上的β-元件。一些连接穿经β-折叠，而其它的连接连接位于一个β-折叠内的β-元件。特别是指定为L2，L4，L6和L8的环实际上用于配体结合并因此是导入或修饰结合肽/亲和区的优选位点。L1，L3，L5和L7环的长度、结构、序列和氨基酸组成的高度多样性明显表明这些环也可以至少以人工形式用于配体结合。
β-元件中形成实际核心的氨基酸侧链朝向核心内部投影(project)，并因此充填了核心中心空间，其能通过H键，共价键(半胱氨酸桥)及其它力而彼此相互作用，决定了折叠的稳定性。由于发现排列在内部的β元件部分的残基的氨基酸组成和序列非常易变，因此推断可以产生许多其它序列形式。
为获得所述结构作为出发点以设计含有这种Ig样折叠的新型蛋白质的基本理念，使用含有Ig样折叠的结构域投影。InsightII，Cn3D和Modeller程序用于确定最小元件和长度。另外，只有所述结构的C-α原子被投影，因为这些描述了所述折叠的最低特征。允许这些β-元件的空间位置(坐标)中有微小差别。
代表Ig样折叠核心的C-α原子的坐标的PDB文件用于产生新的含有9，8，7，6和5个β-元件的结构。针对8个链的结构，可以忽略β-元件1或9，而且元件5或6也可以忽略。因此一个8个链的核心优选包含元件2-8，及1或9。另一个优选的8个链的核心包含元件1-4，7-9，及链5或链6。针对7个链的结构，可以去除元件1和9，1和5，6和9，9和5及元件4和5的组合中的2个β-元件。因为空间限制优选除去元件4和5。6个链的结构优选缺失元件1，4和5或者4，5和9，但用Insight和Modeller分析显示其它形式也是可靠的并足以进行工程化。
构建多种初级支架并合并起来(pooled)。所有计算机设计的蛋白质仅是推测的。在初级支架中的一个突变或者多个氨基酸变化使其成为成功的支架或者使其功能比预期的更加完善。为实现这个目的，将构建的初级支架通过PCR扩增进行适度突变，所述PCR包括易错PCR，如在反应混合物中dNTP摩尔浓度不等，加入锰或其它添加剂，或者加入核苷酸类似物，如dITP(Spee等，1993)或dPTP(Zaccolo等，1996)，其最后可改变初级支架的氨基酸组成和氨基酸序列。以这种方式产生新的(二级)支架。
为测试所述支架所需的功能性、稳定性及其它特性或希望的特征，将一系列已知的亲和区如结合溶菌酶的1MEL及结合RNase的1BZQ插入初级模块构建的支架中。构建的VAP的功能性、热及化学稳定性通过测定伸展条件而确定。在化学或热处理后的功能性通过结合分析(ELISA)确定，而温度诱导的伸展使用圆二色性(CD)旋光计测定。使用噬菌体展示技术选择希望的支架或者优化支架。
用于构建文库的起始亲和区在本发明中，需要新的及独特的亲和区。亲和区可得自天然来源，简并的引物或者堆积的DNA三联体。所有这些来源均具有上述某些重要的局限性。在我们的新设置中，设计了一种新的及明显改良的亲和区来源，其局限性较小，可用于模块系统中，是非常便于应用和优化的，并快速及便于产生及调节，具有低百分比的终止密码子，具有非常低百分比的移码，其中重要的结构特征可以保存在大量新形成的克隆中而且可以导入新的结构元件。
在正常抗体轻链和重链中的主要的重要亲和区(CDR3)平均长度在11(小鼠)和13(人)个氨基酸之间。因为在这种抗体中，轻链和重链中的CDR3协同作为抗原结合物(antigen binder)，这种结合的强度是这两个区域共同的结果。相反，由于缺乏轻链的原因，VHH抗体(骆驼科(Camelidae))的抗原结合是一个CDR3区的结果。估计这些CDR3区域的平均长度为16个氨基酸，明显比正规的CDR3区长(Mol.Immunol.Bang Vu等，1997，34，1121-1131)。强调的是长的或多个CDR3区潜在地具有更多的与配体相互作用的位点，及因此可以具有更多的特异性及更强的结合。另一例外是在牛(Bos taurus)体内发现的CDR3区(Berens等，1997)。尽管牛体内的抗体由轻链和重链组成，但其CDR3区比在小鼠和人体内发现的CDR3区更长，其长度与骆驼CDR3区相当。主要亲和区的平均长度应优选是大约16个氨基酸长。为尽可能地覆盖潜在功能性CDR长度，主要亲和区的长度可在1-50个氨基酸之间或者甚至更多个氨基酸之间变化。由于CDR3区(类似于CDR1和CDR2)的结构和结构类别还未阐明及理解，因此不可能以至关重要的氨基酸的位置和性质均正确的方式设计长的亲和区。因此，大多数文库要补充完全简并的区域，以发现至少一些正确的区域。在本发明中，我们描述了天然发生的骆驼VHHCDR3以及牛衍生的VHCDR3区作为新的亲和区的模板的应用，但当然可以使用其它CDR区(例如CDR1和CDR2)以及长度相应的改变的其它序列。通过PCR将CDR3区从编码VHH抗体的mRNA中扩增，所述VHH抗体源自骆驼科的多种动物或者源自含有长CDR3区的多种其它动物。接着将此大约108个不同CDR3区如库上所述通过PCR进行突变，所述库在编码氨基酸组成，氨基酸序列，推定的结构类别及长度方面不同。结果是大多数产物与原始模板不同，及因此含有潜在地具有不同亲和区的编码区。其它非常重要的结果是所述产物保持其长度，所述库保持其长度分布，明显一部分保持结构重要信息而其它部分可形成非天然类别的结构，所述产物不含有或仅非常罕见地含有移码及大多数产物缺失终止密码子。这些新亲和区可以通过模块亲和性及支架转移(Modular Affinity and Scaffold Transfer，MAST)技术克隆入选择的支架中。这个技术基于如下的事实，即上述所有设计的和构建的支架具有一个模块结构，由此连接β-链的所有环均可以易于由其它环置换而不改变VAP的整体结构(见图2)。新构建的文库可以由本领域熟练技术人员进行与筛选正规文库相似的筛选步骤而筛选。因此本发明进一步提供了一种生产包含人工结合肽的文库的方法，所述方法包括提供至少一个核酸模板，其中所述模板编码不同特异性结合肽，产生所述模板通过其突变所得的核酸衍生物的集合(collection)，及将所述集合或其一部分提供给肽合成系统以产生包含人工结合肽的所述文库。所述文库的复杂性随着用于产生文库的不同模板的数目的增加而增加。在这种方式中，使用数目增加的不同结构。因此优选提供至少2个核酸模板，最好提供至少10个核酸模板。可以使用多种方式和方法导入突变。优选所述方法通过改变核酸模板或其衍生物中的碱基而导入突变。衍生物是指一种核酸，其与所述模板相比包含至少一个导入的突变。在这种方式中，亲和区的大小不受影响。合适的修饰策略包括扩增策略如PCR策略，包括例如不平衡浓度的dNTPs(Cadwell等，(1992)；Leung等，(1989)1；Kuipers，(1996))，加入dITP(Xu等(1999)；Spee等(1993)；Kuipers，(1996))，加入dPTP(Zaccolo等，5(1996))，加入8-oxo-dG(Zaccolo等，(1996))，加入Mn2+(Cadwell等，(1992)；Leung等，(1989)1，Xu等，(1999))，具有高度误掺入(highmisincorporation)水平的聚合酶(Mutagene，Stratagene)。当然也可以使用导入突变的位点特异性方案，然而，使用这种方法产生文库需要相当多的时间和精力，因此选择采用一种仅基于定点诱变的策略。当然可以使用杂交策略。优选包含在新生链延伸期间掺入dITP和/或dPTP的突变策略，因为这种策略易于控制在每个循环中导入的突变数目。所述方法不依赖使用简并引物(degenerate primer)导入复杂性。因此在一个实施方案中，所述扩增利用非简并引物。然而，可以使用(部分)简并引物，因此本发明还提供了一种方法，其中至少一个非简并引物进一步包含一个简并区。产生所述结合肽的文库的方法尤其适于产生上述优选的较大的亲和区。在这些区域中，可以导入较多的改变同时保留一样的相似结构。因此优选地，至少一个模板编码一种特异性结合肽，其具有一个包含至少14个氨基酸优选至少16个氨基酸的亲和区。尽管在本发明的这个实施方案中可以使用非连续区域，但优选所述区域包含至少14个连续的氨基酸。当使用多个模板时，优选所述区域长度包含平均24个氨基酸。
有利的是，产生结合肽文库的方法可与本发明的核心区及产生核心区的方法组合。例如，一旦选择一种合适的结合区，则可以设计或选择一个核心以适合特殊应用。然而，也可以根据结合肽的指定用途而选择一个特殊的核心区。随后可以产生具有所述核心的文库及所述结合肽的文库。这类文库的用途当然是多种多样的。或者，可以使用组合策略以产生具有核心文库的结合肽文库。各个文库的复杂性当然可以加以控制以使组合文库适应特殊用途。因此在一个优选的实施方案中，至少一个所述模板编码本发明的蛋白质分子。可以使用所述肽，核心及其组合选择本发明的蛋白质分子，因此本发明进一步提供了一种方法，其包含提供所述人工肽的文库中肽的一种潜在的结合配体，并选择能特异性结合来自所述文库的所述结合配偶体(partner)的肽。本发明当然还提供了使用所述方法获得的一种选择的蛋白质分子。为易于回收和生产选择的蛋白质分子，优选将至少所述核心和结合肽展示在一种可复制的包装上，所述包装包含编码展示的核心/肽蛋白质分子的核酸。优选地所述可复制的包装包含一种噬菌体，如用于噬菌体展示策略中的噬菌体。因此本发明还提供了一种噬菌体展示文库，其包含本发明的至少一个蛋白质分子。如上所述，产生结合肽文库的方法可有利地适用于核心区。因此本发明还提供了一种生产包含人工核心文库的方法，所述方法包含提供至少一种核酸分子模板，其中所述模板编码不同的特异性核心，通过突变生产所述模板的核酸衍生物集合，并将所述集合或其一部分提供给肽合成系统以产生所述人工核心文库。优选的结合肽文库衍生自包含来自牛(Bos Taurus)或骆驼(优选地羊驼(lama pacos)和驼羊(lama glama))的CDR3区的模板。
亲和区(AR)蛋白质-配体相互作用是生命的基本原理之一。实际上蛋白质之间，蛋白质与核酸之间，蛋白质与糖之间或蛋白质与其它类型分子之间所有蛋白质-配体介导的相互作用是通过蛋白质表面存在的界面和配体表面分子性质介导的。参与蛋白质-配体相互作用的绝大多数蛋白质表面在生物体的生命周期中始终是保守的。属于这些类别的蛋白质例如是受体蛋白、酶和结构蛋白。某一特异性配体的相互作用表面部位通常是恒定的。然而，一些类别的蛋白质可通过例如突变、重组或其它类型的自然遗传工程程序调节其暴露的表面部位的性质。这种作用的原因是其配体或配体类型可以很大程度地改变。属于这种类别的蛋白质是例如抗体、B细胞受体和T细胞受体蛋白。尽管大体上这两种类别的蛋白质之间无差别，但这两种类别的表面改变速度不同。第一类主要对进化力敏感(物种的寿命)，而第二类对突变力更敏感(在生物体的寿命期限内)。
受体与配体之间的结合特异性和亲和性是由这两种分子的暴露的界面之间的相互作用介导的。蛋白质表面是由在该部位存在的氨基酸类型而决定的。自然界常见的20种不同的氨基酸具有有其自身化学和物理性质的侧链。这是在可能与其它分子相互作用的某暴露的表面部位中所有氨基酸的累积作用。静电力，疏水性，H键，共价偶联及其它类型的性质决定了与配体结合的类型，特异性和强度。
参与蛋白质—配体相互作用的最复杂的蛋白质是那些抗体。已经进化了一种精巧的系统，其控制可编码这种蛋白质的基因内的突变，重组及其它遗传改变的位置和水平。遗传改变力(genetic changingforce)主要针对形成参与结合推定的配体的暴露的抗体表面部位的这些区域。(理论上)可以形成大量不同的抗体表明抗体的能力。例如，如果在抗体的轻链和重链中直接参与配体结合的氨基酸数目假定为每个链8个氨基酸(而且这确实不乐观)，则可以形成202*8，大约1020个不同的抗体(20种氨基酸类型，2个链，8个残基)。如果位于附近的氨基酸的间接作用包括和/或增加直接相互作用氨基酸的实际数目，则会以天文数字而告终。在选择所述配体的抗体中，地球上没有一种生物体能测试所有这些或者甚至仅仅是这些组合的一部分。
不是所有存在于暴露表面部位的氨基酸均相等地参与配体结合。一些氨基酸可以改变为其它氨基酸而不显著改变或者仅略微改变配体结合性质。另外，蛋白质的大多数表面部位是非常柔性的，并在配体表面的影响下可以易于重塑(remodel)，因此与所述配体表面相适应，这种情况在不具柔性的配体结合区不会发生。上述蛋白质与配体之间的相互作用力因此可引导(steer)或催化这种重塑。一般地，大量但有限数目的遗传改变与氨基酸中的冗余及表面的柔性性质组合结合力一起可导致有效的配体结合蛋白的产生。
在免疫选择过程中，对自然产生的抗体及其亲和区已经在某种程度上优化。这些选择基于免疫系统中这些分子的作用。在免疫系统之外的抗体应用由于免疫选择标准的性质和限制被阻碍了。因此，工业、化妆品、研究及其它应用通常需要不同性质的配体结合蛋白。其中可以应用结合分子的环境对抗体结构可能非常苛刻，例如极端的pH条件，盐条件，不寻常的温度等。根据应用，CDR可以或不可以从天然抗体中移至一个支架上。针对至少一些应用，需要与众不同的亲和区。因此，针对其它应用需要人工构建的及仔细选择的支架和亲和区。
人工支架上存在的亲和区可以得自一些来源。首先，可以使用天然亲和区。使用PCR可以分离编码抗体片段的cDNA的CDR，并将其在适当的位置插入支架。这种区域的来源可以是免疫或未免疫的动物。其次，使用简并引物可以构建完全合成的AR。再者，可以构建半合成的AR，其中只有一些区域是简并的。第四，编码选择的氨基酸(单一的或混合物)的三联体(triplet)可以以预定的方式融合在一起。第五，将天然产生的亲和区(来自免疫动物或天然的动物)在扩增过程(例如NASBA或PCR)期间通过导入突变条件(例如锰离子)或者在反应期间导入制剂(例如dITP)进行突变。
由于先前提及的原因，基于CDR的免疫可以成功，但大多数配体或配体结构域不是免疫原性的。如果不是必然的，则人工亲和区组合强力选择及优化策略越来越重要。基于引物的策略因为高水平的终止密码子，移码，难以测序，太大随机化性，相对少量的突变点(spot)(最多大约8个点)及短随机化序列段(stretch)(不超过8个氨基酸)的原因不是非常强力的。非天然衍生的AR的能力也依赖于推定正确折叠的AR的百分率，即能在支架上呈递而无AR或者甚至所述支架折叠的问题。目前几乎没有关于在AR中存在的结构和区域的任何信息可获得。因此，通过随机化构建的正确折叠及呈递的人工AR尤其是长AR的百分率，与构建的AR的长度成反比。将来很有可能获得对CDR和AR结构的认识，但现在还未获得。
用于本发明中的单支架蛋白质需要高亲和性及高特异性，一般需要至少一个长亲和区或者多个中等长度的AR以具有足够暴露的氨基酸侧链与配体相互作用。使用引物或三联体融合策略，合成构建的高度功能性长AR由于上述原因不是非常有效的。含有这种合成AR的文库功能性太低或太大而不便操作。长AR的唯一可获得来源是那些可以得自动物来源的那些(最通常是抗体重链中的CDR3s)。尤其分别是牛及骆驼的Vh链和Vhh链产生的CDR3区域是不同寻常地长。这些区域的长度平均为大约13个氨基酸，但不排除30个氨基酸或者甚至更多个氨基酸。用得自免疫的动物的这种AR构建的文库对那些具有免疫学活性的配体或配体结构域是成功的。非免疫原性配体或配体结构域及在免疫应答(毒性，自身识别等)中沉默的配体，不触发免疫系统产生配体特异性长CDR。因此，介导这种靶位结合的长CDR不能或难以通过这种方式获得，因此存在一个技术真空，即提供可用于单支架蛋白质上的具有特异性长AR的CDR。。Muyldermans阐述了一种相似的结论(Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001)277-302)，其分析了合成的AR在lama Vhh支架上的应用。
通过PCR分离CDR区域，尤其CDR3区域，使得可以使用可获得的CDR区域中存在的所有长度的变体及所有结构变体。通过核酸扩增技术例如PCR导入较小，轻度，中等水平或高水平随机突变，将产生新型亲和区。这种AR库的益处在于如此产生的区域的长度分布是保守的。同样，如果与基于随机引物的方法相比，由于相对低数目的突变很大程度上防止了终止密码子导入和移码。进一步，根据突变百分比，明显一部分或者甚至大部分产物将编码与动物中存在的其原始模板序列呈现结构信息相同或至少部分相同的肽序列。由于这些突变，大部分产物将产生改变的氨基酸序列及其因此具有新的结合性质。就原始模板而言，结合性质可以改变，不仅强度改变而且特异性和选择性也改变。如果与合成的、半合成的及天然获得的AR相比，通过这种方式可以产生长AR区域文库，其具有明显减少的上述技术或物理问题。
近年来，已经发展了一些新的及有力的体外诱变方法和制剂。诱变方法的一个分支产生不依赖于特定位置的突变(与定点诱变(sitedirected mutagenesis)方法相反)。PCR策略涵盖了例如不均衡浓度的dNTPs(Cadwell等，(1992)2；Leung等，(1989)；Kuipers，(1996))，加入dITP(Xu等，(1999)；Spee等，(1993)；Kuipers 57(1996))，加入dPTP(Zaccolo等，(1996))，加入8-oxo-dG(Zaccolo等，(1996))，加入Mn2+(Cadwell等，(1992)；Leung等(1989)；Xu等，(1999))，具有高度误掺入水平的聚合酶(Mutagene，Stratagene)。
亲和成熟在一或多个选择循环后，形成一群富集的VAP，其识别选择的配体。为获得抗所述配体的更好的、不同的或其它改变的VAP，由于其模块性质可以将VAP编码区或其一部分进行上述突变。一些策略是可能的首先，可以将完整的VAP或VAP用作模板。其次，只有一或多个亲和区可以突变。第三，构架区可以突变。第四，遍及VAP的片段可以用作模板。当然可以重复处理以改变更多的区域。突变的平均数目可以通过改变PCR条件而改变。通过这种方式每个希望的区域均可以突变及每个希望水平的突变数目均可以单独应用。在突变之后，新形成的VAP库可以再筛选及再选择以发现抗所述配体的新的及改良的VAP。所述成熟方法可以根据需要再开始及再应用多次。
这种突变程序的作用是不仅可以发现具有希望亲和性和特异性的亲和区1和2，还可以在选择的亲和区3中导入较小的改变。已经示出(REF)在这个主要配体结合区中的突变程序可明显提高配体结合性质。总而言之，在此描述的本发明在成熟阶段非常有力。
VAP的工业应用本发明的VAP可用于各种各样的应用中，从治疗至抗生素，从检测试剂至纯化组件(module)等等。在每种应用中，环境和下游应用决定了特点，即配体结合蛋白应具有例如温度稳定性，蛋白酶抗性，标签(tag)等。无论选择的支架是什么，均具其自身独特性质。一些性质对某些应用可以是有利的，而其它则是无法接受的。针对大规工业性商业应用，至关重要的是支架含有一个模块设计以能易于及快速突变、除去、插入及交换区域。模块性使其能通过标准化程序使需要的性质优化，及允许结构域交换程序，例如交换预制的盒。由于最佳模块支架基因应符合一些特点，因此将其设计及合成构建，而自然提取的基因含有这种特点是极不可能的。
除了模块性之外，在支架基因或蛋白质中应存在或不存在一些其它性质。基于天然蛋白质中存在的构架的所有支架系统也继承了其天然性质。这些性质已经通过进化动力而优化，以用于这一特异性蛋白质所作用的系统。特异性性质涵盖了例如密码子选择，密码子频率，表达水平，折叠模式及半胱氨酸桥(cystein bridge)形成。然而，这类蛋白质的工业上的商业生产需要优化的表达、翻译和折叠以获得经济利益。不仅遗传信息应该是适合于该生产生物并为其所接受，而且蛋白质性质也应该对其应用类型而言是最佳化的。这类性质可以是热敏感性、pH敏感性、盐浓度敏感性、蛋白酶解敏感性、稳定性、纯化可能性等等。因此，为了在亲和方法中有实用性，仅仅特异性结合活性是不够的。特异性结合制剂必须也能够与一固相连接，所述固相例如柱中的载体材料，一种不可溶的珠，一种塑料、金属或纸表面或任何其它有用的表面。理想地，这种连接通过对特异性结合活性不具有任何不利作用而实现。因此这种连接优选地用VAP分子中与所述特异性亲和性区域相对较远的区域而实现。
本发明的一个重要实施方案是亲和性吸收材料，其包含固定在多孔性硅等材料上的一种特异性结合物(binding agent)，所述特异性结合物包含所选择的VAP分子。
本发明的一个特别重要的实施方案是亲和性吸收材料，其包含固定在多孔性载体材料如硅或惰性、刚性聚合物等上的一种特异性结合物，该多孔性载体材料具有至少30但不超过1000的孔径，其中所述特异性结合物包含一系列所选择的VAP分子。优选地所述载体的孔径为至少60。优选地所述孔径不超过500，更优选地不超过300。蛋白质与支持物的偶联广泛用于研究和工业中(Narayanan andCrane，bas(1990)。作为VAP的支持物或载体材料的聚合物包括但非限于尼龙、烯类聚合物、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙酸乙烯酯、聚四氟乙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、纤维素、壳多糖、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、蛋白质。活性的(即为蛋白质偶联准备的)支持材料是可商购的或者可以由本领域技术人员化学激活。
载体介质如硅或惰性聚合物的孔大小可以使用例如标准大小排阻技术或其它公布的方法测定。所述孔径大小通常是指孔平均直径，其以孔体积与表面积的函数表示，通过Wheeler等式(MPD＝(40,000×孔体积)/表面积而计算。所述孔体积和表面积可以通过标准氮吸收方法测定。
以使VAP呈递给而且也包括终产物的方式应用VAP的产物范围非常广泛。但在VAP是固定的及优选地可以再生以再循环应用的方法中，充分利用了了VAP的主要优势，即相对低成本的VAP使其特别适合大规模应用，因为需要使用大量的亲和体。以下示出了应用范围，无限制之意。用括号表示的可能应用的产物或方法实例是(1)工业化食品加工如乳清、番茄酱、柑橘等的加工，或者与大量农业原料相关的加工，如从大量农作物中提取淀粉、油和脂肪、蛋白质、纤维、糖等，所述农作物包括但非限于马铃薯、玉米、水稻、小麦、大豆、棉花、向日葵、甜菜、甘蔗、木薯、油菜。大量工业生产加工流(process stream)的其它实例在乳品相关工业中发现，例如在干酪和黄油生产期间。由于所述VAP符合现有的加工步骤，而且所述VAP由于其与支持物的不可逆固定，其不会存在于终产物中，其特别适合于农产品加工业惯用的大规模工业环境。
在更详细的实例中，干酪生产过程的中产生的乳清级分含有相对大量的具有重要生物学功能的低丰度(low-abundant)蛋白质，例如在婴儿发育期间，作为天然抗生素，食品添加剂等。
这种蛋白质例如是乳铁传递蛋白、乳过氧化物酶、溶菌酶、血管生长素、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素受体、IGF-结合蛋白、转化生长因子(TGF)、结合及可溶的TGF-受体、表皮生长因子(EGF)、EGF-受体配体、白细胞介素-1受体拮抗剂。可从乳清中回收的另一亚类有价值的化合物是存在于乳汁或初乳中的免疫调节肽。也可以选择特异性VAP以从乳清中回收激素。乳汁中存在的激素例如是促乳素、生长激素抑制素、催产素、黄体激素释放激素、甲状腺刺激激素、甲状腺素、降钙素、雌激素、孕酮。
(2)消费者可食用产品如冰淇凌，油基(oil-based)产品如油、人造黄油、调味品和蛋黄酱，其它加工的食品如汤、沙司、预制食品(pre-fabricated meals)、不含酒精的饮料、啤酒、葡萄酒等。(保存和防止食品变质，通过直接的抗生素活性或者选择性抑制酶，在加工期间保护敏感的基序免于例如以活性形式存在的影响终产物质量的酶或化合物的作用，香味和气味的控制释放，分子模拟物掩盖或增强香味或气味例如在啤酒酿造工业中掩盖或除去苦味组成，除去杀虫剂或其它污染物，在加工期间保护敏感的基序，例如优选地变性在变性处理步骤下游需要活性的酶，其与特异性VAP的结合防止酶的活性位点被变性)(3)个人卫生用品(care product)如香波、染发液、洗发液、洗衣去污剂、不同形式应用的凝胶如粉末、糊状物、片剂或液体形式等。(应用于皮肤或衣物附属品如鞋垫、卫生纸中的抑制头屑或其它皮肤相关微生物的抗微生物活性、牙膏和漱口水的抗微生物活性、提高去污剂中去污(stain-removing)酶的特异性，稳定肥皂或去污剂中不稳定的酶以提高例如温度或pH稳定性，提高染发产品的结合活性，抑制产生体味的酶活性)(4)非食品应用如打印墨水、胶水、涂料、纸张、卫生纸等(针对以别的方式难以印刷的表面的表面特异性墨水、胶水、涂料等，所述难以印刷的表面例如polyofines塑料瓶或容器或者需要高度特异性结合的表面，例如电子芯片生产中的平版印刷术，有价纸张的鉴定)(5)环境保护过程如水净化、生物除污(bioremediation)、工艺用水的净化，浓缩污染物(除去水净化厂中或者例如温室水再循环系统中微生物、病毒、有机污染物质，除去空调管道中生物学有害物质)(6)干燥或潮湿形式的动物饲料(除去、掩盖或以其它方式抑制通常在牛和鱼饲料组成中发生的抗营养因子的作用，特别是蛋白酶抑制剂或者阴性因子如肌醇六磷酸，加入VAP作为抗微生物制剂以代替目前的基于蛋白质的抗生素)。
尽管本发明的优选实施方案包括工业过程，但VAP以亲和层析方式的应用确实不限于这些应用。对于生产规模的“低容积/高价值(low volume/high value)”标准，由于针对在传统免疫应答中难以产生抗体的配体的VAP的可利用性，使得针对价格对应用而言不是特别重要的制药、诊断和研究目的的多种应用均切实可行，。同样也由于尺寸小及稳定性高可以提供“低容积/高价值”应用，因此VAP比常规抗体或其片段更好。
(7)制药学应用，其中VAP可用作治疗自身，特别当所述核心设计为类似一种天然发生的蛋白质或者为治疗而鉴别和设计了适当的亲和区和/或核心区时。
(8)诊断应用，其中VAP由于与常用的抗体或抗体片段在本质上不同的3D结构，其可以检测不同类别的分子。例如检测感染性朊蛋白，其中导致感染状态的突变掩藏在天然分子内部。常规抗体仅可以在变性情况下区别感染形式，而VAP的小的和暴露的AR能识别位于更内部的肽序列。
(9)研究应用，其中VAP与例如平板表面或组织结合以提高检测水平、将特异性化合物定位于一个固定的表面上、固定痕量分子在适当的位置等，或者其中编码特异性VAP的选择的基因以瞬时、持续或以控制方式通过在细胞环境中翻译所述基因而表达，及其中通过其定向表达而形成功能敲除的靶分子。例如，模拟一种受体配体可干扰正常信号转导途径，或者具有酶抑制剂功能的VAP可以干扰代谢途径或代谢行程。
尽管上述实例多种多样，但VAP可以应用的方式中存在共性，如以下与所述应用组合形成矩阵的那些类别所例证1.亲和层析，其中VAP固定在一个合适的支持物上，例如在层析柱中，其可呈直列式、串连或carroussel构型以充分连续运转。管子、试管、管线过滤器等也可与固定VAP排成一行。可以选择VAP固定于其上的支持物以适应在压缩稳定性、流动特性、化学惰性、温度、pH及溶剂稳定性等方面的加工需要。优选地相对不能压缩的载体，尤其是硅或刚性惰性聚合物。这些物质在用于工业规模的亲和层析中具有重要优势，因为与用于柔软载体材料如琼脂糖相比其可以充填在层析柱中并可在更高压力下运转。将结合蛋白质与这种不同的支持物偶联的方法是熟知的。在将选择的工业生产液流加入所述层析柱后，通过熟知的方法如改变pH或盐浓度，结合的配体可从固定的VAP中释放出来，之后所述VAP可再生以用于新的循环。选择的VAP的高度稳定性使其特别适于这种重复循环，因此改良了这种回收和纯化方法的成本效力。亲和层析的原理和多方适应性已经在几千种不同的应用中充分描述。
2.不溶珠是一种不同形式的亲和层析，其中VAP固定于其上的支持物不是固定位置的，而是如珠一样的，例如硅石、金属、磁性颗粒、树脂等，可以固定在工业生产液流中以结合例如流化床(fluidisedbed)或搅拌罐中的特异性配体，之后所述珠可以简便方法使用重力、磁力、过滤等方法从工业生产加工流中分离。
3.通过将所述配体与VAP交联而凝固(coagulation)靶配体，从而通过沉淀降低其溶解性并浓缩所述配体。为此，VAP应是二价的，即在所述支架每一侧必须构建至少两个AR。这两个AR可具有相同分子靶，但优选地两个不同的分子靶以提供交联或凝固作用。
4.掩盖(masking)特异性分子以在加工步骤期间保护敏感性基序，提高靶配体对于不利pH，温度或溶剂条件的稳定性，或者提高对有害或降解酶的抗性。分子掩盖的其它功能作用可以是掩盖挥发性分子以改变这种分子的感官感觉。相反，这种分子从VAP中缓慢和条件性释放可以在更下游的加工步骤中，在消耗或消化期间或者在将VAP-配体复合物定向于合适的位点之后进行生物医学或研究性应用期间看到。使用具有特异性受体结合能力的VAP的挥发性化合物的分子模拟物也可以用于掩盖消费品发出的气味。
5.用VAP包被不可溶的材料以提供高特异性表面亲和性或者将VAP或潜在的融合产物(即与所述VAP化学结合的产物，或者在蛋白质的情况中与所述VAP一起翻译的产物，在这种方式中VAP的特异性保持不变)与特异性表面结合。VAP的这种应用例如是将特异性分子固定在例如平板等上的组织以提高检测水平，将特异性化合物固定在一个固定的表面上，将痕量分子固定在一定位置等。
当然不是所有的天然支架从商业和/或工业的观点看均是令人感兴趣的。例如整个蛋白质的稳定性和敏感性应符合所提出的应用的需要。酸性环境中的配体结合蛋白在高盐或高温环境中不适用。设计一个支架具有所有支架功能特征是不可能的。例如有些应用需要蛋白酶解不敏感的支架，而其它应用需要支架中特异性蛋白酶裂解位点。针对这些及许多其它应用，不可能设计一个符合所有需要的支架。因此我们设计了不同的支架，使这些支架适合不同的需要。如本发明所示，我们能设计和构建具有如热稳定性、广泛pH抗性及甚至在高盐浓度中具有配体结合特性的支架。另外，我们能使所述支架具有所需要的特性而不改变配体特异性，这通过改变核心中的氨基酸或朝向内部或外部导向的氨基酸进行，例如导入或除去一个半胱氨酸桥或者除去一个潜在的N-糖基化位点。关于这方面，可以设计和构建可用于多种配体结合环境而不改变配体结合结构域的性质和空间位置的支架。使用上述MAST技术选择的亲和区可以从一个支架交换至另一个支架而不丧失其配体特异性，意味着仅通过改变支架就可以将一次选择的亲和性用于一些不同应用中。
本发明进一步提供了一种蛋白质分子，其生产和应用方法，其中所述蛋白质分子包含表2、3、10、13或16所示的一种分子。
实施例实施例1确定核心坐标(coordinates)免疫球蛋白样(Ig-样)折叠在自然界非常普遍。许多蛋白质尤其动物界蛋白质中，属于这一类的蛋白质具有一个折叠区域。回顾含有Ig样折叠的蛋白质的功能以及回顾这种Ig样折叠在该特异性蛋白质中的功能，明显表明即便不是所有也是大多数这些结构域参与配体结合。含有Ig样折叠的蛋白质的一些实例是V-CAM、免疫球蛋白重链可变结构域、免疫球蛋白轻链可变结构域、免疫球蛋白的恒定区、T细胞受体、纤连蛋白、呼肠孤病毒外壳蛋白、β-半乳糖苷酶、整合素、EPO-受体、CD58、核酮糖羧化酶、desulphoferrodoxine、过氧化物，生物素脱羧酶及P53核心DNA结合蛋白。大多数Ig样折叠的分类可以得自SCOP数据库(Murzin A.G等，1995；http//scop.mrc-lmb.camac.uk/scop)及得自CATH(Orengo等，1997；http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath_new/index.html)。SCOP将这些折叠分类为全部是β蛋白，在2个折叠中具有一个含有7个链的免疫球蛋白样β夹层，尽管含有所述折叠的一些成员具有额外的链。CATH将这些折叠分类为主要是β蛋白，一个在免疫球蛋白样折叠中具有如夹层的一个结构，指定代码为2.60.40。在结构数据库如CE(Shindyalov等1998；http//cl.sdsc.edu/ce.htm)、VAST(Gibrat等，1996；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml)和FSSP(Holm等，1998；http//www.ebi.ac.uk/dali/fssp)中，使用了相似的分类方法。
使用软件Cn3D(NCBI；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml)，InsightII(MSI；http//www.accelrys.com/insight)及其它结构查看程序获得的对来自不同蛋白质的这些折叠的投影示出Ig样折叠具有不同的亚结构域。所述结构的示意投影示于图3A。在所述折叠的中心观测到最保守的结构，称为核心。所述核心结构长度几乎不变化，具有一个相对保守的空间制约，但发现其在序列和氨基酸组成方面变化程度较大。在所述核心的两侧，存在极端可变的亚结构域，其称为连接环。这些连接环可以在氨基酸含量、序列、长度和构型方面变化。所述核心结构因此认为是这些蛋白质中最重要的结构域。形成核心的β元件数可在7和9之间变化，尽管6链核心结构也可能是重要的。所述β元件均排列在两个β折叠中。每个β折叠均由反平行方向的β元件构成。观测到的一个β折叠中β元件的最小数目是3个元件。观测到的一个β折叠中β元件的最大数目是5个元件。较多数目的β元件也是可能的。连接环连接所述桶一侧上的β元件。一些连接穿经所述β折叠，而其它连接位于一个β折叠内的β元件。尤其称为L2、L4、L6和L8的环实际上用于配体结合。L1、L3、L5和L7环的长度、结构、序列和氨基酸组成的高度变化性明显表明这些环也可以用于配体结合，至少是在人工形式中。
形成真正核心的β元件中的氨基酸侧链朝向核心内部投影，因此充填核心中心内的空间，可以通过H-键、共价键(半胱氨酸桥)及其它力量而彼此相互作用以稳定所述支架。由于发现位于内部的β元件部分的残基的氨基酸组成和序列极端可变，因此推断也可以产生许多其它形式。
为获得作为设计含有这种Ig样折叠的新型蛋白质起始点的结构基本理念，使用含有Ig样折叠的结构域投影。使用InsightII、Cn3D和modeller程序确定最小元件和长度。另外，由于确定氨基酸相同性无任何重要性，只有所述结构的C-α原子投影，因为这些描述了折叠的最小特征。允许这些β元件的空间位置(坐标)略有不同。确定含有9个β元件的这种结构的四个实例，转变为PDB形式(坐标描述；见表1)，但结构内的许多微小差别也假定是重要的，只要所述折叠符合关于Ig样折叠的描述(见例如CATH和SCOP)。
使用代表Ig样折叠核心的C-α原子的坐标的这些PDB文件揭示含有9，8，7和6个β元件的新结构。针对8链结构，β元件1或9可以缺失，也可以缺失元件4或5。针对7链结构，除去β元件1和9，或者优选地缺失元件4和5。由于空间制约，优选地除去元件4和5(图3B)。6链结构优选地缺失元件1、4和5或者4、5和9，但使用Insight和modeller分析的其它形式示出针对工程目的也是足够可靠的(图3C)。
实施例2设计9链折叠蛋白质折叠依赖于氨基酸主链原子与氨基酸侧链中存在的原子之间的相互作用。β折叠依赖于两种类型相互作用，而例如上述结构中两个β折叠之间的相互作用主要由对立残基(opposing residue)的氨基酸侧链的相互作用而介导。氨基酸侧链的空间制约、物理和化学性质限制了特殊结构和折叠的可能性及因此可在折叠或结构中某一位置可使用的氨基酸类型。为获得符合空间制约的氨基酸序列及与上述结构的3D结构适合的性质(实施例1)，使用3D分析软件(Modeller、Prosa、InsigthII、What if和Procheck)。目前计算机的计算能力及有限的模型精确性和算法可靠性限制了可计算及评价的残基和推定结构数。
为获得可形成上述9β链折叠的氨基酸序列，需要不同水平的测试，从例如PDB文件1所述C-α主链痕迹开始。首先需要设计和测试折叠的内部。其次，需要附着和计算β元件连接环。第三，需要装配外部氨基酸即其氨基酸侧链暴露于环境中的氨基酸而不干扰获得的推定折叠。另外，外部氨基酸侧链应优选地产生一种可溶产物。在第四及最后阶段，重新计算全部模型发现偶然导入的空间抵触(spatialconflict)。导致不相容的氨基酸残基由呈现更适当及可靠适应性的氨基酸置换。在第一阶段，在符合上述标准及也如实施例1所示的排列于正确折叠的双β折叠结构内部的氨基酸序列通过在例如VAST中提交结构排列对比的PDB文件而获得(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml)。服从如PDB文件1中所述的PDB文件已经产生了上千个采样数(hit)。大多数这些蛋白质是含有至少一个结构域的蛋白质，所述结构域根据SCOP或者CATH被分类(见上述)为折叠。
排列在提交结构内部的一些独特序列用于产生产物实例。根据采样数的分类、均方根偏差(rootmean square deviation)(RMSD-值)、VAST-score值(较高数值代表更精确符合)、序列相同性、物种起源及提出的生物学功能的标准，从这个结构排列对比实验中选择感兴趣的序列。结构如类纤连蛋白蛋白质，抗体相关的蛋白质，细胞粘着分子，病毒核心蛋白及其它蛋白质等。由C-α主链代表的结构称为核心结构。
在第二阶段，将环附着于获得的产物。尽管可以应用一些分析方法分辨终产物的结构，但最具挑战性的特点是在核心序列上呈递具有完整的功能配体结合性质的亲和区。为测试终产物的功能性，识别已知配体的亲和环可以移植在核心结构上。因为充分论证了抗鸡溶菌酶(结构已知为1MEL)，而且充分描述了这些亲和区的特点(在抗体称为CDR′s)，因此将这些环插入通过第一阶段所述方法获得的核心结构上的正确位置。正确位置通过结构对比确定，即通过已经获得的折叠与描述1MEL的3D结构的文件(例如PDB文件)的重叠投影而确定。对从IBZQ(PDB)描述的结构中提取的牛RNase A结合亲和区进行相似投影及随后的环移植。移植的亲和环将β元件的一个末端与另一个末端相连接。亲和区1将β元件2与3连接(L2)，AR2将β元件4与5连接(L4)，AR3将β元件6与7连接(L6)及AR4将β元件8与9连接(L8)。每个β元件的其它末端通过环连接，所述环分别连接1与2(L1)，3与4(L3)，5与6(L5)及7与8(L7)(见图3A示意投影)。当然所有种类的环均可用于连接β元件。环序列及环长度的来源包括例如通过环建模(软件)获得的环及得自例如SCOP和CATH的指定类别中描述的天然发生的环的可利用数据。代表环1(L1)、3(L3)、5(L5)和7(L7；图3A)环的C-α主链选自结构例如1NEU、1EPF-B、1QHP-A、1CWV-A、1EJ6-A、1E50-C、1MEL、1BZQ和1F2X，但已经使用许多具有相似结果的其它结构。如上述在第一阶段获得的核心结构的3D-对比，与得自结构1EPF、1NEU、1CWV、1F2X、1QHP、1E50和1EJ6的PDB文件中存在的结构信息的环位置，使用强大的计算机及Cn3D、modeller和/或Insight软件体现。将相应环插入第一阶段模型中的正确位置。环不是必须精确符合核心，因为可以存在一定程度的能量和/或空间自由度。实际中形成环的氨基酸种类及这些氨基酸在所述环内的位置决定了环的能量自由度。不同来源的环可用于改组(shuffle)环区域。这个特征使得在将来的蛋白质中存在新的特征，因为不同的环具有不同的性质，如物理、化学、表达、翻译后修饰等等。类似地，由于β元件数降低所致的含有较少环的结构可以被转变成具有9个β元件和相适应数目的环的蛋白质。本文中证明了7链蛋白质例如1EPF、1QHP、1E50和1CWV的环的C-α痕量(trace)主链可以用作9链核心模板的模板。在此情况中额外的环(L3)可以从9链模板1F2X中挽回，但也可以使用根据评估分析确认可靠的任何其它环。指向蛋白质结构内部的氨基酸侧链的性质是受限的，因此通过空间制约而确定。因此，根据使用模拟软件的3D结构投影可能获得几种有限的构型。
在第三阶段，针对每个位置逐一计算暴露于外部的氨基酸侧链即从所述结构伸出至环境中的侧链的所有可能的特性。对于大多数应用优选地使用可溶性非常好的蛋白质，因此选择非疏水性氨基酸。这种氨基酸例如是D、E、N、Q、R、S和T。优选地，甲硫氨酸被缺失，因为编码甲硫氨酸的密码子(ATG)可以由于异常的翻译起始而产生另外的蛋白质产物。另外，半胱氨酸残基也被缺失，因为游离半胱氨酸可以导致半胱氨酸-半胱氨酸键。因此，游离半胱氨酸可以导致非所希望的含有游离半胱氨酸的共价蛋白质-蛋白质相互作用。可以在具有极端空间制约的位置导入甘氨酸残基。这些残基不具有侧链，因此在活性上或多或少是中性的。然而，甘氨酸残基的极端柔性及缺乏相互作用性的侧链可导致不稳定，因此甘氨酸残基不常用。
在第四阶段，使用modeller软件评价所述模型。Modeller编程为当合适时接受半胱氨酸-半胱氨酸桥。然后将所有预测的蛋白质结构用ProsaII(http//www.came.sbg.ac.at/Services/prosa.html)，Procheck和What if(http//www.cmbi.kun.nl/What if)评估。假定ProsaII zp-comb值低于-4.71表示蛋白质序列在体内可能会折叠成所希望的β基序。表1所示7个蛋白质序列代表符合上述所有标准的一系列解决方案。
Procheck和What if评价还表示这些序列可以适合所述模型，因此是可靠的(例如pG值大于0.80；Sanchez等，1998)。
实施例3装配合成的支架基于其推测的三维结构设计合成的VAP。使用肠道细菌基因表达优选的密码子(Informax Vector Nti)，将氨基酸序列(表3)反向翻译为DNA序列(表4)。检测所得DNA序列可能干扰随后克隆步骤的非希望的限制位点。这种位点通过改变DNA序列而不改变氨基酸密码子而除去。然后将所述DNA序列在5’末端产生一个Ndel位点以导入ATG起始密码子及在3’末端产生一个SfiI位点，这两个位点均是单向克隆所需要的。PCR装配由4个步骤组成寡引物设计(操纵子顺序)、基因装配、基因扩增及克隆。如下方法装配所述支架首先将DNA序列的正链和负链均分成大约35bp的寡核苷酸引物，以此方式设计编码相反链的寡核苷酸引物对，其具有大约16-17个碱基的互补重叠。其次，将每个合成支架的所有寡核苷酸引物均以等摩尔数量混合，将100pmol这种引物混合物用于PCR装配反应中，使用1单位Taq聚合酶(Roche)、1×PCR缓冲液+MgCl2(Roche)和0.1mM dNTP(Roche)，终体积为50μl，共进行35次循环30秒92℃、30秒50℃及30秒72℃。第三，将5μl PCR装配产物用于标准PCR扩增反应中，使用合成支架的两种外侧引物、1单位Taq聚合酶、1×PCR缓冲液+MgCl2及0.1mM dNTP，终体积为50μl，进行25次循环30秒92℃、30秒℃55℃、1分钟72℃。第四，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，将正确大小的PCR产物用NdeI和SfiI消化并连接入用NdeI和SfiI线性化的载体pCM126中。将连接产物转化入TOP10感受态细胞中(InVitrogen)，所述细胞在37℃在含有100mg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2×TY平板上生长过夜。单一集落在含有100μg氨苄青霉素的液相培养基中生长，分离质粒DNA并用于序列分析。
实施例4构建表达载体CM126基于pET-12a(Novagen)构建有效表达蛋白质的载体(CM126；见图4A)。插入一个虚拟(dummy)的VAP，iMab100，其包含常规的限制位点、接头(linker)、VSV-标签、6×His-标签及终止密码子(见表4，3)。结果pET-12a中缺失信号肽OmpT。经PCR扩增iMab100，使用含有5′Ndel突出端序列的正向引物129(见表5)及含有所有接头和标签序列及一个BamHI突出端序列的一种非常长的反向寡核苷酸引物306(见表5)。在扩增后，将PCR产物和pET-12a用NdeI和BamHI消化。在经凝胶纯化后，将产物通过Qiagen凝胶洗脱系统根据厂商指导纯化。连接所述载体与PCR片段，通过电穿孔转化入大肠杆菌TOP10细胞中。选择正确的克隆，通过测序核实其序列。包含所述虚拟VAP的该载体作为其它VAP表达分析的基本载体。通过用引物129和51(见表5)扩增，用NdeI和SfiI消化及连接入NdeI和SfiI消化的CM126中而插入其它VAP。
实施例5表达iMab100大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)用表达载体CM 126-iMab100转化。将细胞在含有补加了氨苄青霉素(200mg/ml)的50ml2×TY培养基(16g/l胰化蛋白胨、10g/l酵母提取物，5g/l NaCl(Merck))的250ml摇瓶中，在30℃搅动生长。加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)，以当OD(600nm)达到1时引发蛋白质表达。在加入IPTG后4小时收获细胞，离心(4000g，15分钟，40℃)并将沉淀在-20℃贮存直至使用。
蛋白质表达通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。图X泳道2示出大肠杆菌BL21(CM126-iMab100)表达iMab100。
实施例6经加热从包涵体中纯化iMab100蛋白如实施例5所述，iMab100在大肠杆菌BL21中表达(CM126-iMab100)。大多数表达的iMab100沉积在包涵体中。这在图5泳道3中证实，其表示了大肠杆菌BL21(CM126)在裂解后(弗氏细胞压碎器，french press)及随后离心(12000g，15分钟)后的可溶蛋白质。如下纯化包涵体。将细胞沉淀(来自50ml培养物)再悬浮于5ml PBS pH8中直至20g cdw/l，通过流经2次冷的弗氏细胞压碎器(Sim-Aminco)而裂解。通过离心(12000g，15分钟)收集包涵体并再悬浮于含有1％Tween-20(ICN)的PBS中，以溶解及除去膜结合的蛋白质。在离心(12000g，15分钟)后，将沉淀(含有包涵体)用PBS洗涤2次。分离的包涵体再悬浮于PBS pH 8+1％ Tween-20中，在60℃孵育10分钟。由此导致iMab100几乎完全溶解，如图5所示。泳道1表示分离的iMab100包涵体。泳道2表示将分离的包涵体在60℃在PBS pH8+1％Tween-20中孵育10分钟后溶解的iMab100。将上清加样于镍-氨三乙酸(Ni-NTA)超流层析柱(superflow column)上，根据Qiagen(TheQIAexpressionistTM，fifth edition，2001)所述标准方法纯化。由此纯化的iMab100与鸡溶菌酶的结合通过ELISA分析(根据实施例8所述分析)，概括示于表6。
实施例7使用尿素及有助于再折叠的基质从包涵体中纯化iMab100蛋白。
或者，使用8m尿素从包涵体中溶解iMab100，通过有助于再折叠的基质纯化为活性形式。如实施例6所述制备包涵体，溶解于1mlPBS pH8+8m尿素中。溶解的蛋白质通过离心(12000g，30分钟)从不可溶的物质中澄清，随后加样于用PBS pH8+8M尿素平衡的Ni-NTA超流动层析柱(Qiagen)中。通过用4倍体积PBS pH6.2+8M尿素洗涤该层析柱释放一种特异性蛋白质。结合的His-标签的iMab100通过在室温逐步降低于PBS pH8中尿素浓度而在所述层析柱上再折叠。将所述层析柱用2倍体积的PBS+4M尿素洗涤，随后用2倍体积的PBS+2M尿素、2倍体积的PBS+1M尿素及2倍体积的无尿素的PBS洗涤。iMab100用含有250mM咪唑的PBS pH8洗脱。释放的iMab100用PBS pH8(4℃)透析过夜，冻干浓缩及确定结合性质及进行结构测定。
纯化的iMab100级分通过SDS-PAGE分析，如图6泳道13所示。
实施例8iMab100蛋白与鸡溶菌酶的特异性结合(ELISA)iMab蛋白与靶分子的结合使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测。用希望的抗原(如鸡溶菌酶)包被微滴定平板(Nunc)的孔，及用合适的封闭剂如3％脱脂奶粉溶液(ELK)封闭而进行ELISA。将源自一个单一集落的纯化的iMab蛋白或者纯化的噬菌体(108-109)加入每个孔中，在室温孵育1小时。使用平板洗涤仪(Bio-Tek Instruments)将平板用含有0.1％Tween-20的PBS彻底洗涤。结合的iMab蛋白或噬菌体通过标准ELISA方法分别使用抗-VSV-hrp缀合物(Roche)或抗-M13-hrp缀合物(Pharmacia)检测。使用Turbo-TMB(3，3′，5，5′-四甲联苯胺，Pierce)作为底物进行比色分析。
如下分析iMab100与鸡溶菌酶的结合。将100μl纯化的iMab100(～50μg)加入用ELK(对照组)或溶菌酶(+ELK作为封闭剂)包被的一个微滴定平板孔中，在一个台式摇动器上(300rpm)在室温孵育1小时。将该微滴定平板用PBS(3次)、PBS+0.1％Tween-20(3次)及PBS(3次)彻底洗涤。结合的iMab100通过将所述孔与含有抗VSV-HRP缀合物(Roche)的100μl ELK在室温孵育1小时而检测。
在用PBS(3次)、PBS+0.1％Tween-20(3次)和PBS(3次)彻底洗涤后，将所述孔与100μl Turbo-TMB孵育5分钟。
用100μl 2M H2SO4终止反应，使用微滴定平板读数器(Biorad)读数在450nm的吸光度。
如实施例6和实施例7所述制备的纯化iMab100呈现与鸡溶菌酶强力及特异性的结合，如表6所示。
实施例9大小排阻层析如实施例7所述纯化iMab100。
使用具有40％乙腈、60％milliQ和0.1％TFA作为流动相的Shodex 803层析柱分析纯化的iMab100的分子量分布。在14.7分钟的存留时间洗脱的90％蛋白质相应于分子量为21.5kD。这与用计算机计算的分子量(19.5kD)非常吻合，表明大多数蛋白质以单体形式存在。
实施例10在95℃随着时间推移iMab100的稳定性在95℃通过ELISA确定iMab100的稳定性。将10μg/ml iMab100加热至95℃持续10分钟-2.5小时，未加热的iMab用作输入对照。
在加热后，将样品置于20℃并加以保持直至进行分析。
这些样品与溶菌酶的结合通过ELISA使用于PBS中1∶2000稀释的抗-VSV-hrp(Roche)测试。TMB-ultra(Pierce)用作hrp酶水平的底物(图7)。iMab100在高温非常稳定。检测到活性略微降低。
实施例11在20℃随着时间推移iMab100的稳定性在20℃在50天时间内测定iMab100的稳定性。将iMab100(0.1mg/ml)在20℃下放置。每7天取样品并将每个样品均在-20℃贮存至少2小时以防止破坏及冷冻所述实验条件。将样品在PBS中稀释200倍。这些样品与溶菌酶的结合通过ELISA使用于PBS中1∶2000稀释的抗-VSV-hrp(Roche)测试。TMB-ultra(Pierce)用作hrp酶水平的底物(图8)。iMab100在室温非常稳定。iMab100的活性随着时间的推移几乎不降低，因此可以推断所述iMab支架及其亲和区是非常稳定的。
实施例12通过凝胶测试确定iMab100大小，对pH4.8环境的抗性及将纯化的iMab100(如实施例6所述)使用乙酸钾(终浓度为50mM)调节为pH4.8，导致蛋白质沉淀。通过离心(12000g，30分钟)收集沉淀，再溶解于PBS pH7.5中，随后通过0.45μm滤膜过滤以除去剩余沉淀。
在pH休克之前和之后通过SDS-PAGE，western印迹分析样品，及使用ELISA定性结合(实施例8)。
结果表明所有iMab100在pH4.8均沉淀及在再次溶解于PBS pH7.5中及过滤后也可以完全回收。ELISA测定表明沉淀及随后的再次溶解不导致活性丧失(表7)。证实VSV-标签在纯化和沉淀期间不丧失而且不形成降解产物。
实施例13支架的结构分析使用圆二色性(CD)旋光计分析iMab100的结构并与另一种结构相对比。作为参考，测定一种天然发生的含有9β链的Vhh分子Vhh10-2/271102(由Kwaaitaal，Wagening University惠赠)。这两种蛋白质均具有附于C-末端的标签。这些标签的氨基酸序列和长度相同。这两个蛋白质之间的唯一结构差别存在于相当于亲和环4(iMab100)的CDR3(Vhh)中。系统设置是灵敏性＝标准(100mdeg)、起始＝260nm、结束＝205nm、间隔＝0.1nm；延迟＝1秒、速度＝50nm/分、堆积(accumulation)＝10。
制备iMab100和Vhh10-2/271102，纯度为于PBS pH7.5中98％及OD280约为1.0。将样品加样于0.1cm石英试管中，并用计算机控制JASCO公司J-715旋光分光计软件(Spectramanager version 1.53.00，JASCO Corporation)的测定CD光谱。通过测定PBS光谱获得基线校正。获得的PBS信号从所有测定值中减去以校正溶剂和盐作用。用每个样品进行初始测定以确定最大信号。如果需要，将样品用1倍PBS稀释以优化光电倍增管信号分辨。使用于PBS中的RNase A溶液以校验所述CD设备。如果与iMab100和Vhh光谱相比，观测到的KNase A光谱完全不同。图9L代表在远UV(205-260nm)中iMab100和所述Vhh蛋白的CD光谱。大部分光谱模式是相同的。光谱差异主要在波长低于220nm时观测到。观测到的光谱差异可能由于CDR3/AR4结构不同所致。从1MEL中挽回的iMab100的AR4结构可以按随机卷曲分类。同样，iMab100中存在的AR4比Vhh蛋白的CDR3大约长10个氨基酸。
以相似方式使用CD-仪确定iMab100蛋白的温度稳定性，除了进行测定时调整温度之外。
除了在室温进行测定，还在20、50、80(未示出)和95℃分析折叠和再折叠情况。首先在20℃测定于PBS中稀释的iMab100蛋白的新鲜溶液。然后，确定温度增加情况下的光谱，最后再次测定在20℃的光谱。用PBS的光谱作为基线校正(图9A)。结果清晰示出随着温度提高椭圆率也逐渐提高。在加热之后再次出现20℃的光谱明显表明所述支架完全再折叠。这个结论随后通过ELISA检测样品的溶菌酶结合能力也得以证实(数据未示出)。
实施例14大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)用均含有9个β链的iMab1302，iMab1602，iMab1202和iMab122的多种VAP插入体的表达载体CM126转化。生长和表达类似于实施例5所述。
所有9链iMab蛋白均与实施例7所述相似，通过有助于再折叠的基质进行纯化。iMab1302，iMab1602，iMab1202和iMab122的纯化级分通过SDS-PAGE分析，分别如图10泳道10，9，8和7所示。
实施例15多种9链iMab蛋白与鸡溶菌酶的特异性结合(ELISA)与实施例8所述相似，分析纯化的iMab1302(～50ng)，iMab1602(～50ng)，iMab1202(～50ng)和iMab122(～50ng)与ELK(对照)或溶菌酶(+ELK作为封闭剂)的结合。ELISA证实纯化的iMab1302，iMab1602，iMab1202和iMab122与鸡溶菌酶的特异性结合，如表6所示。
实施例16多种9链iMab的CD光谱如实施例14所述纯化iMab100，iMab1202，iMab1302和iMab1602及如实施例13所述分析CD光谱。在20℃、95℃及再次在20℃测定iMab1202，iMab1302和iMab1602的光谱以测试支架稳定性和再折叠特性。相应光谱分别示于图9D，9E和9F。在20℃测定的光谱与在20℃测定的iMab100的光谱相对比以确定二级结构的相似程度(见图9J)。可以推断所有不同的9链支架性质相同。这表明这些支架的基本结构相同。在连续20-95-20℃处理之后获得的数据清晰示出所有支架均重现其原始构象。
实施例17设计7链Ig样-折叠如实施例2所述的方法用于发展含有Ig样折叠的序列，所述Ig样折叠由核心中7个β元件和3+3个连接环组成。所述方法与实施例2所述方法相同，包括4个阶段，由其指导新序列的开发。第一阶段，使在PDB表1中表明的9链核心结构的C-α原子的坐标相适应。代表β元件4和5的C-α原子从PDB文件中去除，产生一个7链的核心实例(PDB表8)。如实施例2所详述获得在β折叠内部排列的氨基酸侧链并插入。在第二阶段，加入连接环。在一个位点上，通过亲和区将β元件与另一个β元件连接，所述亲和区从得自结构1MEL或1BZQ的牛RNase A结合区(L2，L6和L8)的抗鸡溶菌酶结合区中挽回。在所述结构的其它末端，β元件与得自一些不同来源(1E50，1CWV，1QHP，1NEU，1EPF，1F2x或1EJ6)的C-α主链痕迹环连接。附着并使所述环适合的方法如实施例2所详述。在第三阶段，如实施例2所述确定决定蛋白质溶解性的位于核心和环L1，L3，L7的氨基酸侧链。在最后阶段，使用Insight建立模型。Insight以当合适时接受半胱氨酸-半胱氨酸桥形式编程。然后用ProsaII，Procheck和WHATIF评价用Insigth建立的所有预测的蛋白质结构。假定ProsaII zp-combscore小于-4.71表示可以在体内折叠为希望的Ig样β基序折叠的蛋白质序列(表9)。表10所示的众多序列代表表现可靠的一个集合。Procheck和What if评价还表明这些序列可以符合所述模型及因此是可靠的(例如pG值大于0.80；Sanchez等，1998)。
实施例18大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)用均含有7个β链的iMab1300，iMab1200，iMab101和iMab900的多种VAP插入体的表达载体CM126转化。生长和表达类似于实施例5所述。
所有7链iMabs均类似如实施例7所述，通过有助于再折叠的基质纯化。iMab101，iMab1300，iMab1200和iMab900的纯化级分通过SDS-PAGE分析，分别如图10的泳道2，3，5和6所示。
实施例19如实施例8所述相似地分析纯化的iMab1300(～50ng)，iMab1200(～5ng)，iMab101(～20ng)和iMab900(～10ng)与ELK(对照)或溶菌酶(+ELK作为封闭剂)的结合。ELISA证实纯化的iMab1300，iMab1200，iMab101和iMab900与鸡溶菌酶的特异性结合，如表6所示。
实施例20多种7链iMab蛋白的CD光谱iMab1200和iMab101如实施例18所述纯化并如实施例13所述分析CD光谱。在20℃、95℃及再次在20℃测定iMab1200和iMab101的光谱，以测试支架稳定性和再折叠特性。相应的光谱分别示于图9H和9G。相互对比在20℃测定的iMab1200和iMab101光谱以确定二级结构的相似程度(见图9K)。可以推断不同的7链支架性质相同。这表明这些支架的基本结构相同。进而，由于从9链支架获得的信号(实施例16)与所述7链支架观测到的信号相似，因此还可推断这两种类型的支架具有相似构象。在连续20-95-20℃处理后获得的数据清晰示出所有支架均在其原始构象中。
实施例21设计6链Ig-样折叠如实施例2和3所述方法用于发展含有Ig样折叠的序列，所述Ig样折叠由核心中6个β元件及3+3个连接环组成。所述方法包括4个阶段，由其指导发展新序列，与实施例2和3所述方法相同。在第一阶段，使在PDB表1中表明的9链核心结构的C-α原子的坐标相适应。代表β元件1，4和5的C-α原子从PDB文件中去除，产生一个6链的核心实例(表11)。如实施例2和3所述获得在β折叠内部排列的氨基酸侧链并插入。在第二阶段，加入连接环。在一个位点上，通过亲和区将β元件与另一个β元件连接，所述亲和区从得自结构1MEL或1BZQ的牛RNase A结合区(L2，L6和L8)的抗鸡溶菌酶结合区中挽回。在所述结构的其它末端，β元件与得自一些不同来源(1E50，1CWV，1QHP，1NEU，1EPF，1F2x或1EJ6)的C-α主链痕迹环连接。附着并使所述环适合的方法如实施例2和3所述。在第三阶段，如实施例2和3所述确定决定蛋白质溶解性的位于核心和环L1，L3，L7的氨基酸侧链。在最后阶段，使用Modeller软件评价所述模型。Modeller以当合适时接受半胱氨酸-半胱氨酸桥形式编程。然后用ProsaII，Procheck和WHAT IF评价所有预测的蛋白质。确定ProsaII zp-comb score(表12)以表明产生的蛋白质序列是否可以在体内折叠为希望的Ig样β基序折叠。应用Procheck和What if评价以检测序列是否符合所述模型(表13)。
实施例22纯化6链iMab蛋白大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)用含有6个β链的iMab701的VAP插入的表达载体CM126转化。生长和表达类似于实施例5所述。
类似如实施例7所述，通过有助于再折叠的基质纯化iMab701蛋白。iMab701的纯化级分通过SDS-PAGE分析，如图6泳道4所示。
实施例236链iMab蛋白与鸡溶菌酶的特异性结合(ELISA)类似如实施例8所述，分析纯化的iMab701(～10ng)与ELK(对照)和溶菌酶(+ELK作为封闭剂)的结合。
ELISA证实纯化的iMab701与鸡溶菌酶的特异性结合，如表6所示。
实施例246链iMab蛋白的CD光谱IMab701如实施例22所述纯化并如实施例13所述分析CD光谱。在20℃、95℃及再次在20℃测定iMab701的光谱以测试支架稳定性和再折叠特性。相应的光谱示于图9I。如实施例20所述可以推断6链支架与7链支架性质相同。这表明这个支架的基本结构与含有7链的支架结构相同。进而，由于从9链支架获得的信号(实施例16)与在此所述6链支架观测到的信号相似，也可以推断这两种类型的支架具有相似构象。在连续20-95-20℃处理后获得的数据清晰表明所有支架均在其原始构象中。
实施例25设计一种最小的初级(primary)支架如实施例1所述根据需要及特点设计一种最小的支架。然而目前所述支架中只使用4和5个β元件(见图1)。在形成新支架的外套(mantle)的β元件2，3，6，7和8的5个β元件氨基酸侧链的情况中，需要调整以适应水环境。免疫球蛋白杀伤受体2dl2(VAST代码2DLI)用作对比建模模板以设计一种由5个β元件组成的新的小支架。
实施例26交换表面残基的方法赖氨酸置换赖氨酸残基含有化学活性的氨基基团，其在例如共价偶联VAP的方法中是便利的。共价偶联可用于将蛋白质固定在表面上或者将其它分子与靶位不可逆地偶联。
VAP内赖氨酸残基的空间位置决定了在固定后VAP在表面上的位置。由于VAP表面上暴露的不固定位置的赖氨酸残基可易于发生错误定位。因此针对一些VAP结构需要从某些位置除去赖氨酸残基，尤其从可引起亲和区可用性降低的那些位置中除去。
位于外表面上残基的交换策略例如是改变iMab100外表面赖氨酸残基。3D成像表明iMab100中存在的所有赖氨酸残基实际上均位于外表面上。3D建模及分析软件(InsightII)确定了这种置换的空间结果。
Modeller软件以这种方式编程，即考虑β折叠之间半胱氨酸桥形成或者在分析中忽略半胱氨酸桥。针对更多或更少的客观结果顺序，所有挽回模型均用ProsaII软件构建。ProsaII的zp-comb参数表明所述模型的可靠性。结果示出实际上所有类型的氨基酸均可以置换赖氨酸残基。然而，表面暴露的氨基酸侧链决定蛋白质的溶解性。因此只考虑溶解所述蛋白质的氨基酸并用X标示(见表14)。
iMab100的序列下划线处赖氨酸残基被交换。
NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSRGQGTDVTVSS实施例27改变外部氨基酸除去糖基化位点如果糖基化位点例如存在于推定的配体结合位点内，则N-糖基化可强烈干扰蛋白质功能。iMab100蛋白质示出在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)细胞中是糖基化的而且不能与配体结合。分析示出在AR3中有一个推定的N糖基化位点。使用模板建模策略与Modeller软件分析iMab100结构表明这个位点由于糖基化的阻碍而潜在地阻断配体结合。这个位可以通过两种方式去除，通过除去糖基化的残基或者通过改变N-糖基化识别基序进行。在此除去糖基化位点自身(..RDNAS..)。所有残基均可以用于置换该氨基酸，之后可以使用ProsaII、What if和Procheck检测各个氨基酸的可靠性。然而，一些氨基酸可导入不适宜的化学或物理性质。例如半胱氨酸可使蛋白质易于与也携带一个游离半胱氨酸基团的蛋白质形成共价二聚体。非亲水性氨基酸还可扰乱折叠过程因而被忽略。另一方面，甲硫氨酸由ATG编码，其在DNA序列中可导入异常起始位点。导入ATG序列可造成由于潜在的起始位点改变而产生改变的蛋白质产物。如果无其它合适的氨基酸，则仅评价甲硫氨酸。所有其它氨基酸残基均用ProsaII、What if和Procheck评价。用Q置换N认为可行及可靠的。
来自具有糖基化位点的iMab的蛋白质序列NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSRGQGTDVTVSS来自没有糖基化位点的iMab的蛋白质序列NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDQASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSRGQGTDVTVSS在Primus96 PCR仪(MWG)中，通过在100μl PCR反应混合物中扩增10ng的CM114-iMab100 DNA在巴斯德毕氏酵母中表达iMab100，所述PCR反应混合物包含2单位Taq聚合酶(Roche)、200μl每种dNTP(Roche)、缓冲液(Roche Taq缓冲系统)、2.5μM引物107和108，按以下程序进行25次[94℃ 20″，55℃ 25″，72℃ 30″]，用EcoRI和NotI消化并连接入EcoRI和NotI消化的pPIC9(InVitrogen)中。通过测序检测构建体，示出所有正确的iMab100序列。根据厂商方案通过电穿孔进行巴斯德毕氏酵母转化。根据厂商方案进行生长及通过甲醇诱导蛋白质表达。iMab100的表达导致产生一种蛋白质，其在SDS-PAGE上示出大小为50kD，而在大肠杆菌中表达时iMab100的大小为21kD。这种差别很可能是由于如上所述的在iMab100中存在的推定的N-糖基化位点糖基化所致。因此将这个糖基化位点通过除了使用引物136(表5)之外与实施例26所述相似方式用天冬酰胺(N)交换谷氨酰胺(Q)而除去。这样产生iMab115。iMab115在大肠杆菌中表达产生一个21kD蛋白质。ELISA实验证实这个iMab对溶菌酶的特异性。因此，iMab115中的AR正确定位，更特别地，在AR3中用谷氨酰胺置换天冬酰胺不改变AR3性质。
实施例28改变核心内部氨基酸除去半胱氨酸残基获得的在Ig样结构中折叠的序列可用于挽回相似折叠的结构但异常的氨基酸序列。氨基酸可以用其它氨基酸交换及因此与模板蛋白质相比推定地改变新蛋白质的物理和化学性质。在蛋白质结构外侧的改变是非常直接了当的。在此我们改变了核心内部排列的氨基酸。相邻氨基酸侧链的空间制约及核心结构自身的空间制约确定并限制了在这些位置可以存在的侧链类型。另外，相邻侧链的化学性质也可以影响置换结果。在一些置换研究中，可能需要置换紧密接近靶残基的另外的氨基酸以获得合适及可靠的置换。在此去除了在核心中形成半胱氨酸桥的潜力。仅除去一个半胱氨酸已经阻止了在核心中形成半胱氨酸桥的潜力。然而，也可以进行双重置换以防止在体内或体外折叠或再折叠期间游离半胱氨酸与其它游离半胱氨酸相互作用。首先，将各个半胱氨酸残基用任何其它普通的氨基酸置换(共19个)。重复两次这种方式，得到19个模型。将所有模型使用ProsaII(zp-score)，What if(2ndgeneration packing quality，主链构象)及Procheck(允许区域外的残基数)评价。获得一些可靠的模型。表15示出在96位半胱氨酸置换的zp-combined Prosa score。在体内测试用缬氨酸置换半胱氨酸之一以验证所述方法。这个克隆称为iMab116(见表3)并根据实施例3所述方法构建(表4)。将这个克隆的全部iMab序列通过以下方式移至CM126中。iMab序列，iMab116使用Cys-min iMab116作为模板及引物pr121和pr129(表5)通过PCR分离。所得PCR片段用NdeI和SfiI消化并连接入用NdeI和SfiI线性化的CM126中。选择称为CM126-iMab116的这个克隆并用于进一步测试。
实施例29纯化iMab116大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)用含有iMab116的VAP插入体的表达载体CM126转化，所述iMab116含有9个β链及潜在地缺失核心中半胱氨酸桥(如实施例27所述)。生长和表达与实施例5所述相似进行。
类似于实施例7所述，将iMab116通过有助于再折叠的基质纯化。纯化的iMab116级分通过SDS-PAGE分析，如图6泳道11所示。
实施例30iMab116与鸡溶菌酶的特异性结合(ELISA)类似于实施例8所述，分析纯化的iMab116(～50ng)与ELK(对照)和溶菌酶(+ELK作为封闭剂)的结合。
ELISA证实纯化的iMab116与鸡溶菌酶特异性结合，如表6所示。
实施例31iMab116蛋白的CD光谱iMab116如实施例28所述纯化及如实施例13所述分析CD光谱。在20℃、95℃及再次在20℃测定iMab116光谱以测试支架稳定性及再折叠特性。相应的光谱示于图9C。在20℃测定的光谱与在20℃测定的iMab100及其它9链iMab蛋白的光谱相对比，以确定二级结构的相似程度(见图9J)。由于获得的光谱与得自其它9链支架的光谱包括iMab100光谱相同，因此可推断从内部核心除去半胱氨酸残基对其自身结构无作用。
实施例32在核心中导入额外的半胱氨酸桥蛋白质结构中两个半胱氨酸残基的化学结合(半胱氨酸桥)在低于大约70℃的温度下可显著稳定蛋白质结构。高于该温度，半胱氨酸桥断裂。一些应用需要比原始蛋白质更稳定的蛋白质。如实施例1所述β链折叠核心的空间制约产生了半胱氨酸桥。这个结论基于观测到在一些具有所述折叠的天然发生的蛋白质中半胱氨酸桥存在于核心中央(例如抗体中所有重链可变区)。这种半胱氨酸C-α主链原子之间的距离最通常发现在6.3-7.4之间。通过测量而分析在核心基序中推定形成桥的新半胱氨酸残基的导入。在PDB文件中书写的蛋白质C-α原子的坐标可用于确定潜在的半胱氨酸桥。可以计算各个C-α原子及所有其它C-α原子之间的距离。通过对比建模获得的iMab100蛋白的C-α原子的位置示于图BBB3。可以使用Insight软件确定C-α原子之间的距离。然而，也可以使用确定由坐标(如在PDB坐标中所示)表示的两个位置空间距离的标准数学公式。Excel表单用于确定所有可能的距离。距离数值在6.3-7.4之间认为是推定的半胱氨酸位置。分析表明33个可能的半胱氨酸桥位于iMab100内。半胱氨酸数表明所述结构中C-α原子的位置，其可以用于插入一个半胱氨酸(表16A)。然而，不是所有空间位置均是非常有用的，一些桥可以接近已经利用的半胱氨酸桥，彼此相邻的两个半胱氨酸可能有问题，相同β链之间的两个半胱氨酸桥不是非常有益的，与位于附近的其它氨基酸侧链有空间制约。构建所有33个模型并用iMab100作为模板在modeller中分析。用ProsaII获得的评估模型的Zp-score表明大多数半胱氨酸残基是有问题的。最佳半胱氨酸位置示于表16B。基于这些半胱氨酸残基的空间位置及与其它潜在半胱氨酸桥相关的桥选择两个模型，以黑体字表示。同样，尽管zp-score极佳但因为其在折叠内的位置仍放弃一些模型，如用Insight(MSI)所示。
实施例33构建在核心中含有两个额外半胱氨酸的iMab100衍生物使用寡核苷酸介导的定点诱变方法构建一种iMab100衍生物，称为iMab111(表3)，其接受两个额外的半胱氨酸残基。CM114-iMab100与寡核苷酸pr33、pr35、pr82、pr83一起用作PCR反应的模板(见表5)。在第一次PCR反应中，引物pr82和pr83用于产生一个401bp片段。在这个PCR片段中，一个谷氨酰胺和一个甘氨酸编码残基改变为半胱氨酸编码序列。这个PCR片段在两个平行PCR反应中用作模板。在一个反应中，使用获得的PCR片段，CM114-iMab100模板和pr33，在另一个反应中，使用获得的PCR片段，CM114-iMab100模板和引物35。所述第一个反应产生一个584bp产物，而第二个反应产生一个531bp片段。将这两个PCR片段均经琼脂糖凝胶分离方法分离(Qiagen gel extraction试剂盒)。将产物等摩尔混合，用引物pr33和pr35进行的片段重叠-PCR反应产生一个714bp片段。这个PCR片段用NotI和SfiI消化。所得411bp片段通过琼脂糖凝胶分离并连接入用NotI和SfiI线性化的CM114中。测序分析证实所述产物，即iMab111(表4和3)。
实施例34表达iMab111如实施例28所述将iMab111 DNA亚克隆入CM126中。CM126-iMab111转化的BL21(DE3)细胞用IPTG诱导并如实施例7所述分离蛋白质。蛋白质提取物在15％SDS-PAGE凝胶上分析，示出强诱导21KD蛋白质。包括标签的iMab111的期望长度也为大约21kD，表明这个克隆的高水平生产。
实施例35纯化iMab111大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)用含有iMab111 VAP插入体的表达载体CM126转化，所述iMab111含有潜在具有一个额外半胱氨酸桥的9β链(如实施例32和33所述)。生长和表达如实施例5和34所述相似进行。
如实施例7所述相似地通过有助于再折叠的基质纯化iMab111。通过SDS-PAGE分析iMab111的纯化级分，如图6泳道12所示。
实施例36iMab111与鸡溶菌酶的特异性结合(ELISA)如实施例8所述相似地分析纯化的iMab111(～50ng)与ELK(对照)和溶菌酶(+ELK作为封闭剂)的结合。在ELISA分析中蛋白质提取物的100倍稀释物产生的信号比背景信号高大约20倍。ELISA结果证实纯化的iMab111与鸡溶菌酶特异性结合，如表6所示。
实施例37iMab111蛋白的CD光谱iMab111如实施例32所述纯化并如实施例13所述分析CD光谱。在20℃、95℃及再次在20℃测定iMab116的光谱以测试支架的稳定性及再折叠特性。相应的光谱示于图9C。将在20℃测定的光谱与在20℃测定的iMab100及其它9链iMab蛋白质的光谱相对比，以确定二级结构的相似程度(见图9J)。由于获得的光谱与得自其它9链支架的光谱包括iMab100光谱相同，因此可以推断所述核心中央的一个额外的半胱氨酸残基对其自身结构无作用。
实施例38改良特异性应用的支架的性质针对某些应用，支架的性质需要优化。例如热稳定性、耐酸性或蛋白酶解稳定性可以有利于或者甚至是在某些环境中所需要的以更好地发挥作用。可应用突变和再选择程序产生一种新支架，其具有相似结合性质，除了改良了性质。在这个实施例中，一种选择的结合蛋白得以改良以在蛋白酶解环境中抵抗蛋白酶解降解。新支架的蛋白酶解抗性可以通过用蛋白酶的一种混合物处理或者用特异性蛋白酶连续处理而测试。另外，可以将新支架导入将要应用的环境中测试其抗性。为获得蛋白酶解抗性支架，使用诱变方法突变编码支架的基因。然后从该突变的PCR产物中建立一个噬菌体展示文库，以便新支架在噬菌体外侧表达为与一种外壳蛋白的融合蛋白。将所述噬菌体加入一个希望的蛋白酶解活性环境中，在希望的温度持续一定时间。完整的噬菌体可用于所述标准淘选(panning)方法中。在充分洗涤后，结合的噬菌体被洗脱，感染携带F-pili的大肠杆菌细胞，并在含有适当抗生素的琼脂平板上生长过夜。重新检测各个克隆的新性质并测序。可将突变导入和选择方法重复几次或者在进一步优化循环中可以应用其它选择条件。
实施例39随机诱变支架区域退火仅3个和5个主要的希望区域(亲和区、构架、环或这些结构组合)的引物用于在存在所述dITP或dPTP情况下的扩增。这些突变的片段在第二次PCR反应中用引物扩增，所述引物与第一次PCR中使用的系列引物具有相同的序列，但还含有将所述片段再克隆入支架结构中的限制位点，在此DNA序列彼此不同及因此蛋白质序列也不同。噬菌体展示选择程序可用于挽回具有希望性质的克隆。
实施例40构建噬菌体展示载体CM114-iMab100使用pBAD(InVitrogen)的部分主链构建噬菌体展示的有效载体(CM114-iMab100，见图4B)。将所需要的pBAD载体部分使用分别含有AscI和BamHI突出端限制位点的引物4和5扩增。平行产生一个合成构建的含有表4所述序列的片段，其包括一个新启动子、优化的g3分泌前导序列、NotI位点、虚拟的插入体、Sfil位点、接头、VSV-标签、胰蛋白酶特异性蛋白酶解位点、Strep-标签II及AscI位点(见图4B)。在组合消化的片段与PCR扩增的pBAD载体片段后，ml3噬菌体g3核心蛋白的编码区使用与引物附着的AscI突出端位点扩增(表5，引物6和7)并在AscI消化后插入。含有正确序列及正确插入片段方向的载体用于进一步实验。
实施例41构建噬菌体展示载体CM114-iMab113AR4与其它亲和区(例如针对iMab100的AR1)之间的半胱氨酸桥可参与某些类型的结构和稳定性，如果没有半胱氨酸桥形成，所述结构和稳定性是不太可能的。不仅AR1可用于附着一些亲和区4中存在的半胱氨酸，而且AR2和AR3也是半胱氨酸桥形成的明显的稳定位点。由于AR2是与AR4形成半胱氨酸桥的另一个有吸引力的部位，因此构建一个与CM114-iMab100完全相同的表达载体，除了AR2中半胱氨酸密码子的位置不同及在AR1中没有该密码子之外。3D-建模分析表明AR2中半胱氨酸最合适的位置在最初确定为苏氨酸的位置(.VATIN..→.VACIN..)。分析表明除了新的半胱氨酸位置之外(..VACIN..)，AR2中就在苏氨酸残基之前的丙氨酸残基由一个丝氨酸残基(..VSCIN..)置换。根据3D建模分析，AR1中原始半胱氨酸由一个丝氨酸置换，产生了一个合适的置换体(表3)。
新确定的序列称为iMab113(表4)，根据上述基因构建方法(实施例3)构建并插入CM114中置换iMab100。
实施例42构建噬菌体展示载体CM114-iMab114AR4与其它区域之间的半胱氨酸桥不总是希望的，因为在折叠期间形组成子间半胱氨酸桥可影响表达效力及正确折叠的蛋白质的百分率。同样，在还原环境中，这种AR也变得活性降低或者甚至无活性。因此，需要无半胱氨酸桥的支架。
构建在AR1，2和3中无半胱氨酸的一种表达载体。这种载体与CM114完全相同，除了AR1中半胱氨酸(..PYCMG..)改变为丝氨酸(..PMSMG..，见表3)。新确定的序列称为iMab114(表4)，根据上述基因构建方法(实施例3)构建并插入CM114中置换iMab100。
实施例43扩增骆驼衍生的CDR3区域根据Spinelli等(Biochemistry 39(2000)1217-1222)所述标准方法分离羊驼和驼羊的血液淋巴细胞。这些细胞的RNA通过QiagenRNeasy方法根据厂商方案而分离。使用muMLv或AMV(NewEngland Biolabs)根据厂商方法产生cDNA。来自Vhh cDNA的CDR3区域使用于100μl PCR反应混合物中的1μl cDNA反应物在Primus96PCR仪(MWG)中进行扩增(见图10)，所述PCR反应混合物包含2单位Taq聚合酶(Roche)，200μM每种dNTP(Roche)，缓冲液(Roche Taq缓冲液系统)，2.5μM正向和反向引物，以下扩增程序进行35次[94℃ 20″，50℃ 25″，72℃ 30″]。在第一次PCR循环中，为选择含有至少一个半胱氨酸的CDR3区域，使用引物56(表5)作为正向引物，在选择不含有半胱氨酸的CDR区域的情况中，使用引物76(表5)。在这两种情况中，引物16(表5)均用作反向引物。产物在1％琼脂糖凝胶上分离，并分离出正确长度(～250bp)的产物及使用Qiagen gelextraction试剂盒纯化。将5μl这些产物用于与上述相似的下一个PCR循环，其中引物8(表5)和引物9(表5)用于扩增CDR3区域。产物在2％琼脂糖凝胶上分离，分离出正确长度(～80-150bp)的产物及使用Qiagen gel extraction试剂盒纯化。为使骆驼CDR3区域的环境适应支架iMab100，对5μl产物进行与第一次PCR方法相似的两次额外的PCR，除了循环次数降低为15次及其中引物73(表5)和75(表5)随后用作正向引物及引物49(表5)用作反向引物。
实施例44扩增牛衍生的CDR3区域根据Spinelli等(Biochemistry 39(2000)1217-1222)所述标准方法分离牛(Bos taurus)血液淋巴细胞。这些细胞的RNA通过QiagenRNeasy方法根据厂商方案分离。使用muMLv或AMV(New EnglandBiolabs)根据厂商方法产生cDNA。来自Vh cDNA的CDR3区域使用于100μl PCR反应混合物中的1μl cDNA反应物在Primus96 PCR仪中(MWG)扩增，所述PCR反应混合物包含2单位Taq聚合酶(Roche)，200μM每种dNTP(Roche)，缓冲液(Roche Taq缓冲液系统)，2.5μM引物299(表5)和300(表5)，进行35次以下程序[94℃ 20″，50℃25″，72℃ 30″]。将产物在2％琼脂糖凝胶上分离，分离出正确长度的产物及使用Qiagen gel extraction试剂盒纯化。观测到的PCR产物长度分布(见图11)代表牛CDR3区域的平均长度。校正引物299(21个氨基酸，表5)和300(27个氨基酸，表5)中存在的构架序列，可以推断牛CDR3的平均长度为120个碱基PCR产物平均长度减去48个构架碱基得72个碱基及因此是24个氨基酸。这个结果非常符合Spinelli等(Biochemistry 39(2000)1217-1222)观测的结果。这些CDR区因此对天然文库构建非常有用。
分离及纯化的产物可用于适应实际CDR3/AR4位置周围的序列，以通过与针对lama衍生的AR所述相似的一些PCR修饰循环而逐渐适应所述构架编码区的方式进行(见实施例43)。
实施例45通过插入扩增的CDR3区域使文库在AR4中含有环多样化(variegation)通过以下方法制备在AR4中具有多样化的核酸噬菌体展示文库。如实施例43所述获得来自用乳过氧化物酶和乳铁蛋白免疫的lama′s的扩增的CDR3区域，并用PstI和KpnI消化及用T4 DNA连接酶连接入PstI和KpnI消化的及碱性磷酸酶处理的载体CM114-iMab113或CM114-iMab114中。将含有半胱氨酸的CDR3克隆入CM114-iMab114中，而无半胱氨酸的CDR3克隆入载体CM114-iMab113中。通过使用BTX电子细胞操纵仪(electrocellmanipulator)ECM630电穿孔入大肠杆菌TG1电子感受态(electrocompetent)细胞中而构建文库。将细胞回收在SOB中并在含有4％葡萄糖，于2×TY琼脂中100μg/ml氨苄青霉素的平板上生长。在37℃培养过夜后，在2×TY培养基中收获细胞并以浓缩的分散系在-80℃贮存在50％甘油中。典型地，用1μg DNA获得5×108个转化体，一个文库含有大约109个独立克隆。
实施例46通过随机化插入CDR3区域使文库在AR4中含有多样化通过以下方法通过随机化插入CDR3区域制备在AR4中具有多样化的核酸噬菌体展示文库。如实施例28所述扩增来自未免疫的及免疫的lama′s的CDR3区域，除了在第二次PCR循环中包括如实施例35所述Spee等(1993)的dITP或者Zaccolo等(1996)的dPTP。如实施例28所述制备文库。PCR中使用dITP突变率达到2％，而使用dPTP突变率达到20％以上。
实施例47富集与靶分子结合的VAP将大约50μl所述文库原种(stock)接种于50ml 2×TY/100μg氨苄青霉素/4％葡萄糖中，并生长直至OD600达到0.5。接着加入1011VCSM13(Stratagene)辅助噬菌体。在37℃静止培养45分钟以感染。将细胞通过离心沉淀并弃去上清。将沉淀再悬浮于400ml 2×TY/100μg氨苄青霉素中，在37℃培养1小时，之后加入50μg/ml卡那霉素。将感染的培养物在200rpm摇床上在30℃生长8小时。接着，通过以5000g在4℃离心沉淀30分钟除去细菌。将上清通过0.45μmPVDF滤膜过滤。加入聚乙二醇和NaCl，流过的终浓度分别为4％和0.5M。在这种方式中，将噬菌体在冰上沉淀并通过在6000g离心而沉淀。将所述噬菌体沉淀溶解于50％甘油/50％PBS中并在-20℃贮存。
如下进行选择噬菌体展示的VAP。
将于0.1m碳酸钠缓冲液(pH9.4)中的大约1μg靶分子(抗原)在4℃在一个免疫试管(immunotube)(Nunc)或微滴定平板(Nunc)中固定过夜。在除去该溶液后，将该试管用于PBS中3％脱脂奶粉溶液(ELK)或者相似的封闭剂封闭至少2小时，在室温或在4℃过夜。在除去封闭剂后，在封闭缓冲液中加入含有大约1012-1013个集落生成单位(cfu)的噬菌粒文库溶液，所述噬菌粒文库溶液用封闭缓冲液在室温预先封闭1小时。在缓慢旋转的平台上在室温孵育1小时。然后将该试管用PBS洗涤3次，用具有0.1％Tween的PBS洗涤2次，再用PBS洗涤4次。结合的噬菌体用合适的洗脱缓冲液洗脱，所述洗脱缓冲液为于PBS中的300μl 0.1m甘氨酸pH2.2或500μl 0.1％胰蛋白酶。如果用甘氨酸洗脱，则将回收的噬菌体立即用700μl 1m Tris-HClpH8.5中和。或者，结合的噬菌体通过用含有抗原(1-10μM)的PBS孵育而洗脱。回收的噬菌体如上述扩增，应用大肠杆菌XLI-Blue(Stratagene)或Top10F′(InVitrogen)细胞作为宿主。将选择方法重复几次以浓缩阳性克隆。在最后一次循环后，挑取各个克隆并确定其结合亲和性及DNA序列。
如实施例6所述通过ELISA确定VAP的结合亲和性，作为噬菌体颗粒上的g-III融合蛋白或之后如实施例4所述作为NdeI-SfiI亚克隆入表达载体CM126中。大肠杆菌BL21(DE3)或Origami(DE3)(Novagen)如实施例5所述通过电穿孔转化，并将转化体在补加氨苄青霉素(100μg/ml)的2×TY培养基上生长。当细胞培养物达到OD600为大约1时，通过加入IPTG(0.2mM)诱导蛋白质表达。在37℃4小时后，通过离心收获细胞。如实施例5所述分离蛋白质。
实施例48富集乳铁蛋白结合VAP纯化的乳铁蛋白(LF)由DMV-Campina提供。
如实施例45所述使用AR4中具有多样化的一个噬菌体展示文库选择LF结合VAP。将(于1ml碳酸氢钠缓冲液(0.1m，pH9.4)中的10μg)LF固定于一个免疫试管中(Nunc)，随后用于PBS中的3％鸡血清封闭。如实施例32所述进行淘选。1013个噬菌体用作输入物。在第一轮淘选后，形成大约10000个集落。在第二轮淘选后，形成500-1000个集落。如实施例6所述将各个克隆生长并生产VAP，通过ELISA检测。发现富集的是具有以下AR4的克隆CAAQTGGPPAPYYCTEYGSPDSW。
实施例49富集乳过氧化物酶结合VAP纯化的乳过氧化物酶(LP)由DMV-Campina提供。
如实施例45所述AR4中具有多样化的一个噬菌体展示文库用于选择LP结合VAP。将(于1ml碳酸氢钠缓冲液(0.1m，pH9.4)中10μg)LP固定于一个免疫试管中(Nunc)，随后用于PBS中的3％鸡血清封闭。如实施例32所述进行淘选。1013个噬菌体用作输入物。在第一轮淘选后，形成大约5000个集落。在第二轮淘选后，形成500-1000个集落。如实施例6所述将各个克隆生长及生产VAP，并通过ELISA检测。对阳性克隆进行测序。发现富集的是具有以下AR4的克隆CAAVLGCGYCDYDDGDVGSWCAATENFRIAREGYEYDYWCAATSDFRIAREDYEYDYW。
实施例50RNase A结合物，构建成熟及淘选如实施例3所述合成一种合成的RNase A结合iMab，iMab130(表4，表3)，随后克隆入CM114中形成CM114-iMab130。在如实施例32中针对文库扩增程序所述条件下产生iMab130的嵌合噬菌体，作为具有g3外壳蛋白的一种融合蛋白质。用这些嵌合噬菌体针对RNaseA包被的免疫试管进行淘选(见实施例32淘选程序)，未示出RNase A特异性结合iMab130。显然无法进行RNase A结合区的功能性定位，可能由于周围氨基酸侧链的略微扭曲所致。对支架少量修饰可有助于将AR移至正确位置。为达到这个目的，将iMab130编码区使用以下方法突变将载体CM114中存在的iMab130使用dITP或dPTP在用引物120和121(表...)扩增所述支架期间突变，使用诱变浓度为1.7mM dITP或300μM，75μM或10μM dPTP。将所得PCR产物从琼脂糖凝胶中根据厂商方法通过Qiagen′s凝胶洗脱系统进行分离。分离的产物在存在100μM dNTPs(Roche)时扩增以产生dITP和dPTP游离产物。在经过Qiagen′s PCR clean up试剂盒纯化后，将这些PCR片段用NotI和Sfil(NEB)消化并连接入NotI和SfiI线性化的CM114中。将沉淀并用70％乙醇洗涤的连接产物通过电穿孔转化入TGI中，及在含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2×TY培养基中生长，随后用VCSM13辅助噬菌体(Stratagene)感染以如实施例32所述产生嵌合噬菌体。将一部分转化体铺板于含有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×TY平板上，以确定转化频率。如实施例32所述将这些噬菌体文库用于RNase A淘选实验中。将RNase A固定在免疫试管中进行淘选。在淘选后，洗脱噬菌体并用于感染TOP10 F′(InVitrogen)，在37℃在含有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素及25μg/ml四环素的2×TY平板上生长过夜。挽回集落的数目示于表17。
从用衍生自iMab130不同诱变水平的噬菌体文库淘选后获得的集落数目可以推断在具有轻度诱变水平，dITP的文库中可观测到结合物明显增加(表17)。
实施例51固定程序将1g环氧激活的琼脂糖6B(厂商Amersham Biosciences)填充在一个层析柱中并用10个床体积的偶联缓冲液(200mM磷酸钾，pH7)洗涤。将待偶联的蛋白质以1mg/ml浓度溶解在偶联缓冲液中，以0.1ml/分钟的流速流经所述层析柱。在流过20个床体积的蛋白质溶液之后，将该柱用偶联缓冲液洗涤。流过10个床体积的0.2M乙醇胺/200mM磷酸钾pH7封闭未反应的环氧基团。然后将该树脂用20个床体积的50mM磷酸钾pH7洗涤，之后备用。
实施例52通过溶菌酶固定的珠进行iMab100纯化将溶菌酶固定在Eupergit上并用于一个层析柱中，所述Eupergit是得自Rohm的一种激活的环氧树脂。将含有iMab100的一种溶液经过所述柱并测定直接旁路(direct bypass)及流经所述柱后的浓度(A280nm)。差别表示与所述柱结合的iMab100数量。结合的iMab100可以用CAPS缓冲液pH11释放。用BSA的对照实验表明iMab100与固定的溶菌酶的结合是特异性的。
实施例53通过iMab100固定的珠进行溶菌酶纯化将iMab100固定在Eupergit上并用于一个层析柱中。将一种含有溶菌酶的溶液经过该柱并测定在直接旁路及流经所述柱后的浓度(A280nm)。差别表示与所述柱结合的溶菌酶数量。结合的溶菌酶可以用CAPS缓冲液pH11释放。用BSA的对照实验表明溶菌酶与固定的iMab100的结合是特异性的。
实施例54iMab100在乳清级分中的稳定性iMab100在一些乳汁级分中的稳定性通过ELISA方法(实施例8)使用溶菌酶包被的平板测定。如果所述标签，支架区或亲和区经蛋白酶解降解，则观测到抗溶菌酶活性降低。将iMab100在一些不同溶液中稀释1×PBS作为对照，来自干酪乳清、高德干酪乳清及低巴氏灭菌的undermilk的离子交换组分，经1.4μm过滤为终浓度40μg/ml。将所有级分在8℃贮存，在0，2和5小时及在1，2，3，4，5和7天后取样品。将样品置于-20℃以防止进一步降解。如实施例8所述进行ELISA检测并示于图12。IMab100的活性模式在实验始终保持相似。因此可以推断iMab100，包括所述标签，在分析的乳汁级分中是稳定的。
附图简述表1PDB形式中9链(仅是链)实例。
表2很可能与9链iMab蛋白同样折叠的氨基酸序列实例。
表3VAP氨基酸序列。
表4iMab DNA序列。
表5使用的引物表。
表6纯化的iMab变体与溶菌酶的结合特性。分析含有6-，7-或9-β折叠的多种纯化的iMabs与ELK(对照)及溶菌酶的结合，如实施例8，15，19和23中所述。
所有iMabs均使用尿素及随后用有助于再折叠的基质纯化(实施例7)，除了iMab100之外，其额外通过热诱导的包涵体溶解而纯化(实施例6)。
表7pH休克(shock)对iMab100的作用，在通过乙酸钾pH4.8沉淀之前和之后在对溶菌酶的ELISA中测定。
表8在PDB2.0版本中7链(仅是链)折叠的四个表示空间构象的实例。
表9来自针对7链iMab蛋白的MODELLER目标功能的PROSAII结果(zp-comp)及数值。较低数值相应于更可能正确折叠的iMab蛋白。
表10不太可能与7链iMab蛋白同样折叠的氨基酸序列实例。
表11在PDB2.0版本中6链(仅是链)折叠的4个表示空间构象的实例。
表12来自针对6链iMab蛋白的MODELLER目标功能的PROSAII结果(zp-comp)及数值。较低数值相应于更可能正确折叠的iMab蛋白。
表13很可能与6链iMab蛋白同样折叠的氨基酸序列实例。
表14来自iMab100衍生物的PROSAII结果(zp-comp)，所述衍生物在3，7，19和65位的赖氨酸由所有其它可能的氨基酸残基置换。产生有及无天然半胱氨酸桥的模型。更有利的衍生物(亲水性的)用X表示。
表15来自iMab100衍生物的PROSAII结果(zp-comp)，所述衍生物在第96位的半胱氨酸由所有其它可能的氨基酸残基置换。
表16A)iMab100的氨基酸序列(参考)及可能的候选物以形成额外的半胱氨酸桥。标明了可以形成半胱氨酸桥的位置。
B)半胱氨酸桥的优选位置，具有其相应PROSAII score(zp-comp)及相应iMab名称。
表17在淘选之后dITP的突变频率对结合物数目的作用。
表18在实施例40和实施例4中使用的载体的序列。
图1支架结构域的3D-拓扑学示意图该图描述了可用于呈递抗原结合位点的蛋白质结构的8个拓扑学实例。基本核心β元件在实例A中提及。这个基本结构含有位于2个平板(plate)中的9个β元件。一个β折叠含有元件1，2，6和7，另一个含有元件3，4，5，8和9。与所述β元件连接的环也加以了描述。粗线是在顶部β元件之间的连接环，虚线表示位于底部的连接环。从虚线开始至实线结束的连接表示β元件底部和顶部之间的连接。该图中描述的β元件的数目相应于在图1和2中提及的数目和位置。
A9β元件拓扑学例如所有抗体轻链和重链可变结构域及T细胞受体可变结构域。
B8β元件拓扑学例如白细胞介素-4α受体(lIAR)。
C7aβ元件拓扑学例如免疫球蛋白杀伤受体2d12(2DLI)。
D7bβ元件拓扑学例如E-钙粘着蛋白结构域(1FF5)。
E6aβ链拓扑学。
F6bβ元件拓扑学例如Fcε受体类型α(1J88)。
G6cβ元件拓扑学例如白细胞介素-1受体类型-1(1GOY)。
H5β元件拓扑学。
图2模块亲和性及支架转移(MAST)技术。
含有本发明所述核心结构的推定的抗原结合蛋白可用于转移操作。另外，支架或核心结构的各个或多个元件或区域也可用于转移作用。所述转移操作可在结构相同的或相似的氨基酸组分不同的支架或核心之间发生。推定的亲和区可以从一个支架或核心移至另一个支架或活性，通过例如PCR，限制性消化，DNA合成或其它分子学技术进行。这种转移的结果在此以示意图形式描述。来自分子A的推定的(编码)结合区(上部，亲和区)及分子B的支架(编码)区(下部，构架区)可以通过分子方式分离。在重组这两个元件后，出现一种新的分子(杂合结构)，其具有分子A的结合性质及支架B的支架性质。
图3免疫球蛋白结构的结构域指示。
该图示出分别由9，7和6个β元件组成的蛋白质结构的拓扑学(从N末端至C末端以1-9表示)。B元件1，2，6和7及元件3，4，5，8和9形成两个β折叠。
8个环(L1-L8)负责所有β元件的连接。
环2，4，6和8位于该图的上部，这代表这些环在所述蛋白质中的物理位置。环2，4和8在轻链和抗体可变结构域中的功能是结合抗原，已知是CDR区。L6的位置(也用图案标记)也允许抗原结合活性，但未指明为结合区。
L2，L4，L6，L8分别确定为亲和区1(AR1)，AR2，AR3和AR4。环1，3，5和7位于蛋白质的相对位置。
图4A)载体CM126的示意图B)载体CM126的示意图。
图5加热(60℃)溶解iMab100的包涵体。
泳道分子量标记(1)，分离的iMab100包涵体(2)，包涵体在PBS pH8+1％Tween-20中在60℃孵育10分钟基础上的溶解的iMab100。
图6含有6，7或9个β折叠的纯化的iMab变体。
泳道分子量标记(1)，iMab1300(2)，iMab1200(3)，iMab701(4)，iMab101(5)，iMab900(6)，iMab122(7)，iMab1202(8)，iMab1602(9)，iMab1302(10)，iMab116(11)，iMab111(12)，iMab100(13)。
图7iMab100在95℃的稳定性。
分析在95℃孵育多种时间的纯化的iMab100与ELK(方形所示)或溶菌酶(圆形所示)的结合。
图8iMab100在20℃的稳定性。
分析在20℃孵育多种时间的纯化的iMab100与ELK(方形所示)或鸡溶菌酶(圆形所示)的结合。
图9A-LAiMab100在20℃，95℃及再次在20℃的远UV CD光谱(205-260nm)。iMab100溶解于1×PBS，pH7.5中。
BiMab111，与在20℃的iMab100光谱相比，在20℃，在95℃(部分)变性，及在20℃再折叠测定的远UV光谱。
CiMab116，与在20℃的iMab100光谱相比，在20℃，在95℃(部分)变性，及在20℃再折叠测定的远UV光谱。
DiMab1202，与在20℃的iMab100光谱相比，在20℃，在95℃(部分)变性，及在20℃再折叠测定的远UV光谱。
EiMab1302，与在20℃的iMab100光谱相比，在20℃，在95℃(部分)变性，及在20℃再折叠测定的远UV光谱。
FiMab1602，与在20℃的iMab100光谱相比，在20℃，在95℃(部分)变性，及在20℃再折叠测定的远UV光谱。
GiMab101，在20℃，在95℃(部分)变性及在20℃再折叠测定的远UV光谱。
HiMab1200，在20℃，在95℃(部分)变性及在20℃再折叠测定的远UV光谱。
IiMab701，在20℃，在95℃(部分)变性及在20℃再折叠测定的远UV光谱。
J天然(未变性的)9链iMab支架的覆盖图。
K天然(未变性的)7链iMab支架的覆盖图。
LiMab100和VHH的远UV CD光谱(感谢Kwaaitaal M，Wageningen University and Research，Wageningen，the Netherlands)。
图10针对MAST，PCR分离CDR3的示意图。
图11扩增牛衍生的CDR3区2％琼脂糖-TBE凝胶。
泳道1用引物8和9经PCR扩增的1μg Llama cDNA cyst+。
泳道2用引物8和9经PCR扩增的1μg Llama cDNA cyst-。
泳道325bp DNA步梯(step ladder)(Promega)。
泳道4用引物299和300经PCR扩增的0.75μg牛cDNA。
泳道5用引物299和300经PCR扩增的1.5μg牛cDNA。
泳道6用引物299和301经PCR扩增的0.75μg牛cDNA。
泳道7用引物299和301经PCR扩增的1.5μg牛cDNA。
泳道850bp GeneRuler DNA梯(MBI Fermentas)。
图12用iMab100的ELISA测定的溶菌酶结合活性。及时测试一些不同溶液对iMab100蛋白的蛋白酶解活性。在图A)和C)中测试样品稀释100倍，而在图B)和D)中样品稀释1000倍。A)和B)示出溶菌酶活性而C)和D)示出背景活性。
表11NeuATOM 1 CA GLY 2-9.450 -13.069 10.6711.0025.06 CATOM 2 CA GLY 3-9.868 -10.322 8.019 1.0020.77 CATOM 3 CA GLY 4-6.884 -9.280 5.813 1.0019.01 CATOM 4 CA GLY 5-6.047 -5.991 4.016 1.0019.75 CATOM 5 CA GLY 6-2.638 -4.349 3.125 1.0022.33 CATOM 6 CA GLY 7-1.382 -1.720 5.647 1.0024.80 CATOM 7 CA GLY 8-0.685 1.0803.150 1.0028.23 CATOM 8 CA GLY 9-0.917 1.393-0.6231.0026.37 CATOM 9 CA GLY 10 0.737 3.923-2.8871.0029.08 CATOM 10CA GLY 11 -0.741 5.082-6.1561.0026.48 CATOM 11CA GLY 12 0.157 7.450-8.9891.0027.26 CATOM 12CA GLY 13 -2.216 10.173 -10.146 1.0026.73 CATOM 13CA GLY 15 -3.567 5.434-12.371 1.0023.37 CATOM 14CA GLY 16 -5.492 2.682-10.482 1.0022.86 CATOM 15CA GLY 17 -4.920 0.709-7.2881.0020.21 CATOM 16CA GLY 18 -6.462 -2.512 -5.9331.0019.23 CATOM 17CA GLY 19 -7.735 -2.659 -2.3661.0017.13 CATOM 18CA GLY 20 -7.524 -6.278 -1.1411.0019.06 CATOM 19CA GLY 21 -9.914 -7.812 1.355 1.0015.28 CATOM 20CA GLY 22 -10.325-11.479 2.238 1.0015.88 CATOM 21CA GLY 23 -11.233-13.572 5.249 1.0018.12 CATOM 22CA GLY 24 -10.228-16.988 6.550 1.0018.67 CATOM 23CA GLY 25 -11.569-19.457 9.107 1.0020.29 CATOM 24CA GLY 33 -21.431-13.432 3.640 1.0024.64 CATOM 25CA GLY 34 -21.423-9.665 3.090 1.0021.24 CATOM 26CA GLY 35 -18.613-7.157 2.347 1.0017.90 CATOM 27CA GLY 36 -18.908-3.427 3.018 1.0016.78 CATOM 28CA GLY 37 -16.219-0.829 2.103 1.0015.77 CATOM 29CA GLY 38 -16.1232.5733.946 1.0016.15 CATOM 30CA GLY 39 -13.8705.6193.251 1.0017.11 CATOM 31CA GLY 40 -12.4948.3145.642 1.0019.95 CATOM 32CA GLY 46 -16.46110.313 9.058 1.0025.44 CATOM 33CA GLY 47 -16.5566.8207.445 1.0021.65 CATOM 34CA GLY 48 -18.7356.8344.274 1.0018.17 CATOM 35CA GLY 49 -19.8773.5392.632 1.0016.87 CATOM 36CA GLY 50 -18.7813.271-1.0241.0016.20 CATOM 37CA GLY 51 -19.542-0.410 -1.8191.0018.17 CATOM 38CA GLY 58 -23.016-6.057 -5.6561.0025.27 CATOM 39CA GLY 59 -24.037-2.432 -4.8971.0025.25 CATOM 40CA GLY 60 -21.8010.483-5.9601.0027.11 CATOM 41CA GLY 61 -22.3914.033-4.7461.0033.08 CATOM 42CA GLY 69 -14.4284.962-10.168 1.0019.37 CATOM 43CA GLY 70 -15.1911.646-8.3891.0017.40 CATOM 44CA GLY 71 -14.920-1.883 -9.8621.0017.48 CATOM 45CA GLY 72 -15.954-5.092 -8.0381.0017.29 CATOM 46CA GLY 73 -13.296-7.784 -8.4461.0017.82 CATOM 47CA GLY 74 -13.990-10.198 -5.6111.0020.26 CATOM 48CA GLY 81 -14.142-8.971 -1.3811.0015.95 CATOM 49CA GLY 82 -11.604-6.836 -3.2561.0014.51 CATOM 50CA GLY 83 -12.322-3.672 -5.3371.0014.59 CATOM 51CA GLY 84 -10.287-1.441 -7.6461.0015.51 CATOM 52CA GLY 85 -10.2042.403-7.2911.0016.32 CATOM 53CA GLY 86 -9.791 3.931-10.768 1.0017.40 CATOM 54CA GLY 87 -8.338 7.203-12.126 1.0020.53 CATOM 55CA GLY 89 -6.478 11.899 -7.8441.0033.26 CATOM 56CA GLY 90 -4.328 13.752 -5.2931.0033.41 CATOM 57CA GLY 91 -7.275 14.318 -3.0271.0028.24 CATOM 58CA GLY 92 -8.033 10.627 -2.7151.0023.61 CATOM 59CA GLY 93 -5.654 10.161 0.314 1.0022.12 CATOM 60CA GLY 94 -7.413 8.4863.205 1.0018.21 CATOM 61CA GLY 95 -8.183 5.2945.047 1.0018.57 CATOM 62CA GLY 96 -10.4622.5023.647 1.0017.72 CATOM 63CA GLY 97 -12.048-0.109 5.899 1.0018.72 CATOM 64CA GLY 98 -13.364-3.549 4.893 1.0018.53 CATOM 65CA GLY 99 -16.169-4.934 7.135 1.0018.45 CATOM 66CA GLY 100 -17.005-8.651 6.806 1.0017.71 CATOM 67CA GLY 108 -18.629-7.767 11.6741.0032.51 CATOM 68CA GLY 109 -14.846-7.953 11.7181.0028.62 C
ATOM69 CA GLY110 -12.921 -5.079 10.098 1.00 23.31 CATOM70 CA GLY111 -9.483 -4.260 8.692 1.00 19.82 CATOM71 CA GLY112 -8.175 -1.005 7.171 1.00 19.75 CATOM72 CA GLY113 -5.635 0.154 4.554 1.00 18.42 CATOM73 CA GLY114 -4.325 3.731 4.046 1.00 18.70 CATOM74 CA GLY115 -3.915 5.265 0.576 1.00 19.95 CATOM75 CA GLY116 -1.274 7.843 -0.510 1.00 25.78 CATOM76 CA GLY117 -1.158 9.173 -4.076 1.00 31.06 CATOM77 CA GLY118 1.96210.836 -5.500 1.00 38.60 CATOM78 CA GLY119 3.25111.884 -8.972 1.00 42.50 CTER1MELATOM79 CA GLY A 3 -9.610 -12.24111.306 1.00 36.96 CATOM80 CA GLY A 4 -9.672 -9.746 8.420 1.00 28.80 CATOM81 CA GLY A 5 -6.352 -8.965 6.761 1.00 31.64 CATOM82 CA GLY A 6 -6.225 -6.212 4.154 1.00 24.68 CATOM83 CA GLY A 7 -3.391 -5.808 1.630 1.00 21.60 CATOM84 CA GLY A 8 -2.679 -3.267 -1.055 1.00 17.27 CATOM85 CA GLY A 9 -2.837 0.450 -0.715 1.00 18.58 CATOM86 CA GLY A 10 0.1122.848 -0.895 1.00 16.78 CATOM87 CA GLY A 11 0.6635.945 -3.023 1.00 11.36 CATOM88 CA GLY A 12 -0.001 6.528 -6.640 1.00 8.84CATOM89 CA GLY A 13 -0.394 9.450 -8.944 1.00 11.16 CATOM90 CA GLY A 14 -3.805 10.880 -9.667 1.00 10.62 CATOM91 CA GLY A 16 -3.498 5.586 -11.682 1.00 7.90CATOM92 CA GLY A 17 -5.029 2.507 -10.132 1.00 7.54CATOM93 CA GLY A 18 -4.536 0.406 -6.998 1.00 6.47CATOM94 CA GLY A 19 -5.823 -2.962 -5.868 1.00 5.43CATOM95 CA GLY A 20 -6.773 -3.739 -2.263 1.00 8.09CATOM96 CA GLY A 21 -7.534 -7.231 -0.907 1.00 8.76CATOM97 CA GLY A 22 -9.056 -8.745 2.173 1.00 8.33CATOM98 CA GLY A 23 -9.100 -12.2813.393 1.00 13.77 CATOM99 CA GLY A 24 -11.485 -13.1776.222 1.00 17.53 CATOM100 CA GLY A 25 -9.970 -15.9108.360 1.00 23.23 CATOM101 CA GLY A 26 -11.324 -17.98511.176 1.00 25.25 CATOM102 CA GLY A 32 -22.537 -12.9614.478 1.00 5.00CATOM103 CA GLY A 33 -21.061 -9.574 3.450 1.00 4.64CATOM104 CA GLY A 34 -17.557 -8.097 2.923 1.00 2.48CATOM105 CA GLY A 35 -17.173 -4.447 1.958 1.00 2.00CATOM106 CA GLY A 36 -14.942 -1.420 2.147 1.00 3.40CATOM107 CA GLY A 37 -15.248 1.775 4.153 1.00 6.64CATOM108 CA GLY A 38 -12.980 4.768 4.009 1.00 8.74CATOM109 CA GLY A 39 -12.174 7.634 6.381 1.00 19.24 CATOM110 CA GLY A 44 -17.378 11.364 7.293 1.00 26.93 CATOM111 CA GLY A 45 -16.728 7.653 7.090 1.00 16.63 CATOM112 CA GLY A 46 -17.836 6.562 3.651 1.00 13.26 CATOM113 CA GLY A 47 -19.278 3.220 2.664 1.00 8.30CATOM114 CA GLY A 48 -17.484 2.453 -0.627 1.00 6.32CATOM115 CA GLY A 49 -18.387 -0.943 -1.936 1.00 3.71CATOM116 CA GLY A 57 -24.217 -9.042 -5.792 1.00 11.04 CATOM117 CA GLY A 58 -22.300 -5.759 -5.582 1.00 7.10CATOM118 CA GLY A 59 -23.147 -2.237 -4.440 1.00 9.00CATOM119 CA GLY A 60 -21.067 0.930 -4.751 1.00 8.36CATOM120 CA GLY A 61 -21.147 4.392 -3.266 1.00 15.85 CATOM121 CA GLY A 67 -14.348 3.577 -11.091 1.00 12.68 CATOM122 CA GLY A 68 -14.176 0.900 -8.416 1.00 8.15CATOM123 CA GLY A 69 -15.003 -2.767 -8.799 1.00 8.39CATOM124 CA GLY A 70 -15.301 -5.266 -5.949 1.00 5.47CATOM125 CA GLY A 71 -15.018 -8.998 -6.510 1.00 8.48CATOM126 CA GLY A 72 -14.299 -12.215-4.617 1.00 18.00 CATOM127 CA GLY A 79 -12.288 -10.021-1.938 1.00 9.55CATOM128 CA GLY A 80 -10.619 -7.230 -3.968 1.00 4.94CATOM129 CA GLY A 81 -11.319 -3.691 -4.814 1.00 4.92CATOM130 CA GLY A 82 -9.808 -2.556 -8.096 1.00 7.44CATOM131 CA GLY A 83 -9.608 1.233 -8.010 1.00 6.55CATOM132 CA GLY A 84 -9.109 2.986 -11.359 1.00 9.49CATOM133 CA GLY A 85 -9.157 6.689 -12.211 1.00 12.54 CATOM134 CA GLY A 87 -8.265 11.163 -7.900 1.00 15.46 CATOM135 CA GLY A 88 -6.724 12.875 -4.855 1.00 13.94 CATOM136 CA GLY A 89 -10.223 13.046 -3.286 1.00 18.68 C
ATOM 137 CA GLY A 90 -9.896 9.253-2.924 1.00 9.55CATOM 138 CA GLY A 91 -7.043 9.782-0.407 1.00 6.54CATOM 139 CA GLY A 92 -8.201 8.1112.809 1.00 6.38CATOM 140 CA GLY A 93 -7.841 5.1985.205 1.00 6.33CATOM 141 CA GLY A 94 -9.509 2.1303.746 1.00 6.08CATOM 142 CA GLY A 95 -11.083 -0.367 6.028 1.00 10.12 CATOM 143 CA GLY A 96 -12.264 -3.845 5.241 1.00 10.76 CATOM 144 CA GLY A 97 -15.411 -5.059 6.995 1.00 9.08CATOM 145 CA GLY A 98 -17.534 -8.225 7.154 1.00 8.28CATOM 146 CA GLY A 122-15.862 -7.486 11.967 1.00 15.49 CATOM 147 CA GLY A 123-13.351 -4.917 11.000 1.00 12.37 CATOM 148 CA GLY A 124-9.811 -4.988 9.801 1.00 14.34 CATOM 149 CA GLY A 125-6.730 -2.842 10.015 1.00 22.49 CATOM 150 CA GLY A 126-6.910 0.3347.957 1.00 17.72 CATOM 151 CA GLY A 127-4.732 0.8024.921 1.00 16.51 CATOM 152 CA GLY A 128-3.822 4.3193.804 1.00 16.84 CATOM 153 CA GLY A 129-4.119 5.1190.160 1.00 11.90 CATOM 154 CA GLY A 130-2.710 8.445-0.901 1.00 8.75CATOM 155 CA GLY A 131-3.277 9.842-4.344 1.00 14.37 CATOM 156 CA GLY A 132-0.480 12.243 -5.478 1.00 23.32 CATOM 157 CA GLY A 133-0.447 15.425 -7.580 1.00 36.14 CTER1F97ATOM 158 CA GLY A 29 -9.830 -13.499 10.551 1.00 41.25 CATOM 159 CA GLY A 30 -9.746 -10.552 8.150 1.00 22.43 CATOM 160 CA GLY A 31 -6.475 -9.224 6.722 1.00 24.73 CATOM 161 CA GLY A 32 -4.787 -7.203 3.981 1.00 20.95 CATOM 162 CA GLY A 33 -1.574 -7.581 1.983 1.00 28.77 CATOM 163 CA GLY A 34 -0.760 -3.875 2.262 1.00 33.48 CATOM 164 CA GLY A 35 -2.198 -1.487 4.855 1.00 27.47 CATOM 165 CA GLY A 36 -0.223 1.5103.544 1.00 29.20 CATOM 166 CA GLY A 37 -0.984 1.885-0.160 1.00 23.99 CATOM 167 CA GLY A 38 0.6814.472-2.392 1.00 24.19 CATOM 168 CA GLY A 39 -0.199 4.783-6.071 1.00 15.35 CATOM 169 CA GLY A 40 0.2607.491-8.737 1.00 12.64 CATOM 170 CA GLY A 41 -2.766 9.641-9.587 1.00 9.24CATOM 171 CA GLY A 43 -3.890 4.861-12.131 1.00 14.44 CATOM 172 CA GLY A 44 -5.807 1.735-11.160 1.00 21.52 CATOM 173 CA GLY A 45 -5.444 0.202-7.726 1.00 22.48 CATOM 174 CA GLY A 46 -6.964 -2.720 -5.861 1.00 21.22 CATOM 175 CA GLY A 47 -7.458 -2.391 -2.118 1.00 20.06 CATOM 176 CA GLY A 48 -7.106 -5.988 -0.927 1.00 13.56 CATOM 177 CA GLY A 49 -9.118 -7.626 1.851 1.00 19.14 CATOM 178 CA GLY A 50 -8.738 -11.362 2.401 1.00 22.49 CATOM 179 CA GLY A 51 -10.667 -13.442 4.932 1.00 20.58 CATOM 180 CA GLY A 52 -11.032 -17.051 6.076 1.00 24.55 CATOM 181 CA GLY A 53 -13.512 -18.935 8.234 1.00 17.82 CATOM 182 CA GLY A 57 -19.932 -13.290 4.102 1.00 10.39 CATOM 183 CA GLY A 58 -21.330 -9.790 3.738 1.00 8.00CATOM 184 CA GLY A 59 -18.524 -7.465 2.656 1.00 7.62CATOM 185 CA GLY A 60 -18.773 -3.717 3.244 1.00 6.84CATOM 186 CA GLY A 61 -16.384 -0.804 2.777 1.00 8.48CATOM 187 CA GLY A 62 -16.301 2.6564.292 1.00 13.92 CATOM 188 CA GLY A 63 -14.245 5.7263.449 1.00 11.89 CATOM 189 CA GLY A 64 -13.094 8.0836.189 1.00 23.18 CATOM 190 CA GLY A 68 -16.689 12.612 6.413 1.00 46.37 CATOM 191 CA GLY A 69 -17.861 8.9886.532 1.00 32.33 CATOM 192 CA GLY A 70 -19.096 7.4273.276 1.00 18.88 CATOM 193 CA GLY A 71 -19.976 3.8412.373 1.00 12.11 CATOM 194 CA GLY A 72 -18.208 2.531-0.728 1.00 9.54CATOM 195 CA GLY A 73 -19.659 -0.955 -0.492 1.00 9.17CATOM 196 CA GLY A 77 -22.346 -4.092 -3.568 1.00 17.96 CATOM 197 CA GLY A 78 -20.630 -0.882 -4.664 1.00 11.41 CATOM 198 CA GLY A 79 -22.720 2.163-3.704 1.00 8.01CATOM 199 CA GLY A 85 -15.239 3.577-11.142 1.00 17.93 CATOM 200 CA GLY A 86 -15.128 0.968-8.358 1.00 15.44 CATOM 201 CA GLY A 87 -15.569 -2.740 -9.020 1.00 16.79 CATOM 202 CA GLY A 88 -16.272 -5.311 -6.312 1.00 14.07 CATOM 203 CA GLY A 89 -14.727 -8.756 -5.888 1.00 16.75 CATOM 204 CA GLY A 91 -10.820 -10.288 -2.524 1.00 17.13 C
ATOM 205 CA GLY A 92-11.033 -6.489 -2.552 1.00 12.84 CATOM 206 CA GLY A 93-12.232 -3.404 -4.409 1.00 12.33 CATOM 207 CA GLY A 94-10.610 -2.146 -7.602 1.00 12.43 CATOM 208 CA GLY A 95-10.518 1.519 -8.590 1.00 11.12 CATOM 209 CA GLY A 96-10.279 1.926 -12.3551.00 16.95 CATOM 210 CA GLY A 97-8.644 5.292 -11.5321.00 21.11 CATOM 211 CA GLY A 99-7.443 11.068 -7.844 1.00 22.37 CATOM 212 CA GLY A 100 -5.937 13.065 -4.977 1.00 23.75 CATOM 213 CA GLY A 101 -9.515 13.338 -3.639 1.00 22.84 CATOM 214 CA GLY A 102 -9.383 9.634 -2.783 1.00 15.51 CATOM 215 CA GLY A 103 -6.718 10.015 -0.070 1.00 11.57 CATOM 216 CA GLY A 104 -7.876 8.577 3.237 1.00 9.52 CATOM 217 CA GLY A 105 -8.530 5.333 5.050 1.00 12.64 CATOM 218 CA GLY A 106 -10.727 2.534 3.753 1.00 7.32 CATOM 219 CA GLY A 107 -12.073 -0.044 6.175 1.00 7.52 CATOM 220 CA GLY A 108 -13.078 -3.483 4.952 1.00 9.97 CATOM 221 CA GLY A 109 -15.819 -4.936 7.140 1.00 12.91 CATOM 222 CA GLY A 110 -16.559 -8.639 6.792 1.00 11.27 CATOM 223 CA GLY A 118 -17.046 -10.415 12.491 1.00 13.29 CATOM 224 CA GLY A 119 -13.800 -8.756 11.482 1.00 15.55 CATOM 225 CA GLY A 120 -12.342 -5.613 9.917 1.00 11.36 CATOM 226 CA GLY A 121 -9.139 -4.141 8.532 1.00 11.36 CATOM 227 CA GLY A 122 -8.151 -0.571 7.641 1.00 11.14 CATOM 228 CA GLY A 123 -6.080 0.520 4.643 1.00 11.58 CATOM 229 CA GLY A 124 -4.595 3.978 4.206 1.00 15.52 CATOM 230 CA GLY A 125 -4.504 5.200 0.621 1.00 9.61 CATOM 231 CA GLY A 126 -2.079 7.899 -0.493 1.00 10.84 CATOM 232 CA GLY A 127 -2.415 9.054 -4.098 1.00 10.58 CATOM 233 CA GLY A 128 0.98510.216 -5.373 1.00 14.41 CATOM 234 CA GLY A 129 1.30813.675 -6.915 1.00 12.32 CTER1DQTATOM 235 CA GLY C 2 -10.005 -8.876 13.603 1.00 35.96 CATOM 236 CA GLY C 3 -10.267 -7.502 10.101 1.00 30.20 CATOM 237 CA GLY C 4 -7.171 -6.498 8.221 1.00 27.24 CATOM 238 CA GLY C 5 -6.397 -5.009 4.845 1.00 23.16 CATOM 239 CA GLY C 6 -3.219 -3.760 3.070 1.00 22.73 CATOM 240 CA GLY C 7 -1.859 -0.343 3.998 1.00 24.33 CATOM 241 CA GLY C 8 -1.267 0.851 0.436 1.00 21.64 CATOM 242 CA GLY C 9 -2.613 0.109 -3.024 1.00 20.25 CATOM 243 CA GLY C 10-1.486 1.813 -6.246 1.00 20.37 CATOM 244 CA GLY C 11-4.559 2.055 -8.480 1.00 22.46 CATOM 245 CA GLY C 12-4.228 1.091 -12.1391.00 24.30 CATOM 246 CA GLY C 14-7.812 2.779 -15.6131.00 30.82 CATOM 247 CA GLY C 15-8.831 3.617 -12.0601.00 25.29 CATOM 248 CA GLY C 16-8.949 0.054 -10.7091.00 21.63 CATOM 249 CA GLY C 17-7.920 -0.828 -7.174 1.00 20.22 CATOM 250 CA GLY C 18-8.037 -4.397 -5.930 1.00 20.86 CATOM 251 CA GLY C 19-7.062 -5.746 -2.558 1.00 21.25 CATOM 252 CA GLY C 20-7.903 -8.418 0.003 1.00 21.73 CATOM 253 CA GLY C 21-9.906 -7.860 3.174 1.00 22.97 CATOM 254 CA GLY C 22-9.210 -10.573 5.688 1.00 26.59 CATOM 255 CA GLY C 23-10.945 -11.564 8.878 1.00 26.47 CATOM 256 CA GLY C 24-10.701 -13.907 11.826 1.00 31.54 CATOM 257 CA GLY C 25-11.932 -16.084 13.335 1.00 31.33 CATOM 258 CA GLY C 32-20.611 -12.339 5.419 1.00 21.25 CATOM 259 CA GLY C 33-21.785 -8.834 4.607 1.00 21.86 CATOM 260 CA GLY C 34-18.854 -6.717 3.456 1.00 19.78 CATOM 261 CA GLY C 35-18.920 -2.932 3.364 1.00 19.11 CATOM 262 CA GLY C 36-16.430 -0.515 1.806 1.00 19.23 CATOM 263 CA GLY C 37-16.229 2.889 3.460 1.00 25.95 CATOM 264 CA GLY C 38-14.212 5.923 2.415 1.00 30.90 CATOM 265 CA GLY C 39-12.916 7.802 5.426 1.00 40.84 CATOM 266 CA GLY C 43-16.713 11.053 8.779 1.00 46.74 CATOM 267 CA GLY C 44-17.290 8.066 6.505 1.00 36.18 CATOM 268 CA GLY C 45-19.030 7.541 3.173 1.00 28.21 CATOM 269 CA GLY C 46-20.279 4.093 2.143 1.00 25.48 CATOM 270 CA GLY C 47-18.891 3.200 -1.269 1.00 23.13 CATOM 271 CA GLY C 48-20.541 -0.174 -1.750 1.00 20.54 CATOM 272 CA GLY C 58-19.057 -12.667 -7.642 1.00 24.08 C
ATOM 273 CA GLY C 59 -20.627 -9.992 -5.444 1.00 22.25CATOM 274 CA GLY C 60 -21.579 -6.311 -5.553 1.00 22.96CATOM 275 CA GLY C 61 -23.676 -7.234 -8.605 1.00 28.83CATOM 276 CA GLY C 62 -25.740 -4.088 -8.210 1.00 32.00CATOM 277 CA GLY C 63 -22.747 -1.772 -7.854 1.00 30.87CATOM 278 CA GLY C 66 -17.371 -2.468 -7.103 1.00 23.17CATOM 279 CA GLY C 67 -16.897 -6.161 -7.488 1.00 22.56CATOM 280 CA GLY C 68 -15.405 -9.022 -5.517 1.00 21.60CATOM 281 CA GLY C 69 -15.312 -12.649 -4.466 1.00 22.69CATOM 282 CA GLY C 75 -12.905 -11.173 0.577 1.00 23.03CATOM 283 CA GLY C 76 -11.171 -10.003 -2.613 1.00 24.30CATOM 284 CA GLY C 77 -12.370 -6.459 -3.308 1.00 23.46CATOM 285 CA GLY C 78 -12.157 -4.457 -6.510 1.00 25.74CATOM 286 CA GLY C 79 -13.139 -0.780 -6.670 1.00 26.08CATOM 287 CA GLY C 80 -13.383 0.660 -10.196 1.00 29.15CATOM 288 CA GLY C 81 -13.950 3.973 -11.951 1.00 26.23CATOM 289 CA GLY C 84 -7.281 11.072 -8.931 1.00 24.79CATOM 290 CA GLY C 85 -9.649 12.909 -6.605 1.00 25.37CATOM 291 CA GLY C 86 -10.734 9.536 -5.170 1.00 25.21CATOM 292 CA GLY C 87 -7.287 9.058 -3.657 1.00 23.95CATOM 293 CA GLY C 88 -7.874 8.354 0.014 1.00 23.67CATOM 294 CA GLY C 89 -8.483 5.896 2.834 1.00 22.75CATOM 295 CA GLY C 90 -10.866 2.985 2.312 1.00 23.39CATOM 296 CA GLY C 91 -12.127 0.902 5.210 1.00 22.55CATOM 297 CA GLY C 92 -13.188 -2.683 4.810 1.00 22.29CATOM 298 CA GLY C 93 -15.931 -3.797 7.205 1.00 20.45CATOM 299 CA GLY C 94 -16.933 -7.418 7.719 1.00 20.73CATOM 300 CA GLY C 105 -15.090 -5.968 12.589 1.00 24.94CATOM 301 CA GLY C 106 -13.327 -3.332 10.512 1.00 25.24CATOM 302 CA GLY C 107 -9.792 -2.872 9.205 1.00 24.05CATOM 303 CA GLY C 108 -7.671 0.283 9.656 1.00 25.85CATOM 304 CA GLY C 109 -8.117 1.175 6.019 1.00 23.77CATOM 305 CA GLY C 110 -6.209 0.891 2.770 1.00 22.46CATOM 306 CA GLY C 111 -4.626 4.045 1.330 1.00 24.13CATOM 307 CA GLY C 112 -5.545 4.027 -2.339 1.00 22.83CATOM 308 CA GLY C 113 -3.438 6.352 -4.496 1.00 23.40CATOM 309 CA GLY C 114 -4.906 7.221 -7.840 1.00 25.42CEND
表2iMab100NVKLVE--KGG-NFVEN--DDDL--KLTCRAEGYTI----GPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPED---SAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYR--GQ-GTDVTVSSAiMab502SVKFVC--KVLPNFWEN--NKDLPIKFTVRASGYTI----GPTCVGVFAQNPEDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKLRFDIRRDNAKVTRTNSLDDVQPEGRGKSFELTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDQVAR--YHRGIDITVDGPiMab702AVKSVF--KVSTNFIENDGTMDS--KLTFRASGYTI----GPQCLGFFQQGVPDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKSIFDIRRDNAKDTYTASVDDNQPE----DVEITCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDLILRTLQK-GIDLFVVPTiMab1202(1EJ6)IVKLVM--EKR-GNFEN--GQDC--KLTIRASGYTI----GPACDGFFCQFPSDDSFSTED-NMGGGIT-VNDAMKPQFDIRRDNAKGTWTLSM-DFQPEG---IYEMQCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDNPVR--LG-GFDVDVPDViMab1302VVKVVI--KPSQNFIEN--GEDK--KFTCRASGYTI----GPKCIGWFSQNPEDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNAKDTSTLSIDDAQPED---AGIYKCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDSEA---TV-GVDIFVKLMiMab1502(1NEU)NVKVVT--KRE-NFGEN--GSDV--KLTCRASGYTI----GPICFGWFYQPEGDDSAISIFHNMGGGITDEVDTFKERFDIRRDNAKKTGTISIDDLQPSD---NETFTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDGKTR--QV-GLDVFVKVPiMab1602AVKPVIGSKAP-NFGEN---GDV--KTIDRASGYTI----GPTCGGVFFQGPTDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKETFDIRRDNAKSTRTESYDDNQPEG---LTEVKCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDVSSR--LY-GYDILVGTQ
表3VAPs氨基酸序列iMab100NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab101VKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab102DLKLTCRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab111NVKLVCKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRCQGTDVTVSSiMab112NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFCQAPNDDSTCVATINMGGGITYYGDSVKER
FDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab113NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYSMGWFRQAPNDDSTNVSCINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab114NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYSMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab115NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDQASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab116NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNGAGDSTIYGSYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab120NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKER
FDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSRGQGTDVTVSSiMab121NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGRSFSSYIMGWFRQAPNDDSTNVATISETGGDIVYTNYGDSVKERFDIRRDIASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGSVYGSGWRPDRYDYRGQGTDVTVSSiMab124DDLKLTCRASGRSFSSYIMGWFRQAPNDDSTNVATISETTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGSVYGSGWRPDRYDYRGQGTDVTVSSiMab122NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGRTFSSRTMGWFRQAPNDDSTNVATIRWNGGSTYYTNYGDSVKERFDIRVDQASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGTDIGDGWSGRYDYRGQGTDVTVSSiMab125DDLKLTCRASGRTFSSRTMGWFRQAPNDDSTNVATIRWNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGTDIGDGWSGRYDYRGQGTDVTVSSiMab123NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGRTFSRAAMGWFRQAPNDDSTNVATITWSGRHTRYGDSVKERFDIRRDQASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGEGSNTASTSPRPYDYRGQGTDVTVSS
iMab130NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGYAYTYTYMGWFRQAPNDDSTNVATIDSGGGGTLYGDSVKERFDIRRDKGSNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAAGGYELRDRTYGQRGQGTDVTVSSiMab201VQLQASGGGSVQAGGSLRLSCRASGYTIGPYCMGWFRQAPGDDSEGVAAINMGTVYLLMNSLEPEDTAIYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSWGQGTQVTVSSiMab300VQLQQPGSNLVRPGASVKLSCKASGYTIGPSCIHWAKQRPGDGLEWIGEINMGTAYVDLSSLTSEDSAVYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDYWGQGTTLTVSSiMab302ASVKLSCKASGYYTIGPSCIHWAKQPPGDGLEWIGEINMGTAYVDLSSLTSEDSAVYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDYWGQGTTLTVSSiMab400VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCRASGYTIGPYCMNWVRQAPGDGLEWVGWINMGTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDVWGQGTLVTVSSiMab500PNFLCSVLPTHWRCNKTLPIAFKCRASGYTIGPTCVTVMAGNDEDYSNMGARFNDLRFVGRSGRGKS
FTLTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYPQVATYHRAIKITVDGPiMab502SVKFVCKVLPNFWENNKDLPIKFTVRASGYTIGPTCVGVFAQNPEDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKLRFDIRRDNAKVTRTNSLDDVQPEGRGKSFELTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDQVARYHRGIDITVDGPiMab600APVGLKARNADESGHVVLRCRASGYTIGPICYEVDVSAGQDAGSVQRVEINMGRTESVLSNLRGRTRYTFACAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYSEWSEPVSLLTPSiMab700DKSTLAAVPTSIIADGLMASTITCEASGYTIGPACVAFDTTLGNNMGTYSAPLTSTTLGVATVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYAAFSVPSVTVNFTAiMab702AVKSVFKVSTNFIENDGTMDSKLTFRASGYTIGPQCLGFFQQGVPDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKSIFDIRRDNAKDTYTASVDDNQPEDVEITCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDLILRTLQKGIDLFVVPTiMab701MASTITCEASGYTIGPACVAFDTTLGNNMGTYSAPLTSTTLGVATVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYAAFSVPSVTVNFTAiMab800
GRSSFTVSTPDILADGTMSSTLSCRASGYTIGPQCLSFTQNGVPVSISPINMGSYTATVVGNSVGDVTTTCAADSTTYASYYECGHGLSTGGYGYTLILSTLQKKISLFPiMab900LTLTAAVIGDGAPANGKTAITVECTASGYTIGPQCVVITTNNGALPNKITENMGVARIALTNTTDGVTVVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYQRQSVDTHFVKiMab1000HKPVIEKVDGGYLCKASGYTIGPECIELLADGRSYTKNMGEAFFAIDASKVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYHWKAENiMab1001VDGGYLCKASGYTIGPECIELLADGRSYTKNMGEAFFAIDASKVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYHWKAENiMab1100APVGLKARLADESGHVVLRCRASGYTIGPICYEVDVSAGNDAGSVQRVEILNMGTESVLSNLRGRTRYTFACAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYSAWSEPVSLLTPSiMab1200HGLPMEKRGNFIVGQNCSLTCPASGYTIGPQCVFNCYFNSALAFSTENMGEWTLDMVFSDAGIYTMCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYNPVSLGSFVVDSPiMab1202
IVKLVMEKRGNFENGQDCKLTIRASGYTIGPACDGFFCQFPSDDSFSTEDNMGGGITVNDAMKPQFDIRRDNAKGTWTLSMDFQPEGIYEMQCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDNPVRLGGFDVDVPDViMab1300LQVDIKPSQGEISVGESKFFLCQASGYTIGPCISWFSPNGEKLNMGSSTLTIYNANIDDAGIYKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYQSEATVNVKIFQiMab1302VVKVVIKPSQNFIENGEDKKFTCRASGVTIGPKCIGWFSQNPEDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNAKDTSTLSIDDAQPEDAGIYKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSEATVGVDIFVKLMiMab1301ESKFFLCQASGYTIGPCISWFSPNGEKLNMGSSTLTIYNANIDDAGIYKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYQSEATVNVKIFQiMab1400VPRDLEVVAATPTSLLISCDASGYTIGPYCITYGETGGNSPVQEFTVPNMGKSTATISGLKPGVDYTITCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYSKPISINYRTiMab1500IKVYTDRENYGAVGSQVTLHCSASGYTIGPICFTWRYQPEGDRDAISIFHYNMGDGSIVIHNLDYSDNGTFTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYVGKTSQVTLYVFE
iMab1502NVKVVTKRENFGENGSDVKLTCRASGYTIGPICFGWFYQPEGDDSAISIFHNMGGGITDEVDTFKERFDIRRDNAKKTGTISIDDLQPSDNETFTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDGKTRQVGLDVFVKVPiMab1501SQVTLHCSASGYTIGPICFTWRYQPEGDRDAISIFHYNMGDGSIVIHNLDYSDNGTFTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYVGKTSQVTLYVFEiMab1600SKPQIGSVAPNMGIPGNDVTITCRASGYTIGPTCGTVTFGGVTNMGNRIEVYVPNMAAGLTDVKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYGVSSNLYSYNILSiMab1602AVKPVIGSKAPNFGENGDVKTIDRASGYTIGPTCGGVFFQGPTDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKETFDIRRDNAKSTRTESYDDNQPEGLTEVKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDVSSRLYGYDILVGTQiMab1700KDPEIHLSGPLEAGKPITVKCSASGYTIGPLCIDLLKGDHLMKSQEFNMGSLEVTFTPVIEDIGKVLVCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYVRQAVKELQVDiMab1701KPITVKCSASGYTIGPLCIDLLKGDHLMKSQEFNMGSLEVTFTPVIEDIGKVLVCAADSTIYASYYEC
GHGLSTGGYGYVRQAVKELQVD
表4iMab DNA序列iMab D1001AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401CGiMab D1011 CATA TGGTTAAACT GGTTGAAAAA GGTGGTAACT TCGTTGAAAA CGACGACGAC CTGAAACTGACCTGCCGTGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGTACTGCAT GGGTTGGTTC CGTCAGGCTC CGAACGACGA CTCCACCAACGTTGCTACCA161TCAACATGGG TACCGTTACC CTGTCCATGG ACGACCTGCA GCCGGAAGAC TCCGCTGAAT ACAACTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC GACTCCCACTACCGTGGTCA321GGGTACCGAC GTTACCGTTT CCTCGGCCAG CTCGGCCiMab D1021 CATA TGGACCTGAA ACTGACCTGC CGTGCTTCCG GTTACACCAT CGGTCCGTAC TGCATGGGTTGGTTCCGTCA81GGCTCCGAAC GACGACTCCA CCAACGTTGC TACCATCAAC ATGGGTACCG TTACCCTGTC CATGGACGACCTGCAGCCGG161AAGACTCCGC TGAATACAAC TGCGCTGCTG ACTCCACCAT CTACGCTTCC TACTACGAAT GCGGTCACGGTATCTCCACC241GGTGGTTACG GTTACGACTC CCACTACCGT GGTCAGGGTA CCGACGTTAC CGTTTCCTCG GCCAGCTCGG CCiMab D1111CATATG AATGTGAAAC TGGTTTGTAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTCACGTGCCGTG81CTGAAGGTTA CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAACGTGGCCACG161ATCAACATGG GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACAACGCGTCCAA241CACCGTTACC TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCTACCATTTACG321CGAGCTATTA TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTTGCCAGGGTACCGAC401GTTACCGTCT CGTCGGCCAG CTCGGCCiMab D1121AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CTGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTTG CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401CGTCGiMab D1131AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA
81CACCATTGGC CCGTACTCCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGTCCTGCATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401 CGTCGiMab D1141AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTCCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401CGTCGiMab D1151AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACC AGGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401CGTCGiMab D1161CATATG AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTCACGTGTCGTG81CTGAAGGTTA CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAACGTGGCCACG161ATCAACATGG GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACAACGCGTCCAA241CACCGTTACC TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATGGTGC AGGTGATTCTACCATTTACG321GGAGCTATTA TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCAGGGTACCGAC401GTTACCGTCT CGTCGGCCAG CTCGGCCiMab D1201AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCGTG GTCAGGGTAC CGACGTTACCGTCTCGTCGiMab D1211 CATA TGAACGTTAA ACTGGTTGAA AAAGGTGGTA ACTTCGTTGA AAACGACGAC GACCTGAAACTGACCTGCCG81TGCTTCCGGT CGTTCCTTCT CCTCCTACAT CATGGGTTGG TTCCGTCAGG CTCCGAACGA CGACTCCACCAACGTTGCTA161CCATCTCCGA AACCGGTGGT GACATCGTTT ACACCAACTA CGGTGACTCC GTTAAAGAAC GTTTCGACATCCGTCGTGAC
241ATCGCTTCCA ACACCGTTAC CCTGTCCATG GACGACCTGC AGCCGGAAGA CTCCGCTGAA TACAACTGCGCTGGTTCCGT321TTACGGTTCC GGTTGGGGTC CGGACCGTTA CGACTACCGT GGTCAGGGTA CCGACGTTAC CGTTTCCTCGGCCAGCTCGG401CCiMab D1221 CATA TGAACGTTAA ACTGGTTGAA AAAGGTGGTA ACTTCGTTGA AAACGACGAC GACCTGAAACTGACCTGCCG81TGCTTCCGGT CGTACCTTCT CCTCCCGTAC CATGGGTTGG TTCCGTCAGG CTCCGAACGA CGACTCCACCAACGTTGCTA161CCATCCGTTG GAACGGTGGT TCCACCTACT ACACCAACTA CGGTGACTCC GTTAAAGAAC GTTTCGACATCCGTGTTGAC241CAGGCTTCCA ACACCGTTAC CCTGTCCATG GACGACCTGC AGCCGGAAGA CTCCGCTGAA TACAACTGCGCTGGTACCGA321CATCGGTGAC GGTTGGTCCG GTCGTTACGA CTACCGTGGT CAGGGTACCG ACGTTACCGT TTCCTCGGCCAGCTCGGCCiMab D1231 CATA TGAACGTTAA ACTGGTTGAA AAAGGTGGTA ACTTCGTTGA AAACGACGAC GACCTGAAACTGACCTGCCG81TGCTTCCGGT CGTACCTTCT CCCGTGCTGC TATGGGTTGG TTCCGTCAGG CTCCGAACGA CGACTCCACCAACGTTGCTA161CCATCACCTG GTCCGGTCGT CACACCCGTT ACGGTGACTC CGTTAAAGAA CGTTTCGACA TCCGTCGTGACCAGGCTTCC241AACACCGTTA CCCTGTCCAT GGACGACCTG CAGCCGGAAG ACTCCGCTGA ATACAACTGC GCTGGTGAAGGTTCCAACAC321CGCTTCCACC TCCCCGCGTC CGTACGACTA CCGTGGTCAG GGTACCGACG TTACCGTTTC CTCGGCCAGCTCGGCCiMab D1241 CATA TGGACGACCT GAAACTGACC TGCCGTGCTT CCGGTCGTTC CTTCTCCTCC TACATCATGGGTTGGTTCCG81TCAGGCTCCG AACGACGACT CCACCAACGT TGCTACCATC TCCGAAACCA CCGTTACCCT GTCCATGGACGACCTGCAGC161CGGAAGACTC CGCTGAATAC AACTGCGCTG GTTCCGTTTA CGGTTCCGGT TGGCGTCCGG ACCGTTACGACTACCGTGGT241CAGGGTACCG ACGTTACCGT TTCCTCGGCC AGCTCGGCCiMab D1251 CATA TGGACGACCT GAAACTGACC TGCCGTGCTT CCGGTCGTAC CTTCTCCTCC CGTACCATGGGTTGGTTCCG81TCAGGCTCCG AACGACGACT CCACCAACGT TGCTACCATC CGTTGGAACA CCGTTACCCT GTCCATGGACGACCTGCAGC161CGGAAGACTC CGCTGAATAC AACTGCGCTG GTACCGACAT CGGTGACGGT TGGTCCGGTC GTTACGACTACCGTGGTCAG241GGTACCGACG TTACCGTTTC CTCGGCCAGC TCGGCCiMab D1301 A ATGTGAAACT GGTTGAAAAA GGTGGCAATT TCGTCGAAAA CGATGACGAT CTTAAGCTCACGTGCCGTGC81TAGCGGTTAC GCCTACACGT ATATCTACAT GGGTTGGTTC CGTCAGGCGC CGAACGACGA CAGTACTAACGTGGCCACCA161TCGACTCGGG TGGCGGCGGT ACCCTGTACG GTGACTCCGT CAAAGAGCGC TTCGATATCC GTCGCGACAAAGGCTCCAAC241ACCGTTACCT TATCGATGGA CGATCTGCAA CCGGAAGACT CTGCAGAATA CAATTGTGCA GCGGGTGGCTACGAACTGCG321CGACCGCACC TACGGTCAGC GTGGTCAGGG TACCGACGTT ACCGTCTCGT CGGCCAGCTC GGCCiMab D2011 CATA TGGTTCAGCT GCAGGCTTCC GGTGGTGGTT CCGTTCAGGC TGGTGGTTCC CTGCGTCTGTCCTGCCGTGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGTACTGCAT GGGTTGGTTC CGTCAGGCTC CGGGTGACGA CTCCGAAGGTGTTGCTGCTA161TCAACATGGG TACCGTTTAC CTGCTGATGA ACTCCCTGGA ACCGGAAGAC ACCGCTATCT ACTACTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC GACTCCTGGGGTCAGGGTAC321CCAGGTTACC GTTTCCTCGG CCAGCTCGGC C
iMab D3001 CATA TGGTTCAGCT GCAGCAGCCG GGTTCCAACC TGGTTCGTCC GGGTGCTTCC GTTAAACTGTCCTGCAAAGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGTCCTGCAT CCACTGGGCT AAACAGCGTC CGGGTGACGG TCTGGAATGGATCGGTGAAA161TCAACATGGG TACCGCTTAC GTTGACCTGT CCTCCCTGAC CTCCGAAGAC TCCGCTGTTT ACTACTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC GACTACTGGGGTCAGGGTAC321CACCCTGACC GTTTCCTCGG CCAGCTCGGC CiMab D3021 CATA TGGCTTCCGT TAAACTGTCC TGCAAAGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG TCCTGCATCCACTGGGCTAA81ACAGCGTCCG GGTGACGGTC TGGAATGGAT CGGTGAAATC AACATGGGTA CCGCTTACGT TGACCTGTCCTCCCTGACCT161CCGAAGACTC CGCTGTTTAC TACTGCGCTG CTGACTCCAC CATCTACGCT TCCTACTACG AATGCGGTCACGGTATCTCC241ACCGGTGGTT ACGGTTACGA CTACTGGGGT CAGGGTACCA CCCTGACCGT TTCCTCGGCC AGCTCGGCCiMab D4001 CATA TGGTTCAGCT GGTTGAATCC GGTGGTGGTC TGGTTCAGCC GGGTGGTTCC CTGCGTCTGTCCTGCCGTGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGTACTGCAT GAACTGGGTT CGTCAGGCTC CGGGTGACGG TCTGGAATGGGTTGGTTGGA161TCAACATGGG TACCGCTTAC CTGCAGATGA ACTCCCTGCG TGCTGAAGAC ACCGCTGTTT ACTACTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC GACGTTTGGGGTCAGGGTAC321CCTGGTTACC GTTTCCTCGG CCAGCTCGGC CiMab D5001 CATA TGCCGAACTT CCTGTGCTCC GTTCTGCCGA CCCACTGGCG TTGCAACAAA ACCCTGCCGATCGCTTTCAA81ATGCCGTGCT TCCGGTTACA CCATCGGTCC GACCTGCGTT ACCGTTATGG CTGGTAACGA CGAAGACTACTCCAACATGG161GTGCTCGTTT CAACGACCTG CGTTTCGTTG GTCGTTCCGG TCGTGGTAAA TCCTTCACCC TGACCTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC CCGCAGGTTGCTACCTACCA321CCGTGCTATC AAAATCACCG TTGACGGTCC GGCCAGCTCG GCCiMab D5021 CATA TGTCCGTTAA ATTCGTTTGC AAAGTTCTGC CGAACTTCTG GGAAAACAAC AAAGACCTGCCGATCAAATT81CACCGTTCGT GCTTCCGGTT ACACCATCGG TCCGACCTGC GTTGGTGTTT TCGCTCAGAA CCCGGAAGACGACTCCACCA161ACGTTGCTAC CATCAACATG GGTGGTGGTA TCACCTACTA CGGTGACTCC GTTAAACTGC GTTTCGACATCCGTCGTGAC241AACGCTAAAG TTACCCGTAC CAACTCCCTG GACGACGTTC AGCCGGAAGG TCGTGGTAAA TCCTTCGAACTGACCTGCGC321TGCAGACTCC ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTCTGT CCACCGGTGG TTACGGTTACGACCAGGTTG401CTCGTTACCA CCGTGGTATC GACATCACCG TCTCGTCGGC CAGCTCGGCCiMab D6001 CATA TGGCTCCGGT TGGTCTGAAA GCTCGTAACG CTGACGAATC CGGTCACGTT GTTCTGCGTTGCCGTGCTTC81CGGTTACACC ATCGGTCCGA TCTGCTACGA AGTTGACGTT TCCGCTGGTC AGGACGCTGG TTCCGTTCAGCGTGTTGAAA161TCAACATGGG TCGTACCGAA TCCGTTCTGT CCAACCTGCG TGGTCGTACC CGTTACACCT TCGCTTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC TCCGAATGGTCCGAACCGGT321TTCCCTGCTG ACCCCGTCGG CCAGCTCGGC CiMab D700
1 CATA TGGACAAATC CACCCTGGCT GCTGTTCCGA CCTCCATCAT CGCTGACGGT CTGATGGCTTCCACCATCAC81CTGCGAAGCT TCCGGTTACA CCATCGGTCC GGCTTGCGTT GCTTTCGACA CCACCCTGGG TAACAACATGGGTACCTACT161CCGCTCCGCT GACCTCCACC ACCCTGGGTG TTGCTACCGT TACCTGCGCT GCTGACTCCA CCATCTACGCTTCCTACTAC241GAATGCGGTC ACGGTATCTC CACCGGTGGT TACGGTTACG CTGCTTTCTC CGTTCCGTCC GTTACCGTTAACTTCACCGC321GGCCAGCTCG GCCiMab D7011 CATA TGATGGCTTC CACCATCACC TGCGAAGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG GCTTGCGTTGCTTTCGACAC81CACCCTGGGT AACAACATGG GTACCTACTC CGCTCCGCTG ACCTCCACCA CCCTGGGTGT TGCTACCGTTACCTGCGCTG161CTGACTCCAC CATCTACGCT TCCTACTACG AATGCGGTCA CGGTATCTCC ACCGGTGGTT ACGGTTACGCTGCTTTCTCC241GTTCCGTCCG TTACCGTTAA CTTCACCGCG GCCAGCTCGG CCiMab D7021 CATA TGGCTGTTAA ATCCGTTTTC AAAGTTTCCA CCAACTTCAT CGAAAACGAC GGCACCATGGACTCCAAACT81GACCTTCCGT GCTTCCGGTT ACACCATCGG TCCGCAGTGC CTGGGTTTCT TCCAGCAGGG TGTTCCGGACGACTCCACCA161ACGTTGCTAC CATCAACATG GGTGGTGGTA TCACCTACTA CGGTGACTCC GTTAAATCCA TCTTCGACATCCGTCGTGAC241AACGCTAAAG ACACCTACAC CGCTTCCGTT GACGACAACC AGCCGGAAGA CGTTGAAATC ACCTGCGCTGCAGACTCCAC321CATCTACGCT TCCTACTACG AATGCGGTCA CGGTCTGTCC ACCGGTGGTT ACGGTTACGA CCTGATCCTGCGTACCCTGC401AAAAAGGTAT CGACCTGTTC GTCTCGTCGG CCAGCTCGGC CiMab D8001 CATA TGGGTCGTTC CTCCTTCACC GTTTCCACCC CGGACATCCT GGCTGACGGT ACCATGTCCTCCACCCTGTC81CTGCCGTGCT TCCGGTTACA CCATCGGTCC GCAGTGCCTG TCCTTCACCC AGAACGGTGT TCCGGTTTCCATCTCCCCGA161TCAACATGGG TTCCTACACC GCTACCGTTG TTGGTAACTC CGTTGGTGAC GTTACCATCA CCTGCGCTGCTGACTCCACC241ATCTACGCTT CCTACTACGA ATGCGGTCAC GGTATCTCCA CCGGTGGTTA CGGTTACACC CTGATCCTGTCCACCCTGCA321GAAAAAAATC TCCCTGTTCC CGGCCAGCTC GGCCiMab D9001 CATA TGCTGACCCT GACCGCTGCT GTTATCGGTG ACGGTGCTCC GGCTAACGGT AAAACCGCTATCACCGTTGA81ATGCACCGCT TCCGGTTACA CCATCGGTCC GCAGTGCGTT GTTATCACCA CCAACAACGG TGCTCTGCCGAACAAAATCA161CCGAAAACAT GGGTGTTGCT CGTATCGCTC TGACCAACAC CACCGACGGT GTTACCGTTG TTACCTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC CAGCGTCAGTCCGTTGACAC321CCACTTCGTT AAGGCCAGCT CGGCCiMab D10001 CATA TGCACAAACC GGTTATCGAA AAAGTTGACG GTGGTTACCT GTGCAAAGCT TCCGGTTACACCATCGGTCC81GGAATGCATC GAACTGCTGG CTGACGGTCG TTCCTACACC AAAAACATGG GTGAAGCTTT CTTCGCTATCGACGCTTCCA161AAGTTACCTG CGCTGCTGAC TCCACCATCT ACGCTTCCTA CTACGAATGC GGTCACGGTA TCTCCACCGGTGGTTACGGT241TACCACTGGA AAGCTGAAAA CTCGGCCAGC TCGGCCiMab D10011 CATA TGGTTGACGG TGGTTACCTG TGCAAAGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG GAATGCATCGAACTGCTGGC81TGACGGTCGT TCCTACACCA AAAACATGGG TGAAGCTTTC TTCGCTATCG ACGCTTCCAA AGTTACCTGCGCTGCTGACT
161CCACCATCTA CGCTTCCTAC TACGAATGCG GTCACGGTAT CTCCACCGGT GGTTACGGTT ACCACTGGAAAGCTGAAAAT241TCGGCCAGCT CGGCCiMab D11001 CATA TGGCTCCGGT TGGTCTGAAA GCTCGTCTGG CTGACGAATC CGGTCACGTT GTTCTGCGTTGCCGTGCTTC81CGGTTACACC ATCGGTCCGA TCTGCTACGA AGTTGACGTT TCCGCTGGTA ACGACGCTGG TTCCGTTCAGCGTGTTGAAA161TCCTGAACAT GGGTACCGAA TCCGTTCTGT CCAACCTGCG TGGTCGTACC CGTTACACCT TCGCTTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC TCCGCTTGGTCCGAACCGGT321TTCCCTGCTG ACCCCGTCGG CCAGCTCGGC CiMab D12001 CATA TGCACGGTCT GCCGATGGAA AAACGTGGTA ACTTCATCGT TGGTCAGAAC TGCTCCCTGACCTGCCCGGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGCAGTGCGT TTTCAACTGC TACTTCAACT CCGCTCTGGC TTTCTCCACCGAAAACATGG161GTGAATGGAC CCTGGACATG GTTTTCTCCG ACGCTGGTAT CTACACCATG TGCGCTGCTG ACTCCACCATCTACGCTTCC241TACTACGAAT GCGGTCACGG TATCTCCACC GGTGGTTACG GTTACAACCC GGTTTCCCTG GGTTCCTTCGTTGTTGACTC321CCCGGCCAGC TCGGCCiMab D12021 CATA TGATCGTTAA ACTGGTTATG GAAAAACGTG GTAACTTCGA AAACGGTCAG GACTGCAAACTGACCATCCG81TGCTTCCGGT TACACCATCG GTCCGGCTTG CGACGGTTTC TTCTGCCAGT TCCCGTCCGA CGACTCCTTCTCCACCGAAG161ACAACATGGG TGGTGGTATC ACCGTTAACG ACGCTATGAA ACCGCAGTTC GACATCCGTC GTGACAACGCTAAAGGCACC241TGGACCCTGT CCATGGACTT CCAGCCGGAA GGTATCTACG AAATGCAGTG CGCTGCAGAC TCCACCATCTACGCTTCCTA321CTACGAATGC GGTCACGGTC TGTCCACCGG TGGTTACGGT TACGACAACC CGGTTCGTCT GGGTGGTTTCGACGTTGACG401TCTCGTCGGC CAGCTCGGCCiMab D13001 CATA TGCTGCAGGT TGACATCAAA CCGTCCCAGG GTGAAATCTC CGTTGGTGAA TCCAAATTCTTCCTGTGCCA81GGCTTCCGGT TACACCATCG GTCCGTGCAT CTCCTGGTTC TCCCCGAACG GTGAAAAACT GAACATGGGTTCCTCCACCC161TGACCATCTA CAACGCTAAC ATCGACGACG CTGGTATCTA CAAATGCGCT GCTGACTCCA CCATCTACGCTTCCTACTAC241GAATGCGGTC ACGGTATCTC CACCGGTGGT TACGGTTACC AGTCCGAAGC TACCGTTAAC GTTAAAATCTTCCAGGCCAG321CTCGGCCiMab D13011 CATA TGGAATCCAA ATTCTTCCTG TGCCAGGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG TGCATCTCCTGGTTCTCCCC81GAACGGTGAA AAACTGAACA TGGGTTCCTC CACCCTGACC ATCTACAACG CTAACATCGA CGACGCTGGTATCTACAAAT161GCGCTGCTGA CTCCACCATC TACGCTTCCT ACTACGAATG CGGTCACGGT ATCTCCACCG GTGGTTACGGTTACCAGTCC241GAAGCTACCG TTAACGTTAA AATCTTCCAG GCCAGCTCGG CCiMab D13021 CATA TGGTTGTTAA AGTTGTTATC AAACCGTCCC AGAACTTCAT CGAAAACGGT GAAGACAAAAAATTCACCTG81CCGTGCTTCC GGTTACACCA TCGGTCCGAA ATGCATCGGT TGGTTCTCCC AGAACCCGGA AGACGACTCCACCAACGTTG161CTACCATCAA CATGGGTGGT GGTATCACCT ACTACGGTGA CTCCGTTAAA GAACGTTTCG ACATCCGTCGTGACAACGCT241AAAGACACCT CCACCCTGTC CATCGACGAC GCTCAGCCGG AAGACGCTGG TATCTACAAA TGCGCTGCAGACTCCACCAT
321CTACGCTTCC TACTACGAAT GCGGTCACGG TCTGTCCACC GGTGGTTACG GTTACGACTC CGAAGCTACCGTTGGTGTTG401ACATCTTCGT CTCGTCGGCC AGCTCGGCCiMab D14001 CATA TGGTTCCGCG TGACCTGGAA GTTGTTGCTG CTACCCCGAC CTCCCTGCTG ATCTCCTGCGACGCTTCCGG81TTACACCATC GGTCCGTACT GCATCACCTA CGGTGAAACC GGTGGTAACT CCCCGGTTCA GGAATTCACCGTTCCGAACA161TGGGTAAATC CACCGCTACC ATCTCCGGTC TGAAACCGGG TGTTGACTAC ACCATCACCT GCGCTGCTGACTCCACCATC241TACGCTTCCT ACTACGAATG CGGTCACGGT ATCTCCACCG GTGGTTACGG TTACTCCAAA CCGATCTCCATCAACTACCG321TACGGCCAGC TCGGCCiMab D15001 CATA TGATCAAAGT TTACACCGAC CGTGAAAACT ACGGTGCTGT TGGTTCCCAG GTTACCCTGCACTGCTCCGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGATCTGCTT CACCTGGCGT TACCAGCCGG AAGGTGACCG TGACGCTATCTCCATCTTCC161ACTACAACAT GGGTGACGGT TCCATCGTTA TCCACAACCT GGACTACTCC GACAACGGTA CCTTCACCTGCGCTGCTGAC241TCCACCATCT ACGCTTCCTA CTACGAATGC GGTCACGGTA TCTCCACCGG TGGTTACGGT TACGTTGGTAAAACCTCCCA321GGTTACCCTG TACGTTTTCG AGGCCAGCTC GGCCiMab D15011 CATA TGTCCCAGGT TACCCTGCAC TGCTCCGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG ATCTGCTTCACCTGGCGTTA81CCAGCCGGAA GGTGACCGTG ACGCTATCTC CATCTTCCAC TACAACATGG GTGACGGTTC CATCGTTATCCACAACCTGG161ACTACTCCGA CAACGGTACC TTCACCTGCG CTGCTGACTC CACCATCTAC GCTTCCTACT ACGAATGCGGTCACGGTATC241TCCACCGGTG GTTACGGTTA CGTTGGTAAA ACCTCCCAGG TTACCCTGTA CGTTTTCGAG GCCAGCTCGG CCiMab D15021 CATA TGAACGTTAA AGTGGTTACC AAACGTGAAA ACTTCGGTGA AAACGGTTCC GACGTTAAACTGACCTGCCG81TGCTTCCGGT TACACCATCG GTCCGATCTG CTTCGGTTGG TTCTACCAGC CGGAAGGTGA CGACTCCGCTATCTCCATCT161TCCACAACAT GGGTGGTGGT ATCACCGACG AAGTTGACAC CTTCAAAGAA CGTTTCGACA TCCGTCGTGACAACGCTAAA241AAAACCGGCA CCATCTCCAT CGACGACCTG CAACCGTCCG ACAACGAAAC CTTCACCTGC GCTGCAGACTCCACCATCTA321CGCTTCCTAC TACGAATGCG GTCACGGTCT GTCCACCGGT GGTTACGGTT ACGACGGTAA AACCCGTCAGGTTGGTCTGG401ACGTTTTCGT CTCGTCGGCC AGCTCGGCCiMab D16001 CATA TGATCAAAGT TTACACCGAC CGTGAAAACT ACGGTGCTGT TGGTTCCCAG GTTACCCTGCACTGCTCCGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGATCTGCTT CACCTGGCGT TACCAGCCGG AAGGTGACCG TGACGCTATCTCCATCTTCC161ACTACAACAT GGGTGACGGT TCCATCGTTA TCCACAACCT GGACTACTCC GACAACGGTA CCTTCACCTGCGCTGCTGAC241TCCACCATCT ACGCTTCCTA CTACGAATGC GGTCACGGTA TCTCCACCGG TGGTTACGGT TACGTTGGTAAAACCTCCCA321GGTTACCCTG TACGTTTTCG AGGCCAGCTC GGCCiMab D16021CATATGGCTG TTAAACCGGT TATCGGTTCC AAAGCTCCGA ACTTCGGTGA AAACGGTGAC GTTAAAACCATCGACCGTGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGACCTGCGG TGGTGTTTTC TTCCAGGGTC CGACCGACGA CTCCACCAACGTTGCTACCA161TCAACATGGG TGGTGGTATC ACCTACTACG GTGACTCCGT TAAAGAAACC TTCGACATCC GTCGTGACAACGCTAAATCC241ACCCGTACCG AATCCTACGA CGACAACCAG CCGGAAGGTC TGACCGAAGT TAAATGCGCT GCAGACTCCACCATCTACGC
321TTCCTACTAC GAATGCGGTC ACGGTCTGTC CACCGGTGGT TACGGTTACG ACGTTTCCTC CCGTCTGTACGGTTACGACA401TCCTGGTCTC GTCGGCCAGC TCGGCCiMab D17001 CATA TGAAAGACCC GGAAATCCAC CTGTCCGGTC CGCTGGAAGC TGGTAAACCG ATCACCGTTAAATGCTCCGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGCTGTGCAT CGACCTGCTG AAAGGTGACC ACCTGATGAA ATCCCAGGAATTCAACATGG161GTTCCCTGGA AGTTACCTTC ACCCCGGTTA TCGAAGACAT CGGTAAAGTT CTGGTTTGCG CTGCTGACTCCACCATCTAC241GCTTCCTACT ACGAATGCGG TCACGGTATC TCCACCGGTG GTTACGGTTA CGTTCGTCAG GCTGTTAAAGAACTGCAGGT321TGACTCGGCC AGCTCGGCCiMab D17011 CATA TGAAACCGAT CACCGTTAAA TGCTCCGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG CTGTGCATCGACCTGCTGAA81AGGTGACCAC CTGATGAAAT CCCAGGAATT CAACATGGGT TCCCTGGAAG TTACCTTCAC CCCGGTTATCGAAGACATCG161GTAAAGTTCT GGTTTGCGCT GCTGACTCCA CCATCTACGC TTCCTACTAC GAATGCGGTC ACGGTATCTCCACCGGTGGT241TACGGTTACG TTCGTCAGGC TGTTAAAGAA CTGCAGGTTG ACTCGGCCAG CTCGGCC
表5
表6吸收(450nm)ELK 溶菌酶(100每孔应用的iMabNo.ofβ-纯化方法 μg/ml)折叠 iMab量(in100μl) (对照)13029 尿素 ～50ng0.045 0.34516029 尿素 ～50ng0.043 0.35712029 尿素 ～50ng0.041 0.317116 9 尿素 ～50ng0.042 0.238101 7 尿素 ～20ng0.043 0.142111 9 尿素 ～50ng0.043 0.420701 6 尿素 ～10ng0.069 0.094122 9 尿素 ～50ng0.051 0.27113007 尿素 ～50ng0.041 0.32512007 尿素 ～5ng 0.040 0.061900 7 尿素 ～10ng0.043 0.087100 9 尿素 ～50ng0.040 0.494100 9 加热(60℃)～50ng0.041 0.369表X.纯化的iMab变体对溶菌酶的结合性质。
分析多种含有6-，7-，或9β-折叠的纯化的iMab对ELK(对照)和溶菌酶的结合，如实施例8，15，19和23所述。所有iMab使用尿素及随后用有助于再折叠的基质进行纯化(实施例7)，除了iMab100，其还通过热诱导包涵体溶解进行纯化(实施例6)。
表7
表81NEUATOM 1CA GLY2 -33.839 -10.967 -0.688 1.00 25.06 CATOM 2CA GLY3 -31.347-8.590 -2.388 1.00 20.77 CATOM 3CA GLY4 -29.325-6.068 -0.288 1.00 19.01 CATOM 4CA GLY5 -27.767-2.669 -1.162 1.00 19.75 CATOM 5CA GLY6 -27.1090.4871.010 1.00 22.33 CATOM 6CA GLY7 -29.8343.2040.812 1.00 24.80 CATOM 7CA GLY8 -27.5426.1610.057 1.00 28.23 CATOM 8CA GLY9 -23.7906.593-0.286 1.00 26.37 CATOM 9CA GLY10 -21.7509.765-0.074 1.00 29.08 CATOM 10 CA GLY11 -18.50510.289 -1.920 1.00 26.48 CATOM 11 CA GLY12 -15.85912.991 -2.286 1.00 27.26 CATOM 12 CA GLY13 -14.78214.286 -5.685 1.00 26.73 CATOM 13 CA GLY15 -12.2219.666-4.538 1.00 23.37 CATOM 14 CA GLY16 -13.8626.196-4.876 1.00 22.86 CATOM 15 CA GLY17 -16.9484.527-3.422 1.00 20.21 CATOM 16 CA GLY18 -18.0420.875-3.195 1.00 19.23 CATOM 17 CA GLY19 -21.543-0.132 -4.244 1.00 17.13 CATOM 18 CA GLY20 -22.550-3.266 -2.294 1.00 19.06 CATOM 19 CA GLY21 -24.854-5.946 -3.635 1.00 15.28 CATOM 20 CA GLY22 -25.493-9.401 -2.203 1.00 15.88 CATOM 21 CA GLY23 -28.333-11.882 -1.980 1.00 18.12 CATOM 22 CA GLY24 -29.458-14.458 0.564 1.00 18.67 CATOM 23 CA GLY25 -31.806-17.445 0.594 1.00 20.29 CATOM 24 CA GLY33 -26.348-16.618 -10.937 1.00 24.64 CATOM 25 CA GLY34 -26.032-13.298 -12.772 1.00 21.24 CATOM 26 CA GLY35 -25.552-9.691 -11.546 1.00 17.90 CATOM 27 CA GLY36 -26.440-6.639 -13.630 1.00 16.78 CATOM 29 CA GLY37 -25.790-3.001 -12.553 1.00 15.77 CATOM 29 CA GLY38 -27.841-0.127 -14.139 1.00 16.15 CATOM 30 CA GLY39 -27.4213.671-13.662 1.00 17.11 CATOM 31 CA GLY40 -30.0236.514-13.788 1.00 19.95 CATOM 32 CA GLY69 -13.9753.798-13.786 1.00 19.37 CATOM 33 CA GLY70 -15.5170.412-12.834 1.00 17.40 CATOM 34 CA GLY71 -13.840-2.419 -10.867 1.00 17.48 CATOM 35 CA GLY72 -15.422-5.847 -10.205 1.00 17.29 CATOM 36 CA GLY73 -14.951-6.863 -6.568 1.00 17.82 CATOM 37 CA GLY74 -17.604-9.507 -6.001 1.00 20.26 CATOM 38 CA GLY81 -21.892-8.819 -6.747 1.00 15.95 CATOM 39 CA GLY82 -20.250-5.588 -5.572 1.00 14.51 CATOM 40 CA GLY83 -18.342-3.035 -7.740 1.00 14.59 CATOM 41 CA GLY84 -16.2540.065-7.050 1.00 15.51 CATOM 42 CA GLY85 -16.8473.424-8.859 1.00 16.32 CATOM 43 CA GLY86 -13.4905.206-9.235 1.00 17.40 CATOM 44 CA GLY87 -12.3928.860-9.565 1.00 20.53 CATOM 45 CA GLY89 -17.02213.543 -10.254 1.00 33.26 CATOM 46 CA GLY90 -19.76316.019 -9.293 1.00 33.41 CATOM 47 CA GLY91 -21.94614.910 -12.147 1.00 28.24 CATOM 48 CA GLY92 -22.00111.307 -11.004 1.00 23.61 CATOM 49 CA GLY93 -25.08411.842 -8.710 1.00 22.12 CATOM 50 CA GLY94 -27.7979.318-9.433 1.00 18.21 CATOM 51 CA GLY95 -29.4086.033-8.549 1.00 18.57 CATOM 52 CA GLY96 -27.7532.594-9.167 1.00 17.72 CATOM 53 CA GLY97 -29.778-0.614 -9.279 1.00 18.72 CATOM 54 CA GLY98 -28.513-4.176 -8.741 1.00 18.53 CATOM 55 CA GLY99 -30.558-6.911 -10.517 1.00 18.45 CATOM 56 CA GLY100-29.969-10.529 -9.427 1.00 17.71 CATOM 57 CA GLY108-34.816-10.904 -11.290 1.00 32.51 CATOM 58 CA GLY109-34.993-9.224 -7.900 1.00 28.62 CATOM 59 CA GLY110-33.628-5.668 -7.622 1.00 23.31 CATOM 60 CA GLY111-32.406-3.176 -5.020 1.00 19.82 CATOM 61 CA GLY112-31.1400.403-5.467 1.00 19.75 CATOM 62 CA GLY113-28.6972.839-3.811 1.00 18.42 CATOM 63 CA GLY114-28.4616.627-4.417 1.00 18.70 CATOM 64 CA GLY115-25.1108.413-4.799 1.00 19.95 CATOM 65 CA GLY116-24.28612.022 -3.753 1.00 25.78 CATOM 66 CA GLY117-20.81613.493 -4.292 1.00 31.06 CATOM 67 CA GLY118-19.61616.565 -2.380 1.00 38.60 CATOM 68 CA GLY119-16.26718.356 -1.757 1.00 42.50 C
TER1MELATOM 69 CA GLY A3 -34.517 -10.371 -1.234 1.0036.96CATOM 70 CA GLY A4 -31.790 -8.022-2.500 1.0028.80CATOM 71 CA GLY A5 -30.310 -5.6030.0181.0031.G4CATOM 72 CA GLY A6 -27.884 -2.957-1.209 1.0024.68CATOM 73 CA GLY A7 -25.500 -1.0421.0731.0021.60CATOM 74 CA GLY A8 -23.005 1.710 0.4581.0017.27CATOM 75 CA GLY A9 -23.567 4.843 -1.499 1.0018.58CATOM 76 CA GLY A10 -23.648 8.381 -0.100 1.0016.78CATOM 77 CA GLY A11 -21.736 11.497-1.127 1.0011.36CATOM 78 CA GLY A12 -18.140 11.942-1.980 1.008.84 CATOM 79 CA GLY A13 -16.006 14.459-3.746 1.0011.16CATOM 80 CA GLY A14 -15.243 14.091-7.418 1.0010.62CATOM 81 CA GLY A16 -12.920 9.782 -4.554 1.007.90 CATOM 82 CA GLY A17 -14.217 6.244 -4.387 1.007.54 CATOM 83 CA GLY A18 -17.233 4.430 -2.940 1.006.47 CATOM 84 CA GLY A19 -18.104 0.790 -2.418 1.005.43 CATOM 85 CA GLY A20 -21.615 -0.610-2.878 1.008.09 CATOM 86 CA GLY A21 -22.724 -4.116-1.837 1.008.76 CATOM 87 CA GLY A22 -25.644 -6.399-2.433 1.008.33 CATOM 88 CA GLY A23 -26.642 -9.585-0.745 1.0013.77CATOM 89 CA GLY A24 -29.318 -11.732 -2.396 1.0017.53CATOM 90 CA GLY A25 -31.340 -13.525 0.2561.0023.23CATOM 91 CA GLY A26 -33.969 -16.194 0.0811.0025.25CATOM 92 CA GLY A32 -27.171 -16.809 -12.135 1.005.00 CATOM 93 CA GLY A33 -26.411 -13.068 -12.502 1.004.64 CATOM 94 CA GLY A34 -26.109 -10.036 -10.166 1.002.48 CATOM 95 CA GLY A35 -25.386 -6.603-11.615 1.002.00 CATOM 96 CA GLY A36 -25.845 -2.895-11.151 1.003.40 CATOM 97 CA GLY A37 -28.032 -0.410-12.986 1.006.64 CATOM 98 CA GLY A38 -28.158 3.311 -12.472 1.008.74 CATOM 99 CA GLY A39 -30.731 6.025 -13.179 1.0019.24CATOM 100 CA GLY A67 -12.972 2.698 -13.036 1.0012.68CATOM 101 CA GLY A68 -15.482 0.261 -11.584 1.008.15 CATOM 102 CA GLY A69 -14.843 -3.306-10.511 1.008.39 CATOM 103 CA GLY A70 -17.520 -5.831-9.556 1.005.47 CATOM 104 CA GLY A71 -16.742 -8.900-7.482 1.008.48 CATOM 105 CA GLY A72 -18.459 -11.484 -5.287 1.0018.00CATOM 106 CA GLY A79 -21.342 -8.788-4.615 1.009.55 CATOM 107 CA GLY A80 -19.553 -5.399-4.519 1.004.94 CATOM 108 CA GLY A81 -18.901 -2.601-6.858 1.004.92 CATOM 109 CA GLY A82 -15.755 -0.638-6.085 1.007.44 CATOM 110 CA GLY A83 -16.081 2.748 -7.765 1.006.55 CATOM 111 CA GLY A84 -12.869 4.759 -8.177 1.009.49 CATOM 112 CA GLY A85 -12.245 8.019 -10.028 1.0012.54CATOM 113 CA GLY A87 -16.853 12.035-11.452 1.0015.46CATOM 114 CA GLY A88 -20.054 14.055-10.955 1.0013.94CATOM 115 CA GLY A89 -21.497 12.384-14.095 1.0018.68CATOM 116 CA GLY A90 -21.637 9.217 -11.955 1.009.55 CATOM 117 CA GLY A91 -24.288 10.888-9.734 1.006.54 CATOM 118 CA GLY A92 -27.349 8.637 -9.936 1.006.38 CATOM 119 CA GLY A93 -29.573 6.105 -8.204 1.006.33 CATOM 120 CA GLY A94 -27.866 2.727 -8.154 1.006.08 CATOM 121 CA GLY A95 -29.928 -0.377-8.312 1.0010.12CATOM 122 CA GLY A96 -28.884 -3.923-7.638 1.0010.76CATOM 123 CA GLY A97 -30.439 -6.641-9.794 1.009.08 CATOM 124 CA GLY A98 -30.321 -10.442 -10.097 1.008.28 CATOM 125 CA GLY A122-35.231 -9.331-9.016 1.0015.49CATOM 126 CA GLY A123-34.520 -5.802-8.079 1.0012.37CATOM 127 CA GLY A124-33.455 -4.050-4.953 1.0014.34CATOM 128 CA GLY A125-33.918 -0.696-3.317 1.0022.49CATOM 129 CA GLY A126-32.054 2.128 -5.022 1.0017.72CATOM 130 CA GLY A127-29.137 3.817 -3.342 1.0016.51CATOM 131 CA GLY A128-29.275 7.401 -4.265 1.0016.84CATOM 132 CA GLY A129-24.678 8.216 -4.904 1.0011.90CATOM 133 CA GLY A130-23.878 11.873-5.299 1.008.75 CATOM 134 CA GLY A131-20.508 13.061-6.466 1.0014.37CATOM 135 CA GLY A132-19.632 16.597-5.198 1.0023.32CATOM 136 CA GLY A133-17.732 19.533-6.720 1.0036.14C
TER1F97ATOM 137 CA GLY A 29-33.679-11.517 -0.808 1.00 41.25 CATOM 138 CA GLY A 30-31.468-8.740-2.170 1.00 22.43 CATOM 139 CA GLY A 31-30.250-5.8860.038 1.00 24.73 CATOM 140 CA GLY A 32-27.706-3.1050.530 1.00 20.95 CATOM 141 CA GLY A 33-25.811-1.7233.523 1.00 28.77 CATOM 142 CA GLY A 34-26.3491.878 2.419 1.00 33.48 CATOM 143 CA GLY A 35-29.0273.067 -0.012 1.00 27.47 CATOM 144 CA GLY A 36-27.9806.732 0.249 1.00 29.20 CATOM 145 CA GLY A 37-24.2796.955 -0.586 1.00 23.99 CATOM 146 CA GLY A 38-22.27510.179-0.393 1.00 24.19 CATOM 147 CA GLY A 39-18.59210.286-1.302 1.00 15.35 CATOM 148 CA GLY A 40-16.11713.059-2.218 1.00 12.64 CATOM 149 CA GLY A 41-15.28613.515-5.906 1.00 9.24 CATOM 150 CA GLY A 43-12.4128.992 -4.540 1.00 14.44 CATOM 151 CA GLY A 44-13.1155.267 -4.685 1.00 21.52 CATOM 152 CA GLY A 45-16.4603.862 -3.630 1.00 22.48 CATOM 153 CA GLY A 46-18.0820.444 -3.532 1.00 21.22 CATOM 154 CA GLY A 47-21.8170.219 -4.135 1.00 20.06 CATOM 155 CA GLY A 48-22.797-2.825-2.072 1.00 13.56 CATOM 156 CA GLY A 49-25.390-5.432-3.034 1.00 19.14 CATOM 157 CA GLY A 50-25.724-8.537-0.876 1.00 22.49 CATOM 158 CA GLY A 51-28.046-11.470 -1.549 1.00 20.58 CATOM 159 CA GLY A 52-28.951-14.871 -0.105 1.00 24.55 CATOM 160 CA GLY A 53-30.893-17.875 -1.353 1.00 17.82 CATOM 161 CA GLY A 57-26.875-15.797 -9.701 1.O0 10.39 CATOM 162 CA GLY A 58-26.674-13.408 -12.632 1.00 8.00 CATOM 163 CA GLY A 59-25.845-9.939-11.318 1.00 7.62 CATOM 164 CA GLY A 60-26.653-6.841-13.371 1.00 6.84 CATOM 165 CA GLY A 61-26.457-3.109-12.711 1.00 8.48 CATOM 166 CA GLY A 62-28.184-0.168-14.336 1.0O 13.92 CATOM 167 CA GLY A 63-27.6113.567 -14.043 1.00 11.89 CATOM 168 CA GLY A 64-30.5325.981 -14.200 1.00 23.18 CATOM 169 CA GLY A 85-12.8882.268 -13.813 1.00 17.93 CATOM 170 CA GLY A 86-15.508-0.149-12.447 1.00 15.44 CATOM 171 CA GLY A 87-14.603-3.542-11.016 1.00 16.79 CATOM 172 CA GLY A 88-17.118-6.318-10.381 1.00 14.07 CATOM 173 CA GLY A 89-17.389-8.592-7.349 1.00 16.75 CATOM 174 CA GLY A 91-20.798-8.262-3.202 1.00 17.13 CATOM 175 CA GLY A 92-20.995-5.059-5.247 1.00 12.84 CATOM 176 CA GLY A 93-19.287-2.826-7.795 1.00 12.33 CATOM 177 CA GLY A 94-16.243-0.709-6.986 1.00 12.43 CATOM 178 CA GLY A 95-15.4852.596 -8.696 1.00 11.12 CATOM 179 CA GLY A 96-11.7653.339 -8.675 1.00 16.95 CATOM 180 CA GLY A 97-12.8557.004 -8.899 1.00 21.11 CATOM 181 CA GLY A 99-16.93512.349-10.689 1.00 22.37 CATOM 182 CA GLY A 100 -19.97414.613-10.361 1.00 23.75 CATOM 183 CA GLY A 101 -21.19013.009-13.619 1.00 22.84 CATOM 184 CA GLY A 102 -21.8209.789 -11.695 1.00 15.51 CATOM 185 CA GLY A 103 -24.65111.224-9.565 1.00 11.57 CATOM 186 CA GLY A 104 -27.8179.170 -9.882 1.00 9.52 CATOM 187 CA GLY A 105 -29.4015.897 -8.871 1.00 12.64 CATOM 188 CA GLY A 106 -27.8512.484 -9.413 1.00 7.32 CATOM 189 CA GLY A 107 -30.057-0.590-9.334 1.00 7.52 CATOM 190 CA GLY A 108 -28.588-3.984-8.524 1.00 9.97 CATOM 191 CA GLY A 109 -30.576-6.743-10.211 1.00 12.91 CATOM 192 CA GLY A 110 -29.973-10.300 -9.043 1.00 11.27 CATOM 193 CA GLY A 118 -35.528-12.495 -8.616 1.00 13.29 CATOM 194 CA GLY A 119 -34.748-9.395-6.594 1.00 15.55 CATOM 195 CA GLY A 120 -33.436-5.837-6.855 1.00 11.36 CATOM 196 CA GLY A 121 -32.267-2.894-4.778 1.00 11.36 CATOM 197 CA GLY A 122 -31.6350.758 -5.660 1.00 11.14 CATOM 198 CA GLY A 123 -28.7912.935 -4.379 1.00 11.58 CATOM 199 CA GLY A 124 -28.6266.699 -4.773 1.00 15.52 CATOM 200 CA GLY A 125 -25.1288.065 -5.281 1.00 9.61 CATOM 201 CA GLY A 126 -24.27511.677-4.483 1.00 10.84 CATOM 202 CA GLY A 127 -20.73912.778-5.330 1.00 10.58 CATOM 203 CA GLY A 128 -19.66715.540-2.929 1.00 14.41 CATOM 204 CA GLY A 129 -18.35518.818-4.335 1.00 12.32 C
TER1DQTATOM 205 CA GLY C 2 -37.000-7.803 -3.232 1.00 35.96 CATOM 206 CA GLY C 3 -33.582-6.481 -4.122 1.00 30.20 CATOM 207 CA GLY C 4 -31.887-3.962 -1.908 1.00 27.24 CATOM 208 CA GLY C 5 -28.640-2.044 -1.950 1.00 23.16 CATOM 209 CA GLY C 6 -27.0690.7200.216 1.00 22.73 CATOM 210 CA GLY C 7 -28.2564.289-0.273 1.00 24.33 CATOM 211 CA GLY C 8 -24.8005.874-0.329 1.00 21.64 CATOM 212 CA GLY C 9 -21.2524.822-1.130 1.00 20.25 CATOM 213 CA GLY C 10 -18.1867.087-0.970 1.00 20.37 CATOM 214 CA GLY C 11 -15.8555.961-3.761 1.00 22.46 CATOM 215 CA GLY C 12 -12.1595.548-2.990 1.00 24.30 CATOM 216 CA GLY C 14 -8.661 5.520-6.931 1.00 30.82 CATOM 217 CA GLY C 15 -12.2185.495-8.241 1.00 25.29 CATOM 218 CA GLY C 16 -13.3422.240-6.604 1.00 21.63 CATOM 219 CA GLY C 17 -16.8531.719-5.287 1.00 20.22 CATOM 220 CA GLY C 18 -17.869-1.533 -3.647 1.00 20.86 CATOM 221 CA GLY C 19 -21.187-2.475 -2.147 1.00 21.25 CATOM 222 CA GLY C 20 -23.544-5.395 -1.581 1.00 21.73 CATOM 223 CA GLY C 21 -26.665-6.116 -3.611 1.00 22.97 CATOM 224 CA GLY C 22 -29.032-8.318 -1.684 1.00 26.59 CATOM 225 CA GLY C 23 -32.087-10.258 -2.722 1.00 26.47 CATOM 226 CA GLY C 24 -34.892-12.390 -1.373 1.00 31.54 CATOM 227 CA GLY C 25 -36.216-14.994 -1.386 1.00 31.33 CATOM 228 CA GLY C 32 -28.221-15.396 -10.763 1.00 21.25 CATOM 229 CA GLY C 33 -27.582-12.861 -13.499 1.00 21.86 CATOM 230 CA GLY C 34 -26.676-9.507 -11.974 1.00 19.78 CATOM 231 CA GLY C 35 -26.814-6.238 -13.884 1.00 19.11 CATOM 232 CA GLY C 36 -25.505-2.810 -12.890 1.00 19.23 CATOM 233 CA GLY C 37 -27.3710.131-14.384 1.00 25.95 CATOM 234 CA GLY C 38 -26.5923.830-14.106 1.00 30.90 CATOM 235 CA GLY C 39 -29.7615.879-13.906 1.00 40.84 CATOM 236 CA GLY C 66 -16.463-4.323 -12.728 1.00 23.17 CATOM 237 CA GLY C 67 -15.869-7.277 -10.506 1.00 22.56 CATOM 238 CA GLY C 68 -17.716-9.180 -7.811 1.00 21.60 CATOM 239 CA GLY C 69 -18.545-12.367 -5.959 1.00 22.69 CATOM 240 CA GLY C 75 -23.757-10.273 -4.597 1.00 23.03 CATOM 241 CA GLY C 76 -20.713-8.179 -3.648 1.00 24.30 CATOM 242 CA GLY C 77 -20.192-5.631 -6.425 1.00 23.46 CATOM 243 CA GLY C 78 -17.130-3.554 -7.209 1.00 25.74 CATOM 244 CA GLY C 79 -17.159-0.822 -9.864 1.00 26.08 CATOM 245 CA GLY C 80 -13.7220.567-10.770 1.00 29.15 CATOM 246 CA GLY C 81 -12.1543.299-12.879 1.00 26.23 CATOM 247 CA GLY C 77 -15.85712.510 -10.546 1.00 24.79 CATOM 248 CA GLY C 85 -18.20012.785 -13.517 1.00 25.37 CATOM 249 CA GLY C 86 -19.3829.218-12.817 1.00 25.21 CATOM 250 CA GLY C 87 -20.99310.374 -9.582 1.00 23.95 CATOM 251 CA GLY C 88 -24.5889.210-9.761 1.00 23.67 CATOM 252 CA GLY C 89 -27.2276.570-9.098 1.00 22.75 CATOM 253 CA GLY C 90 -26.4362.913-9.751 1.00 23.39 CATOM 254 CA GLY C 91 -29.1500.276-9.841 1.00 22.55 CATOM 255 CA GLY C 92 -28.491-3.332 -9.011 1.00 22.29 CATOM 256 CA GLY C 93 -30.706-5.811 -10.865 1.00 20.45 CATOM 257 CA GLY C 94 -30.958-9.487 -9.970 1.00 20.73 CATOM 258 CA GLY C 105-35.975-7.679 -9.086 1.00 24.94 CATOM 259 CA GLY C 106-34.133-4.376 -8.832 1.00 25.24 CATOM 260 CA GLY C 107-32.992-2.157 -5.970 1.00 24.05 CATOM 261 CA GLY C 108-33.7171.590-5.665 1.00 25.85 CATOM 262 CA GLY C 109-30.1272.411-6.479 1.00 23.77 CATOM 263 CA GLY C 110-26.9423.329-4.666 1.00 22.46 CATOM 264 CA GLY C 111-25.7596.950-4.824 1.00 24.13 CATOM 265 CA GLY C 112-22.0656.752-5.605 1.00 22.83 CATOM 266 CA GLY C 113-20.1369.957-4.898 1.00 23.40 CATOM 267 CA GLY C 114-16.79910.239 -6.594 1.00 25.42 CEND
表9分子zp-comb目标功能(越低越好) (越低越好)iMab 101 -5.63 853iMab 201 -5.34 683iMab IS003 -4.29 860iMab IS004 -1.49 2744iMab 300 -6.28 854iMab IS006 -3.29 912iMab IS007 -2.71 1558iMab IS008 -1.10 808iMab IS009 -3.70 1623iMab IS0010-2.85 2704iMab 400 -5.58 734iMab IS0012-5.35 889iMab IS0013-2.85 1162iMab IS0014-2.92 924iMab IS0015-3.48 925iMab IS0016-3.23 837iMab 500 -3.94 1356iMab IS0018-2.97 867iMab IS0019-3.11 1366iMab 600 -4.15 880iMab 700 -3.94 1111iMab 800 -3.68 653iMab 900 -4.65 833iMab 1000 -3.57 631iMab IS0025-2.79 1080iMab 1100 -4.07 823iMab IS0027-3.59 809iMab IS0028-3.51 1431iMab 1200 -2.66 783iMab 1300 -3.18 1463iMab IS0031-2.98 1263iMab IS0032-3.84 896iMab 1400 -5.17 939iMab IS0034-4.38 966iMab IS0035-3.86 966iMab IS0036-3.29 862iMab IS0037-3.45 874iMab IS0038-2.80 792iMab IS0039-4.44 1858iMab IS0040-S.01 751iMab IS0041-2.70 907iMab IS0042-3.14 837iMab IS0043-2.80 1425iMab IS0044-3.27 1492iMab IS0045-3.56 1794iMab IS0046-3.79 832
表10IMABIS003IVLTQS-P--ASLAV-S-----LGQRATISCRASGYTIGPS-FMNWFQQKP------G--Q-PP-K-LLIYANMGDFSLNI-H-P-M-EE---EDTA---MYFCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYLTFGAGTKVELKRIMABIS004PTVSIF-P--P-SSE-QL----TSGGASVVCFASGYTIGPI-NVKWKIDGS------E----------------NMGSSTLTL-T--K--D-E---YERHN---SYTCAADSTTYASYYECGHGISTGGYGYPIVKSFNRNE---IMABIS006TPPSVY-P--L-APG-SAAQTNSMVTLGCLVKASGYTIGPE-PVTVTWNSG------S--L--SS-G--VHTFPNMGTLSSSV-T--V--P-SSTWPSETN---TCNCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-STKVDKKIVPK-IMABIS007LASPAKTH--E-KTP-I-----EGRPFQLDCVASGYTIGP--LITWKKRLSGADPN------------------NMG-GNLYF-T--I--V-TK---EDVSDIYKYVCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYEVVLVEYEIKGVTIMABIS008PVLKDQPA--E-VLF-R-----ENNPTVLECLASGYTIGPV-KYSWKKDGKSYNW-----Q--EH-N--AALRKNMGEGSLVF-L--R--P-QA---SDEG---HYQCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYVASSRVISFRKTYIMABIS009KYEQKPEK--V-IVV-K-----QGQDVTIPCKASGYTIGPP-NVVWSHNAKP----------------------NMGDSGLVI-K--G--V-KN---GDKG---YYGCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-DKYFETLVQVN-IMABIS010VPQYVS-K--D-MMA-K-----AGDVTMIYCMASGYTIGPG-YPNYFKNGKDVN--------------------NMGGKRLLF-K--T--T-LP---EDEG---VYTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-PQKHSLKTTVVSIMABIS012IQMTQS-P-SS-LSA-S-----VGDRVTITCSASGYTIGPN-YLNWYQQKP------G--K--AP-K--VLIYFNMGDFTLTI-S--S--L-QP---EDFA---TYYCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYWTFGQGTKVEIKRIMABIS013PSVFIF-P--P-SDE-Q----LKSGTASVVCLASGYTIGPA-KVQWLVD---------------N-A--LQS--NMGSSTLTL-S--K--A-DY---EKHK---VYACAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYPVTKSFNRGEC--IMABIS014KGPSVF-P--L-APS-SKSTSGGTAALGCLVKASGYTIGPE-PVTVSWNSG------A--L--TS-G--VHTFPNMGSLSSVV-T--V--P-SSSLGTQTY---ICNCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-NTKVDKKVEPKSIMABIS015NPPHNL-S--V-INSEE-----LSSILKLTWTASGYTIGPL-KYNIQYRTKD-----A--S--TW-S--QIPP-NMGRSSFTV-Q--D--L-KP---FTEY---VFRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSDWSEEASGITYEIMABIS016EKPKNL-S--C-IV--N-----EGKKMRCEWDASGYTIGPT-NFTLKSEWA------T--H--K--F--ADCKANMGPTSCTVDY--S--T-VY---FVNI---EVWCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYKVTSDHINFDPVYIMABIS018NAPKLT-G-IT-CQA-D--------KAEIHWEASGYTIGPL-HYTIQFNTS------F--TPASW-D--AAYEKNMGDSSFVV-Q--M--S--P---WANY---TFRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSPPSAHSDSCT--
IMABIS019GPEELL-C--F-TE--------RLEDLVCFWEASGYTIGPG-QYSFSYQLE------D--E--PW-K--LCR--NMGRFWCSL-P--TADT-SS---FVPL---ELRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGAPRYHRVIHINEIMABIS020APVGLV-A--R-LA--D-----ESGHVVLRWLASGYTIGPI-RYEVDVSAG------Q--GAG-S-V--QRVEINMGRTECVL-S--N--L-RG---RTRY---TFACAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSEWSEPVSLLTPSIMABIS025GPEELL-C--F-TE--------RLEDLVCFWEASGYTIGPPGNYSFSYQLE------D--E--PW-K--LCR--NMGRFWCSL-P--TADT-SS---FVPL---ELRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGAPRYHRVIHINEIMABIS027APVGLV-A--R-LAD-E------SGHVVLRWLASGYTIGPI-RYEVDVSAG------QGAG--SV-Q--RVEILNMG-TECVL-S--N--L-RG---RTRY---TFACAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSEWSEPVSLLTPSIMABIS028GPEELL-C--F-TE--------RLEDLVCFWEASGYTIGPG-QYSFSYQLE------D--E--PW-K--LCR--NMGRFWCSL-PTAD--T-SS---FVPL---ELRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGAPRYHRVIHINEIMABIS031LMFKNAPT-PQ-EFK-------EGEDAVIVCDASGYTIGPP-TIIWKHKGRDV---------------------NMGNNYLQI-R--G--I-KK---TDEG---TYRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYINFK-DIQVIV-IMABIS032DSPTGI-D--F-SD--I-----TANSFTVHWIASGYTIGPT-GYRIRHHPE------H--F--SGRP--REDRVNMGRNSITL-T--N--L-TP---GTEY---VVSCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSPL-LIGQQSTVSIMABIS034SPPTNL-H--L-EAN-P-----DTGVLTVSWEASGYTIGPT-GYRITTTPT------N--G--QQGN-SLEEVVNMGQSSCTG-D--N--L-SP---GLEY---NVSCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSVP-ISDTIIPAVIMABIS035PPTDLR-F--T-NIG-P-----D--TMRVTWAASGYTIGPT-NFLVRYSPV------K--N--EEDV--AELSINMGDNAVVL-T--N--L-LP---GTEY---VVSCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSTPL-RGRQKTGLIMABIS036NPPHNL-S--V-INSEE-----LSSILKLTWTASGYTIGPL-KYNIQYRTKD-----A--S--TW-S--QIPPENMGRSSFTV-Q--D--L-KP---FTEY---VFRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSDWSEEASGITYEIMABIS037PCGYIS-P--ESPVV-Q-----LHSNFTAVCVASGYTIGPN-YIVWKTN---------------H-F--TIPK-NMGASSVTF-T--D--I-AS---L-NI---QLTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYEQNVYGITIISGLIMABIS038EKPKNL-S--CIVN--------EGKKMRCEWDASGYTIGPT-NFTLKSEWA------T--H--KF----ADCKANMGPTSCTV-D--Y--STVY---FVNI---EVWCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYKVTSDHINFDPVYIMABIS039RFIVKP-Y--G-TEV-G-----EGQSANFYCRASGYTIGPP-VVTWHKD-----------D--RE-L--K----NMGDYGLTI-N--R--V-KG---DDKG---EYTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGTKEEIVFLNVTRIMABIS041SEPGRL-A--FNV---V-----SSTVTQLSWAASGYTIGPT-AYEVCYGLVNDDNRPI--
G--PM-K--KVLVDNMGNRMLLI-E--N--L-RE---SQPY---RYTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYWGPEREAIINLATIMABIS042APQNPN-A--K-AA--------GSRKIHFNWLASGYTIGPM-GYRVKYWIQ------G--D--SE-SEAHLLDSNMGVPSVEL-T--N--L-YP---YCDY---EMKCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGPYSSLVSCRTHQIMABIS044IEVEKP--LYG-VEV-F-----VGETAHFEIKASGYTIGPV-HGQWKLKGQP----------------------NMGKHILIL-H--N--C-QL---GMTG---EVSCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-NAKSAANLKVKEIMABIS045FKIETT-PESR-YLA-Q-----IGDSVSLTCSASGYTIGPP-FFSWRTQIDS----------------------NMGTSTLTM-N--P--V-SF---GNEH---SYLCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYRKLEKGIQVEIYS
表111NEUATOM 1 CA GLY 15 -13.154 9.208-3.380 1.00 23.37 CATOM 2 CA GLY 16 -14.293 5.561-3.888 1.00 22.86 CATOM 3 CA GLY 17 -16.782 3.259-2.179 1.00 20.21 CATOM 4 CA GLY 18 -17.260 -0.530 -2.245 1.00 19.23 CATOM 5 CA GLY 19 -20.702 -2.004 -2.834 1.00 17.13 CATOM 6 CA GLY 20 -20.862 -5.442 -1.161 1.00 19.06 CATOM 7 CA GLY 21 -22.944 -8.326 -2.443 1.00 15.28 CATOM 8 CA GLY 22 -22.792 -11.964 -1.378 1.00 15.88 CATOM 9 CA GLY 23 -25.143 -14.899 -1.017 1.00 18.12 CATOM 10 CA GLY 24 -25.395 -17.869 1.3271.00 18.67 CATOM 11 CA GLY 25 -27.226 -21.197 1.3561.00 20.29 CATOM 12 CA GLY 33 -24.118 -18.315 -10.706 1.00 24.64 CATOM 13 CA GLY 34 -24.637 -14.823 -12.130 1.00 21.24 CATOM 14 CA GLY 35 -24.488 -11.328 -10.549 1.00 17.90 CATOM 15 CA GLY 36 -26.181 -8.277 -12.056 1.00 16.78 CATOM 16 CA GLY 37 -25.898 -4.707 -10.644 1.00 15.77 CATOM 17 CA GLY 38 -28.607 -2.078 -11.499 1.00 16.15 CATOM 18 CA GLY 39 -28.680 1.671-10.617 1.00 17.11 CATOM 19 CA GLY 40 -31.657 4.031-9.957 1.00 19.95 CATOM 20 CA GLY 69 -15.648 4.079-12.895 1.00 19.37 CATOM 21 CA GLY 70 -16.470 0.404-12.145 1.00 17.40 CATOM 22 CA GLY 71 -14.063-2.286-10.851 1.00 17.48 CATOM 23 CA GLY 72 -14.971-5.980-10.384 1.00 17.29 CATOM 24 CA GLY 73 -13.707-7.259-7.030 1.00 17.82 CATOM 25 CA GLY 74 -15.790-10.357 -6.383 1.00 20.26 CATOM 26 CA GLY 81 -20.196-10.332 -6.333 1.00 15.95 CATOM 27 CA GLY 82 -18.870-7.004-5.037 1.00 14.51 CATOM 28 CA GLY 83 -17.786-3.962-7.142 1.00 14.59 CATOM 29 CA GLY 84 -16.094-0.638-6.409 1.00 15.51 CATOM 30 CA GLY 85 -17.4982.735 -7.656 1.00 16.32 CATOM 31 CA GLY 86 -14.5675.088 -8.340 1.00 17.40 CATOM 32 CA GLY 87 -14.1058.889 -8.375 1.00 20.53 CATOM 33 CA GLY 89 -19.42912.768-7.705 1.00 33.26 CATOM 34 CA GLY 90 -22.29114.637-6.007 1.00 33.41 CATOM 35 CA GLY 91 -24.76113.465-8.588 1.00 28.24 CATOM 36 CA GLY 92 -24.0719.808 -7.919 1.00 23.61 CATOM 37 CA GLY 93 -26.7369.584 -5.107 1.00 22.12 CATOM 38 CA GLY 94 -29.1276.723 -5.698 1.00 18.21 CATOM 39 CA GLY 95 -30.0453.141 -4.991 1.00 18.57 CATOM 40 CA GLY 96 -28.0330.110 -6.301 1.00 17.72 CATOM 41 CA GLY 97 -29.544-3.367-6.491 1.00 18.72 CATOM 42 CA GLY 98 -27.685-6.700-6.623 1.00 18.53 CATOM 43 CA GLY 99 -29.584-9.550-8.379 1.00 18.45 CATOM 44 CA GLY 100-28.276-13.106 -7.867 1.00 17.71 CATOM 45 CA GLY 108-33.268-14.108 -8.956 1.00 32.51 CATOM 46 CA GLY 109-33.081-12.828 -5.395 1.00 28.62 CATOM 47 CA GLY 110-32.234-9.138-4.891 1.00 23.31 CATOM 48 CA GLY 111-30.950-6.748-2.225 1.00 19.82 CATOM 49 CA GLY 112-30.333-2.979-2.412 1.00 19.75 CATOM 50 CA GLY 113-28.024-0.343-0.875 1.00 18.42 CATOM 51 CA GLY 114-28.4693.472 -1.024 1.00 18.70 CATOM 52 CA GLY 115-25.5465.827 -1.713 1.00 19.95 CATOM 53 CA GLY 116-25.0959.402 -0.363 1.00 25.78 CATOM 54 CA GLY 117-22.03711.484-1.264 1.00 31.06 CATOM 55 CA GLY 118-20.98514.5080.8051.00 38.60 CATOM 56 CA GLY 119-17.88416.7681.1011.00 42.50 CTER1MELATOM 57 CA GLY A16 -13.8539.205 -3.269 1.00 7.90 CATOM 58 CA GLY A17 -14.5575.500 -3.346 1.00 7.54 CATOM 59 CA GLY A18 -16.9583.068 -1.674 1.00 6.47 CATOM 60 CA GLY A19 -17.168-0.701-1.485 1.00 5.43 CATOM 61 CA GLY A20 -20.455-2.621-1.546 1.00 8.09 CATOM 62 CA GLY A21 -20.823-6.351-0.794 1.00 8.76 CATOM 63 CA GLY A22 -23.429-9.023-1.196 1.00 8.33 CATOM 64 CA GLY A23 -23.620-12.484 0.2111.00 13.77 C
ATOM 65 CA GLY A 24 -26.198 -14.877 -1.2451.00 17.53 CATOM 66 CA GLY A 25 -27.419 -17.241 1.448 1.00 23.23 CATOM 67 CA GLY A 26 -29.608 -20.285 1.362 1.00 25.25 CATOM 68 CA GLY A 32 -25.105 -18.522 -11.770 1.00 5.00 CATOM 69 CA GLY A 33 -24.991 -14.689 -11.775 1.00 4.64 CATOM 70 CA GLY A 34 -24.729 -11.897 -9.1521.00 2.48 CATOM 71 CA GLY A 35 -24.799 -8.264 -10.249 1.00 2.00 CATOM 72 CA GLY A 36 -25.716 -4.753 -9.2491.00 3.40 CATOM 73 CA GLY A 37 -28.543 -2.502 -10.376 1.00 6.64 CATOM 74 CA GLY A 38 -29.128 1.074-9.3791.00 8.74 CATOM 75 CA GLY A 39 -32.163 3.371-9.3091.00 19.24 CATOM 76 CA GLY A 67 -14.374 3.095-12.462 1.00 12.68 CATOM 77 CA GLY A 68 -16.189 0.136-10.946 1.00 8.15 CATOM 78 CA GLY A 69 -14.842 -3.360 -10.453 1.00 8.39 CATOM 79 CA GLY A 70 -16.896 -6.384 -9.4081.00 5.47 CATOM 80 CA GLY A 71 -15.309 -9.468 -7.8941.00 8.48 CATOM 81 CA GLY A 72 -16.197 -12.511 -5.7981.00 18.00 CATOM 82 CA GLY A 79 -19.282 -10.422 -4.3311.00 9.55 CATOM 83 CA GLY A 80 -18.031 -6.806 -4.0951.00 4.94 CATOM 84 CA GLY A 81 -18.236 -3.718 -6.1331.00 4.92 CATOM 85 CA GLY A 82 -15.331 -1.340 -5.6351.00 7.44 CATOM 86 CA GLY A 83 -16.455 2.094-6.7951.00 6.55 CATOM 87 CA GLY A 84 -13.706 4.649-7.4621.00 9.49 CATOM 88 CA GLY A 85 -13.919 9.136-8.9591.00 12.54 CATOM 89 CA GLY A 87 -19.256 11.437 -9.0961.00 15.46 CATOM 90 CA GLY A 88 -22.580 12.828 -7.8361.00 13.94 CATOM 91 CA GLY A 89 -24.298 11.258 -10.888 1.00 18.68 CATOM 92 CA GLY A 90 -23.577 7.916-9.1751.00 9.55 CATOM 93 CA GLY A 91 -26.004 8.885-6.3601.00 6.54 CATOM 94 CA GLY A 92 -28.681 6.180-6.3491.00 6.38 CATOM 95 CA GLY A 93 -30.154 3.149-4.6181.00 6.33 CATOM 96 CA GLY A 94 -27.980 0.121-5.2741.00 6.08 CATOM 97 CA GLY A 95 -29.551 -3.256 -5.4911.00 10.12 CATOM 98 CA GLY A 96 -27.885 -6.624 -5.4511.00 10.76 CATOM 99 CA GLY A 97 -29.379 -9.337 -7.6561.00 9.08 CATOM 100 CA GLY A 98 -28.752 -13.014 -8.4551.00 8.28 CATOM 101 CA GLY A 122 -33.497 -12.862 -6.4621.00 15.49 CATOM 102 CA GLY A 123 -33.164 -9.374 -5.2111.00 12.37 CATOM 103 CA GLY A 124 -31.827 -7.789 -2.1021.00 14.34 CATOM 104 CA GLY A 125 -32.483 -4.741 0.002 1.00 22.49 CATOM 105 CA GLY A 126 -31.400 -1.487 -1.6081.00 17.72 CATOM 106 CA GLY A 127 -28.513 0.495-0.2211.00 16.51 CATOM 107 CA GLY A 128 -28.376 4.247-0.8071.00 16.84 CATOM 108 CA GLY A 129 -25.116 5.718-1.9101.00 11.90 CATOM 109 CA GLY A 130 -24.954 9.478-1.9611.00 8.75 CATOM 110 CA GLY A 131 -22.066 11.329 -3.4961.00 14.37 CATOM 111 CA GLY A 132 -21.513 14.817 -1.9471.00 23.32 CATOM 112 CA GLY A 133 -20.378 18.169 -3.3691.00 36.14 CTET1F97ATOM 113 CA GLY A 43 -13.239 8.515 -3.437 1.00 14.44 CATOM 114 CA GLY A 44 -13.393 4.758 -3.940 1.00 21.52 CATOM 115 CA GLY A 45 -16.246 2.710 -2.546 1.00 22.48 CATOM 116 CA GLY A 46 -17.296 -0.926-2.623 1.00 21.22 CATOM 117 CA GLY A 47 -21.001 -1.717-2.638 1.00 20.06 CATOM 118 CA GLY A 48 -21.128 -5.074-0.848 1.00 13.56 CATOM 119 CA GLY A 49 -23.434 -7.972-1.703 1.00 19.14 CATOM 120 CA GLY A 50 -22.907 -11.288 0.0671.00 22.49 CATOM 121 CA GLY A 51 -24.848 -14.490 -0.589 1.00 20.58 CATOM 122 CA GLY A 52 -24.961 -18.121 0.5381.00 24.55 CATOM 123 CA GLY A 53 -26.625 -21.271 -0.752 1.00 17.82 CATOM 124 CA GLY A 57 -24.531 -17.722 -9.307 1.00 10.39 CATOM 125 CA GLY A 58 -25.219 -15.054 -11.903 1.00 8.00 CATOM 126 CA GLY A 59 -24.694 -11.642 -10.310 1.00 7.62 CATOM 127 CA GLY A 60 -26.312 -8.537-11.794 1.00 6.84 CATOM 128 CA GLY A 61 -26.560 -4.910-10.704 1.00 8.48 CATOM 129 CA GLY A 62 -28.971 -2.156-11.641 1.00 13.92 CATOM 130 CA GLY A 63 -28.917 1.574 -10.971 1.00 11.89 CATOM 131 CA GLY A 64 -32.146 3.463 -10.346 1.00 23.18 CATOM 132 CA GLY A 85 -14.367 2.765 -13.291 1.00 17.93 C
ATOM 133 CA GLY A 86-16.308 -0.184 -11.839 1.00 15.44CATOM 134 CA GLY A 87-14.665 -3.500 -11.017 1.00 16.79CATOM 135 CA GLY A 88-16.581 -6.711 -10.341 1.00 14.07CATOM 136 CA GLY A 89-15.959 -9.289 -7.620 1.00 16.75CATOM 137 CA GLY A 91-18.578 -9.954 -2.969 1.00 17.13CATOM 138 CA GLY A 92-19.615 -6.643 -4.531 1.00 12.84CATOM 139 CA GLY A 93-18.746 -3.911 -7.017 1.00 12.33CATOM 140 CA GLY A 94-15.956 -1.401 -6.447 1.00 12.43CATOM 141 CA GLY A 95-16.021 2.137 -7.822 1.00 11.12CATOM 142 CA GLY A 96-12.511 3.493 -8.309 1.00 16.95CATOM 143 CA GLY A 97-14.158 6.925 -7.885 1.00 21.11CATOM 144 CA GLY A 99-19.244 11.655 -8.297 1.00 22.37CATOM 145 CA GLY A 100 -22.479 13.329 -7.197 1.00 23.75CATOM 146 CA GLY A 101 -24.007 11.875 -10.393 1.00 22.84CATOM 147 CA GLY A 102 -23.793 8.420 -8.818 1.00 15.51CATOM 148 CA GLY A 103 -26.377 9.137 -6.093 1.00 11.57CATOM 149 CA GLY A 104 -29.205 6.618 -6.153 1.00 9.52 CATOM 150 CA GLY A 105 -30.075 3.041 -5.324 1.00 12.64CATOM 151 CA GLY A 106 -28.157 0.010 -6.540 1.00 7.32 CATOM 152 CA GLY A 107 -29.828 -3.384 -6.497 1.00 7.52 CATOM 153 CA GLY A 108 -27.747 -6.545 -6.374 1.00 9.97 CATOM 154 CA GLY A 109 -29.572 -9.419 -8.055 1.00 12.91CATOM 155 CA GLY A 110 -28.245 -12.921 -7.462 1.00 11.27CATOM 156 CA GLY A 118 -33.242 -16.054 -6.426 1.00 13.29CATOM 157 CA GLY A 119 -32.582 -13.085 -4.179 1.00 15.55CATOM 158 CA GLY A 120 -31.884 -9.348 -4.193 1.00 11.36CATOM 159 CA GLY A 121 -30.813 -6.471 -1.975 1.00 11.36CATOM 160 CA GLY A 122 -30.903 -2.696 -2.475 1.00 11.14CATOM 161 CA GLY A 123 -28.232 -0.209 -1.404 1.00 11.58CATOM 162 CA GLY A 124 -28.703 3.550 -1.338 1.00 15.52CATOM 163 CA GLY A 125 -25.598 5.531 -2.225 1.00 9.61 CATOM 164 CA GLY A 126 -25.164 9.137 -1.123 1.00 10.84CATOM 165 CA GLY A 127 -22.043 10.899 -2.383 1.00 10.58CATOM 166 CA GLY A 128 -20.981 13.549 0.145 1.00 14.41CATOM 167 CA GLY A 129 -20.447 17.126 -1.025 1.00 12.32CTERZ1DQTATOM 168 CA GLY C 14-9.505 5.982 -6.825 1.00 30.82CATOM 169 CA GLY C 15-13.195 5.487 -7.536 1.00 25.29CATOM 170 CA GLY C 16-13.507 1.942 -6.167 1.00 21.63CATOM 171 CA GLY C 17-16.606 0.707 -4.377 1.00 20.22CATOM 172 CA GLY C 18-16.814 -2.817 -3.021 1.00 20.86CATOM 173 CA GLY C 19-19.629 -4.451 -1.137 1.00 21.25CATOM 174 CA GLY C 20-21.383 -7.769 -0.574 1.00 21.73CATOM 175 CA GLY C 21-24.675 -8.800 -2.148 1.00 22.97CATOM 176 CA GLY C 22-26.301 -11.552 -0.160 1.00 26.59CATOM 177 CA GLY C 23-29.169 -13.867 -0.930 1.00 26.47CATOM 178 CA GLY C 24-31.335 -16.565 0.573 1.00 31.54CATOM 179 CA GLY C 25-32.236 -19.342 0.443 1.00 31.33CATOM 180 CA GLY C 32-26.091 -17.451 -10.077 1.00 21.25CATOM 181 CA GLY C 33-26.340 -14.584 -12.535 1.00 21.86CATOM 182 CA GLY C 34-25.686 -11.294 -10.762 1.00 19.78CATOM 183 CA GLY C 35-26.651 -7.922 -12.193 1.00 19.11CATOM 184 CA GLY C 36-25.711 -4.438 -10.995 1.00 19.23CATOM 185 CA GLY C 37-28.233 -1.721 -11.782 1.00 25.95CATOM 186 CA GLY C 38-27.978 2.010 -11.165 1.00 30.90CATOM 187 CA GLY C 39-31.328 3.464 -10.196 1.00 40.84CATOM 188 CA GLY C 66-16.664 -4.410 -12.490 1.00 23.17CATOM 189 CA GLY C 67-15.247 -7.428 -10.788 1.00 22.56CATOM 190 CA GLY C 68-16.273 -9.875 -8.095 1.00 21.60CATOM 191 CA GLY C 69-16.270 -13.324 -6.554 1.00 22.69CATOM 192 CA GLY C 75-21.405 -12.287 -4.112 1.00 23.03CATOM 193 CA GLY C 76-18.587 -9.814 -3.409 1.00 24.30CATOM 194 CA GLY C 77-18.961 -6.951 -5.886 1.00 23.46CATOM 195 CA GLY C 78-16.435 -4.318 -6.884 1.00 25.74CATOM 196 CA GLY C 79-17.349 -1.380 -9.129 1.00 26.08CATOM 197 CA GLY C 80-14.377 0.652 -10.395 1.00 29.15CATOM 198 CA GLY C 81-13.639 3.807 -12.365 1.00 26.23CATOM 199 CA GLY C 84-18.194 11.980 -8.310 1.00 24.79CATOM 200 CA GLY C 85-21.048 12.151 -10.804 1.00 25.37C
ATOM 201 CA GLY C 86 -21.5408.383 -10.383 1.00 25.21CATOM 202 CA GLY C 87 -22.6968.922 -6.809 1.00 23.95CATOM 203 CA GLY C 88 -26.0507.191 -6.551 1.00 23.67CATOM 204 CA GLY C 89 -28.1034.091 -5.812 1.00 22.75CATOM 205 CA GLY C 90 -26.9050.703 -7.044 1.00 23.39CATOM 206 CA GLY C 91 -29.167-2.332 -7.030 1.00 22.55CATOM 207 CA GLY C 92 -27.838-5.841 -6.783 1.00 22.29CATOM 208 CA GLY C 93 -29.956-8.462 -8.555 1.00 20.45CATOM 209 CA GLY C 94 -29.490-12.198 -8.107 1.00 20.73CATOM 210 CA GLY C 105-34.479-11.361 -6.201 1.00 24.94CATOM 211 CA GLY C 106-33.136-7.836 -5.829 1.00 25.24CATOM 212 CA GLY C 107-31.842-5.752 -2.931 1.00 24.05CATOM 213 CA GLY C 108-33.051-2.231 -2.O38 1.00 25.85CATCM 214 CA GLY C 109-29.830-0.739 -3.310 1.00 23.77CATOM 215 CA GLY C 110-26.5440.520 -1.934 1.00 22.46CATOM 216 CA GLY C 111-25.9634.285 -1.818 1.00 24.13CATOM 217 CA GLY C 112-22.4824.793 -3.205 1.00 22.83CATOM 218 CA GLY C 113-20.9588.192 -2.417 1.00 23.40CATOM 219 CA GLY C 114-18.0619.201 -4.580 1.00 25.42CEND
表12imab号 目标功能zp-combiMabis050 617 -1,83Mabis051 636 -0,5iMab102598 -0.38Mabis052 586 -0,88Mabis053 592 -0,73Mabis054 540 -0,42
表13iMab102DDLKLTCRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGTiMabis050DDLKLTSRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNSACDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDCRGQGTiMabis051DDLKLTSRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNSCADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSCGQGTiMabis052GSLRLSSAASGYTIGPYCMGWFRQAPGDDREGVAAINMGTVYLLMNSLEPEDTAICYSAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSWGQGCiMabis053GSLRLSSAASGYTIGPYCNGWFRQAPGDDREGVAAINMGTVYLLMNSLEPEDTAIYYSCADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSCGQGTiMabis054GSLRLSSAASGYTIGPYCMGWFRQAPGDDREGVAAINMGTVYLLMNSLEPEDTAIYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSWGCGG
表14结果没有半胱氨酸桥 有半胱氨酸桥残基取代溶解度zp-compzp-combIMABA_K_3_A-6.61 -6.85IMABA_K_3_C-6.72 -6.62IMABA_K_3_D X X -6.65 -6.54IMABA_K_3_E X X -6.63 -6.48IMABA_K_3_F-6.61 -6.44IMABA_K_3_G-6.70 -6.63IMABA_K_3_H-6.70 -6.79IMABA_K_3_I-6.65 -6.47IMABA_K_3_L-6.42 -6.55IMABA_K_3_M-6.34 -6.57IMABA_K_3_N X X -6.57 -6.41IMABA_K_3_P-6.74 -6.46IMABA_K_3_Q X X -6.64 -6.56IMABA_K_3_R X X -6.91 -6.56 最佳采样数IMABA_K_3_S X X -6.52 -6.61IMABA_K_3_T X X -6.69 -6.61IMABA_K_3_V-6.60 -6.63IMABA_K_3_W-6.61 -6.57IMABA_K_3_Y-6.54 -6.54IMABA_K_7_A-6.58 -6.51IMABA_K_7_C-6.73 -6.6IMABA_K_7_D X X -6.47 -6.67IMABA_K_7_E X X -6.83 -6.61IMABA_K_7_F-6.66 -6.58IMABA_K_7_G-6.65 -6.76IMABA_K_7_H-6.80 -6.57IMABA_K_7_I-6.62 -6.28IMABA_K_7_L-6.76 -6.66IMABA_K_7_M-6.69 -6.62IMABA_K_7_N X X -6.34 -6.61IMABA_K_7_P-6.48 -6.94IMABA_K_7_Q X X -6.72 -6.61 最佳采样数IMABA_K_7_R X X -6.63 -6.94IMABA_K_7_S X X -6.83 -6.61IMABA_K_7_T X X -6.80 -6.54IMABA_K_7_V-6.78 -6.58IMABA_K_7_W-6.87 -6.61IMABA_K_7_W-6.60 -6.63IMABA_K_19_A -6.67 -6.47IMABA_K_19_C -6.46 -6.41IMABA_K_19_D X X -6.5 -6.41IMABA_K_19_E X X -6.69 -6.77IMABA_K_19_F -6.61 -6.55IMABA_K_19_G -6.94 -6.54IMABA_K_19_H -6.48 -6.62IMABA_K_19_I -6.74 -6.51IMABA_K_19_L -6.52 -6.72IMABA_K_19_M -6.60 -6.16IMABA_K_19_N X X -6.49 -6.84IMABA_K_19_P -6.56 -6.41IMABA_K_19_Q X X -6.91 -6.65
IMABA_K_19_R X X-6.72-6.73IMABA_K_19_S X X-6.57-6.61IMABA_K_19_T X X-6.85-6.61 最佳采样数IMABA_K_19_V -6.75-6.81IMABA_K_19_W -6.4 -6.43IMABA_K_19_Y -6.53-6.48IMABA_K_65_A -6.526.22IMABA_K_65_C -6.436.23IMABA_K_65_D X X-6.796.72IMABA_K_65_E X X-6.826.70 最佳采样数IMABA_K_65_F -6.526.26IMABA_K_65_G -6.666.58IMABA_K_65_H -6.546.33IMABA_K_65_I -6.356.18IMABA_K_65_L -6.236.34IMABA_K_65_M -6.446.72IMABA_K_65_N X X-6.746.62IMABA_K_65_P -6.506.42IMABA_K_65_Q X X-6.626.59IMABA_K_65_R X X-6.636.53IMABA_K_65_S X X-6.686.41IMABA_K_65_T X X-6.476.41IMABA_K_65_V -6.306.25IMABA_K_65_W -6.506.39IMABA_K_65_Y -6.486.72
表15分子 zp-combIMAB_C_96_A -6,52IMAB_C_96_C -7,11IMAB_C_96_D -6,26IMAB_C_96_E -5,75IMAB_C_96_F -6,70IMAB_C_96_G -6,38IMAB_C_96_H -6,26IMAB_C_96_I -6,66IMAB_C_96_K -5,56IMAB_C_96_L -6,37IMAB_C_96_M -6,51IMAB_C_96_N -6,53IMAB_C_96_P -6,48IMAB_C_96_Q -6,19IMAB_C_96_R -6,08IMAB_C_96_S -6,39IMAB_C_96_T -6,38IMAB_C_96_V -6,75IMAB_C_96_W -6,22IMAB_C_96_Y -6,60
表16AiMab100序列1NVKLVEKGGN FVENDDDLKL TCRAEGYTIG PYCMGWFRQAPNDDSTNVAT INMGGGITYY161GDSVKERFDI RRDNASNTVT LSMDDLQPED SAEYNCAGDSTIYASYYECG HGLSTGGYGY221DSHYRGQGTD VTVSS可能的候选CYS2_CYS24CYS4_CYS22CYS4_CYS111CYS5_CYS24CYS6_CYS22CYS6_CYS112CYS6_CYS115CYS7_CYS22CYS7_CYS115CYS16_CYS84CYS18_CYS82CYS18_CYS84CYS20_CYS82CYS21_CYS81CYS22_CYS80CYS23_CYS79CYS34_CYS79CYS35_CYS98CYS36_CYS94CYS39_CYS97CYS37_CYS45CYS37_CYS96CYS38_CYS47CYS38_CYS48CYS39_CYS94CYS92_CYS118CYS94_CYS116CYS95_CYS111CYS95_CYS113
CYS95_CYS115CYS98_CYS109CYS98_CYS111CYS99_CYS110表16B优选的半胱氨酸残基半胱氨酸位置zp-score iMab名称CYS6 CYS112-7.81 iMab111CYS35 CYS98 -7.54CYS99 CYS110-7.50CYS5 CYS24 -7.32CYS23 CYS79 -7.23CYS38 CYS47 -7.11 iMab112
表17突变频率 转化体数目 化合物(binder)数目0 9.3*10F6 502 8.1*10E6 10003，5 5.4*10E6 758 7.4*10E6 1001322*10E6100
表18CM114-IMAB100AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAACAGGAGAAGATATACCATGAAAAAACTGTTATTTGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTTTATAGCCATAGCGCGGGCGGCCGCAATGTGAAACTGGTTGAAAAAGGTGGCAATTTCGTCGAAAACGATGACGATCTTAAGCTCACGTGCCGTGCTGAAGGTTACACCATTGGCCCGTACTGCATGGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGAACGACGACAGTACTAACGTGGCCACGATCAACATGGGTGGCGGTATTACGTACTACGGTGACTCCGTCAAAGAGCGCTTCGATATCCGTCGCGACAACGCGTCCAACACCGTTACCTTATCGATGGACGATCTGCAACCGGAAGACTCTGCAGAATACAATTGTGCAGGTGATTCTACCATTTACGCGAGCTATTATGAATGTGGTCATGGCCTGAGTACCGGCGGTTACGGCTACGATAGCCACTACCGTGGTCAGGGTACCGACGTTACCGTCTCGTCGGCCAGCTCGGCCGGTGGCGGTGGCAGCTATACCGATATTGAAATGAACCGCCTGGGCAAAACCGGCAGCAGTGGTGATTCGGGCAGCGCGTGGAGTCATCCGCAGTTTGAGAAAGCGGCGCGCCTGGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCCCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTAGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGATGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACT
GCGTAATAAGGAGTCTTAAGGCGCGCCTGTAATGAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCT
GCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCTGTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTACCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGACGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGCTGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCATCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCAGCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCTGGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGTAGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAATCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCCCCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGATAACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGATCATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAGCM126-IMAB100TTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTTAGTGGTGATGGTGATGGTGGCTTTTGCCCAGGCGGTTCATTTCTATATCGGTATAGCTGCCACCGCCACCGGCCGAGCTGGCCGACGAGACGGTAACGTCGGTACCCTGACCACGGTAGTGGCTATCGTAGCCGTAACCGCCGGTACTCAGGCCATGACCACATTCATAATAGCTCGCGTAAATG
GTAGAATCACCTGCACAATTGTATTCTGCAGAGTCTTCCGGTTGCAGATCGTCCATCGATAAGGTAACGGTGTTGGACGCGTTGTCGCGACGGATATCGAAGCGCTCTTTGACGGAGTCACCGTAGTACGTAATACCGCCACCCATGTTGATCGTGGCCACGTTAGTACTGTCGTCGTTCGGCGCCTGACGGAACCAACCCATGCAGTACGGGCCAATGGTGTAACCTTCAGCACGGCACGTGAGCTTAAGATCGTCATCGTTTTCGACGAAATTGCCACCTTTTTCAACCAGTTTCACATTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGAAACCGTTGTGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGATCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCA
TGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATGAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAA
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权利要求
1.一种包含一个结合肽及一个核心的合成或重组蛋白质分子，所述核心包含一个含至少4个链的β-桶，其中所述β-桶包含至少两个β-折叠，其中每个所述β-折叠包含两个所述链，及其中所述结合肽是连接所述β-桶内两个链的肽，其中所述结合肽在其天然邻近序列之外。
2.权利要求1的蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少5个链，其中至少一个所述折叠包含3个所述链。
3.权利要求1或权利要求2的蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少6个链，其中至少2个所述折叠包含3个所述链。
4.权利要求1-3任一项的蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少7个链，其中至少一个所述折叠包含4个所述链。
5.权利要求1-4任一项的蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少8个链，其中至少一个所述折叠包含4个所述链。
6.权利要求1-5任一项的蛋白质分子，其中所述β-桶包含至少9个链，其中至少一个所述折叠包含4个所述链。
7.权利要求1-6任一项的蛋白质分子，其中所述结合肽连接所述桶的开放侧上的所述β-桶的两个链。
8.权利要求1-7任一项的蛋白质分子，其中所述结合肽连接所述桶的至少两个β-折叠。
9.权利要求1-8任一项的蛋白质分子，其包含至少一个进一步的结合肽。
10.权利要求1-9任一项的蛋白质分子，其包含3个结合肽及3个连接肽序列。
11.权利要求1-9任一项的蛋白质分子，其包含至少4个结合肽。
12.权利要求11的蛋白质分子，其中至少一个结合肽识别与至少一个其它结合肽识别的靶分子不同的另一个靶分子。
13.一种鉴别具有改变的结合性质的蛋白质分子的方法，包含在权利要求1-12任一项的蛋白质分子的核心中导入一个变化，并从所述蛋白质分子中选择具有改变的结合性质的蛋白质分子。
14.一种鉴别具有改变的结构性质的蛋白质分子的方法，包含在权利要求1-12任一项的蛋白质分子的核心中导入一个变化，并从所述蛋白质分子中选择具有改变的结合性质的蛋白质分子。
15.权利要求13或14的方法，其中所述变化包含一个翻译后修饰。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中所述变化是在编码所述至少一个蛋白质分子的核酸中导入，所述方法进一步包含在能产生所述蛋白质分子的表达系统中表达所述核酸。
17.通过权利要求13-16任一项的方法可获得的蛋白质分子。
18.权利要求1-12或17任一项的蛋白质分子，其衍生自免疫球蛋白超家族。
19.权利要求18的蛋白质分子，其中蛋白质分子的外部与衍生其的免疫球蛋白超家族的分子免疫学相似。
20.包含权利要求1-12或17-19任一项的蛋白质分子的细胞。
21.一种生产编码一种蛋白质分子的核酸的方法，所述蛋白质分子能展示至少一个所希望的肽序列，所述方法包含提供一种编码至少第一个和第二个结构区的核酸序列，所述第一个和第二个结构区由编码所述所希望的肽序列的核酸序列分隔或者由可以插入这种序列的一个区域分隔，及突变编码所述第一个和第二个结构区的所述核酸以获得编码能展示至少一个所希望的肽序列的所述蛋白质分子的所希望的核酸。
22.一种展示一种所希望的肽序列的方法，包括提供编码至少两个β-折叠的核酸，所述β-折叠形成一个β-桶，所述核酸包含一个用于插入编码所希望的肽序列的序列的区域，插入包含所希望的肽序列的一个核酸序列，及表达所述核酸，从而所述β-折叠可通过权利要求21的方法获得。
23.一种生产包含人工结合肽的文库的方法，所述方法包含提供至少一个核酸模板，其中所述模板编码不同的特异性结合肽，通过突变产生所述模板的核酸衍生物的集合，并将所述集合或其一部分提供给肽合成系统以产生包含人工结合肽的所述文库。
24.权利要求23的方法，包含提供至少两个核酸模板。
25.权利要求24的方法，包含提供至少10个核酸模板。
26.权利要求23-25任一项的方法，其中所述突变是通过所述模板的易突变核酸扩增而导入。
27.权利要求26的方法，其中所述扩增利用非简并引物。
28.权利要求27的方法，其中至少一个非简并引物进一步包含一个简并区。
29.权利要求26-28任一项的方法，其中所述核酸扩增包含在存在dITP，dPTP情况下的至少一个延伸步骤。
30.权利要求23-29任一项的方法，其中至少一个模板编码具有包含至少14个氨基酸的亲和区的一个特异性结合肽。
31.权利要求30的方法，其中所述亲和区包含至少16个氨基酸。
32.权利要求31的方法，其中所述亲和区平均长度包含24个氨基酸。
33.权利要求30-32任一项的方法，其中所述亲和区包含至少14个连续氨基酸。
34.权利要求23-33任一项的方法，其中至少一个所述模板编码权利要求1-12，17-19任一项的蛋白质分子。
35.权利要求23-34任一项的方法，进一步包含提供所述人工肽文库中的肽的一种潜在结合配体，并从所述文库中选择能与所述结合配体特异性结合的肽。
36.权利要求36的方法，其中所述文库以噬菌体展示文库提供。
37.可通过权利要求35或36的方法获得的权利要求1-12，17-19任一项的蛋白质分子，或者如表2，3，10，13或16所述的蛋白质分子。
38.权利要求1-12或17-19或37任一项的蛋白质分子用于从一种混合物中分离一种物质的应用。
39.权利要求38的应用，其中所述混合物是一种生物学液体。
40.权利要求39的应用，其中所述生物学液体是生物体的一种分泌物。
41.权利要求40的应用，其中所述分泌物是乳汁或乳汁的衍生物。
42.权利要求39的应用，其中所述混合物是血液或其衍生物。
43.权利要求1-12，17-19或37任一项的蛋白质分子作为一种药物的应用。
44.权利要求1-12，17-19或37任一项的蛋白质分子在制备一种用于治疗有害的蛋白质或细胞或微生物所致的病理状态的药物配方中的应用。
45.权利要求1-12，17-19或37任一项的蛋白质分子在制备一种诊断分析中的应用。
46.一种基因输送载体，其包含权利要求1-12，17-19或37任一项的蛋白质分子及一个感兴趣的基因。
47.一种基因输送载体，其包含编码权利要求1-12，17-19或37任一项的蛋白质分子的核酸及编码感兴趣基因的核酸序列。
48.权利要求1-12，17-19或37任一项的蛋白质分子，其与一种感兴趣的部分缀合。
49.权利要求48的蛋白质分子，其中所述感兴趣的部分是一种毒性部分。
50.一个层析柱，其包含权利要求1-12，17-19或37任一项的蛋白质分子及一种填充材料。
51.可通过权利要求21的方法获得的核酸。
52.一个核酸文库，其包含权利要求51的不同核酸的集合。
53.权利要求52的核酸文库，其进一步包含编码不同亲和区的核酸集合。
54.权利要求52或53的文库，其是一个表达文库。
全文摘要
本发明提供了产生与一种合适的核心区域相关的结合肽的方式和方法、所得蛋白质分子及其应用。本发明提供了一种与结合分子在其全部应用范围内应用相关的问题的解决方法。结合分子可以设计为适应极端应用条件如极端温度或pH。或者，结合分子可以设计为应答环境中非常细微的变化。
文档编号C12N15/09GK1617926SQ02827979
公开日2005年5月18日 申请日期2002年12月10日 优先权日2001年12月10日
发明者埃尔温·豪特扎格尔, 伊尔玛·玛丽亚·塞西丽娅·维金, 彼得·克里斯蒂安·赛蒙斯 申请人:凯驰麦布斯股份有限公司