专利名称：鉴定并发细菌感染对病毒感染致病性影响的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定并发细菌感染对病毒感染致病性影响的方法及其所用的细胞体外同体培养装置。
背景技术：
现有的细菌培养与细胞的培养是分开进行的，如果在细胞培养过程中细胞瓶内出现细菌污染，细胞的培养及传代将无法长期进行下去。原因主要有a)细菌对细胞的蚕食。b)细菌在生长的过程中分泌出来的毒素对细胞膜或细胞不同部位的影响。c)细菌在生长的过程中分泌出来的酶影响了细胞生长的某一个环节。d)细菌在高速分裂的过程中占据了大部分生长空间并吸取大量的营养，继而影响了细胞的生长。
在细胞的培养过程中如出现潜伏病毒和细菌混合污染或低致病力弱病毒和细菌混合感染时而产生病变，现有的技术不能证实是否因细菌的感染而产生协同作用。
例如，高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒差异在于病毒囊膜上血凝素蛋白酶裂解位点的氨基酸序列不同。高致病性毒株能为类枯草杆菌蛋白酶所裂解，低致病性毒株则为类胰蛋白酶所裂解。但是，如果并发能分泌类枯草杆菌蛋白酶的细菌及类胰蛋白酶的细菌感染，低致病性禽流感病毒也能引起高死亡率，即显示“高致病性”。
为分辨高、低致病性禽流感，现有技术主要采用以下方法1.以1∶10稀释的含病毒的鸡胚尿囊液静脉注射0.2ML于8只6周龄的无特定病原(SPF)鸡，死亡率达到75％者为高致病性毒株。
2.病毒接种于鸡成纤维细胞(CEF)培养物，如产生细胞病变(CPE)，则毒株为高致病性。如果要预先用胰蛋白酶处理细胞才能产生CPE，则病株为低致病性。
3.如病毒属H5或H7血清亚型，而血凝素的裂解氨基酸序列KRRR/G毒株为高致病性。
上述现有技术的缺点是难于确定发生大量死亡鸡群的死亡率是由感染的低致病性禽流感病毒其本身引起的，还是在并发细菌感染的协同作用下产生的。另外，因为大多数引起鸡群大量死亡禽流感病毒，在实验室的鉴定中都是低致病性禽流感病毒，所以在诊断上花费的时间较长。
目前广东省鸡群中存在的禽流感病毒主要属低致病性毒株，但有时会发生高死亡率。因此，即使实验室证明分离株属低致病性，也对鸡群按高致病性流感那样严格处理，因而对经济和外贸造成很大的损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定并发细菌感染对病毒感染致病性影响的方法及其所用的细胞体外同体培养装置。它可以解决实验室鉴定与临床诊断出现的差异，准确判断致病的原因，是哪一类细菌或/与病毒混合感染所致，或是高致病性病毒所致。
本发明的方法是将细菌与低致病性病毒共同接种于细胞培养物中，所述细菌接种于一与细胞隔离但通过微孔滤膜与细胞培养物相通的细菌培养室中，使细菌不能直接接触细胞但其分泌物可通过微孔滤膜进入培养液而实现细胞的感染和细胞病变(CPE)的出现。根据CPE的出现情况即可鉴定引起细胞病变的原因，是哪种细菌与弱病毒(低致病性病毒)混合感染所致，或是高致病性病毒所致。
采用细胞体外同体培养装置可方便地实现本发明方法。所说的细胞体外同体培养装置由细胞培养瓶和细菌培养室构成，细菌培养室置于细胞培养瓶中；该细菌培养室为一封闭结构，其壁上有一可与细胞培养瓶相通的孔径不大于0.22微米的微孔滤膜，使细菌不能与细胞培养瓶内的细胞接触，但细菌分泌的酶可通过微孔滤膜进入细胞培养瓶内的培养液中。
将所选的不同细菌分别接种于细菌培养室中，再分别放置于细胞培养瓶内接种有病毒的细胞培养物中，观察CPE的出现情况，并根据CPE的出现情况确定引起细胞病变的原因。
本发明方法具有下列优点1.本方法可以在可观察的条件下，了解何种细菌分泌物使低致病性病毒产生高致病性。建立不同菌株对某一病毒产生影响的数据。
2.可在短时间内区分引起细胞病变的是高致病性病毒，还是细菌与低致病性病毒混合感染所造成。
3.本方法将简单快速，容易操作，一般受过专业训练的普通技术人员都能掌握。
4.本方法所用装置价格低廉，只是基因诊断价格的10％左右。
图1是本发明的细菌与病毒细胞体外同体培养装置的一中实施方式的结构示意图；其中1为克氏细胞培养瓶，2为体外鸡成纤维细胞(CPE)，3为细菌培养室，4为细胞培养液。
图2是细菌培养室的一种结构的示意图；其中31为a壁，32为b壁，33为耐高温密封胶圈，34为微孔膜，35为固定螺丝，5为接种的细菌。
具体实施例方式
参照图1和图2，本发明方法所用的细胞体外同体培养装置由细胞培养瓶1和细菌培养室3构成细菌培养室置于细胞培养瓶中；该细胞培养瓶可采用常规的克氏细胞培养瓶；该细菌培养室由a壁31与b壁32之间夹一密封圈33，并有若干固定螺丝35固定构成一封闭结构，使细菌不能与细胞培养瓶内的细胞接触；其b壁上有开口(孔)36，该开口有一孔径不大于0.22微米的微孔滤膜34封闭作为隔离屏障，使细胞培养瓶内的培养液可进入细菌培养室中，同时细菌分泌的酶可通过微孔滤膜进入细胞培养瓶内的培养液中到达CEF。所述的a壁31、b壁32和固定螺丝35可用不锈钢或无毒耐高温塑料加工制成，密封圈33可用无毒耐高温橡胶或塑料做成。细菌培养室3的大小以能够通过克氏细胞培养瓶1的瓶口为宜。
以下通过实施例对本发明方法作进一步说明实施例1鉴定并发细菌感染对病毒感染致病性的影响(参照图1)1.采用细胞体外同体培养装置，分别在3个克氏细胞培养瓶1中用常规的细胞培养液4培养CEF，待CEF达80％融合时，接种待鉴定的禽流感病毒；2.分别将枯草杆菌及类胰蛋白酶的细菌接种于固体LB培养皿中，37℃培养12小时，挑取单菌落；3.将类枯草杆菌及类胰蛋白酶的细菌分别接种于2个细菌培养室3的a壁31内侧(如图2所示)。再分别将2个细菌培养室放入步骤1的2个细胞培养瓶的培养液4中，剩下1个只接种禽流感病毒的细胞培养瓶作为对照组，继续培养，并观察各细胞培养瓶有无CPE出现。根据出现CPE的情况，可得到以下的鉴定结果a.如果只有接种类枯草杆菌的细胞培养瓶出现CPE，而接种类胰蛋白酶的细菌的细胞培养瓶和对照组不出现CPE，表明此次检测引起大量鸡群死亡的流感病毒样品是因类枯草杆菌的混合感染所造成的。
b.如果只有接种类胰蛋白酶的细菌的细胞培养瓶出现CPE，而接种类枯草杆菌的细胞培养瓶和对照组不出现CPE，表明此次检测引起大量鸡群死亡的流感病毒样品是因类胰蛋白酶的细菌的混合感染所造成的。
c.如果接种类枯草杆菌及类胰蛋白酶的细菌的细胞培养瓶都出现CPE，而对照组不出现CPE，表明此次检测引起大量鸡群死亡的流感病毒样品，可以是因类枯草杆菌或类胰蛋白酶的细菌混合感染所造成的。
d.如果接种流感病毒的细胞培养瓶对照组出现CPE，表明此次检测引起大量鸡群死亡的流感病毒样品是高致病流感病毒。(无论接种类枯草杆菌及类胰蛋白酶的细菌的细胞培养瓶是否出现CPE，只要单独接种禽流感病毒的细胞培养瓶对照组出现CPE，即可以判断为高致病禽流感病毒。)实施例2参照实施例1，将TOP-10菌接种于低盐固体LB培养皿中，37℃培养12小时，挑取单菌落，接种TOP-10菌于A壁的细菌培养室后，放入培养达80％融合的WCK细胞培养瓶中，继续培养并观察有无病变出现。
实施例3参照实施例1，将DH5α大肠杆菌接种于固体LB培养皿上，37℃培养12小时，挑取单菌落，接种DH5α大肠杆菌于A壁的细菌培养室后，放入培养达80％融合的WDCK细胞培养瓶中，继续培养并观察有无病变出现。
权利要求
1.一种鉴定并发细菌感染对病毒感染致病性影响的方法，其特征是将细菌与病毒共同接种于细胞培养物中；所述细菌接种于一与细胞隔离但通过孔径不大于0.22微米的微孔滤膜与细胞培养物相通的培养室中，继续培养，并观察有无细胞病变出现；根据细胞病变的出现情况即可判断引起细胞病变的原因，是由哪种细菌与低致病性病毒混合感染所致，还是单独由高致病性病毒所致。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是采用细胞体外同体培养装置，将所选细菌分别接种于细菌培养室中，再分别放置于细胞培养瓶内接种有待检测病毒的细胞培养物中，观察细胞病变的出现情况，并据此确定引细胞病变的原因。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征是所说的病毒为禽流感病毒，所说的细菌为类枯草杆菌及分泌类胰蛋白酶的细菌；具体步骤为(1)分别在3个克氏细胞培养瓶1中用常规的细胞培养液4培养CEF，待CEF达80％融合时，接种待鉴定的禽流感病毒；(2)分别将枯草杆菌及类胰蛋白酶的细菌接种于固体LB培养皿中，37℃培养12小时，挑取单菌落；(3)将类枯草杆菌及类胰蛋白酶的细菌分别接种于2个细菌培养室，再分别将2个细菌培养室放入步骤1的2个细胞培养瓶的培养液中，剩下1个只接种禽流感病毒的细胞培养瓶作为对照组，继续培养，并观察各细胞培养瓶有无CPE出现；根据出现CPE的情况，可得到以下的鉴定结果a.如果只有接种类枯草杆菌的细胞培养瓶出现CPE，而接种类胰蛋白酶的细菌的细胞培养瓶和对照组不出现CPE，表明此次检测引起大量鸡群死亡的流感病毒样品是因类枯草杆菌的混合感染所造成的；b.如果只有接种类胰蛋白酶的细菌的细胞培养瓶出现CPE，而接种类枯草杆菌的细胞培养瓶和对照组不出现CPE，表明此次检测引起大量鸡群死亡的流感病毒样品是因类胰蛋白酶的细菌的混合感染所造成的；c.如果接种类枯草杆菌及类胰蛋白酶的细菌的细胞培养瓶都出现CPE，而对照组不出现CPE，表明此次检测引起大量鸡群死亡的流感病毒样品，可以是因类枯草杆菌或类胰蛋白酶的细菌混合感染所造成的；d.如果接种流感病毒的细胞培养瓶对照组出现CPE，表明此次检测引起大量鸡群死亡的流感病毒样品是高致病流感病毒。
4.一种细胞体外同体培养装置，其特征是该装置由细胞培养瓶1和细菌培养室3构成，细菌培养室置于细胞培养瓶中；该细菌培养室为一封闭结构，其壁上有一可与细胞培养瓶相通的孔径不大于0.22微米的微孔滤膜34。
5.按照权利要求4所述的装置，其特征是所述细菌培养室3是由a壁31与b壁32之间夹一密封圈33，并有若干固定螺丝35固定构成的封闭结构，其b壁上有开口36，该开口有一使细菌不能通过但其分泌的酶和细胞培养瓶内的培养液可通过的孔径不大于0.22微米的微孔滤膜34封闭。
6.按照权利要求5所述的装置，其特征是所述细菌培养室的a壁31、b壁32和固定螺丝35可用不锈钢或无毒耐高温塑料加工制成，密封圈33可用无毒耐高温橡胶或塑料做成。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定并发细菌感染对病毒感染致病性影响的方法及其所用的装置。将细菌与低致病性病毒共同接种于细胞培养物中，使细菌不能直接接触细胞但其分泌的酶可进入培养液，继续培养，并观察有无细胞病变(CPE)出现；根据CPE的出现情况即可鉴定引起鸡群大量死亡的原因。本方法所用的细胞体外同体培养装置由细胞培养瓶和细菌培养室构成，细菌培养室为有一孔径不大于0.22微米的微孔滤膜可与细胞培养瓶相通的封闭结构。本发明方法简单易操作，鉴定时间短，结果准确可靠，所用装置价格低，对病毒致病性的检测与防治具有重要的意义。
文档编号C12M3/00GK1442486SQ0311420
公开日2003年9月17日 申请日期2003年4月11日 优先权日2003年4月11日
发明者杨德威, 刘福安 申请人:中山大学