一种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA半定量检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物检测试剂盒，具体是一种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA半定量 检测试剂盒，可用于快速检测血清中幽门螺杆菌IgG抗体并对IgG抗体含量进行半定量计 算的ELISA检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. p)，由巴里?马歇尔（Barry J. Marshall) 和罗宾?沃伦（J. Robin Warren)二人首次发现，此二人因此获得2005年的诺贝尔生理学或 医学奖。幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2. 5~4. 0 μπι， 宽0. 5~I. 0 μm。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。
[0003] 幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性胃溃疡以及胃黏膜相关淋巴组织 (MALT)淋巴瘤的主要致病因素，并且与胃癌的发生具有密切相关性。1994年世界卫生组织 /国际癌症研宄机构（WH0/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。在亚洲地区，中国大陆、越 南、印度等少年幽门螺杆菌的感染率分别60%、40 %、70 %，慢性胃炎患者的胃粘膜活检标 本中幽门螺杆菌检出率可达80 %~90 %，而消化性胃溃疡患者更高，可达95 %以上，甚至 接近100%。胃癌由于局部上皮细胞已发生异化，因此其检出率高低报道不一。幽门螺杆菌 的胃部感染已是个世界性医学问题，对其进行准确诊断有利于控制H. p传播与流行及根除 HP感染治疗的监测。
[0004] 1983年通过胃镜取活检标本分离培养成功以来，对幽门螺杆菌感染的诊断已发展 出了许多方法，包括有细菌学、病理学、血清学、同位素示踪、分子生物学等。但总的讲来，从 标本采集角度看，可以分为侵入性和非侵入性两大类。
[0005] 侵入性方法主要指必需通过胃镜取活检标本检查的方法，是目前消化病学科的常 规方法。它包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验，药敏试验。
[0006] 非侵入性方法主要指不通过胃镜取活检标本诊断幽门螺杆菌标本感染的方法。这 类方法包括抗体检测、抗原检测、尿素13C/14C呼气试验等。抗体检测目前已有的方法包括 酶联免疫法、免疫印迹法、胶体金法和胶乳增强免疫比浊法等。
[0007] 血清学检测是一项常用的非侵入性检测方法，尤其适用于Hp感染率较高的地区。 Hp引起慢性炎症，系统的免疫反应会持续存在，产生IgG抗体。常用的血清学试验包括 ELISA法、快速全血/血清试验、蛋白印迹等方法，其中ELISA法最常用。ELlSA法准确率高 达90%~95%，且ELISA试剂盒可以给出抗体定量检测结果，且该法不受药物的影响。但 遗憾的是目前国内外市场上各种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA检测试剂盒均为定性检测，而 IgG抗体含量对于幽门螺杆菌的定殖密度以及幽门螺杆菌根除疗效判断均有重要的提示作 用。本发明制备出幽门螺杆菌I gG抗体标准液，在此基础上采用间接ELI SA法，可方便快速 地对血清中特异性幽门螺杆菌IgG抗体进行半定量检测。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种幽门螺杆菌IgG型抗体ELISA半定量检测试剂盒。本发明的试 剂盒主要用于指导幽门螺旋杆菌感染引起的慢性胃炎，消化性溃疡等疾病的辅助临床诊断 和临床监测指标。
[0009] 本发明技术方案如下：
[0010] -种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA半定量检测试剂盒，其特征在于：由幽门螺杆菌抗 原包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、底物液、终止液、阳性对照液、阴性对照 液及标准液构成，
[0011] 所述的幽门螺杆抗原包被酶标反应板通过下列步骤制备而成：
[0012] (1)取96孔酶标板一块；
[0013] (2)将幽门螺杆菌抗原用包被液按I :1000的倍数进行稀释，将稀释好的抗原液于 每个酶标板孔中加入110 μ 1，把酶标板置入湿盒内，在2-8°C包被过夜；
[0014] (3)用洗绦液清洗：用洗绦液清洗包被过夜的酶标板，每孔加入350ul洗绦液，清 洗2-4次；
[0015] (4)添加稳定缓冲液：每孔加入150ul稳定缓冲液，在18-25°C条件下孵育2-4小 时，然后抽干；
[0016] (5)取抽干的抗原包被板加200 μ I PBS稀释的10%牛血清蛋白在37°C封闭1-2 小时，得到抗原包被酶标反应板；
[0017] (6)包装：用铝箔袋包装，并在袋中放入干燥剂，包装后储存在2_8°C的冷库中；
[0018] 所述的包被液：0. 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)0. 75g碳酸钠，I. 46g碳酸氢钠， 加去离子水定容至500ml ;
[0019] 所述的标本稀释液：10%牛血清蛋白+0.1%?1"〇(：1丨11300+0.01]\1?!17.4的磷酸盐 缓冲液（PBS);
[0020] 所述的洗涤液：0· 05% Tween 20+0.0 lmol/L ρΗ7· 4 的磷酸盐缓冲液（PBST);
[0021] 所述的酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG多抗；
[0022] 所述的底物液！TMB-H2O2尿素溶液；
[0023] 所述的终止液：2mol/L H2SO4溶液；
[0024] 所述的阴性对照液：含人血清基幽门螺旋杆菌IgG阴性对照液；
[0025] 所述的阳性对照液：含人血清基幽门螺旋杆菌IgG阳性对照液；
[0026] 所述的标准液：含人血清基幽门螺旋杆菌IgG标准液。
[0027] 所述的一种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA半定量检测试剂盒在ELISA法检测血清中 幽门螺杆菌IgG抗体中的应用。
[0028] 有益效果
[0029] 本发明制得一种试剂盒，本发明制备出幽门螺杆菌IgG抗体标准液，在此基础上 将幽门螺杆菌抗原包被酶标反应板，采用间接ELISA法，检测血清中特异性幽门螺杆菌IgG 抗体，并且通过酶免疫单位（EIU)的计算对其进行定量。本发明的试剂盒，具有高特异性和 敏感性，本试剂盒主要供实验室研宄和临床辅助诊断使用。
[0030] 利用本发明的试剂盒采用ELISA法检测血清中幽门螺杆菌IgG抗体，本发明的试 剂盒的检测结果与INOVA公司幽门螺杆菌IgG抗体ELISA检测试剂盒的结果一致性高，灵 敏度为95 %，特异度为99. 5 %。
【具体实施方式】
[0031] 1、试剂
[0032] (1)包被液：0· 05mol/L，ρΗ9· 6的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，
[0033] Na2CO3 I. 5g，NaHC032. 9g，Na2N3 0· 2g，加双蒸水定容至 1000ml，调至 pH9. 45-9. 75 ；
[0034] (2)包被稳定液：1%酪蛋白+5%蔗糖的水溶液，
[0035] 蔗糖5g、酪蛋白lg，加双蒸水定容至1000 ml溶解，调节PH值至7. 15-7. 25;
[0036] (3)封闭液：10%小牛血清 +0· 02mol/L PBS(pH7. 4)
[0037] 100mL小牛血清加入到配好的0. 02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至1000ml ;
[0038] (4)标本稀释液：10%牛血清蛋白+0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS(pH7.4)，100g 小牛血清，8. 0gNaCl、0. 2gKH2P04、2. 9gNa2HP04 · 12Η20、0· 2gKCl，0.1 g 硫柳汞，Ig 防腐剂 ProClin300,加双蒸水定容至1000ml，调至ρΗ7· 4,即得；
[0039] (5)洗涤液：0· 01mol/L PBS(pH7. 4)+0. 05% Tween-20PBST :
[0040] NaCl 8. 0g、KH2PO4O. 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KCl 0· 2g、Tween 20 0· 5ml、硫柳汞 〇. lg、加双蒸水定容至lOOOrnl，调至pH7. 4,即得；
[0041] (6)酶标二抗：(HRP标记的兔抗人IgG多抗）辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG 多抗，
[0042] 组成：0. 2mL辣根过氧化物酶标记幽门螺旋杆菌抗人IgG缓冲液，按1:100加入标 本稀释液后使用，含有〇. 02%甲基异噻唑酮和0. 02 %溴硝基二恶烷及0. 02 %其他洗涤异 噻唑酮类作为防腐剂；
[0043] (7)底物液：TMB-H2O2尿素溶液，
[0044] 配制：①底物液A :3、3 '、5、5 '一四甲基联苯胺，TMB，TMB200mg，无水乙醇100ml， 加双蒸水定容至l〇〇〇ml，
[0045] ②底物液B缓冲液（0. lmol/L柠檬酸-0. 2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5. 0~ 5. 4) :Na2HP0414. 60g，梓檬酸9. 33g，0. 75 %过氧化氢尿素6. 4ml，加双蒸水定容至1000ml，