专利名称：一种重组嗜甲醇酵母的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种重组嗜甲醇酵母发酵的改进方法。
毕赤酵母(Pichia pastoris)表达体系是近十年来发展起来的真核表达体系。毕赤酵母的醇氧化酶(Alcohol Oxidase，AOX)基因的强启动子特别适合于外源基因的表达调控。毕赤酵母培养基成分明确，不含热源或毒素，作为诱导剂和碳源的甲醇价格低廉，适宜于高密度发酵大规模生产药用蛋白。根据利用甲醇的能力，整合外源基因的方法，重组毕赤酵母可划分为3种表型。对于含有完整AOX1和AOX2基因的Pichia pastoris菌株，在含有甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称为甲醇利用正表型(Mut+)。当aox1被外源基因取代，则甲醇代谢需依赖AOX2，AOX2与AOX1有97％的同源性，但甲醇代谢速度慢，称为甲醇利用慢表型(MutS)。当AOX基因全部缺失，不能利用甲醇，称为甲醇负表型(Mut-)。后二者表达外源蛋白有时优于Mut+型，且消耗甲醇较少。三种表型菌株在AOX1启动子调控下均可诱导异源蛋白的表达。
重组毕赤酵母的高菌体密度发酵过程一般为三个阶段首先是分批发酵阶段，菌体利用培养基中的甘油生长；其次为甘油完全消耗后进入补料发酵阶段，流加甘油进一步提高菌体浓度；最后是外源基因诱导表达阶段，流加甲醇诱导外源基因的表达。由于具有MutS表型的毕赤酵母在以甲醇为唯一碳源时生长缓慢，所以在表达阶段常采用混合碳源流加的方式，即流加甲醇的同时流加易被其代谢的其它碳源，以使菌体维持一定的生长。甘油—甲醇是常用的混合碳源组合，其中甲醇既是诱导剂又是碳源，甘油作为主要碳源。由于甲醇传感器的发明和应用，甲醇的流加可实现反馈控制，发酵液中的甲醇浓度可以稳定地控制在需要的水平；由于甘油对AOX1启动子有严重的阻遏作用，甘油的代谢产物乙醇也会阻遏AOX1启动子，所以在流加甘油—甲醇混合碳源时，必须严格控制甘油的流加，避免发酵液中出现残余甘油；甘油的在线检测尚未解决，也增加了控制甘油流加的难度。因此，这些不利因素影响了甘油—甲醇混合碳源流加的效果，也限制了MutS表型毕赤酵母的应用。鉴于上述原因，山梨醇作为一种非阻遏碳源被广泛地用在诱导表达阶段的混合碳源中代替甘油，例如文献Biotechnol.Lett.1999，21669-672中，在诱导表达阶段流加山梨醇—甲醇混合碳源，蛋白的比生产速率比流加甘油—甲醇混合碳源时的提高了33％，但由于山梨醇的细胞得率较甘油低，最终的蛋白产量差别不大。因此，开发更为有效的非阻遏碳源用于毕赤酵母发酵的诱导表达阶段，对提高Pichiapastoris表达异源蛋白的能力是十分重要的。
根据上述构思，发明人提出如下技术方案本发明所说的重组嗜甲醇酵母的发酵方法，依次包括培养基发酵、补料发酵和外源基因诱导表达三阶段，其特征在于，在所说的外源基因诱导表达阶段中的碳源含有C2-C3的有机酸(如乳酸或乙酸)和甲醇，所说的碳源中有机酸流加速率可以根据发酵罐中的溶氧变化情况进行调节(见文献Biotechnol.Lett.2003，25(2)173-177)。在所说的外源基因诱导表达阶段中其它培养条件均为同技术领域中一般技术人员所熟知的现有技术，在此不再赘述。为更好控制外源基因诱导表达阶段中的pH值，可采用C2-C3的有机酸盐替代部分有机酸。
本发明的优点在于克服了现有技术中使用甘油—甲醇混合碳源时甘油及其代谢产物乙醇等对AOX1启动子的阻遏而导致重组基因表达量低、发酵过程中碳源流加控制困难等问题，使重组基因表达量得以很大程度的提高。
1mL甘油冷冻菌种保藏管融化后，取0.7mL种液接入装有25mL BMGY培养基(1L含YNB 13.4g，甘油10mL，生物素0.4mg，1mol/L pH6.0磷酸缓冲溶液100mL，Yeast Extract 10g，Polypepton 20g)的250mL的摇瓶中，于250rpm，30℃摇床培养14h，得一级种子。250mL摇瓶中装入25mL摇瓶发酵培养基(1L含甘油5g，(NH4)2SO42g，CaSO40.06g，K2SO41.2g，MgSO4·7H2O 1g，生物素0.2mg，1mol/L pH6.0磷酸缓冲溶液100mL)，接入5mL一级种子，于250rpm，30℃摇床培养12-14h至培养基中的甘油被消耗，同时加入3g/L甲醇及一定量碳源。所选用碳源为甘油，山梨醇，乳酸，乙酸铵，乙酸钠，其中甘油和山梨醇为参照组。由于乙酸的加入会导致发酵液的pH有较大改变，所以使用乙酸铵和乙酸钠。碳源的加入量与5g/L甘油碳原子摩尔数相等，每种碳源都有三个摇瓶平行试验，于250rpm，30℃摇床培养8h。取样测定菌体浓度(采用浊度法，发酵液经稀释后于波长600nm测光密度OD600，1OD600相当于菌体干重0.36g/L)。发酵液6000rpm离心10min后采用ELISA方法测定发酵上清液中血管生长抑制素的浓度。结果见表1。
表1五种碳源对菌体生长及蛋白表达的影响碳源 甘油山梨醇乳酸乙酸铵乙酸钠OD60019.517.1 13.716.9 16.5血管生长抑制素(mg/L) 0.432.65 0.611.65 1.59实施例2将如实施例1中所述的一级种子分别接于三个装有50mL BMGY培养基的500mL摇瓶中，于250rpm，30℃摇床培养7-8h，得二级种子。将二级种子接种于5-L发酵罐中的BSM培养基(1L含85％磷酸26.7mL，CaSO40.93g，K2SO418.2g，MgSO4·7H2O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，PTM1溶液4.35mL。1L PTM1含CuSO46.0g，KI 0.8g，MnSO43.0g，Na2MoO40.2g，H3BO30.2g，CoCl20.5g，ZnCl220.0g，FeSO4·7H2O 65.0g，生物素0.2g，硫酸5mL)中，接种后体积为2.5L(接种量7％)，温度30℃，通气量4mL/min下培养。通过自动流加5MKOH调节pH5.0，手动调节搅拌转速维持溶氧不低于20％。甘油耗尽后，饥饿0.5h开始流加50％(w/w)甘油(每升含12mL PTM1溶液)，菌体密度达64g/L时停止流加甘油，饥饿0.5h后开始诱导重组蛋白表达，流加甲醇(每升加12mLPTM1溶液)，发酵罐中的甲醇浓度由甲醇检测控制系统(见文献无锡轻工大学学报，2003，22(1)12-15)维持在5g/L；同时流加28.7％(w/w)乙酸铵(每升加12mL PTM1溶液)，乙酸铵流加速率由48h的3mL/h逐渐提高到78.8h的7mL/h并至发酵结束，并用50％(v/v)乙酸维持pH5.0。采用乙酸铵—乙酸流加系统时，加入的乙酸铵的CH3COO-被菌体作为碳源而代谢，其消耗造成残余在发酵液中的NH4+引起pH上升，从而加入乙酸维持pH恒定。乙酸不仅是pH调节剂，同时也是碳源。菌体浓度和蛋白表达量的测定同实施例1。经55h诱导(全部发酵时间为111.5h)，菌体浓度达到125g/L，血管生长抑制素的表达水平达到51.5mg/L，平均比生产速率0.01mg/gh。在蛋白诱导表达阶段采用乙酸铵(乙酸)—甲醇混合碳源，在5-L发酵罐中发酵水平与采用山梨醇—甲醇混合碳源相当。
实施例3菌体生长阶段的发酵过程如实施例2中所述，进入诱导表达阶段后，流加甲醇(每升加12mL PTM1溶液)，发酵罐中的甲醇浓度由甲醇检测控制系统维持在5g/L；同时流加51％(w/w)乳酸(每升含12mL PTM1溶液)，乳酸流加速率由49.1h的5.7g/h逐渐提高到102.6h的21.8g/h并至发酵结束，用14％(v/v)氨水调节pH5.0。经64.5h诱导(全发酵时间为113h)，菌体浓度达到87g/L，血管生长抑制素的表达水平达到191mg/L，平均比生产速率达到0.04mg/g·h。诱导阶段采用不同碳源和甲醇混合碳源发酵生产血管生长抑制素的结果见表2，采用乳酸—甲醇混合碳源时重组蛋白表达水平较采用甘油—甲醇混合碳源和山梨醇—甲醇混合碳源有较大提高。
表2诱导表达阶段流加混合碳源发酵结果表达时间 血管生长抑制素 菌体浓度 碳源*用量/甲醇用量 平均比生产速率混合碳源(h)(mg/L)(g/L) (w/w) (mg/g·h)甘油—甲醇 102108 1651.50.02山梨醇—甲醇 65 54.6 1051 0.01乙酸铵—甲醇 55 51.5 1254 0.01乳酸—甲醇 64.5 191 87 1.80.04*所指碳源为混合碳源中甲醇以外的碳源。
根据本发明公开的技术方案和实施例，有关的工程技术人员可以方便地将本发明所述的重组毕赤酵母发酵过程控制方法用于其它重组毕赤酵母特别是具有MutS表型的重组毕赤酵母表达生产其它外源蛋白的发酵过程中。
权利要求
1.一种重组嗜甲醇酵母的发酵方法，依次包括在基础培养基中的分批发酵、流加甘油的补料发酵和外源基因诱导表达三阶段，其特征在于，在所说的外源基因诱导表达阶段中的碳源含有C2-C3的有机酸和甲醇。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，其中所说的有机酸为乳酸。
3.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，在所说的外源基因诱导表达阶段中的碳源还含有C2-C3的有机酸盐。
4.如权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，其中所说的有机酸盐为C2-C3的有机酸铵盐。
5.如权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，其中所说的有机酸为乳酸，所说的有机酸盐为乳酸铵。
全文摘要
本发明涉及一种重组嗜甲醇酵母(特别是巴斯德毕赤酵母)发酵的改进方法，即在重组嗜甲醇酵母发酵生产外源基因产物的诱导表达阶段流加短碳链有机酸—甲醇混合碳源以促进菌体的生长和诱导外源基因的表达，克服了使用甘油—甲醇混合碳源时甘油及其代谢产物乙醇等对AOX1启动子的阻遏而导致重组基因表达量低、发酵过程中碳源流加控制困难等问题。采用短碳链有机酸替代甘油后，重组基因表达量得以很大程度的提高。
文档编号C12N1/16GK1446906SQ0311603
公开日2003年10月8日 申请日期2003年3月27日 优先权日2003年3月27日
发明者叶勤, 谢静莉 申请人:华东理工大学