专利名称：病原微生物诊断型基因芯片的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片的检测方法，特别是涉及病原微生物诊断型基因芯片的快速检测方法。
背景技术：
基因芯片技术的两个主要应用领域是表达谱检测和病原微生物的诊断，其主要优势是可以实现大规模，高通量的检测，也就是说可以同时检测多个基因在某种状态下的表达情况或者同时检测多种病原微生物或同一种病原微生物的不同亚型的感染情况。
目前，在技术方面限制基因芯片应用于临床感染性疾病诊断的主要瓶颈表现在以下三点(1)标记效率不高，效果不确实目前对于目的DNA片段的标记方法很多，但主要有三种类型，一种是在延伸或扩增的过程中掺入荧光标记的dNTP；另一种是直接在引物上标记，然后延伸；第三种方法是在延伸或扩增的过程中掺入aa-dNTP，然后再用荧光素间接标记aa-dNTP。前一种方法涉及到各dNTP以及荧光标记的dNTP的比例关系问题，目前尚无统一的标准，而不适当的比例将会严重影响掺入效率，并进一步影响杂交结果。另外，掺入效率的不统一造成很难在目的片段量与杂交后的荧光强度之间建立相关关系，从而不能很好地用芯片进行定量分析。第二种方法虽然比较经济，但由于仅在引物上有荧光物质，因此标记的荧光强度低，尤其对低拷贝数的目的片段来说其敏感性不高。第三种方法虽然可以放大信号强度，但操作比较繁琐，不易投入临床应用。
(2)杂交动力学条件控制不佳基因芯片的杂交过程受到探针和荧光分子的长度、Tm值、空间位阻等多种因素的影响，目前的探针主要有PCR产物和Oligo两种，对样品的标记主要有扩增全基因组或扩增某个特异性片段。探针与样品分子之间的杂交动力学条件控制不佳，将会严重的影响杂交结果。
(3)杂交时间过长目前通用的杂交温度主要有高温(55～65℃)和低温(42℃)两种，主要特点是在低温杂交缓冲液中加入了甲酰胺从而降低了退火温度，通常的杂交时间需要16～20小时，尤其对于高温杂交来说，由于很容易蒸发，需要的样品液量大，杂交时间也不应过长。杂交时间过长在一定程度上限制了感染性疾病诊断芯片的产业化进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种标记效率高、杂交时间短的病原微生物诊断型基因芯片的快速检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用PCR扩增病原微生物全基因组，并用Cy5-dUTP进行掺入标记，通过调整各种试剂的比例，新生的标记分子中稳定地掺入了大量的荧光物质，以提高标记效率。本发明还通过在病原体全基因组标记前或标记后引入限制性酶切，获得杂交动力学条件最好的长度在200～600bps之间的片段与芯片杂交。此外，本发明还从应用的角度出发，选用低温条件下杂交，对杂交缓冲液的配制进行了改进，使杂交时间从传统的16～20小时缩短到10分钟。
本发明所述的病原微生物诊断型基因芯片的快速检测方法包括以下步骤(1)玻片的准备。
(2)探针准备采用PCR扩增病原体全基因组的各个基因和特异性片段，探针长度从数百到数千碱基不等，浓度在0.25～0.5μg/μL。
(3)芯片制备采用基因芯片点样仪进行点样。
(4)打印后处理。
(5)样品的处理在PCR扩增过程中，Cy5-dUTP进行掺入标记，在标记前或标记后引入限制性酶切，使获得片段长度在200～600bps之间。
(6)杂交2×杂交缓冲液的配方为60％甲酰胺、12×SSC、0.24％SDS。
(7)杂交后清洗。
(8)扫描检测。
在所述步骤(5)中，标记dNTP的配制为三种dNTP的摩尔终浓度与另一种欲用荧光标记物替代的dNTP的摩尔终浓度比应该为5∶3，而荧光标记物cy5-dUTP与和其竞争性掺入的dTTP的摩尔浓度比应该是1∶3。
在所述步骤(5)中，2×标记PCR缓冲液的配比为5U/μL Taq酶8μL，10×PCR buffer 100μL，25mM MgCl280μL，标记dNTP 20μL，ddH2O 292μL，共500μL，充分混匀，-20℃保存。
在所述步骤(5)中，标记PCR反应体系为2×PCR缓冲液10μL，模板DNA1μL，50μM引物0.5μL，Cy5-dUTP 1.2μL，ddH2O 6.8μL。
本发明中所述的病原微生物诊断型基因芯片可以是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)和人乳头瘤病毒(HPV)等诊断型基因芯片。
本发明与现有技术相比具有以下优点①标记效率提高由于本发明采用PCR扩增病原体全基因组，并用荧光标记dNTP进行掺入标记，通过调整各种试剂比例，使得标记效率得到很大提高。以cy5-dUTP掺入标记为例，经计算表明每6个碱基T的位置可掺入一个cy5-dUTP，这样，新生的标记分子中稳定的掺入了大量的荧光物质。②杂交检测结果稳定本发明通过在全基因组标记前或标记后引入酶切，将获得的片段与芯片杂交，并对结果进行统计学分析，得出在200～600bp之间的片段的杂交动力学条件最好，效果最佳，从最初准备的多个探针中选择出杂交效果稳定、特异性高的片段，再点样成为优化的基因芯片，经杂交检测获得了比较稳定的结果。③杂交时间大大缩短本发明从应用的角度出发，选用低温条件下杂交，对杂交缓冲液的配制进行了改进，用该杂交缓冲液处理样品，可将杂交时间从传统的16～20小时(Corning CMT-GAPSTM玻片)缩短到10分钟，整个检测操作过程可在2小时内完成；由于低温杂交，样品的蒸发问题不严重，因此需要的样品量小，约5μL，也无需如封闭胶等特殊的试剂对盖玻片进行封闭，简化了芯片杂交的操作步骤，使用者只需加上样品，盖上盖玻片，放入芯片杂交盒杂交即可。④检测敏感性较高本发明结合PCR可以检测到fg(10-15g)级水平，并具有一定的定量作用。因此，本发明对应用基因芯片做病原微生物检测提供了一种快速、高敏感性的检测方法，尤其适用于临床感染性疾病的诊断。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明的实施例1中的HBV基因芯片的阵列设计图。
图2是本发明的实施例1中的HBV全长标记后经Sau3AI酶切后杂交结果图。
图3是本发明实施例1中的HBV全长标记后直接杂交结果图。
图4是本发明实施例1中的0.1μg模板标记杂交结果图。
图5是本发明实施例1中的0.01μg模板标记杂交结果图。
图6是本发明实施例1中的1ng模板标记杂交结果图。
图7是本发明实施例1中的1pg模板标记杂交结果图。
图8是本发明实施例1中的1fg模板标记杂交结果图。
图9是本发明实施例1中的扩增示意图。
图10是本发明实施例2中HCV Sau3AI酶切后全长标记直接杂交结果图。
图11是本发明实施例2中HIV1G亚型杂交结果12是本发明实施例2中HPV16亚型杂交结果图。
图13是本发明实施例2中HBV、HCV、HIV联合诊断芯片杂交结果图。
具体实施例方式
实施例1本实施例以HBV-DNA诊断芯片为例，其检测方法包括如下步骤(1)玻片的准备以NaOH-乙醇(70gNaOH，300mLddH2O，500mL95％冻乙醇)清洁玻片2h后，用水清洗数次，然后用poly-L-Lysine溶液(70mL poly-L-Lysine，70mL组织培养用PBS，600mL ddH2O)进行包被1小时，用水冲洗5次后，45℃烘干，室温下放置两周备用。
切割盖玻片成适当大小，用2％SDS清洗10min，ddH2O漂洗，100％乙醇脱水，然后用硅烷化试剂包被；凉干备用。
(2)探针准备设计引物扩增双链化HBV-DNA的各个ORF，各段基因及全长序列共20条，调整浓度至0.5μg/μL，加入同样体积的DMSO做点样缓冲液。探针长度在200～3200bp之间。
(3)芯片制备用基因芯片点样仪进行点样成12×12阵列，每个玻片上共8个阵列，可进行四次检测。阵列的设计图如图1所示。
由图1可知，阵列的设计为12×12个点，每行打印两个靶基因片段，每个片段打印12个点，点与点之间的间距为300μm，打印在3.6×3.6mm2的面积上。其中A-E和G-K行均为HBV靶基因片段，F及L行包含有阴性和空白对照。
(4)打印后处理打印后玻片置于42℃ 3×SSC盐水湿盒上方，正面朝下再水合化。迅速在120～140℃的热玻璃盘中干燥，然后放入紫外交联仪中，以65mJ的总能量照射交联，从而使探针结合并固化在玻片表面。
(5)样品的处理a.从病毒血清中分离HBV-DNA，取200μL，病毒血清加入等体积的裂解液(20mMTris-HCl(PH8.0)，10mMEDTA，1％SDS，0.8mg蛋白酶K)，70℃水浴2小时，然后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，乙醇-20℃沉淀1小时，用20μL水溶解。
b.标记dNTP的配制三种dNTP的摩尔终浓度与另一种欲用荧光标记物替代的dNTP的摩尔终浓度比应该为5∶3，而荧光标记物cy5-dUTP与和其竞争性掺入的dTTP的摩尔浓度比应该是6∶1，由于cy5-dUTP较dTTP的空间位阻大，这样的浓度配制可保证在标记好的样品链中每隔6个T的位点可以掺入一个cy5-dUTP。即标记100mM dATP，100mM dGTP，100mM dCTP各10μL，100mMdTTP 6μL，ddH2O 64μL，混匀。
c.2×标记PCR预混液的配制Taq酶8μL，10×PCR buffer 100μL，25mMMgCl280μL，标记dNTP 20μL，ddH2O 292μL，Cy5-dUTP 50μL充分混匀，-20℃保存。
d.样品的荧光标记采用全长Cy5-dUTP掺入后酶切的方法进行标记，将抽提得到的HBV-DNA基因用引物P1、P2进行全长扩增标记(P15’CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA3’P25’CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG3’)，反应体系为2×PCR缓冲液10μL，模板DNA 1μL，引物P1、P2各0.5μL，Cy5-dUTP1.2μL，ddH2O 6.8μL，反应条件为95℃5min→95℃40s，60℃40s，72℃4min共15个循环→72℃7min→4℃保存。
e.样品的标记后处理(限制性酶切及纯化)将标记产物用乙醇沉淀，加入11μL ddH2O溶解，测得浓度为0.0922μg/μL，在剩余的10μL溶液中加入1μL Sau3AI，2μL 10×H Buffer，7μL ddH2O，37℃下酶切1h。该酶在以P1、P2为引物获取得全长HBV基因组中有7个切点(160，599，1101，1170，1419，2653，2891)，其片段分别为F1(1821-1981)，F2(1981-2420)，F3(2420-2922)，F4(2922-2991)，F5(2991-25)，F6(25-1259)，F7(1259-1497)，F8(1497-1825)，酶切片段与探针理论可杂交的对应关系见表1。将酶切产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，溶于11μL ddH2O中，取1μL测得浓度为0.0164μg/μL。
表1探针与芯片位点以及理论可杂交片段对应关系探针阵列点 序列标记样品片段labeled fragmentsprobe spotssequence F1F2F3F4F5F6F7F81 A1-6 1763-2032√√2 A7-121956-2073√√3 B7-121821-2043√√4 B1-6 1997-2363 √5 C1-6 2428-2806√6 C7-122812-202 √√√7 D1-6 67-738 √8 D7-122357-738 √√√√9 E1-6 634-1394 √√10 E7-121266-1825√√11 F1-6 HIV片段12 F7-1250％DMSO13 G1-6 1859-2287√√14 G7-12HBV全长 √√√√√√√√15 H1-6 1821-2363√√16 H7-121928-2400√17 I1-6 2357-2957 √18 I7-123007-116 √ √19 J1-6 104-571 √20 J7-12323-1434 √√ √21 K1-6 94-1239 √ √22 K7-121386-1703√√23 L1-6 HIV片段24 L7-1250％DMSO注打“√”者表示两片段在理论上可以杂交，以同源序列＞50bp认为可以进行杂交。
(6)杂交a.封闭将芯片置于30％甲酰胺，5×SSC，0.1％SDS，1％BSA中孵育20分钟。然后用ddH2O清洗5分钟，在异丙醇中浸一下，空气中干燥。
b.样品准备，将标记好的样品与预热到42℃的2×杂交缓冲液(60％甲酰胺、12×SSC、0.24％SDS)以等体积混匀，95℃变性5分钟，高速(＞12000rpm)离心2分钟冷却。
c.加样加5μL样品于每个阵列上，盖上盖玻片，调整位置，并防止气泡的产生。
d.杂交将芯片放入杂交盒内，在两侧各加10μLddH2O，封闭后42℃杂交10min。
(7)杂交后清洗取出玻片后立即在预热到42℃的洗液I(2×SSC/0.1％SDS)中清洗5min，然后在洗液II(0.1×SSC/0.1％SDS)中清洗10min，洗液III(0.1×SSC)中清洗5次，1min/次。最后用流水漂洗10s，并在乙醇中脱水，室温下干燥。
(8)扫描检测以激光共聚焦显微镜进行扫描检测杂交结果。
本实施例的杂交结果如下(1)杂交具有较好的稳定性和特异性图2和图3是HBV全基因组标记后杂交结果图，其中，图2是全长标记并经Sau3AI酶切后杂交结果图，图3是全长标记后直接杂交结果图。从中可以看出芯片上所有含有HBV基因的点都检测到了阳性信号，图2中各点的荧光强度通过统计学配伍组方差分析表明各片段之间的荧光强度差异有显著性意义，而同一片段的各个点之间的差异没有显著性意义，S-N-K法做两两比较结果表明，空白与阴性对照之间的差异没有显著性意义，而与各阳性点之间的差异有显著性意义。这表明芯片的杂交具有较好的稳定性和特异性。对其荧光强度与片段长度以及可杂交片段长度的分析表明，在200～600bps之间的片段的杂交动力学条件最好，效果最佳，我们据此从20个探针中选择出1，14，3，16，17，6，7，8，9，10，11，12打印新阵列，用于检测芯片结合PCR检测的敏感性。
(2)结合PCR可以检测到fg(10-15g)级水平
对不同浓度模板保守序列1821～2043的222bp长片段标记(引物P35’GGAGCTACTGTGGAGITACTCTC3’，P45’GGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACT3’；扩增条件为95℃5min→95℃30s，50℃30s，72℃30s共25个循环→72℃7min→4℃保存)后杂交结果如图4至图8所示，其中，图4是0.1μg模板标记杂交结果图，图5是0.01μg模板标记杂交结果图，图6是1ng模板标记杂交结果图，图7是1pg模板标记杂交结果图，图8是1fg模板标记杂交结果图。
对不同浓度的模板(PCR扩增全长后纯化)的保守区进行标记，其杂交结果显示，PCR配合芯片可以达到fg级水平，也就是说即使每微升血中有2.5个病毒拷贝也可以鉴定出来。另外还可以看到，随着模板量的减少，扩增产物中非特异扩增片段(片段α、β)数目减少，如图9所示。对应芯片上的杂交结果是除B1-6，H1-6点外其它各点的荧光强度逐渐降低。特异性片段γ的相对量增加，对应芯片上(B1-6，H1-6)的荧光强度尽管下降，但相对于非特异杂交片段强度升高，可据此进行半定量。另外也可以通过不同滴度模板的多次实验，拟合某个特异片段荧光强度与模板浓度的关系曲线，从而达到定量检测的目的。
实施例2本实施例分别选用HCV、HIV1G、HPV16亚型诊断型基因芯片以及HBV、HDV、HIV联合诊断芯片进行了快速检测。其步骤按实施例1中的基本步骤进行，2×标记PCR预混液、PCR反应体系、快速杂交缓冲液均按本发明中所述的配方实施，具体操作过程基本与实施例1相同，主要区别在于根据不同的病原体DNA设计引物扩增探针，即从探针长度、退火温度一致性、特异性等方面进行优化，然后取临床样品或经纯化的病原体DNA设计引物，采用本发明中的标记缓冲液进行全长标记或特异性片段标记。即不同病原体探针不同，标记片段不同，PCR扩增条件不同，但均可采用实施例1中的配方取得较高的荧光物质掺入率，并应用本发明中的杂交缓冲液进行快速杂交，获得稳定的杂交结果。图10是HCVSau3AI酶切设计后全长标记杂交结果图，图11是HIV1G亚型杂交结果图，图12是HPV16亚型杂交结果图。图13是HBV(G-N行)、HDV(A-C行)、HIV(D-E行)联合诊断芯片杂交结果图，其设计探针为HBV、HDV、HIV保守片段点样成芯片，将临床样品经上述HBV-DNA抽提方法进行相同处理，设计探针分别对三种病原微生物的保守序列进行PCR扩增标记，然后将纯化后的标记产物混合起来，再进行快速杂交，图中可见G-N行，A-C行有阳性信号，D-E行基本无信号，统计学分析表明D-E行与空白对照F行之间的差异没有显著性意义，可初步判定该样本有HBV、HDV的混合感染，而HIV检测结果阴性。
权利要求
1.病原微生物诊断型基因芯片的快速检测方法，包括以下步骤(1)玻片的准备；(2)探针准备采用PCR扩增病原体全基因组的各个基因和特异性片段，探针长度从数百到数千碱基不等，浓度在0.25～0.5μg/μL；(3)芯片制备采用基因芯片点样仪进行点样；(4)打印后处理；(5)样品的处理在PCR扩增过程中，Cy5-dUTP进行掺入标记，在标记前或标记后引入限制性酶切，使获得片段长度在200～600bps之间；(6)杂交2×杂交缓冲液的配方为60％甲酰胺、12×SSC、0.24％SDS；(7)杂交后清洗；(8)扫描检测。
2.根据权利要求1所述的病原微生物诊断型基因芯片的快速检测方法，其特征是在所述步组(5)中，标记dNTP的配制为三种dNTP的摩尔终浓度与另一种欲用荧光标记物替代的dNTP的摩尔终浓度比应该为5∶3，而荧光标记物cy5-dUTP与和其竞争性掺入的dTTP的摩尔浓度比应该是1∶3。
3.根据权利要求1所述的病原微生物诊断型基因芯片的快速检测方法，其特征是在所述步骤(5)中，2×标记PCR缓冲液的配比为5U/μL Taq酶8μL，10×PCR buffer 100μL，25mM MgCl280μL，标记dNTP 20μL，ddH2O 292μL，共500μL，充分混匀，-20℃保存；在所述步骤(5)中，标记PCR反应体系为2×PCR缓冲液10μL，模板DNA 1μL，50μM引物0.5μL，Cy5-dUTP 1.2μL，ddH2O 6.8μL。
全文摘要
本发明公开了一种病原微生物诊断型基因芯片的快速检测方法，包括以下步骤(1)玻片的准备；(2)探针准备采用PCR扩增病原体全基因组的各个基因和特异性片段，探针长度从数百到数千碱基不等，浓度在0.25～0.5μg/μL；(3)芯片制备采用基因芯片点样仪进行点样；(4)打印后处理；(5)样品的处理在PCR扩增过程中，Cy5－dUTP进行掺入标记，在标记前或标记后引入限制性酶切，使获得片段长度在200～600bps之间；(6)杂交2×杂交明冲液的配方为60％甲酰胺、12×SSC、0.24％SDS；(7)杂交后清洗；(8)扫描检测。本发明具有标记效率高、杂交检测结果稳定、杂交时间大大病短等优点，可将杂交时间从传统的16～20小时缩短到10分钟，尤其适用于临床感染性疾病的诊断。
文档编号C12Q1/68GK1526829SQ0311385
公开日2004年9月8日 申请日期2003年3月4日 优先权日2003年3月4日
发明者马文丽, 郑文岭, 石嵘 申请人:中国人民解放军基因工程研究所