专利名称：人源甲硫氨酰氨肽酶1的表达方法及它在寻找抗肿瘤药物中应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)的表达方法、活性关键结构要求、高通量筛选方法的建立和用途。该筛选方法可用于发现具有抗肿瘤活性的先导化合物。
背景技术：
在真核细胞的细胞质内，所有蛋白的翻译都起始于N端的甲硫氨酸，然而在原核细胞、线粒体和叶绿体中蛋白的翻译起始于N-甲酰化甲硫氨酸，甲酰化基团一般是在伴随翻译的过程中被去甲酰化酶作用后除去。不论是在真核细胞还是原核细胞中，甲硫氨酰氨肽酶(methionine aminopeptidases，MetAPs)有选择性的切除新生蛋白或多肽链的N端甲硫氨酸。新生蛋白或多肽链N端甲硫氨酸的切除对于蛋白的翻译后修饰以及在细胞的准确定位和功能的正常发挥起着关键的作用。实验证明MetAPs在细胞信号传导、蛋白之间相互作用、肿瘤细胞生长以及细菌和病毒感染等生理病理过程中发挥重要作用。
例如，一些蛋白的N端氨基酸肉豆蔻酰化必需是在该新生蛋白的N端甲硫氨酸去掉的前提下，否则将影响这些蛋白在细胞内的正常功能，如蛋白激酶p60src，磷酸酯酶calcine3-urin B，以及蛋白分泌调节过程中的ADP核糖化因子等(Eur JBiochem.1984；139663-671，Proc Natl Acad Sci USA.1985；824625-4628，Proc Natl AcadSci USA.1988；854620-4624)。
对于原核细胞的生物，甲硫氨酰氨肽酶的存在对于细胞的生存是必需的。研究表明，敲除大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌中的甲硫氨酰氨肽酶的基因，导致细菌生长停止，并且死亡(J Bacteriol.1989；1714071-4072)。
真核生物酵母细胞中发现存在两种类型的甲硫氨酰氨肽酶，分别为ScMetAP1和ScMetAP2。基因敲除实验表明，敲除两者中任一基因可导致酵母细胞生长缓慢，但是不影响其生存；但两基因同时敲除的结果是细胞不再具有生存的能力(Proc Natl Acad Sci USA.1995；9212357-12361)。
在果蝇实验中，dMetAP2基因的突变会引起果蝇眼睛与翅膀发育过程中的缺陷。这表明dMetAP2基因在组织以及器官的发育过程中的蛋白起始翻译或蛋白翻译后加工中可能发挥重要的作用(Mech Dev.1999；8223-28)。
近年来的实验证据确证人源II型甲硫氨酰氨肽酶是抗肿瘤血管生成药物TNP-470在细胞内的直接作用靶点，该药物目前已经进入II期临床试验。该类化合物通过共价修饰HsMetAP2催化区保守氨基酸残基His231，从而抑制该蛋白酶的活性(Proc Natl Acad Sci USA.1998；9515183-15188)。
TNP-470机制的研究，有利于阐明HsMetAP2在血管内皮细胞中的确切功能，为更好的开发抗肿瘤血管药物奠定基础；但是作为与HsMetAP2有着相同底物选择性的同源性酶HsMetAP1，在细胞生长的过程中又发挥什么样的作用？从实验证据来看，HsMetAP2的活性抑制可以选择性地终止内皮细胞的增殖，HsMetAP1的酶活性并不能代偿其中HsMetAP2失去的活性。假如找到一种HsMetAP1的有效抑制剂，可以更清楚的阐明这其中的奥秘，同时也可以观察到HsMetAP1活性的抑制对于细胞生长的影响，进而为寻找具有抗肿瘤活性的先导化合物提供了一条新的途径。
发明内容
本发明目的是建立人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)在原核生物大肠杆菌的表达系统，并纯化得到活性蛋白及它的缺失突变HsMetAP1Δ1-66和HsMetAP1Δ1-135并找出其活性关键结构的要求。
本发明的另一目的是建立HsMetAP1的高通量筛选模型，应用该模型筛选得到活性化合物，这些活性化合物具有抑制肿瘤细胞生长的活性，从而找出人源I型甲硫氨酰氨肽酶与肿瘤之间的关系。
本发明通过下列步骤实施1.HsMetAP1活性蛋白的表达和纯化1)根据GENEBANK数据库公布的HsMetAP1基因序列(AccessionnumberKIA00094)设计引物正向引物5’ATTATAAGAATTCTAATGGCGGCCGTGGAGACGCGG3’反向引物5’ACGGTAGTCGACTTAAAATTGAGACATGAAGTG3’以上引物序列中斜体部分分别为限制性内切酶EcoR I和Sal I的序列，下划线部分分别是目的基因HsMetAP1的编码序列。
2)以人源膀胱细胞ECV304的总RNA为模板做RT-PCR得到该细胞的cDNA。采用1)中的引物和得到的cDNA用PCR方法(94℃变性5分钟，94℃1分钟、52℃1分钟、72℃1分钟30秒30次循环，最后72℃继续延伸10分钟)得到HsMetAP1(385个氨基酸)的编码序列(1155bp)。
3)限制性内切酶EcoR I和Sal I分别酶切质粒载体pGEX-KG(由美国密歇根大学管昆良教授惠赠)和上述2)中得HsMetAP1的PCR产物；低熔点琼脂糖凝胶纯化经双酶切的质粒载体pGEX-KG和PCR产物。
4)T4连接酶连接纯化的质粒载体和PCR产物后转化质粒扩增型大肠杆菌TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上过夜生长得到阳性克隆。挑取3-5个单克隆过夜培养后抽提质粒并用双酶切和PCR的方法验证，最后经DNA测序证实，得到目的基因序列完全正确的pGEX-KG/HsMetAP1重组质粒。
5)将pGEX-KG/HsMetAP1重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Promega，Madison，WI)进行表达。经Ultrospec 4000 UV/Visibale Spectrophotometer仪器(PharmaciaBiotech，Pisacatawatm，NJ)于600nm波长处监测，当大肠杆菌浓度达到0.4-0.6OD时，加入0.5mM的IPTG于30℃诱导表达数小时后收获细胞。
6)配制磷酸缓冲液PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4)，并加入1％的Triton X-100，混匀后，悬浮细胞进行超声破细胞处理。
7)10,000g离心10分钟后收集上清，将含有目的蛋白的上清溶液注射到预先用PBS平衡的GSH-Sepharose亲和层析柱(Pharmacia Biotech，Pisacatawatm，NJ)，然后用PBS充分洗脱不结合的杂蛋白。
8)采用含有10mM还原型谷胱甘肽(reduced Glutathione)的50mM Tris pH8.0溶液洗脱融合蛋白GST-HsMetAP1，收集洗脱液。
9)配制缓冲液(50mM Tris pH8.0，150mM NaCl)，采用55mL HiPrepTM16/10脱盐柱(Pharmacia Biotech，Pisacatawatm，NJ)除去蛋白洗脱液中的谷胱甘肽。
10)在上述9)得到蛋白溶液中加入1.5mM的CaCl2和2μg/mL的凝血酶(thrombin)于4℃酶切过夜。
11)采用GSH-Sepharose亲和层析柱结合酶切后的GST，而不结合的即是目的活性蛋白HsMetAP1。
2.HsMetAP1缺失突变(HsMetAP1 Δ1-66和HsMetAP1 Δ1-135)活性蛋白的表达和纯化设计HsMetAP1 Δ1-66正向引物5’TAGGGAATTCTATGGACTGTGGAAGGTGATATT3’和HsMetAP1 Δ1-135正向引物5’ATCAGAATTCTAATAGAAGGGATGCGACTTGTA3’(其中斜体部分为限制性内切酶序列，下划线部分为编码序列)，结合HsMetAP1反向引物，以HsMetAP1的全长基因为模板，采用PCR的方法(94℃变性5分钟，94℃1分钟、52℃1分钟、72℃1分钟30次循环，最后72℃继续延伸10分钟)得到缺失突变的基因序列。
两种缺失突变型酶的重组质粒构建和目的蛋白纯化方法同上全长蛋白酶的方法。
3.HsMetAP1活性测定方法的建立根据Pei等人的实验结果，大肠杆菌和人源II型甲硫氨酰氨肽酶(EcMetAP1，HsMetAP2)可以水解合成底物Met-S-Gly-Phe的硫酯键，产物Met-SH迅速与过量的DTNB反应，产生的3-羧基-4-硝基硫代苯酚盐在412nm处有特征吸收(ε412＝13600M-1·cm-1)(AnalBiochem.2000，280159-65)。通过检测单位时间内412nm处的的光吸收变化来确定酶活性。
实验结果表明HsMetAP1能够有效切割该硫酯底物Met-S-Gly-Phe，要求的最佳pH值为6.5-7.0，且两价金属钴离子和锌离子都能够激活酶达到较高的水解活性。确定HsMetAP1活性检测体系为50mM MOPS，pH7.0，100μM Met-S-Gly-Phe，1mM DTNB，50μM CoCl2和750nM HsMetAP1，对该底物的酶动力学常数为Km(1.88mM)，kcat(6.5s-1)，kcat/Km(3.5×103M-1s-1)(表1)(Km，kcat确定方法见Anal Biochem.2000，280159-65)。
表1 HsMetAP1野生型酶和缺失突变型酶对底物Met-S-Gly-Phe的酶动力学分析HsMetAP1 variantsKm(mM)kcat(s-1)kcat/Km(M-1s-1)wild-type1.88+/-0.026.47+/-0.473,451HsMetAP1(Δ1-66) 1.28+/-0.0416.61+/-1.13 12,956HsMetAP1(Δ1-135)8.81+/-0.447.31+/-0.180,8294.HsMetAP1活性结构关键要求对缺失突变型酶的性质研究表明1-66序列氨基酸片断较易从全长酶上降解，降解后的HsMetAP1 Δ1-66稳定性增强；对底物Met-S-Gly-Phe的亲和力和转换速率增强，最终导致酶对底物的催化效率提高4倍之多Km(1.28mM)，kcat(16.6s-1)，kcat/Km(1.3×104M-1s-1)。更长片断的缺失突变型酶是源自于HsMetAP1与EcMetAP1之间的同源序列比较，将前者N端与EcMetAP1非同源的1-135片断全部缺失得缺失突变型酶HsMetAP1 Δ1-135；对该酶的动力学分析发现，与前两者全长酶和1-66序列缺失的突变型酶相比较对Met-S-Gly-Phe的切割活性大大减弱(表1)。
分析HsMetAP1的野生型酶和两种缺失突变型酶对一类P1位氨基酸改变底物的水解活性表明HsMetAP1 Δ1-66与野生型酶相似仅具备水解甲硫氨酸起始的底物，但更长片断的缺失突变型酶HsMetAP1 Δ1-135虽然对N末端是甲硫氨酸的正常底物催化效率明显降低，但对N末端非甲硫氨酸替代的底物水解具有较高活性，其中包括Phe-S-Gly-Phe，Val-S-Gly-Phe，Ala-AMC等，可见N端135个氨基酸对HsMetAP1选择性切割底物有着重要的作用。
表2 HsMetAP1野生型酶和缺失突变型酶对不同底物水解活性的比较enzyme activity(μM/min/μM)substrateHsMetAP1 HsMetAP1 Δ1-66 HsMetAP1 Δ1-135Met-S-Gly-Phe43+/-6 146+/-9 18+/-1Leu-S-Gly-Phe0+/-15+/-013+/-2Lys-S-Gly-Phe4+/-11+/-116+/-2Phe-S-Gly-Phe3+/-07+/-126+/-1Pro-S-Gly-Phe3+/-14+/-115+/-0Ser-S-Gly-Phe0+/-03+/-012+/-1Tyr-S-Gly-Phe2+/-14+/-115+/-0Val-S-Gly-Phe4+/-08+/-130+/-2Ala-AMCa2.8+/-0.17.0+/-0.587.3+/-8.2Met-AMCa13.1+/-0.9 21.6+/-0.9 16.9+/-0.7注酶活性分析体系100μL包含50mM MOPS pH7.0，50μM CoCl2，1mM DTNB，500μM各种不同的底物和300-400nM酶，酶活力单位表示为1μM蛋白在1分钟时间内作用于底物产生的μM产物量a荧光底物被酶水解后产生的AMC直接被检测定量(λex＝360nm，λem＝460nm)，活力单位表示为1μM蛋白在1分钟时间内分解底物产生的nM产物量。
5.HsMetAP1高通量筛选模型的建立应用上述活性检测方法，确立高通量筛选条件100μL的反应体系中包括50mMMOPS，pH7.0，50μM CoCl2，100μM Met-S-Gly-Phe，1mM DTNB，750nM HsMetAP1和2μL DMSO。
高通量筛选首先选择20μg/mL的化合物浓度进行初筛，挑取初筛抑制率大于50％的化合物进行稀释，确定其抑制该酶50％活性时所需化合物浓度即IC50。
6.HsMetAP1抑制剂的获得应用上述高通量筛选模型，对5260个纯化合物样品进行大规模筛选，发现13个活性化合物，13个化合物中的12个对HsMetAP1具有很好的抑制作用，且结构是来源于同一结构母核。
7.HsMetAP1抑制剂与抗肿瘤活性对大规模筛选所得到的HsMetAP1抑制剂和经结构改造后的HsMetAP1抑制剂对几株肿瘤细胞的增殖影响和凋亡测试，发现它们具有明显的抗肿瘤细胞生长作用。
Luo288 Luo276 Luo302-3 Liu342筛选并改造得到的几个活性化合物的化学结构表3四个化合物对HsMetAP1活性和三株肿瘤细胞增殖的抑制IC50IC50(μM)compoundMCF-7 MB-MDA-435 A549 HsMetAP1Luo302-3 9.4±0.27.7±1.37.8±0.2 4.6Luo27644.3±7.6 15.5±2.2 37.9±5.5 4.3Luo2887.0±0.210.9±4.4 8.1±0.4 2.5Liu3422.7±0.33.2±1.63.0±0.5 ～100表4四个化合物(40μM)对三株肿瘤细胞(MCF-7，MB-MDA-435和A549)不同时间凋亡率的比较Apoptosis rate of MCF-7(％)compound24h 48h 72hLuo302-3 16.2525.77 38.25Luo27612.6129.28 43.22Luo28812.7931.95 47.47Liu34221.5541.8 52.13Control(-)6.64 6.09 5.51
Apoptosis rate of MB-MDA-435(％)compound24h48h 72hLuo302-3 4.13.863.33Luo2763.73 4.864.26Luo2884.37 4.274.77Liu3425.87.5 11.67Control(-)2.82 3.582.24Apoptosis rate of A549(％)compound24h 48h 72hLuo302-3 N.D.N.D. N.D.
Luo276N.D.11.8121.42Luo288N.D.13.0215.1Liu342N.D.14.8521.74Control(-)N.D.5.74 5.37N.D.未经测试
图1是GENEBANK公布的HsMetAP1基因和蛋白质序列(Accession numberKIA00094)。
图2是重组质粒pGEX-KG/HsMetAP1的构建示意图。
图3是化合物样品(空白圆圈)，100％酶活性对照(黑色圆圈)和阳性抑制剂对照(灰色圆圈)在96孔聚苯丙烯板上的分布。
本发明有益效果本发明的有益效果是在阐明人源I型甲硫氨酰氨肽酶性质的基础上，确定其为新型的肿瘤治疗靶点，以此为基础的筛选方法可用于发展新型的抗肿瘤药物。
具体实施例方式
1.HsMetAP1活性蛋白的表达和纯化1)据GENEBANK数据库公布的HsMetAP1基因序列(Accession numberKIA00094)设计引物正向引物5’ATTATAAGAATTCTAATGGCGGCCGTGGAGACGCGG3’反向引物5’ACGGTAGTCGACTTAAAATTGAGACATGAAGTG3’
以上引物序列中斜体部分分别为限制性内切酶EcoR I和Sal I的序列，下划线部分分别是目的基因HsMetAP1的编码序列。
2)人源膀胱细胞ECV304的总RNA为模板做RT-PCR得到该细胞的cDNA。采用1)中的引物和得到的cDNA用PCR方法(94℃变性5分钟，94℃1分钟、52℃1分钟、72℃1分钟30秒30次循环，最后72℃继续延伸10分钟)得到HsMetAP1(385个氨基酸)的编码序列(1155bp)。
3)限制性内切酶EcoR I和Sal I分别酶切质粒载体pGEX-KG(由美国密歇根大学管昆良教授惠赠)和上述2)中得HsMetAP1的PCR产物；低熔点琼脂糖凝胶纯化经双酶切的质粒载体pGEX-KG和PCR产物。
4)T4连接酶连接纯化的质粒载体和PCR产物后转化质粒扩增型大肠杆菌TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上过夜生长得到阳性克隆。挑取3-5个单克隆过夜培养后抽提质粒并用双酶切和PCR的方法验证，最后经DNA测序证实，得到目的基因序列完全正确的pGEX-KG/HsMetAP1重组质粒。
5)将pGEX-KG/HsMetAP1重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Promega，Madison，WI)进行表达。经Ultrospec 4000 UV/Visbale Spectrophotometer仪器(PharmaciaBiotech，Pisacatawatm，NJ)于600nm波长处监测，当大肠杆菌浓度达到0.4-0.6OD时，加入0.5mM的IPTG于30℃诱导表达5小时后收获细胞。
6)配制磷酸缓冲液PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4)，并加入1％的Triton X-100，混匀后，悬浮细胞进行超声破细胞处理。
7)10,000g离心10分钟后收集上清，将含有目的蛋白的上清溶液注射到预先用PBS平衡的GSH-Sepharose亲和层析柱(Pharmacia Biotech，Pisacatawatm，NJ)，然后用PBS充分洗脱不结合的杂蛋白。
8)采用含有10mM还原型谷胱甘肽(reduced Glutathione)的50mM Tris pH8.0溶液洗脱融合蛋白GST-HsMetAP1，收集洗脱液。
9)配制缓冲液(50mM Tris pH8.0，150mM NaCl)，采用55mL HiPrepTM16/10脱盐柱(Pharmacia Biotech，Pisacatawatm，NJ)除去蛋白洗脱液中的谷胱甘肽。
10)在上述9)得到蛋白溶液中加入1.5mM的CaCl2和2μg/mL的凝血酶(thrombin)于4℃酶切过夜。
11)采用GSH-Sepharose亲和层析柱结合酶切后的GST，而不结合的即是目的活性蛋白HsMetAP1。
2.HsMetAP1缺失突变(HsMetA1 Δ1-66和HsMetAP1 Δ1-135)活性蛋白的表达和纯化设计HsMetAP1 Δ1-66正向引物5’TAGGGAATTCTATGGACTGTGGAAGGTGATATT3’和HsMetAP1 Δ1-135正向引物5’ATCAGAATTCTAATAGAAGGGATGCGACTTGTA3’(其中斜体部分为限制性内切酶序列，下划线部分为编码序列)，结合HsMetAP1反向引物，以HsMetAP1的全长基因为模板，采用PCR的方法得到缺失突变的基因序列。
两种缺失突变型酶的重组质粒构建和目的蛋白纯化方法同上全长蛋白酶的方法。
3.HsMetAP1活性测定方法的具体操作在上述确立HsMetAP1的活性测定体系(50mM MOPS，pH7.0，100μM Met-S-Gly-Phe，1mM DTNB，50μM CoCl2和750nM HsMetAP1)的基础上，活性测定的具体操作为如下将HsMetAP1和CoCl2混合成5×蛋白酶溶液即3.75μM HsMetAP1含有500μM CoCl2，取20μL置于透明的96孔聚苯丙烯板中；制备含有50mM MOPS，pH7.0，100μMMet-S-Gly-Phe，1mM DTNB的混合液，每100μL测活体系中加入80μL以上混合液，酶动力学反应开始；迅速将上述96孔聚苯丙烯板转移至SpectraMax430紫外分光光度计在波长412nm处连续检测产物的产生1分钟。
4.HsMetAP1高通量筛选模型的具体方法称量1mg化合物样品溶解于200μL Me2SO，取20μL加入到96孔聚丙烯板的A2-H11样品孔中，然后加入80μL Me2SO，混合均匀后作为样品母板(图4)。用Biomek 2000自动加样系统取2μL样品转移到96孔聚苯丙烯板中，作为样品子板。6000个待筛选化合物分配在75个样品子板上(样品浓度为1mg/mL)。
在准备好样品的96孔板上，A1-D1和E12-H12样品孔中加入2μL Me2SO作为100％酶活性的样品对照，而E1-H1和A12-D12样品孔中分别加入溶解于Me2SO的不同浓度阳性对照抑制剂。采用Robbins加样系统将80μL反应混合物(含50mM MOPS，pH7.0，100μM Met-S-Gly-Phe，1mM DTNB)加入到待检测的样品板中，5×HsMetAP1蛋白酶溶液(3.75μM HsMetAP1含有500μM CoCl2)20μL的加入使催化反应开始，60秒时间内检测并记录酶动力学曲线的变化。
权利要求
1.一种人源I型甲硫氨酰肽酶(HsMetAP1)及它的缺失突变(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表达方法，包括如下步骤(1)设计不同的正、反向引物；(2)以人源膀胱细胞ECV304的总RNA为模板用RT-PCR方法得该细胞的cDNA，利用上述设计的引物和得到的cDNA用PCR方法得到HsMetAP1的编码序列；(3)用内切酶EcoR I和Sal I双酶切质粒载体pGEX-KG用T4连接酶连接、纯化得重组质粒pGEX-KG/HsMetAP1；(4)将上述重组质粒转化入大肠杆菌表达，经提取、纯化得活性蛋白HsMetAP1或HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135。
2.根据权利要求1所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突变(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表达方法，其特征在于用于HsMetAP1设计的不同引物为正向引物5’ATTATAAGAATTCTAATGGCGGCCGTGGAGACGCGG3’反向引物5’ACGGTAGTCGACTTAAAATTGAGACATGAAGTG3’。
3.根据权利要求1所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突变(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表达方法，其特征在于将双酶切质粒载体PGEX-KG用T4连接酶连接HsMetAP1或它的缺失突变的基因序列，纯化得重组质粒PGEX-KG/HsMetAP1或它的缺失突变。
4.根据权利要求3所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突变(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表达方法，其特征在于T4连接酶连接纯化的质粒载体与PCR产物后转化质粒扩增型大肠杆菌在含氨苄青霉素LB平板上生长得阳性克隆，再挑出单克隆培养抽提质粒用双酶切及PCR方法验证，DNA测序得纯化的PGEX-KG/HsMetAP1或它的缺失突变的重组质粒。
5.根据权利要求1所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突变(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表达方法，其特征在于纯化的重组质粒PGEX-KG/HsMetAP1或它的缺失突变转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达，收获细胞、破细胞加入缓冲液混匀液，离心收集上清，提取纯化得活性蛋白HsMetAP1或它的缺失突变。
6.根据权利要求1所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突变(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表达方法，其特征在于利用该方法进行抗肿瘤药物的高通量的筛选。
全文摘要
本发明公开了一种人源I型甲硫氨酰氨肽酶HsMetAP1在原核生物大肠杆菌的表达系统，并纯化得到活性蛋白并找到了其活性关键结构的要求；本发明公开了建立HsMetAP1的高通量筛选模型，应用该模型筛选得到活性化合物，找到了活性化合物具有抑制肿瘤细胞生长的活性，以及人源I型甲硫氨酰氨肽酶与肿瘤之间的关系。
文档编号C12N9/48GK1609221SQ20031010802
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月20日 优先权日2003年10月20日
发明者李佳, 南发俊, 叶其壮, 李静雅, 罗群力, 陈玲玲, 崔永梅 申请人:中国科学院上海药物研究所