专利名称：离体胃粘膜细胞分离方法及相应的纯化方法
技术领域：
本发明涉及动物体上表皮细胞研究、培育所用的分离方法领域，具体涉及从动物的活体或尸体的胃内壁上表皮上提取并分离粘膜细胞以作进一步生理/生化研究和纯化的方法领域。
背景技术：
在动物的生命活动中，通过胃部消化食物是生命活动中一个很重要的营养环节，其中，胃上皮组织的各种粘膜细胞在此中起着重要的作用胃壁细胞产生消化食物所需的盐酸，胃主细胞产生消化蛋白质的胃蛋白酶原，表面粘液细胞和颈粘液细胞产生丰富的粘多糖类粘液，而ECL细胞则分泌组胺，G细胞分泌胃泌素，D细胞分泌生长抑素等等。这些胃细胞中，以个体最大的胃壁细胞为例，其在分离与生理/生化方面的意义最为重要，例如，消化性胃溃疡疾病中，胃壁细胞分泌的胃酸在胃溃疡病的发生与进展中起着举足轻重的作用，而胃壁细胞及其他粘膜细胞的功能调解是受到神经、体液等因素综合作用的结果，因此，如仅对胃壁细胞或其他粘膜细胞在组织、器官上作综合研究难以提供单因素作用的模型，也使研究不能继续深入。因此，实现胃壁细胞等粘膜细胞的分离及纯化，是生命科研项目中一个非常重要的环节。
但是，由于胃粘膜细胞比较娇弱且多种类混居，对机械性损伤、生理/生化性损伤均很敏感，要将之完好无损地分离开来，确实有很大难度，稍微强烈的机械作用或生理/生化作用，都可能给胃粘膜细胞带来损伤甚至完全消化破坏掉胃粘膜细胞，从而影响后续的纯化或培育。目前国内、外的同行，摸索出一些胃粘膜细胞的分离方法，出版物公开的几篇为陈蕾、黄威权等的“大鼠胃壁细胞的分离及培养”一文，发表在《第四军医大学学报》2002，23(9)上，聂克、王汝俊等的“大鼠胃壁细胞的分离方法”一文，发表在《世界华人消化杂志》1999年11月号上，李晓波、钱家鸣等的“壁细胞的淘洗分离与应用”一文，发表在《胃肠病学和肝病学杂志》1996年12月号上；这些方法的指导思想都是尽可能地避免使机械或生理/生化的分离因子直接或过强地作用于胃粘膜细胞，为做到这一点，这些胃粘膜细胞的分离方法普遍做法是须将胃囊整体切除下来，扎闭贲门、幽门两端，在胃壁上再新开一个第三口，顺新开的第三口，将胃囊内翻外、外转内，扎闭新开的第三口，完成将胃浆膜面翻到内面，而粘膜面翻到外面；然后用注射器，向胃囊内注入消化液，将内含消化液的胃囊整个置入盛有含消化酶的平衡盐营养液的烧杯中，消化一定时间后，将整个的盛有胃囊及营养液的烧杯，放到磁力搅拌器上，借助磁力搅拌籽在烧杯中转动搅拌，将胃囊外面的、已被囊内的消化酶所消化松动的胃粘膜细胞机械性地搅脱下来，达到使胃粘膜细胞、包括壁细胞彼此分离的目的。
上述传统的分离方法，由于要将胃囊整体切除、翻转消化提取，不能对活体状况下的胃粘膜细胞壁进行部分提取，势必限制该方法在更广泛的领域中的普及应用；取下的胃粘膜细胞泡在含消化酶的平衡盐营养液中消化1小时以上，同时借助磁力搅拌器的搅拌籽的机械搅拌力来促使被囊内消化酶消化松动的囊外细胞分散、分离下来，所以，胃粘膜细胞势必受到相当程度的生化和机械损害；此外，因为传统方法时间较长，细胞“老化”严重，细胞活力将明显减弱，使原来预期的分隔效率大打折扣。
发明内容针对现有技术的上述缺点，本发明所要解决的技术问题是要提供一种从机械分离强度上、和从生理/生化分离强度上、时间老化上均对所分离的胃粘膜细胞伤害最轻、简单高效的离体胃粘膜细胞分离方法及其相应的研究、纯化方法。
为此，本发明的技术解决方案之一是一种离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的方法依次包括粘膜细胞收集、溶液纯化稀释、物理因素分离三个步骤；其中，所述的粘膜细胞收集步骤包括采用机械刮具在离体或活体的胃内壁上刮取胃粘膜上皮的操作；所述的溶液纯化稀释步骤依次包括将刮取下来的胃粘膜上皮投入溶液中以获得洁净粘膜上皮的初步清洗操作、在上述的清洗溶液中为获得的洁净粘膜上皮碎末而进行的机械破碎操作、从获得的洁净粘膜上皮碎末溶液中为获得粘膜细胞沉淀而进行的初步机械分离操作、以及为得到粘膜细胞悬液而对上一操作所获的粘膜细胞沉淀重复数次地进行的纯化/稀释与离心分离交替操作，而且所述的纯化/稀释与离心分离交替操作中采用了向离心分离管中所盛的粘膜细胞溶液进行通气兼搅拌方法；所述的物理因素分离步骤是为获得粘膜细胞清液而对溶液纯化稀释步骤所获的粘膜细胞悬液进行的过筛操作。
所述的机械刮具是化学惰性的、具有直角刃口的刮片；所述的通气兼搅拌方法是在每次离心分离前，采用其管口经过火焰倒角的玻璃吸吹管插入离心分离管底对泡在稀释纯化液中的粘膜细胞沉淀作通气兼搅拌；所述的过筛操作所采用的网筛孔径为0.05～0.50mm。
所述的机械刮具是具有直角刃口的平整玻璃片；所述的溶液纯化稀释步骤中，环境温度保持在32℃±5℃，环境气氛为O2-95％，CO2-5％；相应地，所述的通气兼搅拌包括利用压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体和向离心分离管底混匀悬液以保持连续冒出圆气泡的速率吹入环境气氛的气体；所述的网筛是100目的不锈钢丝网筛。
在所述的溶液纯化稀释步骤中，所述纯化/稀释与离心分离交替操作的重复次数为1～5次，在每次该操作中，所述的粘膜细胞沉淀的体积与稀释纯化液的体积之比是0.1～0.3∶5(ml/ml)，所述压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体的次数是5～10次；过筛操作前压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体的次数是25～30次。
所述的溶液纯化稀释步骤中，上一操作所获的粘膜细胞沉淀在所述的稀释纯化液中被纯化/稀释的持续时间为5～10分钟；所述的离心分离转速是1000rpm，离心分离的持续时间是5分钟；最后一次纯化/稀释与离心分离操作所获的粘膜细胞悬液不作离心分离，而直接进行所述的过筛操作以得到粘膜细胞清液，来进一步作细胞生理/生化研究或培育。
所述的初步机械分离操作包括采用具有经过火焰倒角的、内径为1mm的吸嘴的吸管从洁净粘膜上皮碎末溶液中吸取得到粘膜细胞粗分液的过程、以及对该粘膜细胞粗分液进行初次离心分离得到初次粘膜细胞沉淀。
所述的离体胃粘膜细胞分离方法、以及溶液稀释步骤中所采用的稀释纯化液是由生理/生化平衡盐水按不同配比加入消化酶、助剂、酸碱缓冲剂、营养剂、抗生素等配伍而成的系列溶液。
所述的生理/生化平衡盐水是hanks平衡盐溶液或earle’s平衡盐溶液；所述的消化酶是选自胶原酶、链蛋白酶、胰蛋白酶中一或几种；所述酸碱缓冲剂选自羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、碳酸氢钠、磷酸系列中一或几种；所述助剂选自乙二胺四乙酸系列(EDTA)、二硫苏糖(DTT)中一或几种；所述营养剂选自牛血清蛋白(BSA)、胎牛血清、葡萄糖中一或几种；所述抗菌素选自链霉素、青霉素、庆大霉素中一或几种。
所述的系列溶液的pH值控制在7.4。
本发明的技术解决方案之二是一种离体胃粘膜细胞的纯化方法，其特征在于所述的纯化方法是将所述分离方法1～9中之一得到的粘膜细胞清液作为原液，采用不连续密度梯度离心分离法或/和差速离心淘洗分离法进行进一步分离纯化，得到更高纯度的胃粘膜细胞。
本发明的方法的粘膜细胞收集步骤尽管也要伤及动物的胃壁，但毕竟不是非要将胃囊及胃袋整体切下来收集粘膜细胞不可，即可以无需以动物的死亡代价来取得胃粘膜细胞，因此，一定条件下，能够对活体的动物包括人类的胃粘膜细胞壁作部分提取和纯化；相比于传统的需以动物的死亡代价来取得胃粘膜细胞的整体切除、翻转提取的方法，本发明的方法具有极大的优越性，将可能在更广泛的研究甚至相关产业领域中得到推广应用。
本发明的方法的粘膜细胞收集步骤，摒弃了传统的操作复杂、耗时并具细胞伤害性的翻转胃袋进行消化兼电磁搅拌以取得胃粘膜细胞的收集方法，而采用简单的物理刮取方法，利用简单易得的平整玻璃片的直角刃口，直接从胃内壁上刮取粘膜上皮，实践证实，这种方法简单有效，因为机械刮取动作对粘膜细胞造成的损害很少，取得的粘膜上皮刮屑的时间短、生理活性强，更适宜于作进一步的分离纯化。
本发明的方法的溶液纯化稀释步骤，与传统的分离方法相近，但在纯化/稀释与离心分离操作中，采用了向离心分离管中所盛的粘膜细胞溶液进行通气兼搅拌方法，这种通气搅拌方式较之传统的单纯电磁搅拌方式，既避免了强烈的机械力损害，又使胃粘膜细胞泡在含消化酶的溶液中进行纯化稀释所经历的时间有所缩短(从原来的1～2小时缩短到总共不超过40分钟)，气体搅拌均匀了稀释纯化液体以加速其内部的纯化和稀释作用，同时又给粘膜细胞增加了生理呼吸所需的氧气，强化了粘膜细胞的健康分离因子，使粘膜细胞更多地保持了原有的生物活性。
随着相关细胞分离技术的发展，目前已可通过消化而分离胃粘膜细胞，并且能够在细胞分离之后，通过淘洗或梯度密度离心，进一步富集壁细胞，使其纯度达到95％以上，从而扩大了对胃粘膜细胞研究的视野和角度，也加快了对其研究的步伐。此外，目前还可对分离壁细胞进行原代培养，使之存活1周以上，使得直接、长程地研究壁细胞功能成为可能。然而，就特定细胞功能的研究来说，并非一定要获得经过富集的高度纯化细胞。例如，对于胃粘膜等非均一细胞性的组织来说，膜片钳电生理记录、对特定基因mRNA表达的单细胞RT-PCR(single-cell reverse transcription polymerase chainreaction)研究等方法，其研究对象皆为单个的细胞。此时的关键问题，变成了明确特定单个细胞的属性。相反，步骤繁多的富集纯化过程，可能会对于待研究细胞的功能增加负面影响。为此，本发明方法的物理因素分离步骤完成后所得到的粘膜细胞清液，不再采用不连续密度梯度的分离柱法或淘洗机差速沉淀法作进一步富集，而是采用孔径略大于胃粘膜细胞最大直径的网筛作过筛操作，来取得足够稀释的分离细胞液。这种简略工艺的结果是节省时间、简化操作、减少细胞伤害与老化，且不妨碍直接采用本发明的方法所得到的纯化待测稀释液进行膜片钳电生理记录、对特定基因mRNA表达的单细胞RT-PCR(single-cell reverse transcription polymerase chain reaction)研究等。本发明的方法所得到的纯化待测稀释液中，每毫升体积中具有3.62±1.7×105个左右的完整健康的各种胃粘膜细胞，既能保证采用普通的显微镜很容易地观察、定位、并移动所需的粘膜细胞，也可满足进一步用于目前粘膜细胞所有方面的研究与纯化。
本发明的方法中采用的玻璃质的管口均经过火焰倒角，以尽量避免操作中存在锋利的玻璃刃口伤及溶液中的粘膜细胞；本发明的方法高效、经济，适应于现在国内生理、生化方面的技术设备水平，具有相当的技术经济先进性。
图1为本方法实施例的流程示意图。
图2为本方法清液中的胃壁细胞在相差显微镜下(×400)的照相图。
图3为本方法清液中的胃壁细胞在光镜下经HE(×400)染色的照相图。
图4为本方法清液中的胃粘膜细胞在荧光显微镜下的照相图。
图5为本方法清液中的胃壁细胞在透射电镜下(×3900)的照相图。
图6为本方法清液中的胃主细胞在透射电镜下(×6610)的照相图。
图7为本方法清液中的胃粘液细胞在透射电镜下(×5200)的照相图。
图8为本方法清液中的胃内分泌细胞在透射电镜下(×5200)的照相图。
图9为本方法清液中的胃内分泌细胞在兔抗H+-K+-ATP酶免疫细胞化学染色下的壁细胞(×400)的照相图。
具体实施方式离体胃粘膜细胞分离实施例一、预先配制系列稀释纯化液。
其中A溶液含有NaCl 136.9mM、KCl 5.4mM、Na2HPO40.3mM、KH2PO40.4mM、NaHCO34.2mM、葡萄糖5.6mM、HEPES 12.6mM、EDTA 1mM、BSA 1mg/ml，其中B溶液含有BSA 1mg/ml、胶原酶0.05mg/ml、链霉蛋白酶0.5mg/ml、硫酸链霉素0.1mg/ml的M199溶液，其中C溶液含有NaCl 136.9mM、KCl 5.4mM、Na2HPO40.3mM、KH2PO40.4mM、NaHCO34.2mM、葡萄糖5.6mM、HEPES 12.6mM、EDTA 1mM、BSA 1mg/ml、DTT0.154mg/ml。
上述三种溶液都以1mmol/L NaOH调整至pH7.40。
二、离体胃粘膜细胞分离诸步骤。
如图1所示----粘膜细胞收集步骤取非禁食大鼠，按0.35ml/(100g体重)以10％水合氯醛作腹腔内给药麻醉。剖腹找到鼠胃。在贲门和胃体部、胃窦和幽门部分别剪断食管和幽门管，将胃取出，沿大弯侧剪开鼠胃。或剖腹找到鼠胃后，在不剪断贲门管和幽门管的情况下，将胃拉出腹腔，直接沿大弯侧剪开鼠胃。将大弯侧剪开的鼠胃组织，置于盛有A溶液的烧杯中，快速清洗。然后再将经上述清洗的胃组织转入另一盛有A溶液的培养皿中。继而在A溶液中，用平直载玻片刮取胃底粘膜，得到胃粘膜上皮屑。
----溶液纯化稀释步骤将得到的胃粘膜上皮，直接在盛有A溶液的培养皿中，进行初步清洗操作，得到洁净粘膜上皮，再用眼科剪将刮取下来的大片粘膜剪碎，完成机械破碎操作，得到洁净粘膜上皮碎末。用1mm口径的经过倒角的玻璃吸管，吸取剪碎的洁净粘膜上皮碎末和5ml A溶液的混悬液，得到粘膜细胞粗分液，立即转入10ml离心管中。以转速1000rpm，持续时间5分钟作初次离心分离，完成分离后留下初次粘膜细胞沉淀0.1～0.3ml。仍在该10ml离心管中加入5ml B溶液，用吸管压缩空气吹打5～10次，使初次粘膜细胞沉淀在该B溶液中悬浮。向离心管底部，通入O2-95％、CO2-5％混合气体，使在分离过程中的混合胃粘膜细胞得到氧气的供应，同时，所供的气体由离心管底部向液面顶部冒气泡，以对细胞悬浮液起到了一种搅拌的作用。对粘膜细胞沉淀孵育7min，完成一次纯化/稀释过程。以转速1000rpm，持续时间5分钟作离心分离，完成一次离心分离过程。留下粘膜细胞沉淀继悬浮于C溶液中，以类似上述条件，对粘膜细胞沉淀孵育10min，离心，完成再次纯化/稀释与离心分离交替操作。留下粘膜细胞沉淀再在A溶液中孵育5min和离心，连续两次，完成第三次和第四次纯化/稀释与离心分离交替操作。然后再以B溶液第五次孵育留下的粘膜细胞沉淀10min，离心。粘膜细胞沉淀再置于A溶液中，而且在该步操作过程中，用吸管压缩空气吹打25～30次。得到的粘膜细胞悬液，最后孵育5min。
上述整个溶液纯化稀释步骤皆在32℃下进行，并持续予95％O2～5％CO2混合气体通气。每次离心的条件皆为1000rpm持续5min。
----物理因素分离步骤将得到的粘膜细胞悬液随后通过100目不锈钢筛网，过滤为粘膜细胞清液；不再做进一步纯化，即可作为相应各种研究或进一步研究之用。
三、采用上述分离方法的后续研究及其结果经计数，每只大鼠胃粘膜经消化分离后，可获得的细胞数平均为1.81±0.85×106个(取21只大鼠的平均值)。
如图2所示在相差显微镜下放大400倍，混合细胞至少包含两种细胞群集，利用计算机读图软件测得一种群集的细胞直径为21.71±1.72μm(n＝100，n为被测细胞数，下同)，另一种直径为14.10±1.43μm(n＝50)。
如图3所示光镜下放大400倍，HE(苏木素-伊红法)染色的壁细胞胞核呈蓝色，单核，居于细胞中央或稍偏于一侧，胞质红色。壁细胞在分离的混合细胞中体积最大，由读图软件测得直径21.50±1.70μm(n＝100)。
如图4所示电镜放大3900倍，观察到壁细胞胞膜完整，有微绒毛，线粒体丰富，内质网较少，细胞内的分泌小管系统发育正常。静止期壁细胞不开放的微管泡多，处于分泌期壁细胞的微管泡则有一定程度的开放，微管泡的数量并因而稍有减少。壁细胞直径为20.66±2.06μm(n＝17)。
如图5所示电镜放大6610倍，观察到主细胞直径为13.69±1.50μm(n＝6)，如图6所示电镜放大5200倍，观察到粘液细胞直径为17.02±0.92μm(n＝5)(图5)，如图7所示电镜放大5200倍，观察到内分泌细胞直径为15.20±2.78μm(n＝8)，如图8所示荧光显微镜下放大200倍，应用吖啶橙染色后，观察到优先摄取染料的较大壁细胞。
如图9所示采用兔抗H+-K+-ATP酶多克隆抗体，对粘膜细胞清液中的壁细胞进行了鉴定。壁细胞中的H+-K+-ATP酶呈黄色显色，位于细胞膜和细胞质中，壁细胞核被苏木素衬染成蓝色。结果发现，分离的混合细胞中，较大的细胞都是含有H+-K+-ATP酶的壁细胞。壁细胞直径为21.34±1.71μm(n＝100)。阴性对照结果中，没有阳性呈色的细胞。
通过上述相差显微镜、HE染色、电镜、抗H+-K+-ATP酶抗体免疫细胞化学染色检验，4种方法得到的壁细胞直径数值之间，没有显著性差异(P＞0.05)。在相差显微镜中观察到的壁细胞直径和非壁细胞直径数值之间，具有显著性差异(P＜0.01)。在电镜照片中测定的壁细胞直径，和主细胞、粘液细胞、内分泌细胞的直径之间，具有显著性差异，壁细胞的直径都显著大于其它三种细胞的直径(P＜0.01)。总之，壁细胞在分离的所有混合胃粘膜细胞中，是直径最大者。
上述后续研究及其结果，证明本发明的分离方法具有积极肯定效果。
权利要求
1.一种离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的方法依次包括粘膜细胞收集、溶液纯化稀释、物理因素分离三个步骤；其中，所述的粘膜细胞收集步骤包括采用机械刮具在离体或活体的胃内壁上刮取胃粘膜上皮的操作；所述的溶液纯化稀释步骤依次包括将刮取下来的胃粘膜上皮投入溶液中以获得洁净粘膜上皮的初步清洗操作、在上述的清洗溶液中为获得的洁净粘膜上皮碎末而进行的机械破碎操作、从获得的洁净粘膜上皮碎末溶液中为获得粘膜细胞沉淀而进行的初步机械分离操作、以及为得到粘膜细胞悬液而对上一操作所获的粘膜细胞沉淀重复数次地进行的纯化/稀释与离心分离交替操作，而且所述的纯化/稀释与离心分离交替操作中采用了向离心分离管中所盛的粘膜细胞溶液进行通气兼搅拌方法；所述的物理因素分离步骤是为获得粘膜细胞清液而对溶液纯化稀释步骤所获的粘膜细胞悬液进行的过筛操作。
2.如权利要求1所述的离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的机械刮具是化学惰性的、具有直角刃口的刮片；所述的通气兼搅拌方法是在每次离心分离前，采用其管口经过火焰倒角的玻璃吸吹管插入离心分离管底对泡在稀释纯化液中的粘膜细胞沉淀作通气兼搅拌；所述的过筛操作所采用的网筛孔径为0.05～0.50mm。
3.如权利要求1或2所述的离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的机械刮具是具有直角刃口的平整玻璃片；所述的溶液纯化稀释步骤中，环境温度保持在32℃±5℃，环境气氛为O2-95％，CO2-5％；相应地，所述的通气兼搅拌包括利用压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体和向离心分离管底混匀悬液以保持连续冒出圆气泡的速率吹入环境气氛的气体；所述的网筛是100目的不锈钢丝网筛。
4.如权利要求3所述的离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于在所述的溶液纯化稀释步骤中，所述纯化/稀释与离心分离交替操作的重复次数为1～5次，在每次该操作中，所述的粘膜细胞沉淀的体积与稀释纯化液的体积之比是0.1～0.3∶5(ml/ml)，所述压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体的次数是5～10次；过筛操作前压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体的次数是25～30次。
5.如权利要求4所述的离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的溶液纯化稀释步骤中，上一操作所获的粘膜细胞沉淀在所述的稀释纯化液中被纯化/稀释的持续时间为5～10分钟；所述的离心分离转速是1000rpm，离心分离的持续时间是5分钟；最后一次纯化/稀释与离心分离操作所获的粘膜细胞悬液不作离心分离，而直接进行所述的过筛操作以得到粘膜细胞清液，来进一步作细胞生理/生化研究或培育。
6.如权利要求5所述的离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的初步机械分离操作包括采用具有经过火焰倒角的、内径为1mm的吸嘴的吸管从洁净粘膜上皮碎末溶液中吸取得到粘膜细胞粗分液的过程、以及对该粘膜细胞粗分液进行初次离心分离得到初次粘膜细胞沉淀。
7.如权利要求6所述的离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的离体胃粘膜细胞分离方法、以及溶液稀释步骤中所采用的稀释纯化液是由生理/生化平衡盐水按不同配比加入消化酶、助剂、酸碱缓冲剂、营养剂、抗生素等配伍而成的系列溶液。
8.如权利要求7所述的离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的生理/生化平衡盐水是hanks平衡盐溶液或earle’s平衡盐溶液；所述的消化酶是选自胶原酶、链蛋白酶、胰蛋白酶中一或几种；所述酸碱缓冲剂选自羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、碳酸氢钠、磷酸系列中一或几种；所述助剂选自乙二胺四乙酸系列(EDTA)、二硫苏糖(DTT)中一或几种；所述营养剂选自牛血清蛋白(BSA)、胎牛血清、葡萄糖中一或几种；所述抗菌素选自链霉素、青霉素、庆大霉素中一或几种。
9.如权利要求8所述的离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的系列溶液的pH值控制在7.4。
10.一种离体胃粘膜细胞的纯化方法，其特征在于所述的纯化方法是将权利要求1～9中之一所述方法得到的粘膜细胞清液作为原液，采用不连续密度梯度分离法或/和差速离心淘洗分离法进行进一步分离纯化，得到更高纯度的胃粘膜细胞。
全文摘要
一种离体胃粘膜细胞分离方法及相应的纯化方法，其特征为所述的分离方法依次包括粘膜细胞收集、溶液纯化稀释、物理因素分离三个步骤；其中，粘膜细胞收集步骤包括刮取胃粘膜上皮的操作；溶液纯化稀释步骤依次包括获得洁净粘膜上皮的初步清洗操作、为获得的洁净粘膜上皮碎末而进行的机械破碎操作、为获得粘膜细胞沉淀而进行的初步机械分离操作、以及为得到粘膜细胞悬液进行的纯化/稀释与离心分离交替操作，而且纯化/稀释与离心分离交替操作中采用了向离心分离管中所盛的粘膜细胞溶液进行通气兼搅拌方法；物理因素分离步骤是为获得粘膜细胞清液进行的过筛操作。本发明的分离方法对胃粘膜细胞伤害最轻、且简单快捷。
文档编号C12M3/00GK1539961SQ03114260
公开日2004年10月27日 申请日期2003年4月21日 优先权日2003年4月21日
发明者宋于刚, 孙凤蓬 申请人:宋于刚, 孙凤蓬