专利名称：一种检测重组人肝细胞生长因子活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物活性的检测方法，更具体地说是一种重组人肝细胞生长因子(recombinant human hepatocyte growth factor，rhHGP)生物活性检测方法。
背景技术：
肝脏作为人体最重要的器官之一，承担着人体“化工厂”的重任，它的损伤将对机体造成一系列的影响。我国是病毒性肝炎的高发区，现症患者超过三千万，如何防治肝炎肝损伤，阻断“肝炎—肝硬化—肝癌”的发展链，是医学基础与临床工作者面临的重大课题。
促进肝细胞再生是防治肝损伤的关键，而肝细胞的再生受多种细胞因子的调控，其中rhHGF是促进肝细胞增殖、修复肝损伤的一个重要因子。rhHGF的研究成为近十年肝病防治领域研究的一个热点，rhHGF有希望开发成治疗肝病的新生物制品药物。
与化学药物不同，蛋白质类药物的药效体现于细胞因子的生物活性，具有生物活性的细胞因子才会有药效，同时生物活性的大小也影响药效的大小，所以细胞因子类药物的活性检测是药物质量控制的重要环节，目前已报道的rhHGF活性检测方法主要包括(1)体内检测方法制作小鼠CCl4肝损伤模型。分组给药后观察动物死亡率及肝脏病理改变，至少需耗时二周；(2)体外细胞同位素检测方法制备原代培养的肝细胞或传代HTC(hepatocyte cancer)肝癌细胞，分组加药培养后，加入H3-胸腺嘧啶(H3-TdR)进行液闪计数。上述方法主要存在以下不足(1)体内检测方法操作复杂、结果变异大、耗时长，不宜作为药品活性检测的常规方法；(2)体外细胞同位素检测方法存在放射线污染、变异大等不足，操作也较复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便易行、特异敏感的rhHGF活性检测方法。
本发明的目的所采用的技术方案是利用rhHGF对NIH3T3纤维细胞线粒体脱氢酶活性有促进作用，利用测定NIH3T3纤维细胞线粒体脱氢酶活性从而测定rhHGF产品的生物活性的方案。即以线粒体脱氢酶活性方法来检测rhHGF产品的生物学活性。
本发明技术方案的具体步骤为a复苏冻存的NIH3T3纤维细胞株，接种于培养瓶培养增殖；b以培养液调整培养增殖后NIH3T3纤维细胞浓度，置培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(1)NIH3T3纤维细胞对照组(C组)每孔加含1-10％小牛血清的培养液；(2)阴性对照组加含1-10％小牛血清的培养液及rhHGF溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHGF组以含1-10％小牛血清的培养液配置不同浓度rhHGF；置培养箱培养一定时间后，弃上清液，洗涤，加显色剂培养充分后吸尽培养液，加有机溶剂，振荡至溶解，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；数据及统计学处理所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；当样本数n＝8时，t＞2.2有活性。
本发明技术方案进一步可以为a复苏冻存NIH3T3纤维细胞株，接种于培养瓶培养增殖。
b培养增殖后NIH3T3纤维细胞，以含5％小牛血清的1640培养液调整细胞浓度，铺96孔板，置37℃，5％CO2培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(1)NIH3T3纤维细胞对照组(C组)每孔加5％小牛血清的1640培养液；(2)阴性对照组加5％小牛血清的1640培养液，及rhHGF溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHGF组以5％小牛血清的1640培养液配置，终浓度为0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/ml。
每组8孔，置37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次。加四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethylthiazal-2yl)2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT)，培养4-6小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值。检测波长570nm，参考波长630nm。
数据及统计学处理所有数据以x±s表示，以t检验比较差别的显著性。当n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/[活性浓度(μg/ml)×0.1ml]。
本发明步骤b)也可以以含10％小牛血清DMEM-F12调整细胞浓度为0.5×105个细胞/ml；铺96孔板，每孔100μl，置37℃，5％CO2培养箱培养24h。
本发明步骤b)的分组同样可以为分组(1)NIH3T3纤维细胞对照组(C组)以含1％小牛血清的培养液；分组(2)阴性对照组加含1％小牛血清的培养液，及rhHGF溶剂或等剂量冻干保护剂；本发明的检测方法操作简单，无放射性污染，省时，变异小，重复性好，不需特殊仪器设备，克服了现存方法的不足之处。
图1是rhHGF促进NIH3T3细胞增殖的量效关系图。
具体实施例复苏冻存NIH3T3纤维细胞株，接种于10ml培养瓶培养增殖。消化增殖后NIH3T3纤维细胞，以5％小牛血清的1640培养液调整细胞浓度为0.5×105个细胞/ml，铺96孔板，每孔100μl。置37℃，5％CO2培养箱培养24h，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(1)NIH3T3纤维细胞对照组(C组)每孔加100μl5％小牛血清的1640培养液；(2)阴性对照组加5％小牛血清的1640培养液，及rhHGF溶剂或等剂量冻干保护剂；
(3)rhHGF组5％小牛血清的1640培养液配置100μg/瓶rhHGF，终浓度为0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/ml。
每组8孔，置37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次。加0.15mg/ml MTT0.1ml/孔，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜0.1ml/孔，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值。检测波长570nm，参考波长630nm。
实验结果数据及统计学处理所有数据以x±s表示，以t检验比较差别的显著性，具体数值见表1，根据rhHGF促进NIH3T3细胞增殖的量效关系制作rhHGF促进NIH3T3细胞增殖的量效关系图如图1所示。
n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/[活性浓度(μg/ml)×0.1 ml]＝100×100/(10×0.1)＝10000(单位)表1 rhHGF对NIH3T3纤维细胞线粒体脱氢酶活性的影响(x±s，n＝8)浓度(μg/ml) A值Control 0.355±0.007rhHGF5.0 0.441±0.009**1.0 0.440±0.012**0.5 0.422±0.015**0.2 0.408±0.007**0.1 0.379±0.010**0.01 0.366±0.019与对照组比较，**P＜0.0权利要求
1.一种重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于利用测定NIH3T3纤维细胞线粒体脱氢酶活性从而测定rhHGF产品的生物活性。
2.如权利要求1所述的重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于其步骤为a复苏冻存NIH3T3纤维细胞株，接种于培养瓶培养增殖；b培养增殖后NIH3T3纤维细胞，以含1-10％小牛血清的培养液调整细胞浓度，置培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(1)NIH3T3纤维细胞对照组(C组)每孔加含1-10％小牛血清的培养液；(2)阴性对照组加含1-10％小牛血清的培养液，及rhHGF溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHGF组以含1-10％小牛血清的培养液配置系列浓度；c置培养箱培养一定时间后，弃上清液，洗涤，加显色剂培养充分后吸尽培养液，加有机溶剂，振荡至溶解，d用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；e对数据及统计学处理所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；当n＝8，t＞2.2时有活性。
3.如权利要求2所述的重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于步骤b)的分组(1)NIH3T3纤维细胞对照组(C组)每孔加含1％小牛血清的培养液；步骤b)的分组(2)阴性对照组加含1％小牛血清的培养液，及rhHGF溶剂或等剂量冻干保护剂；
4.如权利要求2所述的重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于所述步骤b)以含5％小牛血清的1640培养液调整细胞浓度，所述的置培养箱培养为铺96孔板，每孔100μl，置37℃，5％CO2培养箱培养24h。
5.如权利要求2所述的一种重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤b)以含10％小牛血清1640培养液调整细胞浓度为0.5×105个细胞/ml；所述的置培养箱培养为铺96孔板，每孔100μl，置37℃，5％CO2培养箱培养24h。
6.如权利要求2或4或5所述的任一重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤b)的分组为(1)所述的NIH3T3纤维细胞对照组中每孔加含1-10％小牛血清的1640培养液；(2)阴性对照组加含1-10％小牛血清的1640培养液，及rhHGF溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHGF组以含1-10％小牛血清的1640培养液配置系列浓度；
7.如权利要求5所述的重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤c)为置CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次；加MTT，培养4-6小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜，振荡器振荡5-10min至溶解；所述的步骤e)的活性单位计算公式为活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/[活性浓度(μg/ml)×0.1ml]。
8.如权利要求5所述的重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤b)分组所述的(3)rhHGF组培养液配置终浓度为0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/ml。
9.如权利要求6所述的重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于所述的分组试品每组8孔，置37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次；加0.15mg/ml MTT 0.1ml，培养4-6小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜0.1ml/孔，振荡器振荡5-10min。
10.如权利要求2或3所述的任一重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，其特征在于所述的步骤c)有机溶剂可以为异丙醇或二甲基亚砜。
全文摘要
一种重组人肝细胞生长因子生物活性检测方法，所采用的技术方案是应用NIH3T3纤维细胞株，以线粒体脱氢酶活性方法检测rhHGF产品的生物学活性，提供了一种简便易行、特异敏感的rhHGF活性检测方法。
文档编号C12Q1/32GK1521267SQ0311371
公开日2004年8月18日 申请日期2003年1月30日 优先权日2003年1月30日
发明者李茹冰, 王妍, 柴向东, 万华印, 孔祥平 申请人:深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司, 深圳市海王英特龙生物技术股份有限公