专利名称：一种蛇毒凝血酶及其生产方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种凝血酶及其生产方法与应用，特别是涉及一种蛇毒凝血酶及其生产方法与应用。
背景技术：
凝血酶以纤维蛋白I为作用底物，迅速转入血管受伤部成为纤维蛋白凝块，阻止血液自受伤部位流出。凝血过程大致分为三个阶段，即凝血因子X的激活；凝血酶原的激活；纤维蛋白原变成纤维蛋白。能使纤维蛋白原变成纤维蛋白的作用称为类凝血酶样作用；能通过激活凝血因子X及凝血酶原而发挥作用的，称为类凝血激酶样作用。蛇毒中含有丰富的蛋白酶，其中一类丝氨酸蛋白酶与蛇伤造成的血液凝固失调等毒理作用密切相关，属于凝血酶类。很多凝血酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)已经从各种蛇毒中提纯，并已先后用于制备临床用药。
1767年，Fontana首次叙述了蛇毒的凝血作用，此后二百多年来，有关蛇毒应用于血液系统的研究不断取得成绩。
1967年从马来亚红口蝮(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒中分离的凝血酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)具有脱纤维蛋白的作用，可用于临床，已命名为Ancrod或Arvin，是一种单链的糖肽，含碳水化合物25-36％，由17个氨基酸组成，等电点6.5，分子量35400D±1400D(Ewart，M.R.，Biochem J.1970，118，603；Collins，J.P.etal.Eur.JBiochem，26，510)。人体静脉或皮下注射Ancrod，血浆纤维蛋白原水平会依据剂量而减少，因此这种酶制剂Ancrod可用于防治血管栓塞性疾病，又由于它的作用靶位是纤维蛋白原的Aa链，还可用于研究纤维蛋白原到纤维蛋白的转换。
Ouyang(Ouyang，C.，(1957)J.Formosan Med.Assoc，56，435)将从尖吻蝮(Akistrodon acutus)蛇毒中分离的凝血酶样酶称为Acutin，分子量24000，等电点酸性，它作用于纤维蛋白原的a链，分解出纤维蛋白肽A。它还进一步降解已形成的纤维蛋白的a链。Acutin引起纤维蛋白原凝结，形成对血浆溶解高度敏感的结块。Komori等(1988)从尖吻蝮蛇毒中分离出4种具有不同化学和免疫学特性的凝血酶样酶，都能从血纤维蛋白原中分解出纤维蛋白肽A，但其中仅有一种酶像凝血酶一样，能激活凝血因子XII。
昆明动物研究所将从尖吻蝮蛇蛇毒分离出的Acutin称为“去纤酶”应用于临床治疗脑血栓、心脏血栓、眼底静脉血栓及脉管炎，疗效显著。
蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒中所含的凝血酶样酶，像铜头蝮的A.contortrix毒一样，能选择性地从纤维蛋白原分解出纤维蛋白肽B，是一种单链的糖蛋白，分子量43000D(Ouyang，C.，etal.，(1983)Toxicon，21，797)。该酶的酶活能可被DFP(二异丙基磷酰氟)和PMSF(苯甲基磺酰氟)所抑制，具精氨酸酯酶特性，它分解苯甲酰精氨酸乙酯比胰蛋白酶快2.5倍，分解TAME(对甲苯磺酰精氨酸甲酯)则比胰蛋白酶慢50倍。蝮蛇蛇毒中分离的酶凝结纤维蛋白原很慢，释放血纤肽的动力学分析表明血纤肽Bβ链分裂出来较快，而释放导致凝块形成的血纤肽则较慢，它不像铜头蝮那样由温度取决酶活力大小。我国用于提取抗凝酶的毒蛇已有尖吻蝮、蝮蛇(蛇岛、浙江)。
从南美洲铜头蝮(Agkistrodon contortrix)蛇毒中分离的酶称为“Venzyme”，能从血纤维蛋白原中迅速地分解出血纤肽B，而较慢地释放血纤肽A。Venzyme分子量为64000D，不稳定，在pH 3时空气中暴露2小时，酶活力丧失；pH 10下放置2小时，活性损失60％，pH7时60℃加热30分钟，活力丧失95％(Shimizu，A.，et.al.，(1987)Toxicon，21，679)。由于Venzyme作用于纤维蛋白原的Bβ链，这种独特性可用于研究那些作用于Aa-链的凝血酶(如红口蝮、矛头蝮和响尾蛇的“Anrod”、“batroxobin”、“Crotalase”)形成和凝血酶交叉组合的理化特性。
从蝮蛇日本亚种(Agkistrodon haly brevicaudus)蛇毒中分离的凝血酶(纤凝精氨酸蛋白酶)是分子量为39000D的糖肽，由323个氨基酸残基构成，分子中谷氨酸和天冬氨酸含量较高。
从东部菱斑响尾蛇(Crotalus adamanteus)蛇毒中分离的凝血酶样酶称为响尾蛇酶Crotalase，分子量为32700D，碳水化合物含岩藻糖、甘露糖、半乳糖和葡萄胺，占响尾蛇酶Crotalase干重的5.4％。Crotalase在中性或微碱的磷酸缓冲液中较为稳定，但如在pH5以下的酸性条件，酯酶活性能很快失活(Markland，F.S.，etal.，(1971)J.Biol.Chem.，246，6460)。Crotalase仅从纤维蛋白原分子中分解出血纤肽A，如延长培养将导致纤维蛋白链的降解。Crotalase也用于脱纤维蛋白原疗法。
世界卫生组织将从矛头蝮(Bother atrox)蛇毒中分离纯化的凝血酶样酶命名为“Batroxobin”，它有很多重要的用途，如用于止血称作“Retilase”(蛇酶)或用于脱纤维蛋白原疗法称作Defibrase”(脱纤酶)，用做诊断的工具称作“Reptilase-Reagent”(蛇酶试剂)。自矛头蝮(B.atrox)蛇毒中分离的“Batroxobin”，分子量为43000D；自Bother.moojeni蛇毒中分离的“Batroxobin”，分子量为36000D，由6条二硫链相接，含碳水化合物27％；由己糖、葡糖胺、唾液酸构成的“Batroxobin”是单链的糖肽，等电点6-7。在20℃、pH2.5-9的范围内，在水溶液中仍能保持稳定几小时；在甘油溶液中100℃加热1小时，活性仍无明显损失，表明能从矛头蝮B.atrox或B.moojeni蛇毒中大批量生产Batroxobin(Hofmann，H.，etal.，(1987)Biochemistry，26，780)。止血药Batroxobin是一种局部止血剂，用于流血部位的纤凝作用不为血浆凝血酶抑制剂或任何抗凝介质所抑制。
从B.atrox或是B.moojeni中来的Batroxobin(矛头蝮纤凝酶)像凝血酶样酶ancrid一样，分解纤维蛋白原Aa链上16精氨酸-17甘氨酸酯链，引起血纤肽A释放形成纤维蛋白单体。
国外学者研究表明，Reptilase由两种有效成分组成，具有类凝血酶和类凝血激酶样作用。在正常血管内，Reptilase只发挥类凝血酶样作用，不发挥类凝血激酶样作用，而在血管破损时，Reptilase同时发挥类凝血酶样作用和类凝血激酶样作用。蛇酶Retilase(Pentaphar公司的注册商标CH4002巴塞尔)为含凝血酶homecoagulaes的止血药，血液凝固系统来自B.atrox的毒液。Batroxobin又叫蛇酶，作为引起纤维蛋白I单体形成的媒介，小剂量注射在较长时间可使血液更易凝结。
目前较知名的同类品种为立止血(Reptilase、Hemocoagulase)，它是由瑞士素高大药厂制造的一种用于治疗和预防有出血症状疾病的酶性止血剂，是从巴西洞蝮蛇的毒液中提纯制得的无菌冻干制剂。中国每年进口数百万支“立止血”，价格达3-4亿人民币以上。
白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(pallas)]产于中国的长白山，资源丰富，开发价值很高。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有显著止血效果的蛇毒凝血酶及其生产方法。
一种蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提取；该凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。
所述凝血酶具有类凝血酶样活性及类凝血激酶样活性。它的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳的三条带，按照分子量从大到小各带所占比例分别为7-12％，76-86％及7-12％(重量)。该凝血酶对于牛纤维蛋白原的初凝时间为60-120秒；所述凝血酶对于标准人血浆的初凝时间为40-80秒。
一种生产蛇毒凝血酶的方法，包括如下步骤(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用缓冲液溶解，离心沉淀，酚饱和溶液洗脱，得到蛇毒凝血酶I级酶制品；(2)将所得的蛇毒凝血酶I级酶制品用缓冲液溶解，再经离子交换柱层析，用缓冲液洗脱，得精制蛇毒酶液。
所述用酚饱和溶液洗脱进行2次为益；所述溶解I级酶制品所用的溶剂是0.05mol/L Tris-HCl缓冲液；I级酶制品所用的离子交换剂为DEAE-Sephadex A-50；离子交换柱层析后用Tris-HCl缓冲液NaCl直线梯度洗脱。
为了得到更加纯化的蛇毒凝血酶，可以对上述获得的精制蛇毒酶液再进行如下加工将所述精制蛇毒酶液冻干，得到精制蛇毒酶液的冻干品；将精制蛇毒酶液的冻干品经脱盐得到蛇毒凝血酶II级酶制品溶液。
精制蛇毒酶液冻干品脱盐所用层析柱为G-75柱；所述全部提取过程在10±2℃的GMP环境中进行。
本发明的第二个目的是提供一种有效的凝血药物及其生产方法。
一种凝血药，它的活性成分是蛇毒凝血酶，该凝血酶自白眉蝮蛇蛇毒中提取；它的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。
一种生产凝血药的方法，是将白眉蛇毒凝血酶II级酶制品溶液及其佐剂进行过滤、分装、冷冻、干燥灌封得到的；所述佐剂为甘露醇、水解明胶及注射用水，各种成分的重量(体积)份数比为25％甘露醇125(体积)水解明胶0.5(重量)注射用水350(体积)凝血酶II级酶制品溶液25(体积)。
实验结果表明，本发明的凝血药在0.7U/mg体重的剂量下即有显著的止血作用。研究表明，白眉蛇毒凝血酶能明显缩短家兔出血时间及凝血时间，呈正量效关系，且作用强于立止血。
本发明的凝血酶从中国特产的长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化，原料资源丰富，可以为大规模工业化生产提供可靠的保障，实现凝血药物的国产化。
本发明的凝血药物毒性极弱，经毒理试验给小白鼠注射本发明凝血酶的剂量为250Ku/Kg.B.W，相当于临床成人用量的2500倍，表明该药的LD50大于250Ku/Kg.B.W，临床使用安全，具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施例方式
实施例1、本发明白眉蛇毒凝血酶及凝血酶药物制剂的生产取白眉蛇毒晶体20g溶于1000ml 0.9％NaCl注射液中，3000转/分离心10分钟，弃去沉淀。调整上清液pH至6.5，然后用0.9％NaCl注射液定容至1000ml。向此溶液中加入饱和硫酸铵溶液670毫升，混合物在室温条件下放置1小时，然后3000转/分离心10分钟，弃沉淀。向上清中加入饱和硫酸铵溶液552毫升，室温放置1小时，混合物3000转/分离心10分钟，弃上清沉淀溶解在1000ml蒸馏水中，调节pH至5.0。向此溶液中加入90％苯酚7.7毫升，混合物在室温条件下放置15小时，3000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀。沉淀用酚饱和溶液洗两次，3000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀，得到蛇毒凝血酶I级酶制品。
沉淀移入含乙酸的95％乙醇中，然后在玻璃负压过滤器中过滤，过滤物用0.05mol/LTris-HCl缓冲液溶解，上DEAE-Sephadex A-50的层析柱，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液NaCl洗脱，流速为0.8-1.0ml/min，然后，用含有NaCl的0.05mol/L Tris-HCl进行直线梯度洗脱，得到精制蛇毒酶液180毫升。
用标准人血浆进行检测，收集能使标准人血浆凝固的部分，比活性100Ku/mg，将收集的精制酶液用冻干机冻干，得冻干粉58mg，取冻干品用水溶解，上G-75柱用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，得到蛇毒凝血酶II级酶制品溶液250毫升。
上述全部提取过程均在10±2℃的GMP环境中进行。
用标准人血浆进行检测，收集能使标准人血浆凝固的部分，比活性150Ku/mg，经SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定呈三条带，分子量分别为54000，34000，及15000，各带所占比例分别为7-12％，76-86％及7-12％(重量)。得到的凝血酶对于牛纤维蛋白原的初凝时间为60秒；所述凝血酶对于标准人血浆的初凝时间为40秒。
经配方[甘露醇125ml(25％)、水解明胶0.5g、注射用水350ml、凝血酶25ml]超滤、分装、冻干、灌封得注射用白眉蛇毒凝血酶成品1000支，1Ku/支。
实施例2、本发明白眉蛇毒凝血酶类凝血酶样活性测定本发明白眉蛇毒凝血酶具有类凝血酶样作用及类凝血激酶样作用，通过加入EDTA抑制其类凝血激酶样作用，来观察白眉蛇毒凝血酶对人纤维蛋白原的类凝血酶样作用。
向试管中加入本发明的白眉蛇毒凝血酶样品1ml(每支样品用1ml 5×10-3mol/LEDTA溶解)，分成4组，I、II、III分别为白眉蛇毒凝血酶高、中、低剂量组，剂量分别为2Ku/ml、1Ku/ml、0.5Ku/ml，IV组为空白组(加生理盐水1ml)，各管作用5小时后37℃水浴5分钟，然后向各管加入0.1％人纤维蛋白原1ml，观察并记录人纤维蛋白原凝固时间。结果如表1所示，表1、人纤维蛋白原凝固时间测定结果分组管数(支)样品剂量(Ku/ml)人纤维蛋白原凝固时间 (s)I152 50±6II 151 80±9 a.b
III 15- 0.5 140±16IV151ml生理盐水 -aP＜0.01(同I组比较) bP＜0.01(同III组比较)从表1可以看出，在EDTA存在的情况下，本发明的白眉蛇毒凝血酶能使人纤维蛋白原凝固，表现为类凝血酶样作用，同时，白眉蛇毒凝血酶使人纤维蛋白原凝固，呈正量效关系。
实施例3、本发明白眉蛇毒凝血酶的类凝血激酶样活性测定本发明白眉蛇毒凝血酶具有类凝血酶样作用及类凝血激酶样作用，通过加入DFP(二异丙基氟磷酸)抑制其类凝血酶样作用，来观察白眉蛇毒凝血酶的类凝血激酶样作用。
向试管中加入本发明的白眉蛇毒凝血酶样品1ml(每支样品用2×10-3mol/L DFP溶液溶解)，分成4组，I、II、III组分别为白眉蛇毒凝血酶高、中、低剂量组，剂量分别为2Ku/ml、1Ku/ml、0.5Ku/ml，IV组为空白对照组(加生理盐水)，各管作用5小时后37℃水浴5分钟，然后向各管加入缺凝血因子X的标准血浆(6)1ml或标准人血浆(7)1ml，观察并记录血浆凝固时间。结果如表2、表3所示表2、加入缺X因子血浆后的凝固情况分组试管数(支) 样品剂量(Ku/ml)加入缺X因子血浆后凝固情况I 102-II 101-III100.5 -IV 101ml生理盐水 -表3、加入标准人血浆后的凝固情况及凝固时间结果分组试管数(支) 样品剂量(Ku/ml) 加入标准人血浆后凝固时间(s)I 102 150±16II 101 260±30a.b.c.
III100.5370±41IV 101ml生理盐水-aP＜0.01(同I组比较)bP＜0.01(同III组比)从表中的结果可以看出，在DFP存在的条件下，白眉蛇毒凝血酶不能使缺X因子的标准血浆凝固，但能使标准人血浆凝固，表现为类凝血激酶样作用，呈正量效关系，证明白眉蛇毒凝血酶的类凝血激酶样作用是通过激活X因子而发挥作用的。
实施例4、本发明白眉蛇毒凝血酶对家兔全血的促凝作用与立止血比较蛇毒血凝酶具有类凝血酶样作用及类凝血激酶样作用。家兔给药后，通过观察出血时间及凝血时间，来观察白眉蛇毒凝血酶的促凝作用。
实验动物日本大耳白家兔，体重2-3公斤，雌雄各半。
取家兔50只，分成5组，每组10只，I、II、III组分别为白眉蛇毒凝血酶高、中、低剂量组，剂量分别为4Ku/Kg.BW、2Ku/Kg.BW、1Ku/Kg.BW，IV组为空白对照组，注射2ml/Kg.BW生理盐水，V组为立止血组，剂量为2Ku/Kg.BW。各组静脉注射15分钟后，测定家兔出血时间和凝血时间(出血时间测定采用DuKe氏法--实用医学检验学P116；凝血时间测定采用玻片法--实用医学检验学P129)。结果如表4所示表4 家兔出血时间及凝血时间测定结果分组 例数(只)给药剂量(Ku/Kg.BW)出血时间(s)凝血时间(s)I104 23±4d 75±8dII 102 38±5abc 100±11abcIII 101 51±5d 125±12dIV 102ml 74±8 180±20V102 42±4 108±10aP＜0.01(同I组比较)bP＜0.01(同III组比较)cP＜0.01(同IV组比较)从表4的数据可以看出，实验组家兔出血时间及凝血时间明显短于对照组，并呈明显剂量依赖关系。表明，本发明的白眉蛇毒凝血酶能明显缩短家兔出血时间及凝血时间，且作用强于立止血。
权利要求
1.一种蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提取；该凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。
2.根据权利要求1所述的凝血酶，其特征在于所述凝血酶具有类凝血酶样活性及类凝血激酶样活性。
3.根据权利要求1或2所述的凝血酶，其特征在于所述凝血酶的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳的三条带，按照分子量从大到小各带所占比例分别为7-12％，76-86％及7-12％(重量)。
4.根据权利要求1的凝血酶，其特征在于所述凝血酶对于牛纤维蛋白原的初凝时间为60-120秒；所述凝血酶对于标准人血浆的初凝时间为40-80秒。
5.一种生产蛇毒凝血酶的方法，包括如下步骤(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用缓冲液溶解，离心沉淀，酚饱和溶液洗脱，得到蛇毒凝血酶I级酶制品；(2)将所得的蛇毒凝血酶I级酶制品用缓冲液溶解，再经离子交换柱层析，用缓冲液洗脱，得精制蛇毒酶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述用酚饱和溶液洗脱进行2次；所述溶解I级酶制品所用的溶剂是0.05mol/L Tris-HCl缓冲液；I级酶制品所用的离子交换剂为DEAE-Sephadex A-50；离子交换柱层析后用Tris-HCl缓冲液NaCl直线梯度洗脱。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于将所述精制蛇毒酶液冻干，得到精制蛇毒酶液的冻干品；将精制蛇毒酶液的冻干品经脱盐得到蛇毒凝血酶II级酶制品溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于精制蛇毒酶液冻干品脱盐所用层析柱为G-75柱；所述全部提取过程在10±2℃的GMP环境中进行。
9.一种凝血药，它的活性成分是蛇毒凝血酶，该凝血酶自白眉蝮蛇蛇毒中提取；它的SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。
10.一种生产凝血药的方法，是将白眉蛇毒凝血酶II级酶制品溶液及其佐剂进行过滤、分装、冷冻、干燥灌封得到的；所述佐剂为甘露醇、水解明胶及注射用水，各种成分的重量(体积)份数比为25％甘露醇125(体积)水解明胶0.5(重量)注射用水350(体积)凝血酶II级酶制品溶液25(体积)。
全文摘要
本发明公开了一种蛇毒凝血酶及其生产方法与应用。本发明所提供的蛇毒凝血酶，自白眉蝮蛇蛇毒中提取；该凝血酶的SDS－聚丙稀酰胺凝胶电泳呈三条带，三条带的分子量分别为54000D，34000D及15000D。本发明生产蛇毒凝血酶的方法，包括如下步骤(1)取白眉蝮蛇蛇毒，用缓冲液溶解，离心沉淀，酚饱和溶液洗脱，得到蛇毒凝血酶I级酶制品；(2)将所得的蛇毒凝血酶I级酶制品用缓冲液溶解，再经离子交换柱层析，用缓冲液洗脱，得精制蛇毒酶液。本发明的凝血药物毒性极弱，临床使用安全，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N9/74GK1548534SQ03131420
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月13日 优先权日2003年5月13日
发明者于洪儒 申请人:锦州泰康生物工程有限责任公司