人纤溶酶原Kringle5缺失突变重组多肽的制作方法

文档序号:415730阅读:272来源:国知局
专利名称:人纤溶酶原Kringle 5缺失突变重组多肽的制作方法
技术领域
本发明涉及一种具有抗血管增生活性的人纤溶酶原Kringle5的突变体,特别是涉及一种人纤溶酶原Kringle5缺失突变重组多肽(简称K5mut1)。
血管刺激因子(如VEGF)和抑制因子(如PEDF)之间的平衡在血管增生的调节中起关键作用(Bussolino,F.et al.Trends Biochem.Sci.,22251-256,1997;Jimenez,B.,Volpert,O.V.,J.Mo1.Med.Jmm,78663-672,2001;Miller,J.W.et al.Diabetes Metab.Rev.,1337-50,1997)。在各种原因引起的角膜新生血管性病变、糖尿病性视网膜病、早期视网膜病和年龄相关性黄斑变性等病理状态下,刺激因子过度产生而抑制因子产生下降,对局部缺氧作出反应(Gao G.et al.FEBS Lett.,489270-276,2001;Pierce,E.A.et al.PNAS,92905-909,1995),正常的平衡被打破从而导致大量不正常的新生血管形成。角膜新生血管、视网膜血管增生是致盲的一个普遍原因(Blom,M.L.et al.Del.Med.J.,66379-388,1994;Bussolino et al1997;Miller et al1997)。目前,导致视网膜血管增生的分子机制尚不清楚。
有证据显示,视网膜和玻璃体液中含有内源性血管增生抑制因子(Jacobson,B.et al.Arch Ophthalmol.,1021543-1545,1984;Raymond,L.&Jacobson,B.,Exp.Eye Res.,34267-286,1982)。PEDF,一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,被证明是视网膜内一种内源性表达的强力血管增生抑制因子(Dawson,D.W.et al.Science,285245-258,1999)。血管抑素被证明也是一种内源性血管生成抑制因子(Spranger,J.et al.Diabetologia,431404-1407,2000)。血管抑素和PEDF伴随进行性糖尿病性视网膜病的发展而降低(Spranger et al2000;Spranger,J.et al.Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes,10721-28,1999)。
在过去几年中有一些内源性血管增生抑制因子已被证实。这些抑制因子主要分为两类一类是丝氨酸蛋白酶抑制剂,包括PEDF、maspin和抗凝血酶III(Dawson et al1999;O′Reilly,M.S.et al.Science,2851926-1928,1999;Zhang,M.etal.Nature Med.,6196-199,2000),另一类是胞外蛋白肽片段,包括内皮抑素、血管抑素、人纤溶酶原Kringle5(简称K5)和肿瘤抑素等(Cao Y.et al.J.Biol.Chem.27222924-22928,1997;Cao Y.et al.J.Biol.Chem.27129461-29467,1996;Maeshima,Y.et al.J.Biol.Chem.,27631959-31968,2001;O′Reilly,M.S.et al.Cell,88277-285,1997;O′Reilly,M.S.et al.Cell,79315-328,1994)。在这些因子中,K5是最强的血管增生抑制因子之一(Cao Y.et al.J.Biol.Chem.27222924-22928,1997)。人纤溶酶原含有5个Kringle结构域(Castellino,F.J.&McCance,S.G CibaFound Symp.,21246-60,1997),每个Kringle环由80个氨基酸组成,含3个二硫键,形成双环状构象。人纤溶酶原水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段血管抑素(Kringles1-4),Kringles1-5,Kringles1-3和Kringle5(K5)。不同的Kringle结构对内皮细胞增殖活性的抑制能力顺序为K5>K1>K3>K2>K4(Cao et al.J.Biol.Chem.27129461-29467,1996;Cao et al.J.Biol.Chem.27222924-22928,1997)。人纤溶酶原Kringle5不仅能抑制内皮细胞增生,且其抑制活性比血管抑素(即Kringle1-4)更强(Cao et al1997;Cao et al 1996;O′Reilly etal1994),而且,K5也抑制内皮细胞迁移,而内皮细胞迁移在血管生成过程中是很重要的一个过程(Ji,W.R.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.,247414-419,1998;Lu,H.et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.,258668-673,1999)。近来,已发现K5能抑制视网膜血管增生,因此,可能具有潜在的治疗糖尿病性视网膜病、早期视网膜病和年龄相关性黄斑变性等疾病的价值(Zhang,D.et al.Daibetologia,44757-765,2001),完整K5抑制RCEC细胞增值的EC50(EC50即抑制50%细胞增殖所需的药物浓度)为70nM/L。
血管渗漏是包括肿瘤血管增生、糖尿病性斑点水肿和慢性炎症等多种疾病的一个普遍的病理特征(Ciulla,T.A.et al.Surv.Ophthalmol.,43134-146,1998;Cunha-Vaz,J.G et al.Diabetes,3453-59,1985;Dvorak,H.F.N.Engl.J.Med.,3151650-1659,1986)。目前对血管渗漏还没有满意的治疗手段。
为了达到上述目的,本发明通过去掉K5分子的15个氨基酸残基同时保留K5分子中的所有3个二硫键而得到,并在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,所述的纤溶酶原Kringle5缺失突变重组多肽的cDNA序列如序列表中的SEQ IDNO1所示,其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO2所示。
本发明与现有技术相比具有以下优点①抗血管生成活性本发明所述的K5mut1以浓度依赖的方式抑制原代培养视网膜内皮细胞。在同样浓度范围内,该肽并不抑制同源的外周细胞,表明具有内皮细胞特异性抑制作用。该K5mut1的体内作用采用氧诱导的视网膜大鼠血管增生模型,注射K5mut1后,通过荧光血管造影术和血管细胞计数显示,视网膜新生血管丛和视网膜内层血管细胞比注射PBS的对照组出现有意义性减少(P<0.05)。未发现K5mut1对正常视网膜和正常血管有毒性作用。②降低视网膜中血管渗漏通过Evan蓝—血清蛋白渗漏方法,注射K5mut1可降低视网膜内血管渗漏。这些结果表明,K5mut1是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子,在诸如糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体瘤等血管增生异常和血管渗漏疾病紊乱的治疗中具有潜在的治疗价值。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图2是本发明实施例中K5mut1对内皮细胞的浓度依赖性作用和特异性抑制作用曲线。
图3是本发明实施例中K5mut1在氧诱导视网膜病模型中的抗血管增生作用示意图。
图4是本发明实施例中K5mut1体内实验降低视网膜血管内层增生细胞计数的示意图。
图5是本发明实施例中在氧诱导大鼠视网膜中K5mut1以浓度依赖性方式降低血管渗透性的示意图。
1、K5mut1的构建人K5cDNA通过RT-PCR从肝RNA扩增(Ma J.X.et al.FEBS Lett,452199-204,1999)。缺失型突变体采用人K5本模板通过PCR扩增得到。5′PCR引物(5′-ATGAATTCGTGTATGTTTGGGAATGGG-3′)和3′PCR引物(5′-GCCAAGCTTACACTGAGGGACATCACAGTAG-3′)各自含有EcoR I和HindIII位点以利于克隆。PCR删除了K5分子N端编码10个氨基酸残基的核苷酸序列和C端编码5个氨基酸残基的核苷酸序列。PCR产物EcoR I和HindIII位点克隆到pET22载体(Novagen,Inc.,Madison,WI),插入位点的5′端具有编码信号肽的序列,在3′端含有编码6个组氨酸的序列,K5/pET22重组体的准确性和正确读码框架均经序列测定确认。
2、K5mut1在大肠杆菌中的表达和纯化将突变型K5/pET22重组体导入大肠杆菌BL21/DE3(Novagen,Inc.,Madison,WI)株中。BL21/DE3本为载体能提供一种信号肽,使重组多肽进入细菌细胞壁中。在25℃下用IPTG本用10小时能诱导突变型K5的表达,并用溶菌酶消化使细胞壁中的蛋白质释放,通过组氨酸亲和层析柱(Novagen,Inc.,Madison,WI)来纯化K5mut1。K5mut1的纯度和鉴定采用SDS-PAGE和Western-blot的方法来分析,所用的抗体为组氨酸特异性抗体(Zhang et al2001)。
上述纯化的重组多肽分子量为14kDa,与从序列翻译计算而来的分子量相符,如

图1A所示。采用抗组氨酸抗体进行Western blot分析进一步证实该纯化重组多肽为导入目的基因编码的K5mut1,如图1B所示。从1L培养物中可平均获得10mg纯化肽。
3、重组K5mut1的活性检测(1)重组K5mut1对内皮细胞的特异性抑制采用细胞计数方法,即细胞平铺在12孔平板上,每组3孔,在培养基中培养直至60-70%细胞融会在一起。然后用含1%胎牛血清的培养基置换,重组K5mut1以各种浓度加在培养基中,与细胞共培养72小时,用MTT法定量测定存活内皮细胞(Roche,Mannheim,Germany)。实验至少重复3次,用t检验法分析突变型K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞的抑制作用。
分别以5、10、20、40、80、160nM浓度的重组K5mut1处理RCEC细胞72小时,MTT分析计数活细胞,在10nM的低浓度下,用K5mut1处理,处理细胞比对照组细胞呈现有意义的下降(P<0.05,n=3)。而且K5mut1作用表现为浓度依赖性,如图2所示。由图2可知,在同样浓度下,K5mut1对与RCEC同源的外周细胞没有任何有意义的抑制作用,这表明K5mut1对内皮细胞具有特异性的抑制作用。此外,由图2还可看出,K5mut1的EC50为30nM/L,与文献(ZhangD.et al.Diabetologia,44757-765,2001)中所公开的完整K5抑制RCEC细胞增值的EC50为70nM/L相比,K5mut1抑制视网膜内皮细胞增生的效果较完整K5强约2.5倍。
(2)K5mut1在氧诱导视网膜病模型中的抗血管增生作用氧诱导型视网膜血管增生大鼠模型为研究组建立(Gao G et al.Diabetes,511218-1225,2002)。简要如下新生有色Brown Norway大鼠出生7天后(P7)暴露于高氧(75%O2)5天,然后暴露于正常氧环境中。新生鼠12天(P12),麻醉动物,用玻璃毛细管将纯化的K5mut1注射到右眼中。左眼用同样容量的PBS作对照。注射后,动物处于正常氧中饲养5天(P17)以便观察K5mut1对视网膜新生血管的抑制作用。
通过把新生鼠暴露于高氧中在Brown Norway大鼠中诱导视网膜血管增生,方法如前所述(Gao et al.2002)。出生12天鼠(P12)玻璃体内注射K5mut1,对照眼注射同体积PBS缓冲液。大鼠在正常氧中饲养5天,通过荧光血管造影术检查大鼠(P17)视网膜血管增生情况。对照眼(PBS注射眼)有诸如新生血管丛、微动脉瘤、扩大化非充盈区域和血管渗漏等典型特征的血管增生,如图3A所示,而K5mut1注射眼显示明显的视网膜血管改善的特征,如图3B所示。在正常大鼠视网膜血管中,注射K5mut1未导致任何差异,如图3C和图3D所示。
定量分析显示K5mut1剂量在3μg/眼时,视网膜内层血管增生细胞显著减少(P<0.01,n=8,图4C所示)方法荧光标记的高分子葡聚糖视网膜血管造影术和新生血管计数描述见Smith等方法(Smith,L.E.,et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,35101-111,1994)。简要如下麻醉动物,通过心室内注射50mg/ml荧光标记的高分子葡聚糖进行荧光素灌注。立即处死大鼠,摘下眼球并用4%多聚甲醛固定10分钟,显微镜下分离完整视网膜并用4%多聚甲醛固定3小时,剪切视网膜并在明胶包被的载玻片上制成扁平标本。在荧光显微镜下检查血管增生的程度。如前所述(Zhang D.,et al.Diabetologia44757-765,2001),通过计数视网膜内层血管细胞确定视网膜新生血管数量。注射PBS组为对照组。
视网膜内层血管增生细胞计数表明,K5mut1剂量在3μg/眼时,视网膜血管增生细胞显著减少(P<0.01,n=8),而低剂量没有明显的抑制作用,如图4所示。在缺氧条件下,单纯注射该肽能抑制视网膜血管增生。在任何所分析的视网膜部分,注射K5mut1以后,没有观察到视网膜中毒的表观组织学证据,这表明,该肽在所用的剂量范围内,对视网膜和正常血管系统不导致任何毒性。
(3)K5mut1对血管渗透性的作用血管渗透性测定方法采用Even蓝染料,血管渗透性测定通过Even蓝染料从血管渗透到视网膜、虹膜和脉络膜等组织来进行,所用方法根据文献(Xu Q.,etal.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,42789-794,2001)并略加修改。Even蓝染料溶解于正常盐中(30mg/ml),超声波处理5分钟,通过0.45μm滤膜过滤。大鼠麻醉后,在显微镜下,采用玻璃毛细管,股动脉注射Even蓝染料(30mg/kg)。Even蓝染料非共价结合到血浆清蛋白。注射Even蓝染料后,大鼠立即显现蓝色,表明染料已被吸收并均匀分布。大鼠置于暖垫上2小时确保染料循环完全。然后打开胸腔,左心室灌注1%多聚甲醛柠檬酸缓冲液,缓冲液预热37℃以防止血管收缩。在120mmHg生理压力下灌注持续2分钟以清除血管中的染料。灌注后立即摘下眼球,在显微镜下仔细分离视网膜、虹膜和脉络膜。每个样品在70℃与150μl甲酰氨共育18小时以提取Even蓝染料。提取液在4℃,70000rpm离心20分钟(转子类型TLA100.3,Beckman),取100μl上清液620nm波长测定吸光度。每个样品提取物中Even蓝染料的浓度通过甲酰氨中Even蓝染料的标准曲线计算,并通过总蛋白浓度标准化。结果表示为μg Even蓝染料/mg总蛋白质。
血管渗透性测定结果在新生鼠出生14天(P14鼠),即大鼠置于正常氧下2天后,大鼠右眼玻璃体内注射不同剂量K5mut1(0.1,0.3,1.0μg/眼),左眼注射同体积的PBS缓冲液,每一剂量组4只大鼠。两天后(P16),用Evan蓝—血清渗漏方法测定血管渗透能力。氧诱导大鼠视网膜血管渗透能力,对比年龄匹配正常大鼠,显示有意义性升高,如图5所示。由图5还可看出,氧诱导大鼠视网膜中,K5mut1以剂量依赖性方式降低血管渗透性。显著降低血管渗透性所需的剂量比抑制视网膜血管增生所需的剂量低十倍。
本实施例证实,除了抗血管生成作用外,K5mut1能降低视网膜中血管渗漏,这种作用比其抑制视网膜血管增生活性更强,例如它可把氧诱导大鼠渗漏降低到年龄相配正常大鼠的水平。抗血管生成活性需3μg/眼,而降低血管渗漏仅需0.3μg/眼;在渗漏试验所用的剂量时,没有明显的抑制视网膜血管增生的作用,这表明K5mut1降低血管渗漏不可能是抑制血管增生的结果。尽管作用于血管渗漏的机制还不明确,抑制VEGF产生可能起主要作用,正如以前研究所显示的K5能下调氧诱导大鼠视网膜VEGF表达一样(Gao G,et al.J.Biol.Chem.,277(11)9492-9497,2002)。减少血管渗漏可为该肽治疗实体瘤、糖尿病性视网膜病和慢性炎症提供另一有利的作用。
综上所述,本发明所述的K5缺失突变重组多肽在抑制血管增生方面比K5拥有更强的抑制活性,在低浓度也能抑制血管渗漏,而且,它比K5更短,能在大肠杆菌中大规模地表达,这些特性表明该重组多肽在治疗血管增生性疾病和诸如斑点水肿等血管渗漏中具有巨大的潜在治疗价值。
序列表<110>广州市启源生物科技有限公司<120>人纤溶酶原Kringle 5缺失突变重组多肽<160>2<210>1<211>240<212>cDNA<213>人工序列<220><221><222><223><400>1tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 60ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 120aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 180ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 240<210>2<211>80<212>PRT<213>人工序列<220><221>mutation<222><223><400>2Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr15 10 15Val Thr Gly Thr Pro Cys Qln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg20 25 30His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys35 40 45Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr50 55 60Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys65 70 75 80
权利要求
1.人纤溶酶原Kringle5缺失突变重组多肽,其特征是该重组多肽的cDNA序列如序列表中的SEQ ID NO1所示,其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO2所示。
2.如权利要求1所述的人纤溶酶原Kringle5缺失突变重组多肽,其特征是该突变重组体的构建方法为采用人K5作模板通过PCR扩增得到,5′PCR引物5′-ATGAATTCGTGTATGTTTGGGAATGGG-3′和3′PCR引物5′-GCCAAGCTTACACTGAGGGACATCACAGTAG-3′各自含有EcoR I和HindIII位点,PCR删除了K5分子N端编码10个氨基酸残基的核苷酸序列和C端编码5个氨基酸残基的核苷酸序列,PCR产物EcoR I和HindIII位点克隆到pET22载体,插入位点的5′端具有编码信号肽的序列,在3′端含有编码6个组氨酸的序列。
3.如权利要求2所述的人纤溶酶原Kringle5缺失突变重组多肽,其特征是所述的突变型K5/pET22重组体在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化。
4.如权利要求3所述的人纤溶酶原Kringle5缺失突变重组多肽,其特征是所述的大肠杆菌为BL21/DE3株。
5.如权利要求3所述的人纤溶酶原Kringle5缺失突变重组多肽,其特征是通过组氨酸亲和层析柱来纯化K5mut1。
全文摘要
本发明公开了一种人纤溶酶原Kringle 5缺失突变重组多肽(K5 mut1),该重组多肽通过去掉K5分子的15个氨基酸残基同时保留K5分子中的所有3个二硫键而得到,并在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化。本发明所述的K5 mut1对血管增生和血管渗漏具有高效治疗作用该K5 mut1以浓度依赖的方式抑制原代培养视网膜内皮细胞,具有内皮细胞特异性抑制作用;注射K5 mut1后,视网膜新生血管丛和视网膜内层血管细胞比注射PBS的对照组出现有意义性减少(P<0.05);此外,注射K5 mut1还可降低视网膜内血管渗漏。因此,K5 mut1是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子,在诸如角膜新生血管性疾病、糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体肿瘤等血管增生异常和血管渗漏疾病紊乱的治疗中具有潜在的治疗价值。
文档编号C12N1/20GK1451746SQ0311395
公开日2003年10月29日 申请日期2003年3月20日 优先权日2003年3月20日
发明者高国全, 马建兴, 刘祖国, 李民友 申请人:广州市启源生物科技有限公司
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