专利名称：海洋小单孢菌抗菌类群的分离检出方法
技术领域：
本发明涉及一种小单孢菌的分离检出方法，尤其是一种能够选择性地把海洋小单孢菌抗菌类群分离检出的方法。
背景技术：
小单孢菌(Micromonospora)是放线菌中的一个稀有属，通常以较少的数量存在于土壤，海洋等生境中。近年来，由于该属能够产生各种抗菌抗肿瘤的活性物质而广泛受到人们的注意。
杨宇容(杨宇容，云南大学学报，1997，19(4)403-408，以下称文献1)报道了包括小单孢菌在内的稀有放线菌的分离技术，但采用的YIM培养基的分离数通常较低。李文均(李文均，国外医药抗生素素分册，2002，23(1)18-22，以下称文献2)推荐了土壤风干、苯酚处理和HV(+萘啶酸+衣酸)方法。上述文献未涉及抗菌菌株的检出技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够选择性地分离海洋小单孢菌，并根据菌株的颜色特征快速获得抗菌类群的方法。
本发明的步骤为1)样品制备样品风干15天以上，粉碎，过40～80目筛，110～120℃干热处理1～2h，称取样品溶解于相当于样品5～15倍的无菌水中，加入终浓度为0.8％～1.2％的苯酚，35～45℃水浴20～30min，室温静置，上部菌悬液用于分离。
2)配置改良高氏一号培养基可溶性淀粉1％～3％，KNO30.5％～1.5％，K2HPO40.04％～0.06％，MgSO40.04％～0.06％，琼脂1.5％～2％，余为陈海水。常规高压灭菌20～30min。
3)配置重铬酸钾(K7Cr2O7)溶液；放线菌酮溶液。分别用微孔滤膜过滤除菌。
4)倒平板取刚灭完菌的培养基，使培养基中的K7Cr2O7溶液和放线菌酮的终浓度分别为50～100ppm，倒平板。
5)小单孢菌分离取制备好的上述菌悬液于凝固的平板上，用无菌涂抹棒涂抹分散细胞，常温倒置培养14～21天。
6)斜面转接取分离平板上粉红色的小菌落，转接于伊英逊斜面，1周后涂散菌落，继续培养7～14天即可获得成熟的菌株。
原料气一览表
上表中，L表示“升”，m表示“米”，h表示“小时”。
采用上述工艺控制方法，可以使工件最表层渗入少量活性氮原子，从而增加工件最表层的淬透性以减少非马氏体组织。
为进一步说明本发明的上述目的、工艺特点和效果，以下将对本发明进行详细的描述。
(4)具体实施方式
以下将对本发明非马氏体的工艺控制方法的技术方案和实施进行详细描述。
渗碳淬火工件进炉经排气区到渗碳区，由于加热速度和周围气氛的关系，在到达渗碳区前，工件表层易形成氧化膜，此种晶界氧化是造成非马氏体组织的重要原因之一，即气氛中的H2O和CO2分解形成的氧原子在最外层形成氧化物后，接着沿晶界扩散，晶粒内的合金元素向晶界的氧扩散，并在此形成氧化物，造成氧化物附近基体合金元素减少，从而淬透性降低，易形成非马氏体组织。因此，本发明的非马氏体的工艺控制方法，其工序如下(1)装架，并去除工件的锈斑；(2)清洗，去除工件油渍、表面附着物；(3)热炉内预先排气，按表一的原料气一览表所列的参数在炉内预先排气，注意保持原料气纯度、氨气的干燥度和流量；(4)热炉进工件；(5)对上述工件进行渗碳；(6)在热炉内通15至60分钟的氨气，注意氨气的干燥度和流量，此工抗菌活性测定的比较结果。
表4不同检出技术获得小单孢菌的抗菌比例(测定方法扩散法)
具体实施方式
实施例11)制备样品样品风干15天，粉碎，过50目筛，120℃干热处理1.2h，称取5g溶解于45ml无菌水中(动植物体和腐烂植物残体匀浆机匀浆处理)，加入终浓度为1％的苯酚，40℃水浴(间歇振荡)20min，室温静置5min，上部菌悬液用于分离。
2)配置改良高氏一号培养基可溶性淀粉2％，KNO30.5％，K2HPO40.04％，MgSO40.06％，琼脂1.5％，余陈海水。121℃灭菌25min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放线菌酮0.5％溶液。分别用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。
4)倒平板取刚灭完菌的培养基，使培养基中的K7Cr2O7溶液和放线菌酮的终浓度分别为80ppm、60ppm，倒平板。
5)小单孢菌分离取0.2mL制备好的上述菌悬液于凝固的平板上，用无菌涂抹棒涂抹分散细胞，26℃倒置培养20天。
6)斜面转接取分离平板上粉红色的小菌落，转接于伊英逊斜面，一周后涂散菌落，继续培养10天即可获得成熟的菌株。
7)培养成熟后，挑取带紫红色的菌株，75％的这类菌株中具有抗菌活性。
实施例21)制备样品样品风干18天，粉碎，过80目筛，115℃干热处理1.5h，称取5g溶解于25ml无菌水中(动植物体和腐烂植物残体匀浆机匀浆处理)，加入终浓度为0.8％的苯酚，45℃水浴(间歇振荡)25min，室温静置10min，上部菌悬液用于分离。
2)配置改良高氏一号培养基可溶性淀粉3％，KNO31.5％，K2HPO40.05％，MgSO40.05％，琼脂2％，余陈海水。121℃灭菌20min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放线菌酮0.5％溶液。分别用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。
4)倒平板取刚灭完菌的培养基，使培养基中的K7Cr2O7溶液和放线菌酮的终浓度分别为50ppm、100ppm，倒平板。
5)小单孢菌分离取0.2mL制备好的上述菌悬液于凝固的平板上，用无菌涂抹棒涂抹分散细胞，25℃倒置培养16天。
6)斜面转接取分离平板上粉红色的小菌落，转接于伊英逊斜面，一周后涂散菌落，继续培养7天即可获得成熟的菌株。
7)培养成熟后，挑取带紫红色的菌株，80％的这类菌株中具有抗菌活性。
实施例31)制备样品样品风干20天，粉碎，过40目筛，118℃干热处理2h，称取5g溶解于70ml无菌水中(动植物体和腐烂植物残体匀浆机匀浆处理)，加入终浓度为1.2％的苯酚，35℃水浴(间歇振荡)30min，室温静置8min，上部菌悬液用于分离。
2)配置改良高氏一号培养基可溶性淀粉1％，KNO31％，K2HPO40.05％，MgSO40.04％，琼脂1.5％，余陈海水。121℃灭菌30min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放线菌酮0.5％溶液。分别用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。
4)倒平板取刚灭完菌的培养基，使培养基中的K7Cr2O7溶液和放线菌酮的终浓度分别为100ppm、50ppm，倒平板。
5)小单孢菌分离取0.2mL制备好的上述菌悬液于凝固的平板上，用无菌涂抹棒涂抹分散细胞，24℃倒置培养21天。
6)斜面转接取分离平板上粉红色的小菌落，转接于伊英逊斜面，一周后涂散菌落，继续培养12天即可获得成熟的菌株。
7)培养成熟后，挑取带紫红色的菌株，70％的这类菌株中具有抗菌活性。
实施例41)制备样品样品风干25天，粉碎，过60目筛，110℃干热处理1.3h，称取5g溶解于40ml无菌水中(动植物体和腐烂植物残体匀浆机匀浆处理)，加入终浓度为1％的苯酚，40℃水浴(间歇振荡)25min，室温静置4min，上部菌悬液用于分离。
2)配置改良高氏一号培养基可溶性淀粉2.5％，KNO31％，K2HPO40.06％，MgSO40.05％，琼脂2％，余陈海水。121℃灭菌25min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放线菌酮0.5％溶液。分别用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。
4)倒平板取刚灭完菌的培养基，使培养基中的K7Cr2O7溶液和放线菌酮的终浓度分别为70ppm、80ppm，倒平板。
5)小单孢菌分离取0.2mL制备好的上述菌悬液于凝固的平板上，用无菌涂抹棒涂抹分散细胞，26℃倒置培养14天。
6)斜面转接取分离平板上粉红色的小菌落，转接于伊英逊斜面，一周后涂散菌落，继续培养14天即可获得成熟的菌株。
7)培养成熟后，挑取带紫红色的菌株，75％的这类菌株中具有抗菌活性。
实施例51)样品制备海洋底泥样品风干15天，粉碎，过50目筛，120℃干热处理1h，称取5g溶解于45ml无菌水中(动植物体和腐烂植物残体匀浆机匀浆处理)，加入终浓度为1％的苯酚，40℃水浴(间歇振荡)20min，室温静置5min，上部菌悬液用于分离。
2)配置改良高氏一号培养基可溶性淀粉2％，KNO31％，K2HPO40.05％，MgSO40.05％，琼脂2％，陈海水95％。121℃灭菌20min。
3)配置K7Cr2O70.5％溶液；放线菌酮0.5％溶液。分别用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。
4)倒平板取刚灭完菌的培养基，每100mL培养基分别加入1mL的0.5％K7Cr2O7溶液和1mL的0.5％溶液。摇匀，倒平板。
5)小单孢菌分离取0.2mL制备好的上述菌悬液于凝固的平板上，用无菌涂抹棒涂抹分散细胞，26℃倒置培养16天。
6)斜面转接取分离平板上粉红色的小菌落，转接于斜面，一周后涂散菌落，继续培养10天即可获得成熟的菌株。
7)培养成熟后，挑取带紫红色的菌株用于抗菌活性的研究，80％的这类菌株中具有抗菌活性。
实施例61)样品制备海藻类植物样品风干30天，粉碎，过40目筛，120℃干热处理1.5h，称取5g溶解于30ml无菌水中(动植物体和腐烂植物残体匀浆机匀浆处理)，加入终浓度为1％的苯酚，50℃水浴(间歇振荡)30min，室温静置5min，上部菌悬液用于分离。
2)置改良高氏一号培养基可溶性淀粉3％，KNO30.5％，K2HPO40.05％，MgSO40.05％，琼脂2％，陈海水50％，自来水44.5％。121℃灭菌20min。
3)置K7Cr2O70.5％溶液；放线菌酮0.5％溶液。分别用0.2μm的微孔滤膜过滤除菌。
4)倒平板取刚灭完菌的培养基，每100mL培养基分别加入2mL的0.5％K7Cr2O7溶液和2mL的0.5％溶液。摇匀，倒平板。
5)单孢菌分离取0.2mL制备好的上述菌悬液于凝固的平板上，用无菌涂抹棒涂抹分散细胞，24℃倒置培养21天。
6)斜面转接取分离平板上粉红色的小菌落，转接于斜面，一周后涂散菌落，继续培养10天即可获得成熟的菌株。
7)培养成熟后，挑取带紫红色的菌株用于抗菌活性的研究，75％的这类菌株中具有抗菌活性。
权利要求
1.海洋小单孢菌抗菌类群的分离检出方法，其特征在于其步骤为1)样品制备样品风干15天以上，粉碎，过40～80目筛，110～120℃干热处理1～2h，称取样品溶解于相当于样品5～15倍的无菌水中，加入终浓度为0.8％～1.2％的苯酚，35～45℃水浴20～30min，室温静置，上部菌悬液用于分离；2)配置改良高氏一号培养基可溶性淀粉1％～3％，KNO30.5％～1.5％，K2HPO40.04％～0.06％，MgSO40.04％～0.06％，琼脂1.5％～2％，余为陈海水；常规高压灭菌20～30min；3)配置重铬酸钾(K7Cr2O7)溶液；放线菌酮溶液。分别用微孔滤膜过滤除菌；4)倒平板取刚灭完菌的培养基，使培养基中的K7Cr2O7溶液和放线菌酮的终浓度分别为50～100ppm，倒平板；5)小单孢菌分离取制备好的上述菌悬液于凝固的平板上，用无菌涂抹棒涂抹分散细胞，常温倒置培养14～21天；6)斜面转接取分离平板上粉红色的小菌落，转接于伊英逊斜面，1周后涂散菌落，继续培养7～14天即可获得成熟的菌株；7)培养成熟后，挑取带紫红色的菌株。
2.如权利要求1所述的海洋小单孢菌抗菌类群的分离检出方法，其特征在于在步骤1中，样品风干粉碎后过40～50目筛。
3.如权利要求1所述的海洋小单孢菌抗菌类群的分离检出方法，其特征在于在步骤2中K2HPO40.05％，MgSO40.05％，琼脂2％，余为陈海水。
4.如权利要求1所述的海洋小单孢菌抗菌类群的分离检出方法，其特征在于在步骤3中配置K7Cr2O70.5％溶液；放线菌酮0.5％溶液，分别用0.2μm微孔滤膜过滤除菌。
全文摘要
涉及一种能够选择性地把海洋小单孢菌抗菌类群分离检出的方法。其步骤为制备样品，取上部菌悬液用于分离；配置培养基；配置重铬酸钾(K
文档编号C12Q1/04GK1626670SQ200310124158
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月12日 优先权日2003年12月12日
发明者黄耀坚, 郑忠辉, 徐庆妍, 宋思杨, 苏文金 申请人:厦门大学