专利名称：鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)基因诊断的试剂盒及检测方法。
早期快速诊断鳜鱼传染性脾肾坏死病毒是目前鳜鱼养殖的主要预防措施和减少鳜鱼损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大水产养殖者急切盼望的。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。
本发明的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒由下列部件构成1).样品稀释液A液，2管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4；2).模板抽提液B液，1管，内装酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1；3).C液，1管，内装5M NaCL；4).D液，1管，内装无水乙醇；5).E液，1管，内装70％乙醇；6).F液，1管，内装灭菌双蒸水；7).PCR反应液G液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE；8).PCR反应液H液，1管，内装PCR二扩反应液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE；9).阳性对照I液，1管，内装ISKNV阳性DNA；10).盒子；11).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
上述ISKNV基因诊断试剂盒中所述的内外两对引物是根据ISKNV基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下F15’-AGA CCC ACT TGT ACG GCGR15’-CCC ATG TCC AAC GTA TAG CF25’-CGT GAG ACC GTG CGT AGTR25’-AGG GTG ACG GTC GAT ATG用本发明上述试剂盒检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的方法，按下列步骤进行1).取样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；2).4000～6000r/min离心10～15min；3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下颠倒几次混匀；4).10000～12000r/min离心10～15min；5).取500ul上清加入20μlC液，再加入1mlD液，于-20℃沉淀1小时；6).10000～12000r/min离心10～15min；7).弃上清，加E液冲洗，10000～12000r/min离心5～10min，冲洗两次；8).弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干；9).加20～30μlF液重悬溶解作为模板；10).分别取模板和I液2μl，加入到PCR反应液(G液)中，混匀后离心数秒，置于PCR上；11).按下列条件扩增95℃2min预变性，→94℃30sec 30个循环→72℃10min→4℃保存55℃30sec72℃1min12).分别取一扩反应液，加入到PCR反应液H液中，混匀后离心数秒，置于PCR上。按上述条件扩增；13).一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在1080bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，若无反应条带显示则进行PCR二扩反应。二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在562bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，否则为阴性。
本发明的有益效果本发明的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据ISKNV基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。利用该两对引物，可以特异性地扩增携带ISKNV病毒的待测样品的有关基因片段，所建立的优化的套式PCR反应体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染ISKNV的鳜鱼，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于鳜鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
实施例1鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒该试剂盒由下列部件构成(10样份)1.释液(A液)，2管，5ml/管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4。2.模板抽提液(B液)，自备或配制，酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1。3.C液，1管，200μl/管，内装5M NaCL。4.D液，自备，1ml/份×10份，10ml，主要为无水乙醇。5.E液，自备，主要为70％乙醇。6.F液，1管，30μl/份×10份，300μl/管，内装灭菌双蒸水。7.PCR反应液(G液)，1管，25μl/份×10份，250μl/管，内装PCR一扩反应液(25μl体系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE。8.PCR反应液(H液)，1管，25μl/份×10份，250μl/管，内装PCR二扩反应液(25μl体系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE。9.阳性对照(I液)，1管，20μl/管，内装ISKNV阳性DNA。10.长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm3。11.一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。
该试剂盒中的内外两对引物的DNA序列如下F15’-AGA CCC ACT TGT ACG GCGR1. 5’-CCC ATG TCC AAC GTA TAG CF25’-CGT GAG ACC GTG CGT AGTR25’-AGG GTG ACG GTC GAT ATG该试剂盒中的I液为阳性对照液，包含ISKNV病毒的DNA质粒标准。具体操作是在PCR反应后，用试剂盒回收相关片段，然后酶切，通过载体连接到质粒上，转入大肠杆菌E.coli，经氨苄培养基平板扩大培养，挑取阳性克隆，进一步酶切检查验证，测定质粒DNA的浓度，稀释到106比例即为阳性对照标准。
PCR一扩反应液体系(25μl体系)如下ddH2O20μl10×Buffer(含mg2+) 2.5μldNTP 0.4μl外引物F1 0.4μl外引物R1 0.4μlTaqE 0.3μlPCR二扩反应液体系(25μl体系)如下ddH2O20μl10×Buffer(含mg2+) 2.5μldNTP 0.4μl内引物F2 0.4μl内引物R2 0.4μlTaqE 0.3μl实施例2鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测方法使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行1.样品0.1g，加入样品稀释液(A液)1ml稀释10倍，于匀浆器中冰浴匀浆。2.4000r/min离心10min。3.取上清600μl/用模板抽提液(B液)抽提，上下颠倒几次混匀。4.12000r/min离心10min。5.取500ul上清加入20μl/C液，再加入1mlD液，于-20℃沉淀1小时。6.12000r/min离心10min。7.弃上清，加E液冲洗，12000r/min离心5min，冲洗两次。8.弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干。9.加20～30μlF液重悬溶解作为模板。10.分别取模板和I液2μl，加入到PCR反应液(G液)中，混匀后离心数秒，置于PCR上。11.按下列条件扩增95℃ 2min预变性，→94℃ 30sec 30个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 30sec72℃ 1min12.分别取一扩反应液2μl，加入到PCR反应液(H液)中，混匀后离心数秒，置于PCR上。按上述条件扩增。13.一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在1080bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，若无反应条带显示则进行PCR二扩反应。二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在562bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，否则为阴性(见
图1)。
权利要求
1.一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件1).样品稀释液A液，2管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4；2).模板抽提液B液，1管，内装酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1；3).C液，1管，内装5M NaCL；4).D液，1管，内装无水乙醇；5).E液，1管，内装70％乙醇；6).F液，1管，内装灭菌双蒸水；7).PCR反应液G液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、外引物F1、外引物R1和TaqE F1为5’-AGA CCC ACT TGT ACG GCG，R1为5’-CCC ATGTCC AAC GTA TAG C；8).PCR反应液H液，1管，内装PCR二扩反应液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、内引物F2、内引物R2和TaqE；F2为5’-CGT GAG ACC GTG CGT AGT，R25’-AGG GTGACG GTC GAT ATG；9).阳性对照I液，1管，内装ISKNV阳性DNA。10).盒子；11).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
2.一种检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行1).取样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；2).4000～6000r/min离心10～15min；3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下颠倒几次混匀；4).10000～12000r/min离心10～15min；5).取500ul上清加入20μlC液，再加入1mlD液，于-20℃沉淀1小时；6).10000～12000r/min离心10～15min；7).弃上清，加E液冲洗，10000～12000r/min离心5～10min，冲洗两次；8).弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干；9).加20～30μlF液重悬溶解作为模板；10).分别取模板和I液，加入到PCR反应液G液中，混匀后离心数秒，置于PCR上；11).按下列条件扩增95℃2min预变性，→94℃30sec 30个循环→72℃10min→4℃保存55℃30sec72℃1min12).分别取一扩反应液，加入到PCR反应液H液中，混匀后离心数秒，置于PCR上。按上述条件扩增；13).一扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在1080bp处出现明亮的反应条带，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，若无反应条带显示则进行PCR二扩反应；二扩反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在562bp处出现明亮的反应条带，则为ISKNV阳性，说明待测样品携带传染性脾肾坏死病毒，否则为阴性。
全文摘要
本发明提供一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对传染性脾肾坏死病毒的特异性DNA核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高。可运用于鳜鱼各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/70GK1448518SQ0311436
公开日2003年10月15日 申请日期2003年5月6日 优先权日2003年5月6日
发明者何建国, 邓敏, 翁少萍, 黄志坚, 吕玲 申请人:中山大学