一种筛选和建立小鼠发育相关基因突变es细胞库的方法

专利名称：一种筛选和建立小鼠发育相关基因突变es细胞库的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种筛选和建立小鼠发育相关基因突变ES细胞库的方法。
背景技术：
大规模筛查发育相关基因突变已被证实为揭示诸如果蝇和线虫等生物体胚胎发育基本遗传规律的重要手段。而这种筛查在哺乳动物中却由于基因组庞大和胚胎发育需要在母体中完成而变得非常困难。而且由于需要饲养大量动物和相对较长的生育期限制了大规模筛查的实施。
小鼠是目前被采用的最接近人类生物学功能的模式动物，在小鼠基因组内进行基因剔除的研究是揭示小鼠基因功能的重要手段，同时这类研究对于理解人类的同源基因提供了非常直接的线索。
ES细胞技术使对哺乳动物的大部分遗传操作在体外实现。目前这种技术最常用于通过在ES细胞同源重组产生基因突变。这种方法可用于已知的预测与发育相关的基因的突变后功能分析。通常，这些基因是经过分析与其他物种发育相关基因同源或含有保守的蛋白功能区域。尽管这种方法对于发育相关候选基因的突变研究非常有效，但是对于大量在分子水平无功能信息提示的基因及未知基因进行规模化研究却不适用。
通过报告载体随机整合到基因组、标签插入位点并产生插入失活突变来发现新基因并揭示其功能的“基因捕获”(gene trapping)技术是建立胚胎干细胞水平的高通量、大规模基因突变并产生遗传修饰小鼠动物模型的一种便利的技术手段。在大规模发育相关基因突变研究中具有广阔前景。
目前已有几种不同的载体应用于产生突变ES细胞库，例如增强子捕获(enhancer trap)、促进子捕获(promoter trap)、基因捕获(gene trap)技术等。但这些技术在应用过程中有一定的局限性。首先，报告基因或选择基因的表达依赖于在胚胎干细胞内表达的内源性基因的调控序列，因而不能“捕获”到在胚胎干细胞不表达的内源性调控序列或基因；其次，随机插入的报告基因在转录剪切后有可能发生读码框移码而不能被识别，致使某些功能基因成“漏网之鱼”。设计新型捕获载体和策略是应用基因“捕获”技术解读基因功能的迫切需要。
因此，本领域迫切需要建立一种利用基因捕获技术建立大规模位点明确的突变小鼠胚胎干细胞(ES)库的方法和筛选鉴定突变基因与小鼠胚胎发育之间关系的方法。

发明内容
本发明的目的就是提供一种建立大规模位点明确的突变小鼠胚胎干细胞(ES)库的方法。
本发明的另一目的是提供用该方法制备的ES细胞库以及该细胞库的用途，尤其是用于筛选与小鼠胚胎发育有关的发育相关基因。
在本发明的第一方面，提供了一种建立突变胚胎干细胞库的方法，包括步骤(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-IRES-EGFP-pA-Prom-Anti-SD式中，SA是RNA剪接的受体序列；ST是串联终止密码子；IRES是内部核糖体进入位点；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；pA是polyA序列；Prom是选自下组的启动子CMV、PGK、LTP；Anti是选自下组的抗性基因Neo、Puro，Hygro，Pac；SD是RNA剪接的供体序列；(b)筛选存活的、带有筛选基因的胚胎干细胞；(c)合并存活的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。
在另一优选例中，所述基因捕获载体中，Prom是启动子PGK；Anti是抗性基因Neo。
在另一优选例中，在步骤(b)和(c)之间还包括步骤(b’)对步骤(b)获得的每种胚胎干细胞抽提其DNA样本和RNA样本，进行保存。
在另一优选例中，在步骤(b’)中还包括对于抽提的DNA样本和RNA样本，测定载体插入位点两侧的基因组DNA序列和cDNA序列，并建立突变ES细胞的信息数据库。
在本发明的第二方面，提供了一种突变胚胎干细胞库，所述胚胎干细胞库含有的胚胎干细胞是基因突变的细胞，且所述的细胞库是用以下方法制备的(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-IRES-EGFP-pA-Prom-Anti-SD式中，SA是RNA剪接的受体序列；ST是串联终止密码子；IRES是内部核糖体进入位点；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；pA是polyA序列；Prom是选自下组的启动子CMV、PGK、LTP；Anti是选自下组的抗性基因Neo、Puro，Hygro，Pac；SD是RNA剪接的供体序列；(b)筛选存活的、带有筛选基因的胚胎干细胞；(c)将存活的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。
在另一优选例中，Prom是启动子PGK；Anti是抗性基因Neo。
在本发明的第三方面，提供了本发明上述突变胚胎干细胞库的用途。一种用途是用于制备突变胚胎干细胞库的基因组DNA和cDNA。在另一优选例中，所述的胚胎干细胞库中的干细胞克隆被用于产生基因突变遗传修饰小鼠。
本发明突变胚胎干细胞库的另一用途是被用于筛选发育相关基因突变的胚胎干细胞克隆。
在另一优选例中，所述的筛选是通过以下方式进行(a)比较ES细胞克隆在培养阶段突变基因在胚胎干细胞水平是否表达，
(b)测定EGFP蛋白的亚细胞定位；和/或(c)确定ES细胞克隆经囊胚注射后，突变基因在胚胎发育过程中表达的组织特异性和时间特异性。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，对基因捕获载体系统进行了优化，构建了新的基因捕获载体，建立了突变ES细胞克隆。结合突变基因位点的鉴定方法、鉴定突变基因在小鼠胚胎发育中的表达及时空特异性的方法，以及突变ES细胞转变为小鼠的方法，本发明的ES细胞库可用于发现新基因、建立基因突变小鼠模型和研究基因与小鼠个体发育的关系及其功能。
具体地，本发明方法采用polyA捕获的原理，所用的基因捕获载体从5′至3′的结构如下SA-ST-IRES-EGFP-pA-Prom-Anti-SD式中，SA是RNA剪接的受体序列；ST是串联终止密码子；IRES是内部核糖体进入位点；EGFP是增强的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein)基因(报告基因)；pA是polyA序列；Prom是启动子，如CMV、PGK、LTP等；Anti是抗性基因，如Neo、Puro，Hygro，Pac抗性基因，它们在构建物中作为筛选基因；SD是RNA剪接的供体序列。
本发明的质粒构建可用常规方法进行。代表性的母本质粒包括pBluescript、puc18/19等常用克隆载体。
各筛选基因可以用在胚胎干细胞中基因启动活性的启动子进行转录，如CMV、PGK、LTP等启动子。
载体5′端连接有RNA剪接的受体序列(SA)，载体的3′端连接有RNA剪接的供体序列(SD)。适用于本发明的SA和SD元件没有特别限制，可以选用本领域已知的各种SA和SD元件。
基因捕获载体导入到胚胎干细胞中可以利用常规方法进行，如假病毒感染法或者电转移法。
导入胚胎干细胞后，本发明的基因捕获载体插入到基因染色体中有4种情况，分别为1)插入到基因的5’调控区，造成基因调控区破坏而不能正常转录下游基因；2)插入在基因外显子区域中，如果该外显子是蛋白编码区域，则造成蛋白编码区被打断而EGFP可能表达；3)插入到基因内含子中，在RNA剪接过程中，EGFP基因将和该内含子的上下游外显子融合成一个mRNA分子，如果该内含子下游的外显子是蛋白编码序列，则造成蛋白编码区被打断而EGFP可能表达；4)插入到基因不编码蛋白的外显子中，如果是插入在基因5’端的非编码区外显子，则产生的RNA将只可能翻译EGFP基因的读框，被插入的基因不能翻译，如果是插入在基因3’端的非编码区，则对基因的功能可能没有影响。
由于捕获载体中所具有的功能序列，可使外源片段插入内源基因与破坏内源基因的功能，同时利用一个受捕获的内源基因表达调控但不受读码框影响的报告基因提示捕获基因表达的时空特异性，可以高效地获得大量含有某一基因功能失活的突变ES细胞克隆并研究突变基因与小鼠胚胎发育之间的关系。
利用每一ES细胞克隆对应的DNA和cDNA，可以采用PCR和RACE的方法确定载体插入基因组的位点及每个ES细胞克隆对应的突变基因，建立发育相关基因胚胎干细胞突变细胞库。此外，根据研究需要，还将突变克隆进行显微注射即可获得该基因插入突变的小鼠品系。
在本发明中，术语“合并”指将各存活的胚胎干细胞放置在一起，构成突变胚胎干细胞库。这种放置可以是(1)将多个存活的胚胎干细胞混合在一起，构成亚库；(2)将各存活的胚胎干细胞的基因组DNA和/或cDNA数据一起放置在信息数据库，而各存活的胚胎干细胞仍然是单独存放；(3)上述放置方法的组合。
利用本发明，将极大地提高基因识别和基因剔除小鼠模型的研究效率，降低研究成本，易形成“工业化”研究格局。这一方法和传统的用同源重组方式进行基因剔除的方法相比，具有高效、经济的特点，特别是免除了需要针对每个基因构建基因打靶载体的繁琐过程。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因捕获载体的构建及其功能本实施例所用的基因捕获载体结构如下SA-ST-IRES-EGFP-pA-PGK-Neo-SD在本实施例中使用的筛选基因是没有PolyA信号的Neo基因；用PGK作为Neo的启动子。载体的3’端连接有RNA剪接的供体序列(SD)，5’端连接有RNA剪接的受体序列(SA)和串联终止密码(ST)以及内部核糖体进入位点(IRES)和报告基因EGFP。
质粒构建方法按常规进行。(如果不给出具体序列，需要稍微补充一下过程。)获得的整个基因捕获载体的序列如SEQ ID NO1所示。
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实施例2突变ES细胞库的建立在本实施例中，采用质粒电转移的方法，将实施例1构建的基因捕获载体导入到ES细胞中，方法如下采用Bio-Rad电转化仪500μF/240V，1.2×107细胞转染30-40ug线性化基因捕获载体质粒，24-36小时后，用含G418(0.3mg/ml)的培养基对上述转染细胞进行培养和单克隆筛选，6-7天后挑出G418抵抗克隆并按是否发绿色荧光分为两类，扩大培养后冻存、裂解制备DNA、RNA。
ES细胞培养按标准方法进行，滋养层细胞为用丝裂霉素处理过的原代培养的转有Neo基因的小鼠胚胎成纤维细胞，从液氮罐中取出一支冻存的ES细胞，迅速投入37℃水浴；用无菌的巴斯德管吸出细胞放入带10ml ES培养液的15mlFalcon离心管中，室温下1000rpm离心5分钟；弃上清，细胞用10ml 1xPBS洗涤一次，同上离心去除上清；用适量培养液重新悬浮细胞，将细胞接种到铺有丝裂霉素处理的滋养层细胞的100mm培养皿中。细胞置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中，保持足够的湿度，每天换新鲜的培养液，直至ES细胞长到合适的密度，这一过程通常需要2-3天；处于对数生长期的ES细胞在收获前约4h更换培养液，用PBS漂洗两遍，加2ml 0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液，室温下消化3-5min，加10ml ES细胞培养液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，移入15ml离心管中，1000rpm离心5min收集细胞，用10ml PBS重悬细胞并计数，经离心后收集细胞，去上清，加适量的PBS使细胞密度达到约1.2×107/ml。取0.8ml上述ES细胞悬液中加入0.1ml含Ca2+和Mg2+的PBS(含约40μg经线性化的基因捕获质粒)，混匀后加到无菌电穿孔杯中，常温的条件下，以240V，500μF的电参数进行单脉冲击发后，重新悬浮在3.0ml ES培养基中接种到2个100mm的平皿中培养。24-36h后进行G418(0.3mg/ml)药物筛选，每天更换培养液，5天后，隔天换液，ES细胞阳性克隆生长6-7d后ES细胞克隆长成肉眼可见的细胞集落，即可观察抗性克隆是否发出绿色荧光并分类挑取。方法如下倒置荧光显微镜激发光场观察平皿中抗性克隆，有绿色荧光的克隆作标记。然后将标记及未标记克隆分别挑取。方法如下吸去培养液，用10ml PBS漂洗一遍，再加入5ml PBS；在显微镜下，用0.2ml的Tip吸取阳性克隆，放入含有20μl 0.1％胰蛋白酶/0.04％EDTA的96孔板(凹底)中消化约5min，轻轻吹打，使细胞分散，转移至已胶原化并已加ES细胞培养基的96孔板中，置培养箱中培养，第二天换液，待细胞长满60％-80％后，传至48孔板培养，待细胞长满60％-80％后，取其中3/4的细胞冻存，余下1/4接种至两仅胶原化的48孔板(无滋养层)中，细胞100％长满后用于抽提基因组DNA和RNA。
实施例3突变ES细胞克隆基因组DNA和RNA的制备对于实施例2中的每个突变ES细胞克隆，从长满有ES细胞的48孔板中吸去培养液，用PBS洗涤一次，每孔加入500μl细胞裂解液(1mg/ml蛋白酶K)，56℃过夜消化，乙醇沉淀，获得基因组DNA样本。
相应制备一份RNA，每孔长满有ES细胞的48孔板中加500μlTrizol，反复吹打几次后收集制备RNA，方法按照Trizol(invitrogen)说明书进行，从而获得RNA样品。
实施例4突变ES细胞克隆基因捕获位点的鉴定对于实施例3中的突变ES细胞克隆基因组DNA，可采用inverse PCR或接头法PCR获得载体插入位点两侧的基因组序列，确定载体插入基因组中的位置。本实施例中采用Sau3AI或MspI消化ES细胞克隆基因组DNA后，在其两端加接头5’HO GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGA(SEQ ID NO2)3’CATGTATAACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTAG OHDNA连接酶连接后利用两对根据载体两端已知序列设计的引物(引物序列antisenseCTG TGG AGA GAA AGG CAA AG(SEQ ID NO3)；sensecga tgc ctgctt gcc gaa ta(SEQ ID NO4))与根据两端接头序列设计的引物(引物序列1GTA CAT ATT GTC GTT AGA ACG CGTA(SEQ ID NO5)；2CGT AAT ACG ACT CACTAT AGG GAGA(SEQ ID NO6))分别配对进行PCR获得载体两端序列以外的内源基因组序列。
对于实施例3中的突变ES细胞克隆RNA，可用3’-RACE和5’-RACE的方法获得载体插入位点两侧的cDNA序列。本实施例中根据Neo3’端序列设计引物(引物序列agc aag att ctg gat tca tcg act gtg g(SEQ ID NO7))进行3’-RACE。根据IRES 5’端序列设计引物，引物序列如下gsp1gca aag ggt cgc tac aga cgt(SEQ ID NO8)gsp2sgcc ctg tct tct tga cga gca(SEQ ID NO9)gsp2ascct cac att gcc aaa aga cgg(SEQ ID NO10)用上述引物进行5’-RACE。3’-RACE和5’-RACE均按照TaKaRa试剂盒说明书进行。
实施例5突变ES细胞克隆序列信息的分析对于实施例4中获得的突变ES细胞克隆基因捕获载体两侧基因组DNA和cDNA序列，进行生物信息学分析，确定被捕获基因，分析预测其基因功能及其是否受影响，发现其中新基因，将以上信息分类汇总，建立数据库，并与突变ES细胞库分类编号对应。
实施例6捕获基因表达的亚细胞定位对于实施例5中分析预测基因功能受损的胚胎干细胞有表达基因突变ES细胞克隆(发绿色荧光克隆为有表达)可进行基因表达的亚细胞定位。方法如下冻存突变ES细胞克隆复苏后培养传至底部放有一无菌盖玻片的6孔板中培养，细胞长到对数生长期时，取出玻片以10％中性甲醛固定，激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光亚细胞水平定位情况并分类记录。
实施例7嵌合体小鼠的建立及捕获基因在嵌合体小鼠表达模式的鉴定对于实施例5中分析预测基因功能受损的突变ES细胞克隆按基因在胚胎干细胞有无表达(发绿色荧光克隆为有表达)分两类进行囊胚注射。囊胚注射方法相同，步骤如下冻存突变ES细胞克隆复苏后培养一周后注射C57小鼠囊胚。每30-40个囊胚注射12-15个ES细胞然后移植到四只假孕第三天的受体母鼠。每一突变ES细胞克隆的两个受体在8.5dpc(胚胎处于早期4-15体节阶段)处死取出胚胎，检测胚胎绿色荧光的分布情况并分类记录，第三只受体直到12.5dpc处死取出胚胎，检测胚胎绿色荧光的分布情况并分类记录，第四只受体母鼠正常怀孕直至小鼠出生并观察嵌合体小鼠毛色判断嵌合率；分析汇总几个时间段记录，同一突变ES细胞克隆起源的超过三只以上嵌合体胚胎呈现相同分布者有效，选出其中重要发育相关基因突变ES细胞克隆起源的嵌合体小鼠继续繁育待表型分析。
实施例8小鼠发育相关基因突变ES细胞数据库的建立分析总结以上发育相关基因突变ES细胞克隆信息，包括序列位点、捕获基因表达的亚细胞定位、捕获基因在嵌合体小鼠表达模式等信息，建立数据库与冻存ES细胞数据库统一。待观察到有意义表型可加入数据库。
讨论本发明提供了一种建立大规模突变ES细胞库和获得特定基因突变的ES细胞克隆的方法，其特点是利用基因捕获与polyA捕获相结合的方法建立小鼠突变ES细胞克隆库。
本发明所有ES细胞克隆在培养阶段能提示突变基因在胚胎干细胞水平是否表达及其亚细胞定位且ES细胞克隆经囊胚注射后经一定方法检测可提示突变基因在胚胎发育过程中表达的组织特异性和时间特异性。
此外，所有ES细胞克隆都相应有一份细胞DNA样本和RNA样本，对于这些样本，可根据载体序列，用PCR方法获得载体插入位点两侧的基因组DNA序列；用3’-RACE和5’-RACE的方法获得载体插入位点两侧的cDNA序列。
根据插入位点两侧的基因组DNA序列和载体插入位点两侧的cDNA序列，可判断载体插入小鼠基因组位点及载体功能区与内源基因拼接融合情况，并经生物信息学分析预测捕获基因功能及其与发育的关系，发现新基因，从而建立发育相关基因突变ES细胞克隆信息数据库。根据信息数据库信息，通过判定每一ES细胞克隆内源基因功能失活情况，可以方便快速地确定其中有意义的突变ES细胞克隆，以建立发育相关基因突变小鼠模型研究其功能。
对于本发明的突变ES细胞克隆，由于保持其体外培养时的未分化状态，因此可经小鼠囊胚显微注射将其转变为特定基因突变的遗传修饰小鼠模型，用于胚胎发育机制、基因功能、疾病发病机制、药物筛选等在体研究等。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海南方模式生物科技发展有限公司上海第二医科大学附属瑞金医院中科院上海生命科学研究院上海第二医科大学健康科学中心上海第二医科大学<120>一种筛选和建立小鼠发育相关基因突变ES细胞库的方法<130>033915<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3067<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3067)<223>基因捕获载体<400>1ccgcggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt 60tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggatagc 120taactgagat cccccgggat ccgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga 180agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg 240tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg 300ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt 360cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac 420cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca 480aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg 540ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg 600ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa 660cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatat 720
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<221>misc_feature<223>接头<400>2gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata ggga44<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>3ctgtggagag aaaggcaaag 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4cgatgcctgc ttgccgaata 20<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5gtacatattg tcgttagaac gcgta 25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6cgtaatacga ctcactatag ggaga 25<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7
agcaagattc tggattcatc gactgtgg 28<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8gcaaagggtc gctacagacg t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9gccctgtctt cttgacgagc a 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>10cctcacattg ccaaaagacg g 2权利要求
1.一种建立突变胚胎干细胞库的方法，其特征在于，包括步骤(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-IRES-EGFP-pA-Prom-Anti-SD式中，SA是RNA剪接的受体序列；ST是串联终止密码子；IRES是内部核糖体进入位点；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；pA是polyA序列；Prom是选自下组的启动子CMV、PGK、LTP；Anti是选自下组的抗性基因Neo、Puro，Hygro，Pac；SD是RNA剪接的供体序列；(b)筛选存活的、带有筛选基因的胚胎干细胞；(c)合并存活的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因捕获载体中，Prom是启动子PGK；Anti是抗性基因Neo。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)和(c)之间还包括步骤(b’)对步骤(b)获得的每种胚胎干细胞抽提其DNA样本和RNA样本，进行保存。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(b’)中还包括对于抽提的DNA样本和RNA样本，测定载体插入位点两侧的基因组DNA序列和cDNA序列，并建立突变ES细胞的信息数据库。
5.一种突变胚胎干细胞库，其特征在于，所述胚胎干细胞库含有的胚胎干细胞是基因突变的细胞，且所述的细胞库是用以下方法制备的(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-IRES-EGFP-pA-Prom-Anti-SD式中，SA是RNA剪接的受体序列；ST是串联终止密码子；IRES是内部核糖体进入位点；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；pA是polyA序列；Prom是选自下组的启动子CMV、PGK、LTP；Anti是选自下组的抗性基因Neo、Puro，Hygro，Pac；SD是RNA剪接的供体序列；(b)筛选存活的、带有筛选基因的胚胎干细胞；(c)将存活的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。
6.如权利要求5所述的细胞库，其特征在于，Prom是启动子PGK；Anti是抗性基因Neo。
7.如权利要求5所述的突变胚胎干细胞库的用途，其特征在于，用于制备突变胚胎干细胞库的基因组DNA和cDNA。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的胚胎干细胞库中的干细胞克隆被用于产生基因突变遗传修饰小鼠。
9.如权利要求5所述的突变胚胎干细胞库的用途，其特征在于，被用于筛选发育相关基因突变的胚胎干细胞克隆。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的筛选是通过以下方式进行(a)比较ES细胞克隆在培养阶段突变基因在胚胎干细胞水平是否表达，(b)测定EGFP蛋白的亚细胞定位；和/或(c)确定ES细胞克隆经囊胚注射后，突变基因在胚胎发育过程中表达的组织特异性和时间特异性。
全文摘要
本发明提供了一种利用基因捕获技术建立大规模位点明确的突变小鼠胚胎干细胞(ES)库的方法和筛选鉴定突变基因与小鼠胚胎发育之间关系的方法。本发明通过对基因捕获载体系统进行了优化，构建了新的基因捕获载体，建立了突变ES细胞克隆。结合突变基因位点的鉴定方法、鉴定突变基因在小鼠胚胎发育中的表达及时空特异性的方法，以及突变ES细胞转变为小鼠的方法，本发明的ES细胞库可用于发现新基因、建立基因突变小鼠模型和研究基因与小鼠个体发育的关系及其功能。
文档编号C12N5/10GK1580249SQ0314207
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月6日 优先权日2003年8月6日
发明者王铸钢, 党素英, 费俭, 孙霞, 麻孙恺 申请人:上海南方模式生物科技发展有限公司, 上海第二医科大学附属瑞金医院, 中国科学院上海生命科学研究院上海第二医科大学健康科学中心, 上海第二医科大学