用maoC基因制备聚羟基链烷酸酯的方法

专利名称：用maoC基因制备聚羟基链烷酸酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种用maoC基因制备聚羟基链烷酸酯(以下所述的PHA)的方法。更具体而言，本发明涉及一种maoC基因，一种具有烯酰-CoA水合酶活性的蛋白质，以及一种采用含有maoC基因的重组载体和含有PHA合成基因的重组载体转化的微生物制备PHA的方法。
背景技术：
PHA是一种聚酯型化合物，当微生物体内存在过量的碳而缺少其它营养物质，如磷、氮、镁和氧时，PHA在微生物体内积聚以充当碳源。由于PHA具有与源自汽油的合成聚合物相似的物理性质，并且具有完全的生物降解性，因此其被认为可作为从前所使用的合成塑料的替代物。
通常，将PHA分成含几个碳原子的短链PHA(SCL-PHA)和含较多碳原子的中链PHA(MCL-PHA)。与SCL-PHA相比，MCL-PHA的物理性质更接近于合成的聚合物，于是对MCL-PHA的研究就积极地展开了。在微生物体内形成PHA需要多种酶能够将微生物代谢物转变成PHA单体的酶以及能够从PHA单体合成PHA聚合物的PHA合成酶。已知的能提供PHA单体的酶包括发现于Aeromonas sp.微生物和Pseudomonas sp.微生物的(R)-特定的烯酰-CoA水合酶，和在E.coli和Pseudomonas sp.微生物中发现的3-酮酯酰-ACP还原酶(Fukui et al.，J. Bacteriol.，180667-73，1998；Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184193-8，2000；Taguchi et al.，FEMS Microbiol.Lett.，176183-90，1999；Ren et al.，J. Bacteriol.，1822978-81，2000；and Park et al.，FEMS Microbiol.Lett.，214217-22，2002)。
同时，有报道说MCL-PHA合成酶基因是从Pseudomonas sp.微生物克隆得到的，而且MCL-PHA能够用该基因转化的重组微生物合成得到(Qi etal.，FEMS Microbiol.Lett.，157155-62，1997；Qi et al.，FEMS Microbiol.Lett.，16789-94，1998；Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150303-9，1997；WO 01/55436；USP 6,143,952；WO 98/54329；and WO 99/61624).而且还有报道，即利用一种重组的E.coli也能够产生MCL-PHA，该重组的E.coli缺失脂肪酸降解途径中的酶FadB(Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150303-9，1997)。
另一方面，由于有报道说当采用缺失fadB基因的重组E.coli时，FadB的同源酶YfcX也能够提供PHA单体(Snell et al.，J. Bacteriol.，1845696-5705，2002)，还预言了除YfcX以外还存在能提供PHA单体的酶系。由于采用缺失fadB基因的重组E.coli能够有效得制备MCL-PHA，因此仍然继续努力去发现在缺失fadB基因的重组E.coli中提供PHA单体的酶，但至今未见具体的结果。
因此，仍需要在E.coli中找到新的能提供PHA单体的酶。

发明内容
为了在E.coli中找到了提供PHA单体的新酶，本发明人进行了深入细致的研究，结果发现，一种由E.coli基因maoC表达的蛋白质能够作为在缺失fadB基因的重组E.coli中提供PHA单体的酶，该蛋白质的其它功能还不清楚。本发明即建立在这一基础上。
本发明的目的是提供一种maoC基因、一种maoC蛋白质、一种含有maoC基因的重组载体和一种用重组载体转化的微生物。
本发明的另一个目的是提供用maoC基因制备中链PHA的方法。
为达到上述目的，本发明的一个方案是提供一种maoC基因，其编码由SEQ ID NO1表示的MaoC蛋白。
本发明的另一个方案提供了一种maoC基因，其具有DNA序列为SEQID NO2，并编码能提供合成MCL-PHA的单体的蛋白质。
本发明又一个方案提供了含有maoC基因的重组载体。
本发明的再一个方案提供了一种MaoC蛋白，其具有氨基酸序列SEQID NO1，并显示烯酰-CoA水合酶活性。
本发明的进一步方案提供了用重组载体转化的微生物。
本发明中的微生物优选缺失fadB基因并含有PHA合成酶基因。并且，微生物优选用含有PHA合成酶基因的重组载体转化，或含有插入染色体的PHA合成酶的微生物。
本发明的PHA合成酶优选为phaC。
本发明的另一个方案提供了一种制备中链PHA(MCL-PHA)的方法，其包含的步骤为在含有C6-10的碳源培养基中培养转化的微生物，并得到含有6-10个碳原子单体的MCO-PHA。
本发明还提供了MCL-PHA，其通过如上所述的方法制备而得，以使3-羟基辛酸酯(3HO)和3-羟基癸酸酯(3HD)的每一种在MCL-PHA总单体中的含量都超过30％。
Tsuge et al.报道了烯酰-CoA水合酶与Pseudomonas sp.中的PHA合成有关(Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184193-8，2000)。为了在E.coli中找到提供PHA单体的新酶，本发明进行了寻找在E.coli中被表达且具有的氨基酸序列与报道的烯酰-CoA水合酶具有高度同源性的蛋白质的研究。结果发现了具有SEQ ID NO1的MaoC蛋白显示了34％的同源性，并发现具SEQID NO2的基因编码该蛋白。直到目前，MaoC蛋白的确切功能还不清楚，只是报道了每一个maoC和maoA基因含有一个操纵子(operon)(Steinebach etal.，Eur.J. Biochem.，237584-91，1996)。
本发明人预言发现的蛋白质将显示PHA合成中烯酰-CoA水合酶的活性。为了确认该预言，克隆了编码maoC蛋白的MaoC基因。换言之，用E.coli染色体为模板，利用基于E.coli的基因序列合成的寡核苷酸作引物进行PCR，而将maoCEc基因放大(Blattner et al.，Science 2771453-14，1997)。用SacI/XbaI消化放大的maoCEc基因并将其克隆至p10499A的重组载体中，从而构建p10499MaoC载体。将EcoRV/ScaI消化p10499MaoC的基因片段插入PvuII/DraI消化的pACYC184中，由此建立构建了用于表达maoC基因的pACYC104MaoC重组载体。
用EcoRV/SspI消化能够表达PHA合成酶基因的p10499613C2载体，然后插入EcoRV消化的pBBR1MCS中，由此构建了含有PHA合成酶基因的pMCS104613C2重组载体。
根据Jeong and Lee的方法，即将缺失fadB基因的突变体E.coli WB101中的maoC基因去除，由此得到既缺失fadB基因又缺失maoC基因的突变体E.coli WB 106(Jeong and Lee.，Appl. Environ.Microbiol.，684979-85，2002)。
只缺失fabB基因的突变体E.coli WB101能够从具有10个碳原子的癸酸酯制备MCL-PHA，甚至该突变体是用含有PHA合成酶基因的pMCS104613C2转化的，而当fadB基因和maoC基因都缺失的突变体E.coliWB106，仅用pMCS104613C2转化，则不能从具有10个碳原子的癸酸酯制备MCL-PHA。然而，用pMCS104613C2和pACYC104MaoC转化至E.coliWB106而得到的E.coli W3110能够从具有10个碳原子的癸酸酯制备MCL-PHA。
尽管对于培养E.coli的培养基不作特别限制，但优选使用Luria-Bertani(LB)培养基(酵母提取液5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)，该培养基通常被用于培养E.coli.。根据本发明制备的PHA，其得率比用从前的方法高，而且得到了单体3-羟基己酸酯(3HHx)，3-羟基辛酸酯(3HO)和3-羟基癸酸酯(3HD)，尤其是3HO和3HD占单体的大多数。因此，根据本发明制备的PHA比以前方法制备的PHA质量高。
为了测定maoC基因表达的蛋白质的酶活性，构件了表达MaoC蛋白的重组载体pTac99MaoCH，该MaoC蛋白用6个组氨酸作标记，并通过重组载体pTac99MaoCH得到了MaoC-His6-Tag。以巴豆酰-CoA作为底物，测定MaoC-His6-Tag的烯酰-CoA水合酶活性为47.6U/mg。如这里所用，“1U”的定义为每分钟转移1μmol巴豆酰-CoA的酶活性的一个单位。


图1是含有maoC基因的重组载体p10499MaoC的基因图谱；图2是含有maoC基因的重组载体pACYC104MaoC的基因图谱；图3是含有PHA合成酶基因的重组载体pMCS104613C2的基因图谱；图4是含有maoC基因的重组载体pTac99MaoCH的基因图谱。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明进行详细阐述。然而，对于本领域技术人员而言，这些实施例只是用于举例说明，本发明的范围并不受限于此。
实施例1用maoC基因制备产生PHA的重组E.coli
构建缺失fadB基因和maoC基因的突变体E.coli，一种含有E.colimaoC基因的重组载体，和含有MCL-PHA合成酶基因的重组载体。用这些重组载体制得用于制备MCL-PHA的重组E.coli。
实施例1-1缺失fadB基因和maoC基因的突变体E.coli的制备根据常规的方法，用λ噬菌体的红色操纵子将maoC基因从E.coli中去除(Jeong and Lee，Appl.Environ.Microbiol.，684979-85，2002)。
换言之，缺失fadB基因的突变体E.coli WB101是用含有λ噬菌体的红色操纵子的载体pTrcEBG转化的(Jeong and Lee，Appl.Environ.Microbiol.，684979-85，2002)，并加入1mM IPTG以诱导用pTrcEBG转化的E.coliWB101中的红色操纵子的表达，并用该E.coli制备有电穿孔能力的细胞。E.coli WB101是通过将fadB基因从E.coli W3110(KCTC 2223)中去除而得到的(Park et al.，Enzyme Micro.Technol.，3362-70，2003)。
同时，由于maoC基因5’端的60 bp和3’端的60 bp含有类似于抗氯霉素基因的5’端的60 bp和3’端的60 bp的DNA序列，用抗氯霉素基因替代maoC基因能够产生缺失maoC基因的突变体。基于该目的，用pACYC184(New England Biolab，USA)作为模板，引物为MaoCdelf(SEQ ID NO3)和MaoCdelb(SEQ ID NO4)进行30次循环的PCR，其包括在94℃变性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸1分钟，由此得到PCR产物。5’-atgcagcagttagccagtttcttatccggtacctggcagtctggccggggccgtagccgtagcacttcactgacaccctc-3’(SEQ ID NO3)5’-ttaatcgacaaaatcaccgtgctgcctggccaccagcgtcagaattgaataacttattcaggcgtagcacc-3’(SEQ ID NO4)将PCR片段克隆至如上所述制备的可被电穿孔的细胞中，由此得到缺失fadB基因和maoC基因的突变体E.coli WB106。
实施例1-2p10499A和p10499613C2的构建用含有PHA合成酶基因(Matsusaki et al.，J. Bacteriol.，1806459-67，1998)的Pseudomonas sp.61-3的染色体DNA(JCM 10015)作为模板，引物为phaC2Ps-1(SEQ ID NO5)和phaC2Ps-2(SEQ ID NO6)进行30次循环的PCR，其包括在94℃变性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸2分钟，由此得到PCR产物。5’-cgcggatccaataaggagatatctagatgagagagaaaccaacgccg-3’(SEQ ID NO5)5’-cggatccccgggtaccgagctcgaattctcagcgcacgcgcacgtaggta-3’(SEQ ID NO6)通过琼酯糖凝胶电泳分析PCR产物，1.7 kb基因片段对应于phaC2Ps基因。
然后，放大gntT104启动子使PHA合成酶基因继续被表达，用E.coliW3110(ATCC 39936)的染色体基因作为模板，引物为gntT104-1(SEQ ID NO7)和gntT104-2(SEQ ID NO8)，30次循环的PCR包括94℃变性50秒，52℃退火50秒，72℃延伸2分钟(Peekhaus and Conway，J. Bacteriol.，1801777-85，1998)。5’-gactagttgaaaggtgtgcgcgatctcac-3’(SEQ ID NO7)5’-gcggatcccatttgttatgggcgacgtcaattt-3’(SEQ ID NO8)用琼酯糖凝胶电泳对PCT产物进行分析，结果显示400 bp的基因片段。
质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)通过EcoRV/EcoRI进行消化，然后将相同酶消化的gntT104启动子基因片段用T4DNA连接酶连接到pTrc99A质粒上，由此得到p10499A载体(Lee et al.，Biotechnol. Lett.，161247-52，1994)。然后，p10499A载体被EcoRI/HindIII消化，随后将放大的phaC2Ps基因插入至p10499A载体的EcoRI/HindIII识别位点，由此构建了重组表达载体p10499613C2(Park et al.，FEMS Microbiol.Lett.，214217-22，2002)。
实施例1-3含有maoC基因的重组载体的构建首先，根据已知方法将E.coli W3110的染色体DNA分离并纯化(Sambrook et al.，Molecular cloning，2nd ed，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，1989)。利用纯化的E.coli基因序列作为模板，引物为maoC 1(SEQID NO9)和maoC2(SEQ ID NO10)，30次循环的PCR包括在94℃变性50秒，52℃退火50秒，然后在72℃延伸2分钟，由此得到PCR产物。5’-tttcccgagctcatgcagcagttagccagtt-3’(SEQ ID NO9)5’-gctctagattaatcgacaaaatcaccgt-3’(SEQ ID NO10)同时，p10499A载体被SacI/XbaI消化，然后将PCR片段插入至其中，由此构建重组载体p10499MaoC。p10499MaoC重组载体被EcoRV/ScaI消化，并被克隆至PvuII/DraI消化的pACYC184中，由此构建重组载体pACYC104MaoC(见图1和图2)。图1是含有maoC基因的重组载体p10499MaoC的基因图谱，图2是含有maoC基因的重组载体pACYC104MaoC的基因图谱。
实施例1-4含有MCL-PHA合成酶基因的重组载体的构建为了表达MCL-PHA合成酶基因，用EcoRV/SspI消化p10499613C2得到的基因片段被克隆到用EcoRV消化的pBBR1MCS中(Kovach et al.，Gene，166175-6，1995)，由此构建了MCL-PHA合成酶基因重组载体pMCS104613C2(见图3)。图3是含有PHA合成酶基因的重组载体pMCS104613C2的基因图谱。
实施例1-5重组E.coli的制备缺失fadB基因的突变体E.coli WB101和缺失fadB基因和maoC基因的突变体E.coli WB106，用MCL-PHA合成酶基因重组载体pMCS104613C2和MaoC重组载体p10499MaoC以及MaoC重组载体pACYC104MaoC转化，由此产生重组E.Coli菌株WB101(用pMCS104613C2转化)，WB101(用pMCS104613C2+p10499MaoC转化)，WB106(用pMCS104613C2转化)和WB106(用pMCS104613C2+pACYC104MaoC转化)。用重组E.coli W3110作为对照组，其用含有PHA合成酶基因重组载体pMCS104613C2和MaoC表达重组载体p10499MaoC转化正常的E.coli W3110而制得。
实施例2重组E.coli合成MCL-PHA的能力检测为了检测对照组E.coli菌株和实施例1-5制备的测试组菌株WB101(pMCS104613C2)，WB101(pMCS104613C2 +p10499MaoC)，WB106(pMCS104613C2)和WB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)合成MCL-PHA的能力，每一个重组E.coli菌株都在含有2g/l癸酸酯的LB培养基(酵母提取液5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)中培养4天。然后，培养基肉汤以2,500rpm离心15分钟，然后在100℃干燥。根据传统方法，将MCL-PHA从干燥的菌落中分离出来，然后测定MCL-PHA的含量。
为了检测分离后的MCL-PHA的组分，将分离后的MCL-PHA经甲醇分解，使其转变为3-羟基链烷酸甲酯，组分3-羟基丁酸酯(3HB)，3-羟基己酸酯(3HHx)，3-羟基辛酸酯(3HO)，3-羟基癸酸酯(3HD)和3-羟基十二烷酸酯(3HDD)之间的比率通过气相色谱测定(Donan Co.，Korea)。在该方法中，用熔融后的硅胶毛细管柱(Supelco SPBTM-5，30m 0.32mm ID 0.25m film，USA)作为气相柱，苯甲酸(Sigma Chem.Co.，USA)作为内标。测试的结果见下表1。
表1重组E.coli中的MCL-PHA含量及其组分的比率

如上表1的结果，MCL-PHA能够在对照组E.coli菌株，和测试组E.coli菌株WB101(pMCS104613C2)和WB101(pMCS104613C2+p10499MaoC)中产生，但在缺失maoC基因的E.coli菌株WB106(pMCS104613C2)中不产生。然而，由于MCL-PHA在重组的E.coli WB106(pMCS104613C2+pACYC104MaoC)中产生，其中maoC基因已被克隆至缺失maoC基因的该重组E.coli中，可见，maoC基因在MCL-PHA的制备中发挥着重要的作用。
Langenbach et al.报道了用含有phaC1Pa基因的重组载体pBHR71转化的fadB突变体E.coli中可产生MCL-PHA，其含量为细胞干重的21.1％(w/w)(Langenbach et al.，FEMS Microbiol.Lett.，150303-9，1997)。Tsugeet al.报道MCL-PHA产生于重组E.coli菌株，该菌株表达源于Pseudomonas sp.的PHA合成酶基因和源于Pseudomonas sp.的(R)-特定的烯酰-CoA水合酶PhaJ1和PhaJ2，其含量为干细胞重量的14和29％(w/w)，产生的PHA主要含有6个碳原子的单体(Tsuge et al.，FEMS Microbiol.Lett.，184193-8，2000)。
与现有技术相比，本发明能使MCL-PGA的含量(44.6％(w/w))高于现有技术产生的MCL-PGA含量(14，21.1和29％(w/w))。而且，由现有技术制备的MCL-PHA主要包含6个碳原子的单体，而由本发明制备的MCL-PHA包含6-10个碳原子的单体(3HHx，3HO and 3HD)，尤其包含大量的8-10个碳原子的单体(3HO和3HD)。由此可见，由本发明制备的MCL-PHA比由现有技术制备的PHA的应用领域范围明显要大。
实施例3烯酰-CoA水合酶活性的测定如实施例1-2相同的方法制备PCR片段，不同的是用引物His-Tag5’-gctctagattaatggtgatgatggtgatgatcgacaaaatcaccg-3’(SEQ ID NO11)替代maoC引物2。并且将PCR片段插入pTac99A载体中，该载体含有SacI/XbaI消化的tac启动子，由此构建了重组载体pTac99MaoCH(见图4)。pTac99A载体的构建包括，用PvuII/EcoRI消化pKK223-3载体(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)以得到tac启动子，再将tac启动子克隆至PvuII/EcoRI消化的pTrc99A中(Pharmacia Biotech.Co.，Uppsala，Sweden)。图4是含有maoC基因的重组载体pTac99MaoCH的基因图谱。用重组载体pTac99MaoCH转化E.coli DH5α而制备得重组E.coli DH5α(pTac99MaoCH)。E.coli株DH5α在LB培养基中培养一天，并加入1mM IPTG以诱导蛋白质表达。收集菌落，搅匀，利用NTA柱(Qiagen Ni-NTA试剂盒，USA)得到纯化的含有6个组氨酸的MaoC蛋白。
加入纯化的MaoC蛋白和0.25mM作为底物的巴豆酰-CoA，和反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)混合，由于烯酰-CoA水合酶使巴豆酰-CoA水合，使其263nm吸收减弱，从而测得该酶的活性。在该状况下，可以计算出产物烯酰-CoA硫酯的∈263为6700 M-1cm-1。结果，MaoC蛋白显示了烯酰-CoA水合酶作用于巴豆酰-CoA的活性为47.6 U/mg。
正如以上所描述和证明的，功能还没有完全确定的maoC基因用于本发明中，可以以更高的效率得到与从前PHA相比含有更多数目碳原子的高质量PHA。因此，本发明将被广泛用于高质量PHA的制备中。
并且，用E.coli WB101制备PHA，产量最高，尽管单独使用maoC基因也有可能合成PHA，但MCL-PHA能够通过放大的maoC基因和PHA合成酶基因在重组E.coli W3110(对照组)中制备得到，并且该重组E.coliW3110具有正常的脂肪酸降解途径。考虑到PHA通常不能用缺失fadB基因的E.coli从脂肪酸作为碳源的补料分批培养中制备得，本发明制备MCL-PHA的方法通过重组E.coli中maoC基因的放大，仍具有脂肪酸降解的正常途径，能够通过补料分批培养应用于MCL-PHA的大量生产中。
Sequence listing<110>韩国科学技术院<120>用maoC基因制备聚羟基链烷酸酯的方法<130>PI034755C<150>KR10-2003-0025863<151>2003-04-23<160>11<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>681<212>PRT<213>Escherichia coli<400>1Met Gln Gln Leu Ala Ser Phe Leu Ser Gly Thr Trp Gln Ser Gly Arg1 5 10 15Gly Arg Ser Arg Leu Ile His His Ala Ile Ser Gly Glu Ala Leu Trp20 25 30Glu Val Thr Ser Glu Gly Leu Asp Met Ala Ala Ala Arg Gln Phe Ala35 40 45Ile Glu Lys Gly Ala Pro Ala Leu Arg Ala Met Thr Phe Ile Glu Arg50 55 60Ala Ala Met Leu Lys Ala Val Ala Lys His Leu Leu Ser Glu Lys Glu65 70 75 80Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Gln Thr Gly Ala Thr Arg Ala Asp Ser85 90 95Trp Val Asp Ile Glu Gly Gly Ile Gly Thr Leu Phe Thr Tyr Ala Ser100 105 110Leu Gly Ser Arg Glu Leu Pro Asp Asp Thr Leu Trp Pro Glu Asp Glu115 120 125
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<223>PCR Primer<400>11gctctagatt aatggtgatg atggtgatga tcgacaaaat caccg 4权利要求
1.一种编码SEQ ID NO1的MaoC蛋白的maoC基因。
2.根据权利要求1的maoC基因，其具有DNA序列SEQ ID NO2，编码中链聚羟基链烷酸酯(MCL-PHA)合成所需的单体的蛋白质。
3.一种含有权利要求1的基因的重组载体。
4.一种MaoC蛋白，其具有氨基酸序列SEQ ID NO1并显示烯酰-CoA水合酶活性。
5.一种用权利要求3的重组载体转化的微生物。
6.根据权利要求5的被转化的微生物，其缺失fadB基因但含有PHA合成酶基因。
7.根据权利要求6的被转化的微生物，其中该微生物是用含有PHA合成酶基因的重组载体转化的，或PHA合成酶基因被克隆至微生物的染色体中。
8.根据权利要求6的被转化的微生物，其中PHA合成酶基因是phaC。
9.一种制备中链聚羟基链烷酸酯(MCL-PHA)的方法，其包括步骤(i)在含有C6-10碳源的培养基中培养权利要求6的微生物；和(ii)制得含有6-10个碳原子单体的PHA。
10.根据权利要求9的方法制备的MCL-PHA，使其3-羟基辛酸酯和3-羟基癸酸酯的每一种含量都超过30mol％。
全文摘要
本发明涉及一种利用maoC基因制备中链聚羟基链烷酸酯(MCL－PHA)的方法。本发明的MCL－PHA的制备方法包括步骤用maoC基因转化微生物得到转化体，即缺失fadB基因并含有PHA合成酶基因的微生物；在含有C
文档编号C12N1/19GK1539977SQ03132680
公开日2004年10月27日 申请日期2003年9月28日 优先权日2003年4月23日
发明者李相烨, 朴时载 申请人:韩国科学技术院