专利名称：高产能的l-谷氨酰胺发酵方法
技术领域：
本发明属于氨基酸发酵领域，尤其涉及一种谷氨酰胺的发酵生产工艺。
背景技术：
在世界范围内，L-谷氨酰胺绝大部分是发酵法生产的。就发酵菌种讲，有黄色短杆菌、糖蜜棒杆菌、谷氨酸棒杆菌的各种抗性突变株，如磺氨胍抗性(SGr)、5-重氮-6-氧代-L-正亮氨酸抗性(DONr)、重氮丝氨酸抗性等，其中发酵法生产中产能较高的在糖蜜棒杆菌DONr，发酵产L-GM达84克/升(发酵周期72小时，日本公开特许公报平3-232497)；黄色短杆菌SGr，发酵产L-GM达42克/升(发酵周期48小时，Agric Biochem，51(8)2089-2094，1987)。前者虽然发酵产率高，待发酵周期长，后者发酵周期短，但产率低，还是不能令人满意。
发明内容
本发明的目的就是提供一种发酵周期短、发酵产率高的L-谷氨酰胺的发酵生产工艺。本发明是在黄色短杆菌发酵周期短的基础上，经过潜心研究，把传统的富集培养法运用于抗性菌筛选中，高效率的选育出产能强的优势菌株，又在发酵中以最大的限度强化和保持菌体产酸能力为中心提出一整套保证发酵产能高的发酵控制方法，本发明具体工艺如下1、筛选抗性菌该工艺又包括如下工序A制备完全培养基，其组成有牛肉膏1.0％、蛋白胨1.0％，酵母膏0.3％、NaC10.5％。pH值为7.0-7.2。
B制备基本培养基，其组成有葡萄糖2％、硫酸铵1％、脲0.2％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸美0.1％、硫酸铁0.001％、生物素5微克/升、硫胺素100微克/升、琼脂粉1.5％-1.8％。pH值为7.0-7.2。
C制备磷酸盐缓冲液用61毫升浓度为23.9克/升的十二水磷酸氢二钠和39毫升浓度为10.4克/升的二水磷酸二氢钠混合，并稀释成200毫升即可。该磷酸盐缓冲液的pH值为7.0。
D诱变处理取已活化的完全培养基斜面菌苔(在30-33℃恒温下，培养18-24小时)，接入装有30毫升磷酸盐缓冲液及玻璃珠的250毫升三角瓶中，振摇15分钟左右，使菌体分散成单细胞，然后加入事先溶解的亚硝基胍(NTG)，使菌体的浓度为200-1000微克/毫升，于30℃恒温振摇15-30分钟，30分钟后菌体的死亡率为90％-99.99％。处理完毕后吸0.5毫升菌液到完全培养基中，用250毫升三角瓶盛液25毫升，在30℃恒温下培养1-2天，待菌液明显浑浊，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗2次，制成菌悬液，用玻璃珠分散成单细胞后不稀释，取0.1-0.2毫升涂布于基本培养基上，在30℃恒温下培养3-10天。把3-5天后长出的大菌落挑出，转接于完全培养基斜面上，筛选出SGrNO18。
2、发酵处理该工艺包括如下工序
a制备种子培养基其组成为葡萄糖3-4％、脲0.3-0.5％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.3％、玉米浆3-4％。PH值为7.0-7.2。
b制备发酵培养基其组成为葡萄糖14％、磷酸二氢钾0.25％、硫酸镁0.05％、硫酸锰10毫克/升、硫酸锌1.0毫克/升、硫酸铜1.0毫克/升、硫胺素1.0毫克/升、玉米浆0.7-1.4％、硫铵7％。PH值7.0-7.2。
c将黄色短杆菌SGrNO18在完全培养基斜面上活化18-24小时，接种于种子培养基中，并于30-32℃恒温下振荡培养7-9小时作为种子液。将上述种子液0.5-1.0升接入500-700升种子罐，于30-32℃通气搅拌培养7-9小时。然后在5吨发酵罐中好氧发酵，接种量为5-15％。在发酵过程中，通氨控制pH5.5-7.5，在搅拌转速不变的条件下，加大或减少通氨量使溶氧在0-100％，湿菌体7-13克/100毫升发酵液，糖耗速率为0.2-1.0％，并适时补充葡萄糖和补充生物素。
本发明发酵周期短，为42-50小时，发酵产率高，50m3的发酵罐L-谷氨酰胺产量达64kg/m3。
权利要求
1.一种高产能的L-谷氨酰胺发酵方法，其工艺如下(1)筛选抗性菌该工艺又包括如下工序A制备完全培养基，其组成有牛肉膏1.0％、蛋白胨1.0％，酵母膏0.3％、NaCl0.5％，pH值为7.0-7.2；B制备基本培养基，其组成有葡萄糖2％、硫酸铵1％、脲0.2％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸美0.1％、硫酸铁0.001％、生物素5微克/升、硫胺素100微克/升、琼脂粉1.5％-1.8％，pH值为7.0-7.2；C制备磷酸盐缓冲液用61毫升浓度为23.9克/升的十二水磷酸氢二钠和39毫升浓度为10.4克/升的二水磷酸二氢钠混合，并稀释成200毫升即可，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.0；D诱变处理取已活化的完全培养基斜面菌苔，接入装有30毫升磷酸盐缓冲液及玻璃珠的250毫升三角瓶中，振摇15分钟左右，使菌体分散成单细胞，然后加入事先溶解的亚硝基胍，使菌体的浓度为200-1000微克/毫升，于30℃恒温振摇15-30分钟，30分钟后菌体的死亡率为90％-99.99％，处理完毕后吸0.5毫升菌液到完全培养基中，用250毫升三角瓶盛液25毫升，在30℃恒温下培养1-2天，待菌液明显浑浊，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗2次，制成菌悬液，用玻璃珠分散成单细胞后不稀释，取0.1-0.2毫升涂布于基本培养基上，在30℃恒温下培养3-10天，把3-5天后长出的大菌落挑出，转接于完全培养基斜面上，筛选出SGrNO18；(2)发酵处理该工艺包括如下工序a制备种子培养基其组成为葡萄糖3-4％、脲0.3-0.5％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.3％、玉米浆3-4％，PH值为7.0-7.2；b制备发酵培养基其组成为葡萄糖14％、磷酸二氢钾0.25％、硫酸镁0.05％、硫酸锰10毫克/升、硫酸锌1.0毫克/升、硫酸铜1.0毫克/升、硫胺素1.0毫克/升、玉米浆0.7-1.4％、硫铵7％，PH值7.0-7.2；c将黄色短杆菌SGrNO18在完全培养基斜面上活化18-24小时，接种于种子培养基中，并于30-32℃恒温下振荡培养7-9小时作为种子液，将上述种子液0.5-1.0升接入500-700升种子罐，于30-32℃通气搅拌培养7-9小时，然后在5吨发酵罐中好氧发酵，接种量为5-15％，在发酵过程中，通氨控制pH5.5-7.5，在搅拌转速不变的条件下，加大或减少通氨量使溶氧在0-100％，湿菌体7-13克/100毫升发酵液，糖耗速率为0.2-1.0％，并适时补充葡萄糖和补充生物素。
全文摘要
本发明提供一种高产能的L－谷氨酰胺发酵方法，是在黄色短杆菌发酵周期短的基础上，经过潜心研究，把传统的富集培养法运用于抗性菌筛选中，高效率的选育出产能强的优势菌株，又在发酵中以最大的限度强化和保持菌体产酸能力为中心提出一整套保证发酵产能高的发酵控制方法，具有发酵周期短，发酵产率高等特点。
文档编号C12P13/02GK1537945SQ03116490
公开日2004年10月20日 申请日期2003年4月16日 优先权日2003年4月16日
发明者李文濂, 吕庆林, 梁是森, 徐昊辉, 曾祥群, 宋如生 申请人:江西诚志生物工程有限公司