专利名称：蛙病毒基因诊断试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对蛙病毒(TFV，Tiger Frog Virus)基因诊断的试剂盒及检测方法。
早期快速诊断蛙病毒是目前虎纹蛙养殖的主要预防措施和减少虎纹蛙损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大水产养殖者急切盼望的。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。
本发明的蛙病毒的基因诊断试剂盒由下列部件构成1).样品稀释液A液，2管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4；2).模板抽提液B液，1管，内装酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1。3).C液，1管，内装5M NaCL；4).D液，1管，内装无水乙醇；5).E液，1管，内装70％乙醇；6).F液，1管，内装灭菌双蒸水；7).PCR反应液G液，1管，内装PCR-扩反应液，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、引物F1、引物R1和TaqE；8).阳性对照(H液)，1管，20μl/管，内装TFV阳性模板。9).盒子；10).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
上述TFV基因诊断试剂盒中所述的引物F1和R1是根据TFV基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下F15’-GAC TTG GCC ACT TAT GACR15’-TGT CTC TGG AGA AGA AGA A用本发明上述试剂盒检测蛙病毒的方法，按下列步骤进行1).取样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；2).4000～6000r/min离心10～15min；3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下颠倒几次混匀；4).10000～12000r/min离心10～15min；5).取500μl上清加入20ul C液，再加入1ml D液，于-20℃沉淀1小时；6).10000～12000r/min离心10～15min；7).弃上清，加E液冲洗，10000～12000r/min离心5～10min，冲洗两次；8).弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干；9).加20～30μlF液重悬溶解作为模板；10).分别取模板和H液，加入到PCR反应液G液中，混匀后离心数秒，置于PCR上；11).按下列条件扩增95℃ 2min预变性，→94℃ 30sec 30个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 30sec72℃ 1min12).反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在532bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为TFV阳性，说明待测样品携带蛙病毒，否则为阴性。
本发明的蛙病毒基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据TFV基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。利用该两对引物，可以特异性地扩增携带TFV病毒的待测样品的有关基因片段，所建立的优化的PCR检测体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染TFV的虎纹蛙，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于虎纹蛙各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
实施例1蛙病毒的基因诊断试剂盒该试剂盒由下列部件构成(10样份)1).样品稀释液(A液)，2管，5ml/管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4。2).模板抽提液(B液)，自备或配制，酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1。3).C液，1管，200μl/管，内装5M NaCL。4).D液，自备，1ml/份×10份，10ml，主要为无水乙醇。5).E液，自备，主要为70％乙醇。6).F液，1管，30μl/份×10份，300μl/管，内装灭菌双蒸水。7).PCR反应液(G液)，1管，25μl/份×10份，250μl/管，内装PCR一扩反应液(25μl体系)，包括ddH2O、10×Buffer(含mg2+)、dNTP、引物F1、引物R1和TaqE。8).阳性对照(H液)，1管，20μl/管，内装TFV阳性模板。9).长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm3。10).一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。
该试剂盒中的引物F1和R1的DNA序列如下F15’-GAC TTG GCC ACT TAT GACR15’-TGT CTC TGG AGA AGA AGAAPCR反应液体系(25μl体系)如下ddH2O20μl10×Buffer(含mg2+) 2.5μldNTP 0.4μl
引物F1 0.4μl引物R1 0.4μlTaqE0.3μl实施例2蛙病毒的检测方法使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行1).取样品0.1g，加入样品稀释液(A液)1ml稀释10倍，于匀浆器中冰浴匀浆。2).4000r/min离心10min。3).取上清600μl用模板抽提液(B液)抽提，上下颠倒几次混匀。4).12000r/min离心10min。5).取500ul上清加入20μl C液，再加入1ml D液，于-20℃沉淀1小时。6).12000r/min离心10min。7).弃上清，加E液冲洗，12000r/min离心5min，冲洗两次。8).弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干。9).加20～30μlF液重悬溶解作为模板。10).分别取模板和H液2μl，加入到PCR反应液(G液)中，混匀后离心数秒，置于PCR上。11).按下列条件扩增95℃ 2min预变性，→94℃ 30sec 30个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 30sec72℃ 1min12).反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在532bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为TFV阳性，说明待测样品携带蛙病毒，否则为阴性(见
图1)。
权利要求
1.种蛙病毒的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件1).样品稀释液A液，2管，内装磷酸缓冲液(1×PBS)，pH7.4；2).模板抽提液B液，1管，内装酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1；3).C液，1管，内装5M NaCL；4).D液，1管，内装无水乙醇；5).E液，1管，内装70％乙醇；6).F液，1管，内装灭菌双蒸水；7).PCR反应液G液，1管，内装PCR一扩反应液，包括ddH2O、含mg2+的10×Buffer、dNTP、引物F1、引物R1和TaqE；F1为5’-GAC TTG GCC ACT TAT GAC，R15’-TGT CTC TGGAGA AGA AGAA；8).阳性对照H液，1管，20μl/管，内装TFV阳性模板；9).盒子；10).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
2.一种检测蛙病毒的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行1).取样品，加入样品稀释液A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆；2).4000～6000r/min离心10～15min；3).取上清600μl用模板抽提液B液抽提，上下颠倒几次混匀；4).10000～12000r/min离心10～15min；5).取500μl上清加入20ulC液，再加入1ml D液，于-20℃沉淀1小时；6).10000～12000r/min离心10～15min；7).弃上清，加E液冲洗，10000～12000r/min离心5～10min，冲洗两次；8).弃上清，自然干燥或在超净工作台上吹干；9).加20～30μlF液重悬溶解作为模板；10).分别取模板和H液，加入到PCR反应液G液中，混匀后离心数秒，置于PCR上；11).按下列条件扩增95℃ 2min预变性，→94℃ 30sec 30个循环→72℃ 10min→4℃保存55℃ 30sec72℃ 1min12).反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在与阳性对照同一位置的532bp处出现明亮的反应条带，则为TFV阳性，说明待测样品携带蛙病毒，否则为阴性。
全文摘要
本发明提供一种蛙病毒(TFV，Tiger Frog Virus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以根据蛙病毒基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对蛙病毒的特异性DNA核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于虎纹蛙各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/70GK1448519SQ03114368
公开日2003年10月15日 申请日期2003年5月6日 优先权日2003年5月6日
发明者何建国, 吕玲, 黄志坚, 邓敏, 翁少萍 申请人:中山大学