专利名称：对虾白斑综合症病毒基因诊断试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对对虾白斑综合症病毒(WSSV，White Spot Syndrome Virus)基因诊断的试剂盒及检测方法。
早期快速诊断对虾白斑综合症病毒是目前对虾养殖的主要预防措施和减少对虾损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大对虾养殖者急切盼望的。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起米的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。
本发明的对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒包括下列部件1).样品稀释液A液，1管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4；2).模板提取液B液，1管，内装蛋白酶K；3).PCR反应液C液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE；4).PCR反应液D液，1管，内装PCR二扩反应液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE；5).阳性对照E液，1管，内装WSSV阳性DNA；6).盒子；7).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
上述WSSV基因诊断试剂盒中所述的内外两对引物是根据WSSV基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下F15’—CGT GCC TGA ATC AGT ATG TAG GCR15’—GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG ATF25’—CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG AR25’—CGA TAG ACC ACA AGT TCC GTA GGA用本发明上述试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法，按下列步骤进行1).取样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；2).6000～10000r/min离心5～10min；3).取50μl上清加入1μl模板提取液B液，煮沸15～20min，立刻放于冰上5～10min；4).8000～10000r/min离心10～15min，上清作为PCR模板；5).分别取模板和E液，加入到PCR反应液C液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；6).按下列条件扩增95℃ 2min预变性→94℃ 45sec 34个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 45sec72℃ 1min7).分别取一扩反应液，加入到PCR反应液D液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；8).按下列条件扩增95℃ 2min预变性→94℃ 45sec 34个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 45sec72℃ 1min9).一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在328bp处出现明亮的反应条带，则为WSSV阳性；若无反应条带显示则进行PCR二扩反应；二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在258bp处出现明亮的反应条带，则为WSSV阳性，否则为阴性。
本发明的有益效果本发明的对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据WSSV基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。利用该两对引物，可以特异性地扩增携带WSSV病毒的待测样品的有关基因片段，所建立的优化的套式PCR反应体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染WSSV的对虾，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于对虾各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
实施例1对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒该试剂盒由下列部件构成(10样份)1.样品稀释液(A液)，1管，5ml/管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4。2.模板提取液(B液)，1管，10μl/管，内装蛋白酶K。3.PCR反应液(C液)，1管，250μl/管，内装PCR一扩反应液(25μl体系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE。4.PCR反应液(D液)，1管，250μl/管，内装PCR二扩反应液(25μl体系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE。5.阳性对照(E液)，1管，20μl/管，内装WSSV阳性DNA。6.长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm3。7.一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。
该试剂盒中的内外两对引物的DNA序列如下F15’—CGT GCC TGA ATC AGT ATG TAG GCR15’—GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG ATF25’—CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG AR25’—CGA TAG ACC ACA AGT TCC GTA GGA该试剂盒中的E液为阳性对照液，包含WSSV病毒的DNA质粒标准。具体操作是在PCR反应后，用试剂盒回收相关片段，然后酶切，通过载体连接到质粒上，转入大肠杆菌E.coli，经氨苄培养基平板扩大培养，挑取阳性克隆，进一步酶切检查验证，测定质粒DNA的浓度，稀释到108即为阻性对照标准。
PCR一扩反应液体系(25μl体系)如下ddH2O 19μl
10×Buffer(含mg2+) 2.5μldNTP0.4μl外引物F10.4μl外引物R10.4μlTaqE0.3μlPCR二扩反应液体系(25μl体系)如下ddH2O 19μl10×Buffer(含mg2+) 2.5μldNTP0.4μl内引物F20.4μl内引物R20.4μlTaqE0.3μl实施例2对虾白斑综合症病毒的检测方法使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行1.取样品0.05g，加入样品稀释液(A液)500ul稀释10倍，于匀浆器中冰浴匀浆。2.6000r/min离心5min。3.取50μl上清加入1μl模板提取液(B液)，煮沸15min，立刻放于冰上5min。4.8000r/min离心10min，上清作为PCR模板。5.分别取模板和E液2μl，加入到PCR反应液(C液)中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上。6.按下列条件扩增95℃ 2min预变性→94℃ 45sec 34个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 45sec72℃ 1min7.分别取一扩反应液2μl，加入到PCR反应液(D液)中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上。8.按下列条件扩增95℃ 2min预变性→94℃ 45sec 34个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 45sec72℃ 1min9.一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在328bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为WSSV阳性，说明待测样品携带白斑综合症病毒(见
图1)。若无反应条带显示则进行PCR二扩反应。二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在258bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为WSSV阳性，说明待测样品携带白斑综合症病毒，否则为阴性(见图2)。
权利要求
1.一种对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件1).样品稀释液A液，1管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4；2).模板提取液B液，1管，内装蛋白酶K；3).PCR反应液C液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE；F1为5’-CGT GCC TGA ATC AGT ATG TAG GC，R1为5’—GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG AT4).PCR反应液D液，1管，内装PCR二扩反应液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffr、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE；F2为5’-CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG A，R2为5’—CGA TAG ACC ACA AGT TCC GTA GGA；5).阳性对照E液，1管，内装WSSV阳性DNA；6).盒子；7).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
2.一种检测对虾白斑综合症病毒的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行1).取样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；2).6000～10000r/min离心5～10min；3).取50μl上清加入1μl模板提取液B液，煮沸15～20min，立刻放于冰上5～10min；4).8000～10000r/min离心10～15min，上清作为PCR模板；5).分别取模板和E液，加入到PCR反应液C液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；6).按下列条件扩增95℃ 2min预变性→94℃ 45sec 34个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 45sec72℃ 1min7).分别取一扩反应液，加入到PCR反应液D液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；8).按下列条件扩增95℃ 2min预变性→94℃ 45sec 34个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 45sec72℃ 1min9).一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在328bp处出现明亮的反应条带，则为WSSV阳性；若无反应条带显示则进行PCR二扩反应；二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在258bp处出现明亮的反应条带，则为WSSV阳性，否则为阴性。
全文摘要
本发明提供一种对虾白斑综合症病毒(WSSV，White Spot Syndrome Virus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以根据白斑综合症病毒基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对白斑综合症病毒的特异性DNA核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于对虾各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/68GK1448517SQ0311436
公开日2003年10月15日 申请日期2003年5月6日 优先权日2003年5月6日
发明者何建国, 邓敏, 黄志坚, 吕玲, 翁少萍 申请人:中山大学