多肽的酶表面呈现技术和胆固醇酯转移蛋白c端多肽的酶表面呈现的制作方法

专利名称：多肽的酶表面呈现技术和胆固醇酯转移蛋白c端多肽的酶表面呈现的制作方法
表面呈现技术作为一种新的基因技术最早发展于1985年，即Smith等人成功地在噬菌体表面呈现了外源蛋白。后来，随着研究的不断深入，人们又发展了其他的表面呈现技术，如细菌表面呈现、酵母表面呈现、核糖体呈现和质粒呈现等，这些呈现技术的一个共同特征是能够同时产生许多种结构相关但有序变化的多肽。基于这个特点，这些技术可以对有意义蛋白的抗原表位或活性位点进行扫描定位、筛选和开发有希望成为受体激活剂、拮抗剂、疫苗成分及抗菌肽的先导多肽或用来构建人工抗体库和开发亚单位疫苗。
大肠杆菌L-门冬酰胺酶是一种临床上广泛使用的抗白血病药物，我们从大肠杆菌野生株中克隆了该酶基因，工程菌表达的酶蛋白占菌体总蛋白的48％以上，建立了相应的渗透振扰提取新工艺，能以高收率提取获得高纯度重组蛋白。在研究中我们注意到，当门冬酰胺酶基因的C末端区连接上破伤风毒素830-854肽段基因后，再在下游接加适当长度的多肽编码序列时，所表达的融合蛋白可以分泌到细菌周质腔，并能形成有门冬酰氨酶活性的重组分子，这表明融合的多肽并没有改变或轻微改变了酶分子的天然构象，换言之，连接的多肽可能仅游离于酶分子的表面，具有相对的独立性。
门冬酰胺酶作为有效表位载体有许多优点(1)门冬酰胺酶活力测定的灵敏度高，如果呈现构象化表位的酶依然具有活力，这相当于构象化多肽已被酶标记，并且不影响多肽与抗体的结合活性；(2)门冬酰胺酶由四个相同亚基构成，因此一个酶分子上呈现有四个环状多肽，能方便地设计“夹心法”等酶免疫测定方法。(3)我们在门冬酰胺酶PAGE电泳时还发现该酶有形成多聚分子的倾向，能形成二聚体、三聚体和四聚体蛋白，这种颗粒化倾向有利于增强免疫原性。该酶在临床应用中已经显示有很强的免疫原性，能用于发展疫苗；(4)门冬酰胺酶是血中半衰期较长的药物。若肌肉注射也能缓慢吸收。有足够时间供抗原充分发挥免疫刺激作用；(5)门冬酰胺酶也有一个二硫键，能分泌到细胞周质腔(periplasm)折叠，在周质腔氧化环境中二硫键容易自发形成。(6)将抗原多肽通过T细胞表位肽段与门冬酰胺酶C端融合，在细菌中高效表达并分泌到细胞周质腔中，这种基因工程菌在周质腔中含大量表面呈现有抗原多肽的重组门冬酰氨酶，能够直接用于发展活菌苗或灭活菌苗。(7)门冬酰氨酶已经在临床上用于治疗白血病和淋巴瘤，其安全性已经得到验证，用该酶作为呈现载体，开发用于人体的药物，将是较为安全的。
线性合成多肽构象不稳定、免疫原性较弱，常不能激发有效的保护性免疫，这是多肽疫苗研究中常遇到的老问题。虽然人们也常用戊二醛等双功能试剂将多肽聚合，或用化学方法将肽与载体偶联来弥补多肽免疫原性较弱的不足、有时也通过在肽两端引入半胱氨酸使多肽通过二硫桥环化的方法来保持肽的特定构象，然而常常不能同时兼顾两方面的问题。通过基因工程法将四个拷贝的多肽呈现到一个酶分子表面，有望使多肽能激发机体产生抗多肽特异性免疫反应。在用多肽抗原测定相应抗体时，常常需要用化学方法将多肽与牛血清白蛋白等载体蛋白偶联，通过基因工程法将多肽呈现到门冬酰氨酶分子表面上，能够直接用于抗肽抗体的测定。
动脉粥样硬化(Atherosclersis)是一种由于动脉血管壁上脂质斑的沉积，逐渐导致动脉堵塞，血流量减少的一种疾病。血浆胆固醇水平与冠状动脉粥样硬化的形成密切相关。血液中低密度脂蛋白(LDL)是将胆固醇运输到全身器官的主要载体，高浓度的LDL及LDL胆固醇将导致动脉内膜上粥样斑块形成，造成管腔狭窄或阻塞。相反，高浓度的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇能降低冠状动脉粥样硬化发病的危险。胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl estertransfer protein，CETP)是一个由476个氨基酸组成的糖蛋白，它介导血浆脂蛋白间的脂类交换。通过体外分析证实CETP承担了人体血浆中胆固醇酯(CE)与三磷酸甘油酯(TG)转移的全部活性。CETP能促进中性脂在富含CE的脂蛋白(如HDL)与富含TG的脂蛋白(如LDL)间交换，从而导致HDL上CE的不断消耗与TG的逐渐富集。动物模型研究表明抑制CETP的活性能极大地改变胆固醇在HDL与LDL之间的交换，从而起到抗动脉粥样硬化的作用。
本发明的目的是提供一种呈现(surface display)多肽在门冬酰氨酶表面的方法和用途。
本发明的另一目的是提供一种呈现胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶基因和蛋白质。
本发明的再一目的是提供呈现有胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种呈现多肽在门冬酰氨酶表面的方法和用途。该呈现方法的具体步骤是(1).用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌染色体DNA中扩增获得门冬酰氨酶II基因，在大肠杆菌中高效表达；(2).用基因工程方法将具有强T辅助表位功能的破伤风毒素830-854多肽(QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI，以下简称TTP)、作为连接肽的Ser-Ser-Gly-Thr肽段和作为呈现肽段的人源的胆固醇酯转移蛋白C端肽段(RDGFLLLQMDFGFPEHLLVDFLQSLS，以下简称CETPC)连接到门冬酰氨酶的C末端，在大肠杆菌中表达出有活性的融合蛋白；这样，胆固醇酯转移蛋白C端肽段就被呈现到了酶的表面，由于门冬酰氨酶是同性四聚体蛋白，因此，每个酶分子表面呈现有四个同形的多肽；(3).如果要呈现其他的多肽在酶分子表面，只需通过加端PCR(add-PCR)的方法用拟呈现的多肽置换胆固醇酯转移蛋白C端肽段；因此，该呈现技术能用于呈现各种来源的多肽；呈现有多肽的重组酶不仅可用于发展疫苗，也能用于发展检测抗体的抗原。
在本发明的第二方面，提供一种呈现胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶基因和蛋白质。该基因序列编码具有序列表1所示的氨基酸序列的重组蛋白质，，该蛋白质的DNA序列包括序列表1中第1-2289位所示的核苷酸序列。这种重组门冬酰氨酶采用本发明的第一方面所述的方法进行设计。应用基因操作技术将具有强T辅助表位功能的破伤风毒素830-854多肽(QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI，简称TTP)、作为连接肽的Ser-Ser-Gly-Thr肽段和作为呈现肽段的人胆固醇酯转移蛋白C端肽段(RDGFLLLQMDFGFPEHLLVDFLQSLS，简称CETPC)连接到门冬酰氨酶的C末端，在大肠杆菌中表达出有活性的融合蛋白；这样，胆固醇酯转移蛋白C端肽段就被呈现到了酶的表面，由于门冬酰氨酶是同型四聚体蛋白，因此，每个酶分子表面呈现有四个同形的多肽；通过测定酶活力，能够观察到这种新的呈现有胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组蛋白在大肠杆菌中表达并分泌到细菌细胞的周质腔中，用渗透振扰法也很容易从周质腔中分离出有门冬酰氨酶活性的重组酶。本发明所述的重组酶基因适宜在大肠杆菌中表达，将基因引入其他生物体，如肠道习居的各种微生物、各种减毒的病原菌，同样能表达出相同功能的重组酶。
在本发明的第三方面，是提供呈现有胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶的用途。将含酶的菌体直接用于免疫动物，菌体的其他化学成分提供一种类似佐剂的作用。巨噬细胞是重要的抗原递呈细胞，由于菌体是微小的颗粒，容易被机体的巨噬细胞吞噬，存在于菌体周质腔中的大量重组酶也连同细胞一道被吞噬和递呈，激发机体产生针对胆固醇酯转移蛋白C端肽段的特异性抗体；胆固醇酯转移蛋白C端肽段呈现在重组酶的表面，容易被机体的B细胞表面的受体识别，重组酶还能凭借强的T辅助表位(如破伤风毒素的830-854多肽)，诱导T辅助细胞的应答，激发机体产生针对胆固醇酯转移蛋白C端肽段的特异性抗体。抗胆固醇酯转移蛋白抗体能阻断胆固醇酯转移蛋白的作用，通过抑制CETP的活性阻断胆固醇从HDL向LDL的转移，使血浆高密度脂蛋白胆固醇酯增加，而低密度脂蛋白胆固醇酯减少，从而起到抗动脉粥样硬化的作用。
实施例材料
(1)菌株与质粒大肠杆菌(Escherichia coli ASl.357)该菌种从中国菌种保藏中心获得。
宿主菌Escherichia coli BL21和E.coliJM109是基因工程常用工具菌种，与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。
质粒pET28a和pCR2.1购自Novagen公司。
(2)酶和试剂分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品；(3)培养基LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。
玉米浆培养基含有玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。
(4)Cellouse-DEAE52为Whatman公司产品。
(5)辣根过氧化物酶标记兔抗大鼠Ig二抗为武汉博士德公司产品。
(6)3、3｀、5、5｀-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、过氧化氢尿素和牛血清白蛋白(BSA)为美国西格马(Sigma)公司产品。
(7)96孔酶标板为美国康宁(Corning)公司产品。
(8)硝酸纤维素膜为美国Millipore公司产品。
(9)测定血清中总胆固醇和高密度酯蛋白中胆固醇含量的试剂盒为日本和光(Wako)公司产品。
方法质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，PP.16-340。
重组蛋白表达量的测定参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。
实施例1
1胆固醇酯转移蛋白C端肽段基因的设计、合成和克隆根据胆固醇酯转移蛋白C端肽段的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子，在计算机的辅助下设计出胆固醇酯转移蛋白C端肽段基因的全序列。依据该序列设计出3条寡核苷酸片段，进行化学合成。首先通过PCR法合成胆固醇酯转移蛋基因的部分序列，再通过第二次PCR扩增获得胆固醇酯转移蛋白C端肽段基因的全序列。具体而言，第一步寡核苷酸片段P1和P2按一定比例混合，二者互为引物和模板，95℃，1min，55℃，1.5min，72℃，2min，共10轮；72℃，10min。再以该PCR产物为模板，用P1和P3引物进行PCR扩增，将扩增获得的PCR产物用限制性内切酶BamH1和HindIII消化，与用相同限制性内切酶消化的pED质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21。从转化子中抽提的质粒命名为pED-CETP，其结构框架见

图1，序列测定结果见图2。
3条寡核苷酸如下P15’GGGGGATCCGTCTGGTACTCCGGAAATCATCACTCGTGACGGTTTCCTG 3’P25’CAGCAGGTGTTCCGGGAAACCGAAGTCCATCTGCAGCAGCAGGAAACCGTCACGGCT 3’P35’AAAAAGCTTAAGACAGAGATTGAAGGAAGTCAACCAGCAGGTGTTCCGGGAA 3’实施例2TTP-CETPC基因的设计、合成和克隆TTP基因的合成采用PCR法。三段引物分别为TTTTTCCGGAGTACCAGAAGAGATTACAGACGGGAAGTAGGAGTAGATCTE1 5’GGGGGATCCGTGCCAGTACATCAAAGCTAACTCTAAATTCATCGGT 3’TE2 5’CGGGAAGTAGGAGTAGATCAGTTCAGTGATACCGATGAATTTAGAGT 3’TE3 5’TTTTTCCGGAGTACCAGAAGAGATTACAGACGGGAAGTAGGAGTAGATC 3三者互为引物和模板，94℃，30秒，60℃，45秒，72℃，45秒，共30轮；72℃ 5分钟。将扩增获得的PCR产物用限制性内切酶BamHI和Kpn2I消化，与用相同限制性内切酶消化的pED-CETP质粒连接，连接产物转化大肠杆菌BL21。从转化子中抽提的质粒命名为pED-TTP-CETPC，序列测定结果见图3。
实施例3门冬酰氨酶-TTP-CETPC融合蛋白基因的构建、克隆和表达用普洛麦格试剂盒，抽提大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌染色体DNA。根据文献报道的门冬酰氨酶II基因序列设计并合成一对引物，在引物的两头加入酶切位点。上游引物
5’-TTCGCCATGGCCAAGAACAATTGCGTACG-3’；下游引物5’-TTCCGAAGCTTAGAAATCCATGCCACCCATG-3’。以提取的染色体DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物用NcoI和HindIII酶切，用相同酶切的pET28a载体连接。载体连接后转化大肠杆菌E.coli BL21，转化子涂布于含有卡那霉素的LB平板上培养16小时，通过酶活力测定筛选重组转化子，其重组质粒命名为pET28-ansB，其结构筐架见图1。再以pET28-ansB质粒为模板，用上游引物5’-TTCGCCATGGCCAAGAACAATTGCGTACG-3’；下游引物5’-TTCCGGATCCGCGTACTGATTGAAGATCTG-3’，进行PCR扩增，扩增产物用NcoI和BamHI酶切，与用相同酶切的pED-CETPC和pED-TTP-CETPC载体连接。载体连接后转化大肠杆菌E.coli BL21，转化子涂布于含有卡那霉素的LB平板上培养16小时。通过测定菌体门冬酰氨酶活性进行阳性克隆筛选。从阳性克隆中抽提的质粒用核苷酸自动测序仪进行测定，验证了基因克隆的正确性，该重组质粒分别命名为pET28-ansB-CETPC和pET28-ansB-TTP-CETPC，其其结构筐架见图1。
实施例4门冬酰氨酶-TTP-CETPC融合蛋白在大肠杆菌中的表达将含重组质粒pET28-ansB-CETPC和pET28-ansB-TTP-CETPC的基因工程菌单菌落分别种入液体培养基中37℃过夜，按2％比例转种入新鲜的液体培养基中，37℃培养4小时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导大肠杆菌表达T7RNA聚合酶，菌体经离心回收后，用SDS电泳再经薄层扫描显示重组门冬酰氨酶-TTP-CETPC融合蛋白占细菌总蛋白的30％左右，结果见图4。菌体的门冬酰氨酶活力测定显示(图5)，与表达重组门冬酰氨酶-CETPC融合蛋白的工程菌相比，表达重组门冬酰氨酶-TTP-CETPC融合蛋白的工程菌保持了，说明TTP的引入不仅能强化免疫原性，也有利于多肽的呈现，维持门冬酰氨酶原有的构像。
实施例5门冬酰氨酶-TTP-CETPC融合蛋白的制备含pET28-ansB-TTP-CETPC质粒的工程菌培养在500ml摇瓶中进行。从新鲜转接的平皿中挑取单菌落接入LB液体培养基中，37℃培养至对数期作为一级种子，以2％接种量接入到含200ml玉米浆培养基的500ml摇瓶中，37℃，260rpm培养4h后，加入2％乳糖诱导4h，以5000rpm离心25min收集菌体，用渗透休克法，即每1g湿菌体加入10ml渗透休克液(20％蔗糖，1mmol EDTA，10mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液)中，在37℃搅拌1小时。8000rpm离心15min，收集上清，直接上DEAE纤维素DE52柱(2×60cm)，用含50mmol/LNaCl的PBS到含300mmol/L NaCl的PBS梯度洗脱，分步收集进行SDS-PAGE电泳检测，门冬酰氨酶-TTP-CETPC在80-120mmol/L NaCl处的洗脱峰中， 用SDS-PAGE电泳检查制备样品的纯度(见图4)。纯化蛋白的门冬酰氨酶活力测定显示(图5)，与天然的门冬酰氨酶相比，重组门冬酰氨酶-TTP-CETPC融合蛋白的比活力也很高，说明TTP-CETPC呈现在酶表面对酶活力影响较小，门冬酰氨酶能维持原有的构像。
实施例6用含pET28-ansB-TTP-CETPC的重组大肠杆菌免疫动物诱发产生抗人胆固醇酯转移蛋白特异抗体选用7-8周龄SD大鼠20只，随机分成4组，分开饲养，体重80-110克。进行第一次免疫，第一组皮下注射100μl含pET28-ansB的从组大肠杆菌菌体，第二组皮下注射100μl含pET28-ansB-CETP的重组大肠杆菌菌体，第三组皮下注射100μl含pET28-ansB-TTP-CETPC的从组大肠杆菌菌体，对照组注射不含质粒的大肠杆菌菌体，四组菌体数都为5×108cfu。以后每隔2周加强免疫一次，共进行2次加强免疫，对照组注射相同量的生理盐水。两周后进行第二次免疫。第一次免疫一周后开始每周从眼眶采血一次，血量为0.5-0.8ml，离心，取血清冷冻保存，备用。三次免疫后于第9周处死大鼠，动脉取血，测定血样中的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的含量。
实施例7抗人胆固醇酯转移蛋白特异抗体的ELISA检测用纯化的重组人血管内皮生长因子121及CETPC的融合蛋白(rhVEGF-CETPC)4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100μg融合蛋白。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭一小时。实施例6中所得抗血清，用pH7.5的PBS(含5％BSA和0.1％Tween-20)稀释100倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1小时。用PBST(含0.1％Tween-20)洗涤6次后加入100μl以1∶20000稀释的兔抗大鼠IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1小时。PBST洗涤6次，每孔加入100μl过氧化氢尿素和3、3｀、5、5｀-四甲基联苯胺(TMB)溶液于37℃显色10分钟后，加入50μl 2MH2SO4终止反应，并于450nm波长下，测定各孔吸光度值。结果见图6。
实施例8
抗人胆固醇酯转移蛋白特异抗体的Western检测将纯化后的rhVEGF、还原态rhVEGF-CETPC、氧化态rhVEGF-CETPC和门冬酰氨酶用15％SDS-PAGE电泳后，于25V电压电泳过夜转移到硝酸纤维素膜上，然后以5％BSA溶液室温封闭2小时。实施例6中所得抗血清稀释10倍后，与硝酸纤维素膜上的抗原于37℃作用1小时后，以pH7.5 Tris.Cl缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；加入稀释200倍的兔抗大鼠IgG(辣根过氧化物酶标记)二抗，于37℃作用1小时，再以以pH7.5 Tris.Cl缓冲液(含0.1％Tween-20)洗膜4次；最后，加入二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。具体操作方法参考Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，pp.888-898。
结果见图7。
实施例9血清中总胆固醇和高密度酯蛋白胆固醇含量测定采用商品化的试剂盒，为日本和光公司的产品，按照说明书进行测定。结果(见图8)表明，大鼠经载荷pET28-ansB-TTP-CETPC质粒的大肠杆菌免疫后，机体中高密度酯蛋白胆固醇含量明显升高，较载荷pET28-ansB质粒的大肠杆菌免疫的大鼠高密度酯蛋白胆固醇含量提高了约20％。
图1，重组质粒pET28-ansB、pET28-ansB-CETPC和重组质粒pET28-ansB-TTP-CETPC。
图2.pED-CETPC质粒CETPC基因测序结果。
图3.pET28-ansB-TTP-CETPC质粒TTP-CETPC基因测序结果。
图4.SDS-PAGE电泳显示AnsB-CETPC融合蛋白基因表达(A)和AnsB-TTP-CETPC融合蛋白基因表达(B).A1.标准分子量蛋白；2.纯化的大肠杆菌门冬酰氨酶；3.载荷pET28-ansB-CETPC质粒的大肠杆菌BL21细胞裂解物的水不溶性蛋白；4.载荷pET28-ansB-CETPC质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；5.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；B1.标准分子量蛋白；2.纯化的AnsB-TTP-CETPC融合蛋白；3.载荷pET28-ansB-TTP-CETPC质粒的大肠杆菌BL21细胞裂解物的水不溶性蛋白；4.载荷pET28-ansB-TTP-CETPC质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白；5.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；6.纯化的大肠杆菌门冬酰氨酶.
图5.重组酶(1)和基因工程菌体细胞(2)的门冬酰氨酶活力比较。1.纯化的酶制品酶活力比较。■门冬酰氨酶； 门冬酰氨酶-TTP-CETPC融合蛋白。2.基因工程菌体细胞酶活力比较。■载荷pET28-arsB-TTP-CETPC质粒的大肠杆菌BL21细胞； 载荷pET28-ansB-CETPC质粒的大肠杆菌BL21细胞。
SDS-PAGE电泳显示(GnRH)3-hinger-MVP多肽基因的融合表达。1.大肠杆菌BL21细胞全蛋白；2.载荷pED载体质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白，A箭头显示融合伙伴L-ansB-C的位置；3.标准分子量蛋白；4.大肠与杆菌BL21细胞全蛋白；5.载荷pET28ansB-C-GnRH3质粒的大肠杆菌BL21细胞全蛋白，B箭头显示(抗原表位)3-铰链区-T辅助表位多肽与L-ans B-C形成的融合蛋白的位置。
图6.ELISA测定结果显示载荷pET28-ansB-CETPC质粒的大肠杆菌和载荷pET28-ansB-TTP-CETPC质粒的大肠杆菌均能诱发大鼠产生抗胆固醇酯转移蛋白抗体，其中载荷pET28-ansB-TTP-CETPC质粒的大肠杆菌诱发的抗体滴度最高。 pET28-ansB；□ pET28-ansB-CETPC；■pET28-ansB-TTP-CETPC； PBS。
图7.Western检测显示载荷pET28-ansB-TTP-CETPC的菌体免疫诱导的抗血清能与rhVEGF-CETPC和门冬酰氨酶反应，不能与rhVEGF反应。1.纯化的门冬酰氨酶；2.还原的rhVEGF-CETPC；3.氧化的rhVEGF-CETPC；4.氧化的rhVEGF。
图8.血清中高密度酯蛋白胆固醇含量测定结果。
序列表<110>中国药科大学<120>多肽的酶表面呈现技术和胆固醇酯转移蛋白C端多肽的酶表面呈现<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1236<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1236)<400>1atg gag ttt ttc aaa aag acg gca ctt gcc gca ctg gtt atg ggt ttt 48Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe1 5 10 15agt ggt gca gca ttg gca tta ccc aat atc acc att tta gca acc ggc 96Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly20 25 30ggg acc att gcc ggt ggt ggt gac tcc gca acc aaa tct aac tac aca 144Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr35 40 45gtg ggt aaa gtt ggc gta gaa aat ctg gtt aat gcg gtg ccg caa cta 192Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu50 55 60aaa gac att gcg aac gtt aaa ggc gag cag gta gtg aat atc ggc tcc 240Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser65 70 75 80cag gac atg aac gat aat gtc tgg ctg aca ctg gcg aaa aaa att aac 288Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn85 90 95
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Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe1 5 10 15Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly20 25 30Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr35 40 45Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu50 55 60Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser65 70 75 80Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn85 90 95Thr Asp Cys Asp Lys Thr Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp100 105 110Thr Met Glu Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp115 120 125Lys Pro Val Val Met Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser130 135 140Ala Asp Gly Pro Phe Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp145 150 155 160Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val165 170 175
Leu Asp Gly Arg Asp Val Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr180 185 190Phe Lys Ser Val Asn Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys195 200 205Ile Asp Tyr Gln Arg Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro210 215 220Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr225 230 235 240Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala245 250 255Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr260 265 270Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala275 280 285Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala290 295 300Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn305 310 315 320Pro Gln Lys Ala Arg Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys325 330 335Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr Ala Asp Pro Cys340 345 350
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ile355 360 365Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Ser Gly Thr Pro Glu Ile Ile370 375 380Thr Arg Asp Gly Phe Leu Leu Leu Gln Met Asp Phe Gly Phe Pro Glu385 390 395 400His Leu Leu Val Asp Phe Leu Gln Ser Leu Ser405 410
权利要求
1.一种将多肽呈现在大肠杆菌L-门冬酰氨酶表面的方法，其特征在于通过基因操作将肽段通过一段间隔肽-----源于破伤风毒素的T辅助表位肽段，连接在L-门冬酰氨酶的C端；形成的融合基因可以表达产生具有门冬酰氨酶活性的融合蛋白，多肽被呈现到酶表面，不影响酶自身的折迭。
2.一种人工构建的呈现有胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶，其特征在于呈现有人胆固醇酯转移蛋白C端31肽的重组酶依然具有门冬酰氨酶活性，人胆固醇酯转移蛋白C端31肽呈现在酶的表面。
3.如权利要求2所述呈现有胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶，其特征在于，它包括序列表1所示的第1-411位氨基酸序列。
4.一种人工构建的基因，其特征在于，该基因的DNA序列编码具有序列表1所示的氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求4所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列包括序列表1中第1-1236位所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求2所述呈现有胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶，其特征在于免疫动物能诱发机体产生抗胆固醇酯转移蛋白抗体，通过机体内抗胆固醇酯转移蛋白抗体与胆固醇酯转移蛋白结合，可以阻断高密度脂蛋白胆固醇向低密度脂蛋白的转移，使机体高密度脂蛋白胆固醇升高，从而防止动脉粥样硬化的发生和促进动脉粥样硬化的消退。
7.根据权利要求4所述为呈现有胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶的基因，其特征在于可直接将该基因引入生物体内表达，并将表达有该重组酶的生物体直接作为疫苗。
8.根据权利要求2所述呈现有胆固醇酯转移蛋白C端肽段的重组门冬酰氨酶，其特征在于可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。
全文摘要
本发明提供了一种将多肽呈现在大肠杆菌门冬酰氨酶表面的方法，它包括步骤1〕通过基因操作，将源于破伤风毒素的T辅助表位肽段融合到门冬酰氨酶的C端，形成通用的呈现载体；2〕将待呈现的多肽编码序列DNA连接在上述载体的C端；3〕生成的重组酶能分泌到周质中并保持大部分酶活性，能通过渗透振扰法快速制备；该表面呈现技术能快速呈现抗原多肽，用于发展疫苗和测定抗体的检测试剂。用该呈现技术将人胆固醇酯转移蛋白C端多肽呈现到了酶表面，形成一种新的重组蛋白和相应编码基因，该基因在大肠杆菌中高效表达，重组蛋白保留了85％的酶活性，该重组蛋白的用途是能诱发机体产生抗人胆固醇酯转移蛋白特异抗体，阻断人胆固醇酯转移蛋白的功能，使机体高密度酯蛋白胆固醇含量升高，起到预防动脉粥样硬化和促进动脉粥样硬化消退的作用。
文档编号C12N15/55GK1548540SQ0311340
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月9日 优先权日2003年5月9日
发明者刘景晶, 祁高富, 茅丹, 吴洁, 曹荣月 申请人:中国药科大学