专利名称：植物乳杆菌st-iii菌株及其在调节血脂方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳杆菌属的新菌株，及通过培养该菌株在调节血脂方面的应用。
因而本发明的目的是提供一种植物乳杆菌ST-III；本发明的另一目的是公开上述植物乳杆菌ST-III在调节血脂方面的应用。
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III制备过程如下将泡菜汁或苜蓿汁作为样品冷藏，测定其PH值，并接种于MRS平板(Merck公司购得)且进行总菌落计数；然后采取上述样品，根据上述测定结果用pH6.8的PBS缓冲溶液浸泡混匀并梯度稀释；吸取合适的稀释度(每毫升含有100个左右细菌)100微升涂布于LBS平板，进行培养；挑取典型菌落转接到MRS平板进一步纯化；挑取理想单菌落转接于MRS液体进行增菌，获得乳酸菌菌株并冷藏保存；将上述新鲜的乳酸菌菌株以体外模型初步筛选具有降胆固醇功能的益生菌(USMAN and A.HOSONO.Bile tolerance，taurocholate deconjugation，andbinding of cholesterol by lactobacillus gasseri strains.J.Dairy Sci.199982243-248.)，进行菌种鉴定，其中可获得植物乳杆菌ST-III。
本发明的植物乳杆菌ST-III已于2002年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)保藏，并收到保藏登记号CGMCC No.0847。
该植物乳杆菌ST-III(CGMCC No.0847)的微生物学特性示于表1。
表1植物乳杆菌ST-III的微生物学特性
上述操作均在无菌条件下进行。
本发明的植物乳杆菌ST-III除具有一般乳杆菌的有益作用外，将该菌株应用于调节血脂方面，如开发功能性的乳制品，作为人类膳食补充剂，还起到辅助降低人们血清胆固醇浓度的功效。
通过借助以下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实施例限制。
本发明的植物乳杆菌ST-III已于2002年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，并收到保藏号CGMCCNO.0847。
实施例3LBS平板分离取泡菜汁和苜蓿汁，根据实施例2中所测定的结果，无菌条件下用PBS缓冲溶液(pH6.8)梯度稀释，吸取合适的稀释度溶液(每毫升含有100个左右细菌)100微升涂布于LBS平板，平板倒置放入厌氧培养箱，37℃厌氧培养36-72小时，观察菌落生长情况，平板4℃保存。
实施例4菌株镜检无菌操作，接种环挑取实施例3所得典型菌落培养物，涂于载玻片，制片并革兰氏染色，油镜观察菌体形态，挑取革兰氏阳性细菌作为目的菌株。
实施例5菌株平板纯化无菌条件下，接种环挑取实施例4所初步确定的目的菌落，在MRS平板上划线分离，37℃倒置厌氧培养24-36小时，挑取单菌落进行镜检，直至确定所得的菌株已经纯化。
实施例6菌株的增菌过程挑取实施例5所得的理想单菌落，转接到1毫升MRS液体，37℃静置培养24小时左右，再按1％(体积比)的接种量将培养液转接到新的MRS液体，37℃静置培养24小时，再在液体MRS中重复扩增2次，所得培养液4℃保存。
实施例7以体外模型初步筛选具有降胆固醇功能的益生菌15毫升无菌具塞离心管加入10毫升以无菌鸡蛋黄液为胆固醇源的高胆固醇培养液MRSO-CHOL，按1％(体积比)的接种量接入实施例6获得的新鲜的菌株，37℃培养24小时。培养液12,000×g离心10分钟，按照邻苯二甲醛测定胆固醇的方法测定上清夜中胆固醇的含量，以未接种的MRSO-CHOL作为对照，计算出各个实验菌株对胆固醇的降低率(S.E.Glliland，C.R.Nelson，C.Maxwell.Applied and EnviromentalMicrobiology，1985，49377～381.)，从中选出具有较好的降低胆固醇功效的菌株，结果见表2。
胆固醇的降低率计算公式为D=C-AC×100%]]>其中A为各实验菌株发酵上清液OD550nm[波长550nm(纳米)处的吸收光度值]；C为空白对照的OD550nm；D为胆固醇降低率。
表2降胆固醇益生乳酸菌初步筛选结果胆固醇降低率 菌株数 比例 来源(％) (株)(％) 泡菜 腌制苜蓿40以上 6 9.09 4 230-40 9 13.64 5 220-30 13 19.70 2 820以下 38 57.28 12 16其中，ST-III具有最高的胆固醇降低率，达到47.68％，对应的胆固醇降低量为244.84微克/毫升。另外还有5株菌株的胆固醇降低率在40％以上。
实施例8ST-III菌种鉴定该ST-III的微生物学特性如上述表1示。
实施例9菌体悬浮液制备方法将本发明的植物乳杆菌ST-III(CGMCC No.0847)接入MRS液体，32℃静置培养16小时，计数；根据计数结果用脱脂奶做适当的稀释、悬浮得到如表3中所需的菌液浓度。ST-III死菌悬浮液制备方法悬浮108cfu/ml(每毫升中所含菌体个数)ST-III脱脂奶置于100℃水浴加热15分钟，冷却，冰箱保存待用。
应用实施例降血清胆固醇功能性实验(体内实验，动物实验)动物模型在益生乳酸菌降低血清胆固醇功能性实验研究中得到越来越广泛的应用(郑建仙.功能性食品(第三卷).北京中国轻工业出版社，1999.9.408-412.)。高脂高胆固醇饲料诱发动物脂代谢紊乱，血脂水平发生变化血清胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量降低。降血清胆固醇功能性实验通常做法是，饲喂高脂高胆固醇饲料的同时，饲喂实验动物实验样品，通过测定动物血清脂类含量的变化来确定实验样品对动物血脂的影响效果。
本发明筛选得到的益生乳酸菌是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III(CGMCC No.0847)，该菌株在体外实验中具有较高的降低胆固醇浓度的能力。
本发明采用SD大鼠，在常规饲料中添加重量比为1％的胆固醇、5％的猪油和0.25％的猪胆盐来诱发SD大鼠高胆固醇血症。同时饲喂悬浮植物乳杆菌的脱脂牛奶，最后检测SD大鼠血清胆固醇等血脂含量，来判断该菌株是否具有降低血清胆固醇的功效。
1、实验动物和动物房条件雄性SD大鼠(8周龄)，64个。常规饲料喂养3天，随机分成8组，每组8个，分笼喂养。
动物房条件温度22±2℃，湿度56±5％，1周换2-3次锯末。控制12小时光照，12小时黑暗。
饲料常规饲料由中科院上海实验动物中心提供；高胆固醇饲料常规饲料添加重量比为1.0％的胆固醇，5％的猪油以及0.25％猪胆酸盐，委托中科院上海实验动物中心加工；所有的饲料进动物房前辐射灭菌。
2、益生乳酸菌ST-III功能性动物实验方法(1)实验动物分组和饲喂安排64只SD大鼠随机分成8组，饲喂不同的饲料和菌体悬浮液，具体的分组如表3所示。
表3实验动物分组和饲喂计划实验分组a日常饲喂b灌胃3毫升/个/天1.空白对照 常规饲料+水 水2.高脂对照 高脂饲料+水 水3.高脂SKMc对照高脂饲料+水 SKM4.L.bulgaricusd对高脂饲料+水 悬浮2.5×108cfu/ml L.bulgaricus的SKM照5.L.acidophiluse对高脂饲料+水 悬浮2.5×108cfu/ml L.acidophilus的SKM照6.ST-III活菌高 高脂饲料+水 悬浮2.5×108cfu/ml活菌ST-III的SKM7.ST-III活菌低 高脂饲料+水 悬浮2.5×106cfu/ml活菌ST-III的SKM8.ST-III死菌 高脂饲料+水 悬浮2.5×108cfu/ml死菌ST-III的SKM注a每组8个SD大鼠b饲喂实验共持续21天
cSKM——灭菌10％脱脂奶dL.bulgaricus——保加利亚乳杆菌eL.acidophilus——嗜酸乳杆菌(2)实验动物的日常管理和饲喂SD大鼠按表3随机分成1-8个组别，除空白对照组1饲喂常规饲料外，2-8组均饲喂高脂饲料。按照表3中方案，每日上午8点对SD大鼠灌胃3毫升/个/天，记录每日饲料消耗量，实验开始和结束称量大鼠的体重。
(3)大鼠血清采集和血脂和血清总胆酸浓度的检测21天饲喂实验结束后，禁食12小时，乙醚深度麻醉，摘眼球取血，装入无菌离心管，离心(3000×g，10分钟)收集血清，送上海华山医院检验中心测定血清中总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，和以及总胆酸(TBA)的含量。
(4)统计分析同组数据单因素方差分析。
不同组之间t检验，p＜0.05差异有统计学意义，p＜0.01和p＜0.001差异有高度的统计学意义。
3、结果分析(1)大鼠血清TC和TG浓度的测定结果21天饲喂实验结束后，禁食12小时，收集大鼠血清，送上海华山医院进行血清脂类分析，测定TC、TG、HDL-C、LDL-C和TBA含量。具体结果见表4和表5。
表4大鼠血清TC和TG含量测定实验分组aTC(mmol/L) TG(mmol/L)1 1.4±0.29 0.68±0.202 2.64±0.36 0.99±0.103 2.56±0.23 0.97±0.194 2.36±0.29 0.90±0.325 2.27±0.21*0.98±0.226 2.01±0.30**0.80±0.257 2.26±0.23*0.93±0.358 2.39±0.24 0.86±0.08注a实验分组见表3组4-8分别和组3进行t检验*p＜0.05差异有统计学意义，**p＜0.01差异有高度的统计学意义。
比较表4中的空白对照组1和高脂对照组2的TC和TG含量，可以看出，组2的TC和TG含量分别比组1的高88.57％和45.59％，差异有高度的统计学意义(p＜0.001)和有统计学意义(p＜0.05)。由此本实验中，饲喂高脂饲料可以诱发大鼠高TC和TG水平，符合文献的报道和实验要求。
组3和组2相比，TC和TG含量分别下降了3.03％和2.02％，差异无统计学意义(p＞0.05)，本实验证实SKM对TC含量没有降低效果。和组3相比较，饲喂菌体的组4-8中，组6的TG含量最低，比组3下降了17.52％，但是差异无统计学意义(p＞0.05)，其它4组的TG含量和组3相比差异也没有统计学意义(p＞0.05)。可能饲喂菌体对大鼠TG含量的降低没有明显的影响。
就TC而言，饲喂SKM悬浮L.bulgaricus的组4及ST-III死菌组8和饲喂SKM的高脂对照组3相比，分别下降了7.81％和6.64％，差异无统计学意义(p＞0.05)；而和组3相比，饲喂SKM悬浮L.acidophilus的组5和ST-III活菌低的组7的大鼠TC含量分别下降了11.33％和11.72％，差异有统计学意义(p＜0.05)，饲喂ST-III活菌高的组8大鼠TC含量下降了21.48％，差异有高度的统计学意义(p＜0.01)。组6比组7多降低了11.06％的TC含量。可见本发明的ST-III具有降低TC的功效。
(2)饲喂ST-III菌体对大鼠HDL-C和LDL-C的影响如表5是实验大鼠HDL-C和LDL-C测定结果。
表5大鼠HDL-c和LDL-c含量的测定实验分组aHDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)AIb11.02±0.21 0.32±0.14 0.3220.75±0.10 1.54±0.29 2.0530.79±0.10 1.51±0.22 1.9340.90±0.12 1.15±0.32*1.30**51.05±0.25*1.04±0.16***1.06***60.91±0.07*0.94±0.24**1.03***70.94±0.12*1.13±0.22**1.21**81.09±0.20**1.10±0.28**1.07***注组4-8分别和组3进行t检验*p＜0.05差异有统计学意义，**p＜0.01，***p＜0.001差异有高度的统计学意义a实验分组见表3；bAI-动脉粥样硬化危险因子，AI＝LDL-C/HDL-C从表5中可以看出，高脂对照组2的HDL-C含量比空白对照组1的下降26.47％，差异有统计学意义(p＜0.05)，LDL-C含量上升了381.25％，差异有高度的统计学意义(p＜0.001)，动脉粥样硬化因子AI上升了540.62％，差异有高度的统计学意义(p＜0.001)。可以看出，高脂饲料诱发了大鼠的脂蛋白代谢紊乱，HDL-c含量下降和LDL-c含量升高，而且AI危险因子值升高非常明显。
组3饲喂SKM的大鼠血清HDL-C和LDL-C含量分别比高脂对照组2升高5.33％和降低了1.95％，差异无统计学意义(p＞0.05)，AI因子差别也无统计学意义。说明SKM对脂蛋白代谢没有调节作用。
组4大鼠血清HDL-C含量和LDL-C含量分别比高脂SKM对照组3升高13.92％和降低23.84％，但是差异无统计学意义(p＞0.05)。说明L.bulgaricus对大鼠的脂蛋白代谢没有影响。
组5大鼠血清HDL-c含量比组3高32.91％，差异有统计学意义(p＜0.05)，LDL-C含量比组2低31.12％，差异有高度的统计学意义(p＜0.01)；并且AI因子降低了45.08％(p＜0.001)，差异也有高度的统计学意义。说明L.acidophilus具有升高大鼠HDL-C和降低LDL-C含量的功效。
饲喂SKM悬浮的108cfu/ml浓度ST-III活菌高组6的大鼠血清HDL-C含量比组3升高了15.19％，差异有统计学意义(p＜0.05)，LDL-C含量分别降低了37.75％，差异有高度的统计学意义(p＜0.01)；同时AI因子下降了46.63％，差异也有高度的统计学意义(p＜0.001)。
饲喂SKM悬浮的106cfu/ml浓度ST-III活菌低组7的大鼠血清HDL-C含量比组3升高了18.98％，差异有统计学意义(p＜0.05)，LDL-C含量降低了37.75％，差异有高度的统计学意义(p＜0.01)；同时AI因子下降了46.63％，差异有高度的统计学意义(p＜0.001)。
饲喂SKM悬浮的108cfu/ml浓度ST-III死菌组8的大鼠血清HDL-C含量比组3升高了37.98％，差异有高度的统计学意义(p＜0.01)，LDL-C含量下降了27.15％，差异有高度的统计学意义(p＜0.01)；同时AI因子下降了44.56％，差异有高度的统计学意义(p＜0.001)。
组6，组7和组8的实验结果说明，ST-III活菌和死菌对大鼠血清脂蛋白代谢具有调节作用，可以升高HDL-C含量，降低LDL-C含量。比较发现，菌体量升高，效果明显。
权利要求
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III CGMCC NO.0847。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在调节血脂方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ST－IIICGMCC NO.0847，及其在调节血脂方面的应用。
文档编号A23C9/12GK1467290SQ0311637
公开日2004年1月14日 申请日期2003年4月11日 优先权日2003年4月11日
发明者蒋能群, 孙立国, 郭本恒 申请人:上海光明乳业股份有限公司