专利名称：控制共聚聚酯组成的培养方法
技术领域：
本发明涉及控制由微生物产生的共聚聚酯组成的培养方法。
背景技术：
在多数的微生物中，在菌体内储存聚酯作为能量储备物质现在已经公知。其代表例是聚-3-羟丁酸(以下简称P(3HB))。P(3HB)是热塑性高分子，在自然环境中被生物分解，因此，作为对环境无害的绿色塑料而受到关注。但是由于P(3HB)的结晶度高，而且具有坚硬、易碎的性质，因此从实用性考虑，其应用范围受到限制。因此，一直以来都在开展以改善其性质为目的的研究。
其中，开发了包含3-羟丁酸(以下简称3HB)和3-羟戊酸(以下简称3HV)的共聚物P(3HB-co-3HV)的制造方法(特开昭57-150393号公报；特开昭59-220192号公报；特表平11-500008号公报)。一般认为，该P(3HB-co-3HV)与P(3HB)相比，其富有柔软性，因此能够应用于广泛的用途。在这些专利文献中的共聚物的制造方法，与以前的P(3HB)的制造方法同样地在前期使菌体增殖，在后期限制氮或磷培养微生物，从而制造共聚物。另外，对于P(3HB-co-3HV)，随着3HV含有率的增加柔韧性会发生变化，因此，还一直在进行控制3HV的组成比的研究。例如，在特开昭57-150393号公报或者特开昭63-269989号公报中使用丙酸，另外，在特公平7-79705号公报中使用丙烷-1-醇，并通过改变向这些培养基中的添加量而使3HV的含有率变化，从而制造3HV含有率为10-90mol％的P(3HB-co-3HV)。然而，在实际的情况中，即使增加P(3HB-co-3HV)的3HV的含有率，随之产生的物性的变化也很小，尤其柔韧性也不会提高至能够满足用于薄膜等使用的程度，因此，只能用于洗发剂瓶或者一次性剃刀的手柄等硬成型品领域。
在这样的状况下，为了克服上述3HB和3HV的共聚物的缺点，对含有3HB和3HV以外的羟基酸，例如3-羟基丙酸(以下简称3HP)、3-羟基己酸(以下简称3HH)、3-羟基辛酸(以下简称3HO)、3-羟基壬酸(以下简称3HN)、3-羟基癸酸(以下简称3HD)、3-羟基月桂酸(以下简称3HDD)等作为构成成分的共聚聚酯进行了积极地研究(Poirier Y.，Nawrath C.，Somerville C，BIO/TECHNOLOGY，13，142-150，1995年)。其中，应该关注的是对于含有3HB和3HH的共聚聚酯，特别是仅含3HB和3HH的共聚物P(3HB-co-3HH)及其制备方法的研究(特开平5-93049号公报；特开平7-265065号公报)。这些专利文献的P(3HB-co-3HH)的制造方法是使用由土壤分离的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)，并由油酸等脂肪酸或者橄榄油等油脂进行发酵生产的方法。另外，还开展了对于P(3HB-co-3HH)性质的研究(Y.Doi，S.Kitamura，H.Abe，Macromolecules 28，4822-4823，1995年)。在该报道中，把碳原子数12或12以上的脂肪酸作为唯一的碳源培养豚鼠气单胞菌(A.caviae)，并发酵生产3HH含有率为11-19mol％的P(3HB-co-3HH)。其结果很明显，随着3HH含有率的增加，该P(3HB-co-3HH)由P(3HB)坚硬、易碎的性质逐渐显示出柔韧的性质，并显示出超过P(3HB-co-3HV)的柔韧性。
另外，还报道了下列技术，克隆豚鼠气单胞菌(A.caviae)的聚羟基链烷酸(PHA)合酶基因，将该基因重组到具有90％或90％以上的高聚羟基丁酸(PHB)蓄能的真养罗尔斯通属(R.eutropha)，使用所得重组菌株，以脂肪酸作为碳源而生产P(3HB-co-3HH)(T.Fukui，Y.doi，J.Bacteriol.，vol.179，No.15，4821-4830，1997年；特开平10-108682号公报)。其中，报道了通过把辛酸钠作为碳源，从而能够生产3HH含有率为10-20mol％的P(3HB-co-3HH)。此外，最近在使用上述重组菌株生产聚酯的时候，还公开了使用多种碳源的方法，并且现已知道作为碳源使用的油脂或者脂肪酸的碳原子数对于P(3HB-co-3HH)的3HH合有率有所影响(特开2001-340078号公报)。
现在普遍认为，如果能够在较大的任意范围内控制P(3HB-co-3HH)等共聚聚酯的单体单元的组成比，尤其是控制3HH含有率制造共聚物的话，就可以由生产的坚硬共聚物直到能够发酵生产柔软的共聚物，并可以期待应用于从电视机壳体等要求有硬度的物体，直到要求丝或薄膜等柔韧性物体的广泛领域。
如上所述，对于P(3HB-co-3HH)等共聚聚酯，从实现实用化、商业化以及满足消费者要求的方面来看，确立能够任意控制其组成比的技术是最重要的。另一个成为实用化障碍的是生产成本问题。与此相对，在以前的共聚聚酯的制造方法中，为了聚合3HB以外的单体单元或者为了提高其含有率，需要向培养基中添加高价的特定的脂肪酸(特表平11-500008号公报；特开2001-340078号公报)。此外，在P(3HB-co-3HH)的情况下，在已经公开的任何方法中，菌体的产率都很低，而且为了提高3HH含有率，不但需要高价的碳源还存在产率下降的趋势，因此，以前的方法不能作为使该聚合物实用化的生产方法而进行应用。如上所述，控制共聚聚酯单体单元的组成比对于将其应用于广泛领域是必不可少的。因此，期待着开发一种能够低成本地实现高的菌体产率和聚合物含量，且任意地控制共聚聚酯组成的生产方法。
发明概述鉴于上述现状，本发明提供一种能够控制生物降解性共聚聚酯的组成，且低成本地实现高产率的生产方法。
本发明者进行了各种研究，特别对发酵原料、价格、供应稳定性、质量稳定性、菌体或者聚合物的收率等进行了研究，其结果是成功地实现了使用廉价油脂作为碳源的培养基，培养储备共聚聚酯的微生物，并且保持高产率，而且，即使不使用高价脂肪酸等作为碳源，也能够把聚合物组成良好地控制在任何范围内。
即，本发明的要点是涉及当使用微生物生产共聚聚酯时，在整个培养期间把作为碳源使用的油脂的比基质供给速率(比基質供給速度)控制为定值的培养方法，或者将培养时期分成菌体增殖期和聚酯储备期2个阶段，并在各个阶段把比基质供给速率控制为定值的培养方法。进一步涉及通过选择油脂种类和/或油脂的比基质供给速率的控制值，任意地控制生成的共聚聚酯组成的培养方法。
发明详述以下，详细地描述本发明。
本发明的控制共聚聚酯组成的培养方法，其特征在于，利用微生物生成共聚聚酯，在整个培养期间把作为碳源使用的油脂的比基质供给速率控制为定值，或者将培养时期分成菌体增殖期和聚酯储备期2个阶段，并在各个阶段把比基质供给速率控制为定值。如上所述，本培养方法应用于使用微生物生产生物降解性共聚聚酯的时候。
对于本发明培养方法能够应用的共聚聚酯，没有特别地限制，是使至少2种单体单元聚合得到的共聚聚酯。该共聚聚酯的代表性物质，具体地可以列举包含3HB和3HH的共聚聚酯P(3HB-co-3HH)或者包含3HB和3HH和3HV三种成分的共聚物以及包含由假单胞菌属(Pseudomonas)细菌产生的3HB、3HH、3HO、3HD、3HDD等多成分作为其构成要素的共聚物(I.K.P.Tan，K.S.Kumar，M.Theanmalar，S.N.Gan，B.Gordon III，Appl.Microbiol.Biotechnol.47，207-211，1997；R.D.Ashby，T.A.Foglia，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49，431-437，1998)。其中，从通过改变共聚聚酯单体单元的组成比特别是改变3HH的含有率，聚酯的特性会发生很大变化的角度考虑，优选含有3HH作为其单体单元之一的共聚物，更优选P(3HB-co-3HH)。
在本发明的培养方法中，对于使用的微生物没有特别的限制，可以使用由天然分离的微生物或者保藏在菌株保藏机构(例如IFO、ATCC等)的微生物等。具体地可以使用产碱菌属(Alcaligenes)、罗尔斯通属(Ralstonia)、豚鼠气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)等的菌类。
另外，当上述微生物在野生型状态下不能生产目标共聚物或者其产量较低的情况下，可以向上述微生物导入目标共聚聚酯的聚合酶基因而进行转化，使用得到的转基因微生物。当制备转基因微生物时，可以使用利用含聚酯聚合酶基因的重组载体等普通的方法，对于该载体，可以使用在该菌体内能够自我复制的质粒载体。还可以把该聚酯聚合酶基因直接重组到宿主的染色体中，宿主可以使用产碱菌属(Alcaligenies)、罗尔斯通属(Ralstonia)、气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)等菌类。
对于在本发明的共聚聚酯的生产中使用的聚酯聚合酶基因没有特别地限制，优选由豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)分离的基因，例如，可以使用特开平10-108682号公报中记载的基因片断。
另外，可以按照公知的方法向微生物中导入重组载体。例如，可以使用接合法、钙法或者电穿孔法等。
作为本发明中使用微生物的一例，可以优选使用向真养罗尔斯通菌(Ralstonia eutropha)中导入源自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的聚酯聚合酶基因的Ralstonia eutropha PHB-4/p JRDEE32d13菌株(T.Fukui，Y.Doi，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49，333-336，1998)。
而且，根据布达佩斯条约，将该Ralstonia eutropha PHB-4/p JRDEE32d13菌株，以名称为真氧产碱菌AC32(Alcaligenes eutrophus AC32)，保藏编号为FERM BP-6038，在平成9年8月7日在位于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保管中心进行国际保藏。
在本发明的培养方法中，为生产共聚聚酯，从价格、供应稳定性、质量稳定性、菌体或者聚酯收率等角度考虑发酵原料，使用廉价的油脂作为主要的碳源。这里所谓的“主要”是指占全部碳源的50％或50％以上。除油脂以外的碳源例如可以列举葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖等糖类。
除碳源以外的营养物可以使用含氮源、无机盐类、维生素类和其他有机营养物的培养基。碳源例如可以列举氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐等的无机碳源；胨、肉提取物、酵母提取物等有机氮源。无机盐类例如可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。维生素类例如可以列举维生素B1、维生素B12、维生素C等。其他的有机营养物例如可以列举甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸等。然而，由降低生产成本的观点考虑，优选使用最少量的胨、肉提取物、酵母提取物等有机氮源；甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸等；维生素B1、维生素B12、维生素C等维生素类。优选使作为高价有机氮源的胨、酵母提取物、肉提取物等的用量维持在最少量。
一般来说，优选在对氮或者磷等增殖所需的营养物进行某种程度限制的条件下利用微生物生产聚酯。在本发明中也可以进行那样的营养物限制，其中，更优选对氮或者磷进行限制，进一步优选不对氮进行限制而对磷进行限制。而且，对磷进行限制并不是指在培养基中完全不含磷原子，而是指最低限度地含有作为增殖所需的营养物的磷，即为根据磷规定菌体增殖量的状态，而且并不排除在培养基中以无机盐的形式含有磷的情况。
在本发明中作为碳源使用的油脂，可以使用大豆油、玉米油、棉籽油、棕榈油、棕榈核油、椰子油、花生油等能够比较稳定地供应的天然油脂；对这些油脂进行分馏而得到的各馏分(例如，棕榈W油精油(パ一ムWオレイソ油，对棕榈油进行2次无溶剂分馏而得到的低熔点馏分)、棕榈核油油精(パ一ム核油オレイソ，对棕榈核油进行1次无溶剂分馏而得到的低熔点馏分)等)的分馏油脂；对这些天然油脂或者其馏分进行化学或者生物化学处理而得到的合成油；进一步混合上述这些油脂而得到的混合油等。其中，优选天然油脂、分馏油脂，从成本的角度出发，更优选使用天然油脂或者廉价的分馏油脂。
通过适当地选择所使用的油脂的种类，能够控制构成共聚聚酯单体单元的种类及其组成比。例如，在含有3HH的共聚聚酯的生产中，在想要获得3HH含有率高的共聚聚酯的情况下，优选使用含有月桂酸作为构成油脂脂肪酸的油脂，通常称为月桂酸油脂的油脂。含有月桂酸作为构成脂肪酸的油脂可以列举棕榈核油或椰子油等天然油脂、棕榈核油油精等分馏油脂或含有这些月桂酸油脂的混合油等。
进一步对P(3HB-co-3HH)的情况进行详细描述，当使用月桂酸类油脂时，可以制得具有4-20mol％较高的3HH含有率的P(3HB-co-3HH)，当使用大豆油、玉米油、棉籽油、棕榈油、花生油或者它们的分馏油脂等情况下，可以获得1-10mol％的较低3HH含有率的P(3HB-co-3HH)。此外，通过使用混和了2种或2种以上这些油脂的油脂，并随意地改变其混合比例，就能够任意地控制P(3HB-co-3HH)的3HH含有率。
另外，特别优选作为碳源使用的油脂是含有月桂酸作为其构成脂肪酸的油脂，而且在限制磷的条件下对其进行培养。
一般来说，当在微生物的培养中添加油脂的情况下，作为添加方法，可以考虑一次性大量添加、分开添加、连续或者间歇进料等方法，根据本发明者的研究结果判断如下，如果一次性大量添加，由于生成的脂肪酸会表现出细胞毒性，使由脂肪酸引起的发泡变得剧烈，导致实际操作陷入困难的状况。因此，在本发明中，采用使用泵等对碳源油脂进行连续进料或者间歇进料的方法。本发明者们对碳源油脂的最合适的添加方法进行了研究，结果发现通过设计出进料方法，不仅避免了发泡等操作上的问题，而且还能够控制生成的共聚聚酯的组成。以下，对本发明的培养方法中实施的油脂的进料方法进行详细地描述。
在本发明的培养方法中，对碳源油脂所进行的进料，使其比基质供给速率在整个培养期间或者在培养的菌体增殖期和聚酯储备期的各自阶段时期内大致保持定值。
上述比基质供给速率是指单位时间内单位净重菌体所提供的油脂量，即为定义单位净重菌体的油脂进料速率的培养变量。另外，所谓菌体的净重，是指由全部菌体的重量减去所含聚酯的重量而得到的菌体重量(干燥菌体重量)。即，比基质供给速率是利用下式(1)求得的值。
比基质供给速率＝油脂进料速率(g/h)/菌体的净重(g)＝单位时间的油脂供应量(g/h)/(全部菌体的重量(g)-聚酯的含量(g))在本发明中，为了设定比基质供给速率并将其控制为定值，需要预测菌体净重的变化。本发明者们对菌体净重的变化进行了专心地研究，结果成功地通过预备实验估计出实用的菌体净重增殖曲线，从而完成了本发明。
根据本发明者们的研究结果，在能够抑制发泡、且实现稳定培养的油脂的进料速度范围内，在培养液中存在的油脂的滞留量(占全部培养液量(培养基+菌体+油脂)的油脂的容积比例)低于10％或10％以下时，没有发现根据搅拌条件和换气条件决定的油脂液滴直径发生大的变化。因此，受液滴表面积控制的基质摄入速率也没有大的偏差，其结果是可以认为如果油脂种类以及其他培养条件相同，在能够稳定运转的油脂进料速度范围内，菌体净重的变化可以大致由单一增殖曲线(ひとつの增殖曲線)表示。
另外，生物降解性聚酯的生产是在如下所述控制氮或者磷的培养条件下进行的，因此在氮或者磷耗尽后，菌体净重几乎没有变化而恒定。因此，如果规定了油脂种类和培养条件，在该条件下，在油脂供应并不是不够充足、而且不是过量供应的范围内，可以适当地使油脂的进料速率变化(在实际操作中，一边观察上清液中的油脂层厚度，一边调节进料速度)，并采集菌体净重的变化数据。这样可以得到菌体的净重增殖曲线。以此作为基础，为了使比底物填料速度在整个培养期间或者在上述特定的阶段期间内成为设定的某一定值，可以根据上式(1)计算油脂的进料速率，并按照该计算结果连续地(阶段性地)或者间隙地改变油脂的进料速率。
另外，作为间接的方法，还可以测定通风排气中的氧浓度、二氧化碳浓度，并通过氧消耗速率或者二氧化碳产生速率估计菌体的净重，从而能够实时地控制比基质供给速率。然而，根据本发明者们的研究结果确认，在氮或磷没有耗尽的菌体增殖期和耗尽后的聚酯储备期内，上述的呼吸特性存在着很大变化，因此，优选事先详细地对增殖期以及生产期的呼吸特性进行研究。
在本发明中，在把油脂的比基质供给速率控制为某一定值的情况下，存在如下2种控制方法，第一种是在整个培养期间把油脂的比基质供给速率控制为某一定值的方法，第二种是把整个培养期间分成菌体增殖期和聚酯储备期2个阶段，在各个阶段设定不同的比基质供给速率，并在各个阶段期间内控制比基质供给速率为设定的定值的方法，可以使用上述任意1种方法。为了在整个培养期间内或者培养的特定阶段期间内把油脂比基质供给速率控制为某一定值，需要连续地(阶段性地)或者间歇地变化油脂的进料速率，使其满足设定的比基质供给速率值。
为了连续地(阶段性地)变化油脂的进料速率，例如可以利用计算机控制进料速率。另外，当间歇地或者阶段地使进料速率变化时，尽管可以自动的进行控制，但是，从手动也能够控制进料速率的角度考虑，人工操作很方便。当间歇地或者阶段地使进料速率变化时，严格地讲，并不是总要完全满足预先设定的比基质供给速率的值，而是可以使其平均值满足上述设定的比基质供给速率的值。
如上所述，通过本发明的培养方法，即在整个培养期间或者在培养的特定阶段期间内，控制油脂的比基质供给速率，并使之成为设定的某一定值，从而首次达到了通过以预培养方法所不能达到的提高共聚聚酯产率和控制单体单元组成比，其中，所述的以前的培养方法是在培养初期全部添加规定量的油脂，或者在培养期间内以固定的油脂进料量进行进料培养，不根据比基质供给速率而凭经验变化油脂的添加量的方法。
在本说明书中，所谓整个培养期间是指用于生产聚酯的主培养(本培养)中的从培养开始直到培养结束的整个时期。另外，所谓“在整个培养期间把比基质供给速率控制为某一定值”，即在菌体增殖期和聚酯储备期两个期间内选择相同的某一定值的比基质供给速率，并将油脂的进料速率控制为所选择的该值。这里所谓的培养的菌体增殖期和聚酯储备期，在将培养期间大致分成2个阶段的情况下，分别是指在培养基中存在足量的氮或磷，活跃地进行菌体增殖，聚酯的储备速率不是那么大的前半阶段(菌体增殖期)和培养基中的氮或磷的浓度下降，菌体的增殖受到限制，聚酯的储备速率增大的后半阶段(聚酯的储备期)。根据各自的培养阶段设定不同的比基质供给速率值，并在各个阶段的时期内，通过将比基质供给速率控制为所设定的某一定值进行培养，从而能够更有效地提高共聚聚酯的产率和控制单体单元的组成比。
应用于本发明方法的油脂比基质供给速率的范围也是根据所用油脂的种类和培养阶段而确定的，大致为0.05～0.20(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1，优选为0.06～0.15(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1，更优选为0.07～0.12(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1。
在本发明中，首次发现比基质供给速率越小，P(3HB-co-3HH)的3HH含有率就越高。因此，当想要获得3HH含有率高的P(3HB-co-3HH)的情况下，可以较低(例如0.06～0.08(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1)地设定比基质供给速率进行培养。另外，当根据培养阶段变化比基质供给速率时，通过较高(例如，0.09～0.13(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1)地设定培养前半期菌体增殖期的比基质供给速率值，较低(例如，0.06～0.08(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1)地设定培养后半期聚酯储备期的比基质供给速率值，能够在不降低共聚聚酯产率的同时更有效地提高3HH含有率。
另外，如上所述，通过适当地选择油脂种类，也能够控制生产的共聚聚酯的组成。因此，通过改变油脂种类或者油脂的比基质供给速率的控制值，进一步通过选择两者适当的组合，能够把生产的共聚聚酯的组成，例如P(3HB-co-3HH)的3HH含有率等控制为期望的组成或者比例。
培养温度可以是该细菌能够生长的温度，优选为20～40℃，更优选为25～35℃。对于培养时间没有特别地限制，可以为1～7天左右，优选为40～70小时。
在如上所述生产聚酯的时候，在利用生产聚酯培养基的主培养中进行比基质供给速率的控制、油脂种类的选择和氮或磷的控制等。而且，在利用生产聚酯培养基的主培养之前，为了事先使菌体增殖到某种程度，通常预先利用种培养基(種培地)或者预培养基进行培养。在这种情况下，在种培养基或者预培养基中使用的营养物可以使用与上述相同的物质，这些培养基的培养温度可以分别与利用上述生产聚酯培养基的主培养相同，培养时间分别优选为1～2天。
另外，当使用转基因微生物时，例如，在利用预培养基进行培养时，还可以添加与存在于载体的抗性基因相应的卡那霉素、氨苄青霉素、四环素等抗生素。
在本发明中，对于从微生物菌体回收共聚聚酯的方法没有特别地限制，可以采用公知的溶剂提取法、物理粉碎法、化学处理等，例如可以使用如下方法。培养结束后，使用离心机，从培养液分离菌体，利用蒸馏水以及甲醇等洗涤该菌体后，使之干燥。使用氯仿等有机溶剂从该干燥菌体种提取聚酯。通过过滤等，由含有该聚酯的有机溶剂溶液除去菌体成分，向该滤液中添加甲醇或己烷等弱溶剂使聚酯沉淀。利用过滤或者离心分离而除去上清液，使之干燥，并回收聚酯。
例如可以利用气相色谱法或者核磁共振法等对所得聚酯的单体单元进行分析。
附图的简要说明
图1表示在使用棕榈核油油精的2次预备实验中，每单位培养液量的干燥菌体净重(g/L)的实测值(图中的▲、◆)变化和通过其求得的每单位培养液量的干燥菌体净重的增殖曲线。
图2表示把比基质供给速率设定为0.09(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1的情况下，棕榈核油油精的每单位培养液量的进料速率((g-oil/h)L)的理论值(虚线)和实际上在实施例中进料油脂的每单位培养液量的进料速率的阶段性变化图(实线)。
实施发明的最佳方式下面通过实施例进一步对本发明进行详细地描述。在以下的实施例中的任何共聚聚酯都生产P(3HB-co-3HH)。当然，本发明的技术范围并不限于这些实施例，并不限于生产P(3HB-co-3HH)。
例如，通过改变使用的微生物或聚酯聚合酶基因的种类、使用其他油脂作为碳源、添加特定的脂肪酸，可以生产P(3HB-co-3HH)以外的其他共聚物。
而且，在下述各表中，如果没有特别指出，比基质供给速率的单位为(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1。
(实施例1)按照如下过程培养Ralstonia eutropha PHB-4/p JRDEE32d13菌株(T.Fukui，Y.Doi，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49，333-336，1998)(以下简称Red13菌株)。根据布达佩斯条约，将Red13菌株，以名称为真氧产碱菌AC32(Alcaligeneseutrophus AC32)，保藏编号为FERM BP-6038，在平成9年8月7日在位于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心进行国际保藏。
种培养基的组成为1w/v％肉提取物、1w/v％细菌胰蛋白胨、0.2w/v％酵母提取物、0.9w/v％Na2PO4·12H2O、0.15w/v％KH2PO4(pH6.8)。
预培养基的组成为1.1w/v％Na2PO4·12H2O、0.19w/v％KH2PO4、1.29w/v％(NH4)2SO4、0.1w/v％MgSO4·7H2O、2.5w/v％棕榈W油精油、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1N盐酸中溶解1.6w/v％FeCl3·6H2O、1w/v％CaCl2·2H2O、0.02w/v％CoCl2·6H2O、0.016w/v％CuSO4·5H2O、0.012w/v％NiCl2·6H2O得到的溶液)、5×10-6w/v％卡那霉素。
聚酯生产培养基的组成为0.385w/v％Na2PO4·12H2O、0.067w/v％KH2PO4、0.291w/v％(NH4)2SO4、0.1w/v％MgSO4·7H2O、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1N盐酸中溶解1.6w/v％FeCl3·6H2O、1w/v％CaCl2·2H2O、0.02w/v％CoCl2·6H2O、0.016w/v％CuSO4·5H2O、0.012w/v％NiCl2·6H2O得到的溶液)、0.05w/v％的BIOSPUREX200K(消泡剂コグニスヅヤパソ公司制)。碳源使用分馏棕榈核油得到的低熔点馏分棕榈核油油精，并在整个培养期间使比基质供给速率分别为0.08、0.09、0.10(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1进行进料。
使用预备试验的结果求得以控制比基质供给速率为基础的干燥菌体净重的增殖曲线，其中所述的预备试验使用棕榈核油油精一边观察培养上清液中的油脂层的厚度，一边调节进料速度而进行培养。即，如图1所示，根据预备试验中每单位培养液量的干燥菌体净重的变化数据，到培养36小时时为直线增殖，其后每单位培养液量的干燥菌体净重保持恒定。
在图2以及表1中，表示了利用图1求得的干燥菌体净重的增殖曲线，当比基质供给速率设定为0.09(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1时，棕榈核油油精的每单位培养液量进料速率的理论值(虚线)和实际上在实施例中进料油脂的每单位培养液量进料速率的阶段性变化图(实线)。
而且，在图1、2以及下述表1～8中，L表示每1L培养液量(培养基、菌体、油脂的总体积)，h表示时间。
表1
将Red13菌株的甘油储料(グリセロ一ルストツク)(50μl)接种至种培养基(10ml)，在进行24小时培养后，以0.2v/v％接种至装有3L预培养基的5L缸发酵桶(丸菱バイオエンヅ公司制MDL-500型)。操作条件为，培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通风量1.8L/min，一边把PH控制在6.7-6.8之间，一边进行28小时培养。使用7％氢氧化氨水溶液进行PH调节。
聚酯的生产培养是在装有6L生产培养基的10L缸发酵桶(丸菱バイオエソヅ公司制MDL-1000型)接种1.0v/v％预培养种母(前培餋種母)。操作条件为，培养温度28℃、搅拌速度400rpm、通风量3.6L/min、PH控制在6.7～6.8之间。使用14％的氢氧化铵溶液调节PH。进行60小时培养，培养进行至第16小时之后，每隔4小时进行取样，通过离心分离回收菌体，利用甲醇进行洗涤后，冷冻干燥，测定干燥菌体的重量。
向约1g所得干燥菌体中添加100ml氯仿，室温下搅拌一昼夜，提取菌体内的聚酯。过滤菌体残渣后，利用蒸发器把总体积浓缩至30ml后，缓慢加入约90ml己烷，充分搅拌后，静置1小时。过滤析出的聚酯后，在50℃下真空干燥3小时。测定干燥的聚酯重量，计算菌体内聚酯的含量。
并且，向所得约20mg干燥聚酯中添加2ml的硫酸-甲醇混合液(15∶85)和2ml的氯仿并密封，在100℃下加热140分钟，得到聚酯分解产物的甲酯。冷却后，向其中一点一点加入1.5g碳酸氢钠进行中和，并静置直到停止产生二氧化碳。添加4ml二异丙基醚，充分混合后，离心，利用毛细管气相色谱仪对上清液中的聚酯分解产物单体单元的组成进行分析。气相色谱仪是使用岛津公司生产的GC-17A，毛细管柱是使用GLサイエンス公司生产的NEUTRA BOND-1(柱长25m、柱内径0.25mm、液膜厚0.4μm)。温度条件为，以8℃/分的速度从初始温度100℃升温至200℃，进一步以30℃/分的速度从200℃升温至290℃。
在表2中表示比基质供给速率的控制对共聚聚酯组成比以及产率带来的影响。
表2P(3HB-co-3HH)产量(g/L)
3HH含有率(mol％)
由上述结果可以知道，把比基质供给速率控制得越低，产率会略有降低，但是共聚聚酯中的3HH含有率提高。另外还观察到当比基质供给速率的设定值越低，就能越好地抑制培养中发泡的状况。
(实施例2)除了使用大豆油代替棕榈核油油精以外，利用与实施例1同样的培养基和条件进行培养，得到表3所示的结果。
表3P(3HB-co-3HH)产量(g/L)
3HH含有率(mol％)
如表3所示可以知道，通过使用大豆油，并与使用棕榈核油油精时同样较低地控制比基质供给速率，也能提高聚酯中的3HH含有率。然而，在相同的比基质供给速率条件下，对使用大豆油和使用棕榈核油油精的3HH含有率进行比较可以知道，使用大豆油的3HH含有率明显偏低，由于作为基质使用的油脂不同，即使把比基质供给速率控制为相同值，所得3HH含有率也存在差异。
与实施例1同样地将比基质供给速率的设定值控制为最低值0.08(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1时，能够良好地抑制发泡。
(实施例3)除了基质使用玉米油、棉籽油、棕榈W油精、棕榈核油、椰子油、花生油替代棕榈核油油精，并针对各个油脂分别将比基质供给速率控制为0.06(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1以及0.12(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1以外，利用与实施例1相同的培养基和条件进行培养，得到表4所示结果。在表4中汇总了针对各种油脂，比基质供给速率的控制对共聚聚酯产率以及3HH含有率带来的影响(只对培养至第60小时的结果进行比较)。
表4
如表4所示可以知道，对于任一种油脂，通过将比基质供给速度控制为较低，产率会略有下降，共聚聚酯中的3HH含有率会提高。另外还可以知道，由于作为基质使用的油脂不同，即使将比基质供给速率控制为相同的值，也能确认培养至第60小时的3HH组成存在明显差异，利用作为月桂系油脂的椰子油、棕榈核油，能够获得具有约7～14mol％较高3HH含有率的P(3HB-co-3HH)，使用玉米油、棉籽油、棕榈W油精、花生油，能够获得具有约3～6mol较低3HH含有率的P(3HB-co-3HH)。表4的结果表明通过选择油脂种类或者比基质供给速率的设定值，或者通过确切地组合上述选择，不但能够保证高产率，而且还能够制得具有希望3HH含有率的共聚聚酯。
(实施例4)除了基质使用3种棕榈核油油精和大豆油的混合油，即混合油A(棕榈核油油精/大豆油＝75/25(v/v))、混合油B(棕榈核油油精/大豆油＝50/50(v/v))、混合油C(棕榈核油油精/大豆油＝25/75(v/v))以外，利用与实施例1同样的培养基和条件进行培养，得到表5～7所示的结果。在表5～7中汇总了针对各种混合油脂，比基质供给速率的控制对共聚聚酯产率以及3HH含有率带来的影响。
表5混合油A(棕榈核油油精/大豆油＝75/25(v/v))P(3HB-co-3HH)产量(g/L)
3HH含有率(mol％)
表6混合油B(棕榈核油油精/大豆油＝50/50(v/v))P(3HB-co-3HH)产量(g/L)
3HH含有率(mol％)
表7混合油C(棕榈核油油精/大豆油＝25/75(v/v))p(3HB-co-3HH)产量(g/L)
3HH含有率(mol％)
如表5～7所示可以知道，对于任一种混合油脂，通过将比基质供给速度控制为较低，产率会略有下降，共聚聚酯中的3HH含有率会提高。另外还可以知道，混合油中的棕榈核油油精的比例越多，3HH含有率就越高。这些结论也可以认为是由合并表5～7以及棕榈核油油精、大豆油分别为100％情况时而得到的结果得出的。表5～7所示的结果表明除了通过组合实施例3所示的油脂种类和比基质供给速率，还通过混合多种油脂，并进一步调节它们的混合比例，能够保证高产率，同时还能够制得具有理想3HH含有率的聚酯。
(实施例5)除了把棕榈核油油精作为碳源，并将直至培养36小时的菌体增殖期的比基质供给速率控制为0.09(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1，然后将培养36小时以后的聚酯储备期的比基质供给速率控制为0.08(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1以外，与实施例1同样地进行培养。
表8
把表8所示结果与实施例1表2所示结果进行比较可以知道，通过在聚酯储备期少许降低比基质供给速率进行培养，与在整个培养期间将其控制为0.09(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1的情况相比，能够获得在不降低产率的条件下，与在整个培养期间将其控制为0.08(g；油脂)×(g；干燥菌体净重)-1×(h；时间)-1的情况相同或更高的3HH含有率。
产业利用性在本发明的方法中，通过选择作为碳源使用油脂的比基质供给速率控制值，进一步地通过适当地组合油脂比基质供给速率控制值和油脂种类，能够任意地控制使共聚聚酯的物性发生很大变化的聚酯组成，而且能够稳定地获得高产率，其中所述共聚聚酯为生物降解性聚合物。因此，能够在工业上低成本地生产、提供应用范围广泛的共聚聚酯。此外，通过控制比基质供给速率，可以良好地抑制由过量供应油脂而引起的发泡，能够进行稳定地培养。
权利要求
1.一种培养方法，其特征在于，在利用微生物生产共聚聚酯的过程中，在整个培养期间内把油脂的比基质供给速率控制为定值，其中所述油脂为作为碳源使用的油脂。
2.一种培养方法，其特征在于，在利用微生物生产共聚聚酯的过程中，在培养的菌体增殖期和聚酯储备期改变油脂的比基质供给速率，并在各个阶段将其控制为定值，其中所述油脂为作为碳源使用的油脂。
3.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，通过选择油脂的种类和/或油脂的比基质供给速率的控制值，对生产的共聚聚酯组成进行控制。
4.如权利要求1～3中任一项所述的培养方法，其特征在于，作为碳源使用的油脂是包含选自大豆油、玉米油、棉籽油、棕榈油、棕榈核油、椰子油、花生油，以及分馏这些油脂得到的分馏油脂中至少一种油脂的油脂。
5.如权利要求1～4中任一项所述的培养方法，其特征在于，作为碳源使用的油脂是含有月桂酸作为其构成脂肪酸的油脂，并且在限制磷的条件下进行培养。
6.如权利要求1～5中任一项所述的培养方法，其特征在于，微生物是属于选自罗尔斯通菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、豚鼠气单胞菌属(Aeromonas)、产碱菌属(Alcaligenes)以及埃希氏菌属(Escherichia)的微生物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的培养方法，其特征在于，微生物是重组聚酯聚合酶基因得到的转基因微生物。
8.如权利要求1～7中任一项所述的培养方法，其特征在于，共聚聚酯是含有3-羟基己酸的共聚聚酯。
全文摘要
本发明的目的是开发一种低成本地获得高产率，而且能够任意地控制生物降解性共聚聚酯组成的技术。本发明涉及一种培养方法，其特征在于，当使用微生物生产共聚聚酯时，在整个培养期间把作为碳源使用的油脂的比基质供给速率控制为定值的培养方法，或者将培养时期分成菌体增殖期和聚酯储备期，并在各个阶段把比基质供给速率控制为定值的培养方法。另外，本发明涉及一种通过选择油脂种类和/或油脂比基质供给速率的控制值对生产的共聚聚酯组成进行控制的培养方法。
文档编号C12P7/62GK1703502SQ200380101089
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月10日 优先权日2002年10月10日
发明者中嶋敏光, 小田原修, 横沟聪 申请人:株式会社钟化