倍半萜烯合成酶及其使用方法

专利名称：倍半萜烯合成酶及其使用方法
本申请要求2002年10月4日提交的申请号为No.60/415,765美国临时申请的优先权，该文献内容在此引入作为参考。本申请还要求2002年12月2日提交的申请号为PCT/IB02/05070的国际申请的优先权，该文献内容在此引入作为参考。
本申请涉及倍半萜烯合成酶及其制备和使用方法。一个实施方案中，本发明提供了含有本申请所述核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列编码至少一种倍半萜烯合成酶。另一实施方案中，本发明还提供了倍半萜烯合成酶及其制备和使用方法。例如，本发明的倍半萜烯合成酶可用于将法呢基焦磷酸酯转化为各种氧化的和脂肪族倍半萜烯，包括朱栾倍半萜、二环-吉马烯、荜澄茄醇和δ-杜松烯。
背景技术：
萜烯化合物是一大类结构差异很大的天然分子。植物界中有最为多样性的单萜和倍半萜烯。通常它们在植物抵抗病虫害及草食动物以及吸引授粉昆虫方面发挥作用。
萜烯的生物合成已经在很多种生物体内进行了广泛的研究。萜烯的常见前体为焦磷酸异戊烯酯(IPP)，催化产生IPP步骤的酶大多数已经研究清楚。IPP生物合成的两个不同途径现已清楚(

图1)。甲羟戊酸酯途径发现于植物细胞液和酵母中，而非-甲羟戊酸酯途径(或脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径发现于植物质体和大肠杆菌中。
例如，IPP在IPP异构酶作用下异构化为二甲基烯丙基二磷酸酯，可用异戊烯基转移酶将这两种C5化合物缩合生成每一类萜烯的脂肪族焦磷酸酯萜烯前体，即对于单萜而言是牻牛儿基焦磷酸酯(GPP)，对于倍半萜烯而言是法呢基焦磷酸酯(FPP)，对于二萜烯为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯(GGPP)(图2)。催化脂肪族前体环化步骤的酶命名为萜烯环化酶或萜烯合成酶，在本申请中称之为萜烯合成酶。
这些酶还能够催化复合体多步骤环化形成萜烯或倍半萜烯化合物的碳骨架。例如，催化环化的起始步骤可以是二磷酸酯基团的离子化形成烯丙基阳离子。然后，该底物进行异构和重排，这些反应可以通过酶活性位点控制。产物可以是，例如非环、单、二或三-环。然后，质子从碳正离子释放出来或者碳正离子与水分子反应，释放出萜烯烃或醇。一些萜烯合成酶产生单一产物，但是大部分产生多种产物。
自然界中发现了很多种的萜烯结构和倍半萜烯合成酶。现已从不同的植物来源克隆和定性了几种编码cDNA或基因的倍半萜烯合成酶，例如，源自烟草(Facchini，P.J.and Chappell，J.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，11088-11092.)和辣椒(Back，K.，et al.(1998)Plant CellPhysio.39(9)，899-904.)的5-表-马兜铃烯(aristolochene)合成酶，源自Hyoscyamus muticus的yetispiradiene合成酶(Back，K.and Chappell，J.(1995)J.Biol.Chem.270(13)，7375-7381.)，源自欧薄荷的(E)-β-金合欢烯合成酶(Crock，J.，et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(24)，12833-12838.)，源自北美冷杉的δ-芹子烯合成酶和γ-葎草烯合成酶(Steele，C.L.，et al.(1998)J.Biol.Chem.273(4)，2078-2089.)，源自亚洲棉的δ-杜松烯合成酶(Chen，X.Y.，et al.(1995)Arch.Biochem.Biophys.324(2)，255-266；Chen，X.Y.，et al.(1996)J.Nat Prod.59，944-951.)，源自北美冷杉的E-α-没药烯合成酶(Bohlmann，J.，et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(12)，6756-6761.)，源自番茄的吉马烯C合成酶(Colby，S.M.，et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)，2216-2221.)，源自黄花蒿的表-雪松醇合成酶和紫穗槐-4，11-二烯合成酶(Mercke，P.，et al.(1999)Arch.Biochem.Biophys.369(2)，213-222；Mercke，P.，etal.(2000)Arch.Biochem.Biophys.381(2)，173-180.)，以及源自莴苣、菊苣和加拿大一枝黄花的吉马烯A合成酶(Bennett，M.H.，etal.(2002)Phytochem.60，255-261；Bouwmeester，H.J.，et al.(2002)Plant Physiol.129(1)，134-144；Prosser I，et al.(2002)Phytochem.60，691-702)。
很多倍半萜烯化合物被用于香料(例如，广藿香醇(patchoulol)，诺卡酮，檀香醇，韦惕酮，甜橙醛)，且很多提取自植物。因此，它们的产量和价格取决于植物来源的波动以及主产国的稳定性。因此，人们希望获得非植物依赖性的倍半萜烯生产系统。由于一些倍半萜烯结构的复杂性，所以其化学合成的造价往往让人难以接受。
发明概述一个实施方案中，本发明涉及编码倍半萜烯合成酶的分离的核酸。本申请中的倍半萜烯合成酶还可以根据该酶与脂肪族焦磷酸酯萜烯前体例如法呢基焦磷酸酯接触时产生的至少一种化合物来命名。例如，能生成二环吉马烯作为其一种产物的倍半萜烯合成酶可称为二环吉马烯合成酶。按照这一惯例，本发明核酸的实例包括编码荜澄茄醇合成酶(GFTpsC)(SEQ ID NO1)；δ-杜松烯合成酶(GFTpsE)(SEQ ID NO2)；二环吉马烯合成酶(GFTpsB)(SEQ IDNO3)；朱栾倍半萜合成酶(GFTpsD1 & GFTpsD2)(SEQ ID NO4 &SEQ ID NO5)的cDNA。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。在一个实施方案中，定义的条件为中度严谨条件，另一个实施方案中为高度严谨条件。其他实施方案包括本发明核酸编码的多肽；含有本发明核酸的宿主细胞；经修饰含有本发明核酸的非人生物体；以及制备多肽的方法，其中包括培养本发明的宿主细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，其含有基本如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种含有至少一种核酸的载体，该核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。其他实施方案包括，制备重组宿主细胞的方法，其中包括将本发明载体导入宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备至少一种倍半萜烯合成酶的方法，该方法包括将经修饰以含有至少一种核酸序列的宿主在能够产生所述至少一种倍半萜烯合成酶的条件下培养。在一个实施方案中，所述的至少一种核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。所述宿主可选自，例如，植物、微生物、菌体细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备至少一种萜类化合物的方法，该方法包括1)让至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体与由核酸编码的至少一种多肽接触，在一个实施方案中，所述核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶，2)分离(1)中制备的至少一种萜类化合物。在一个实施方案中，所述至少一种萜类化合物选自倍半萜烯。在另一个实施方案中，所述至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体为法呢基焦磷酸酯。本发明方法制备的倍半萜烯包括，但不限于，二环吉马烯、荜澄茄醇、朱栾倍半萜、α-荜澄茄油烯、吉马烯D和δ-杜松烯(图3)。
应该理解的是上面的概述和下面的详述都只是例举和解释性的，而并不是对本发明的限制。现在对本发明的范例性实施方案进行详述。
附图简述图1焦磷酸异戊烯酯生物合成途径的实例(甲羟戊酸酯途径(A)和脱氧木酮糖途径(B))。
图2由焦磷酸异戊烯酯生物合成萜烯的实例。
图3倍半萜烯化合物实例的结构。
图4两组倍半萜烯合成酶的氨基酸序列比对的中间部分(番茄的吉马烯Cδ-杜松烯合成酶(SEQ ID NO11)；欧薄荷的(E)-β-金合欢烯(SEQ ID NO12)；北美冷杉的δ-芹子烯(SEQ ID NO13)；香橙(citrus junos)的倍半萜烯合成酶(SEQ ID NO14)；烟草的5-表-马兜铃烯(SEQ ID NO15)；辣椒的5-表-马兜铃烯(SEQ ID NO16)；马铃薯的Vetispiradiene(SEQ ID NO17)；H.muticus的Vetispiradiene(SEQ ID NO18)；亚洲棉的δ-杜松烯(SEQ ID NO19)；黄花蒿的紫穗槐-4，11-二烯(SEQ ID NO20)；黄花蒿的表-雪松醇(SEQ ID NO21)；北美冷杉的δ-葎草烯(SEQ ID NO22))以及推导的简并引物的序列(TpsVF1(SEQ ID NO23)、TpsVF2(SEQ IDNO24)、TpsVR3(SEQ ID NO25)；TpsCF1(SEQ ID NO26)、TpsCF2(SEQ ID NO27)、TpsCR3(SEQ ID NO28))。每一比对列下面的箭头表示用于设计简并引物及其方向的比对区域。
图5柚子总RNA RT-PCR扩增产物推导出的氨基酸序列比对(GFTpsA(SEQ ID NO29)、GFTpsB(SEQ ID NO30)和GFTpsC(SEQID NO31))。
图6源自葡萄柚的倍半萜烯合成酶GFTpsA(部分克隆)(SEQ IDNO32)，GFTpsB(SEQ ID NO3)，GFTbsC(SEQ ID NO1)，GFTpsD1(SEQ ID NO4)，GFTpsD2(SEQ ID NO5)和GFTpsE(SEQ ID NO2)的氨基酸序列比对。
图7由重组柚子倍半萜烯合成酶制备的倍半萜烯的GC谱。
图8(a)GFTpsA(SEQ ID NO32和SEQ ID NO33)、(b)GFTpsB(SEQ ID NO3和SEQ ID NO8)、(c)GFTbsC(SEQ ID NO1和SEQID NO6)、(d)GFTpsD1(SEQ ID NO4和SEQ ID NO9)、(e)GFTpsD2(SEQ ID NO5和SEQ ID NO10)以及(f)GFTpsE(SEQ IDNO2和SEQ ID NO7)的氨基酸及核苷酸序列。
发明描述萜烯是含有异戊二烯单元(C5H8)的不饱和烃，可以是脂肪族或环状。萜烯衍生物，包括但不限于樟脑、薄荷醇、萜品醇和莰醇、香叶醇。本申请中的萜烯或萜类化合物包括萜烯和萜烯衍生物，包括经过一个或多个步骤功能化的化合物，例如羟基化、异构化、氧化-还原或酰化作用。在本申请中，倍半萜烯是具有C15结构的萜烯，包括倍半萜烯和倍半萜烯衍生物，包括经过一个或多个步骤功能化的化合物，例如羟基化、异构化、氧化-还原或酰化作用。
本申请中，衍生物是指获自已知或假定化合物且含有亲体结构基本单元的任一化合物。
本申请中，倍半萜烯合成酶是任一种能催化倍半萜烯合成的酶。
“等同”、“基本上等同”或“基本如所示”这些词是指相关序列与给定序列之间具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。例如，所述序列可以是等位变体、来自不同物种的序列，或者它们可以是从给定序列通过截短、缺失、氨基酸取代或添加得到的。就多肽而言，比对序列的长度通常为至少20、30、50、100或更多个氨基酸。就核酸而言，比对序列的长度通常为至少50、100、150、300或更多个核苷酸。两序列之间的同一性百分比可以通过常规对齐算法得到，例如，Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.，215403-410中所述的BasicLocal Alignment Tool(BLAST)、Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.，48444-453中的算法、或者Meyers et al.(1988)Comput.Appl.Biosci.，411-17中的算法。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。在一个实施方案中，定义的条件为中度严谨条件，另一个实施方案中为高度严谨条件。
本申请中，本领域技术人员可以利用本申请实施例中描述的酶特性试验(enzyme characterization assay)测定本发明核酸编码的多肽是否是倍半萜烯合成酶。
本申请中，杂交或在特定条件下杂交是用来描述杂交条件，在该条件下相互基本等同或同源的核苷酸序列在洗涤后仍然保持彼此结合。所述条件可以是具有至少约70％，例如至少约80％，以及例如至少约85-90％同一性的序列仍然保持彼此结合。本发明中提供了低度、中度和高度严谨条件的定义。
本领域技术人员可以根据Ausubel et al.(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，一书第2、4和6章中例举的最小限度试验(minimal experimentation)选择合适的杂交条件。另外，还有Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，第7、9和11章中描述的严谨条件。本申请中的低度严谨条件如下所述。将含有DNA的滤膜40℃下在含下列物质的溶液中预处理6小时35％甲酰胺，5×SSC，50mMTris-HCI(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，和500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。杂交在相同溶液中进行，除下列改动外0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精子DNA，10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，使用5-20×10632P-标记探针。将滤膜在杂交混合液中40℃下孵育18-20小时，然后55℃下用含有2×SSC，25mM Tris-HCI(pH7.4)，5mM EDTA和0.1％SDS的溶液洗涤1.5小时。用新鲜溶液取代洗涤溶液，60℃下再孵育1.5小时。滤膜进行印迹干燥并进行放射自显影。
本申请中定义的中度严谨条件如下所述。将含有DNA的滤膜50℃下在含下列物质的溶液中预处理7小时35％甲酰胺，5×SSC，50mM Tris-HCI(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，和500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。杂交在相同溶液中进行，除下列改动外0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精子DNA，10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，使用5-20×10632P-标记探针。将滤膜在杂交混合液中50℃下孵育30小时，然后55℃下用含有2×SSC，25mM Tris-HCI(pH7.4)，5mM EDTA和0.1％SDS的溶液洗涤1.5小时。用新鲜溶液取代洗涤溶液，60℃下再孵育1.5小时。滤膜进行印迹干燥并进行放射自显影。
本申请中定义的高度严谨条件如下所述。将含有DNA的滤膜65℃下在由下列物质组成的缓冲液中预杂交8小时至过夜6×SSC，50mM Tris-HCI(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA和500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。将滤膜在65℃下在含100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和5-20×10632P-标记探针的预杂交混合液中预杂交48小时。将滤膜在37℃下用含有2×SSC，0.01％PVP，0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液洗涤1小时。然后再用0.1×SSC在50℃下洗涤45分钟。
如果上面给出的条件不合适(例如，当用于种间杂交时)，还可以选用本领域已知的其他低度、中度和高度严谨条件(例如，当用于种间杂交时)。
在一个实施方案中，本发明所述核酸和/或多肽分离自柑桔类植物，例如柚子或橙子。在一个具体实施方案中，本发明涉及特定的分离的核苷酸序列，包括那些基本上不含内源性污染物质的核苷酸序列。术语“核酸”或“核酸分子”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸多聚体，除另有说明外，其中还包括与天然生成核苷酸具有类似功能的天然核苷酸的已知类似物。“核苷酸序列”还指以单个片段或作为更大核酸组分形式存在的多核苷酸分子或寡核苷酸分子。所述核苷酸序列或分子还被称为“核苷酸探针”。本发明中的一些核酸分子源自分离的DNA或RNA，这些分离的DNA或RNA至少一度曾以基本纯化形式存在，其量或浓度足以保证能够用常规生化方法对其组分核苷酸序列进行鉴定、扩增和回收。这些方法的实例，包括本申请中PCR方案所使用的方法，参见Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，CurrentProtocols in Molecular Biology edited by F.A.Ausubel et al.，John Wiley andSons，Inc.(1987)，和Innis，M.et al.，eds.，PCR ProtocolsA Guide to Methodsand Applications，Academic Press(1990)。
在本申请中，本发明所述核酸分子包括单链和双链形式的DNA及其RNA互补链。DNA包括，例如，cDNA、基因组DNA、化学合成DNA、PCR扩增的DNA及其组合。基因组DNA包括翻译区、非翻译区及调控区，可以用常规技术来分离，例如使用本发明的任一种cDNA或其合适的片段作为探针对一段基因组DNA进行鉴定，然后可以使用本领域常规方法克隆该基因组DNA。通常，本发明范围内的核酸分子包括在上述杂交和洗涤条件下能够与本发明所述序列杂交的序列，比本发明所述序列DNA双螺旋熔融温度低5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的序列，包括被这些范围囊括在内的任意范围的条件。
在另一个实施方案中，本发明所述核酸包括基本如SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9，或SEQ IDNO10所示的序列。在一个实施方案中，所述核酸与SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸之间具有至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸编码一种蛋白质，该蛋白质是一种倍半萜烯合成酶，如实施例部分酶测定中所述。本发明还提供了含有不同物种间保守区域的核酸。
在另一实施方案中，所述核酸包含由SEQ ID NO6、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10中的至少50、100、250、500或750个连续核苷酸组成的连续片段。所述的这些核苷酸的连续片段还包括至少1处突变，只要突变体序列仍然保留原序列的功能，仍然能够与这些核苷酸在低或高度严谨条件下杂交，例如，中度或高度严谨条件。所述片段可以源自，例如，SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10中的第200-1600位核苷酸(nt)、第800-1600位nt、第1000-1600位nt、第200-1000位nt、第200-800位nt、第400-1600位nt或第400-1000位nt。
如上所述，由本发明所述核酸编码的多肽也在本发明范围之内。本发明所述的分离的核酸可选自编码基本如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5之间具有至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的多肽含有SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽含有基本如SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ IDNO5所示的氨基酸序列。另一个实施方案中，所述多肽含有与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示氨基酸序列间具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽是一种倍半萜烯合成酶，如下面实施例部分酶测定中所述。
由于遗传密码子的简并性，能够编码同一氨基酸的密码子不止一个，所以多个DNA序列能编码同一多肽。这些变体DNA序列可以获自遗传漂变或人工操作(例如，发生于PCR扩增过程中或者作为天然序列目的诱变(deliberate mutagenesis)的产物)。因此，本发明包括能够编码源自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10蛋白质的任一核酸或其变体。
天然序列的目的诱变可以用本领域已知的许多种技术完成。例如，可以使用寡核苷酸-定点-特异性诱变方法，特别是在期望使基因突变从而通过取代、缺失或插入使预定限制性位点的核苷酸或密码子变化的情况下。进行所述变化的方法的实例见Walder etal.(Gene 42133，1986)；Bauer et al.(Gene 3773，1985)；Craik(BioTechniques，January 12-19，1985)；Smith et al.(Genetic EngineeringPrinciples and Methods，Plenum Press，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488，1985)；Kunkelet al.(Methods in Enzymol.154367，1987)；和美国专利US4,518,584和US4,737,462。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽。本申请中的“多肽”是指一类多肽或肽片段，其中含有本申请鉴定出的氨基酸序列，以及更小的片段。替代地，可以根据多肽与本发明核酸序列编码的任一肽之间的抗原性相关程度来对该多肽进行定义。因此，在一个实施方案中，本发明范围内的多肽定义为其中含有与本发明核酸序列编码的任一肽相同线性或三维表位的氨基酸序列。替代地，本发明范围内的多肽是能够被具有下述特性的抗体识别的，即该抗体能够特异性识别本发明核酸序列编码的任意一种肽。如果抗体与本发明多肽结合时的Ka值大于或等于约107M-1，例如大于或等于108M-1，那么就将该抗体定义为特异性结合。
本申请中的多肽“变体”是指基本上与天然多肽同源的多肽，但是其氨基酸序列因为一处或多处缺失、插入或取代而不同于本发明任一核酸所编码的多肽。
变体可以包括保守取代序列，即一特定氨基酸残基被一具有类似理化特性的残基所取代。保守取代的实例包括用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基，例如，Ile、Val、Leu或Ala之间相互取代，或者用一个极性残基取代另一个极性残基，例如在Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn之间相互取代。参见，Zubay，Biochemistry，Addison-Wesley Pub.Co.，(1983)。这类取代的效果可以用取代打分矩阵(substitution score matrices)来计算，如Altschul，(J.Mol.Biol.219555-65，1991)中所述的PAM-120、PAM-200和PAM-250。其他这类保守取代，例如具有近似疏水特性的完整区域的取代，已为本领域熟知。
天然生成的肽变体也在本发明范围之内。这种变体的实例是本申请所述多肽由于改变mRNA剪接事件或者蛋白水解切割得到的蛋白质。蛋白水解引起的变化包括，例如，在不同类型宿主细胞中表达时，本发明序列编码的多肽由于蛋白水解除去了一个或多个末端氨基酸而导致N-或C-末端的差异。
本发明倍半萜烯合成酶的变体可以用于实现酶促活性的增强或减弱，区域化学(regiochemistry)或立体化学的变化，或者底物利用或者产物分配的改变。可以用本领域已知的任一方法得到变体或实现定点诱变。
如上所述，本发明提供了重组及非重组、分离且纯化的多肽，例如从柑桔类植物。天然多肽的变体及衍生物可以通过下列方法得到从其他或同一植物品系或品种中分离天然生成的变体或变体的核苷酸序列，或者对编码天然柑桔多肽的核苷酸序列的突变进行人工设计。改变天然氨基酸序列可以用许多种常规方法中的任一种来完成。可以通过下述方法将突变导入特定位置合成含有突变序列的寡核苷酸，与限制性酶切位点侧接以能够与天然序列的片段连接。连接后，得到的重构序列编码含有预期的氨基酸插入、取代或缺失的类似物。替代地，可以使用寡核苷酸-定点-特异性诱变方法提供一种经过改变的基因，其中预定的密码子因取代、缺失或插入而改变。
在一个实施方案中，本发明涉及含有本发明所述核酸的载体。例如，含有至少一种选自下列核酸的载体(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。
本发明使用的载体包括任一种重组载体，包括但不限于病毒载体、噬菌体及质粒。
含有本发明所述核酸序列的重组载体可以用熟知的方法制备。在一个实施方案中，所述表达载体中含有编码多肽的cDNA序列，该cDNA序列可操作地连接有合适的转录或翻译调控核苷酸序列，例如源自哺乳动物、细菌、病毒或昆虫基因的调控序列。调控序列的实例包括转录启动子、操纵子、或增强子，mRNA核糖体结合位点、以及调控转录及翻译起始和终止的合适序列。当调控序列与本发明的cDNA序列功能性相连时那么核苷酸序列就是“可操作地连接”。因此，如果一启动子核苷酸序列能够调控cDNA序列的转录，那么该启动子序列就是可操作地连接于该cDNA序列。此外还可以向表达载体中引入在预期宿主细胞中的复制能力和选择基因，所述复制能力通常由复制起点赋予，选择基因可以是转化株得以通过其鉴定的那些。
此外，还可以向表达载体引入信号肽编码序列，天然状态下该信号肽与本发明多肽并不相连。例如，可以将编码信号肽(分泌前导肽)的DNA序列与本发明的核苷酸序列融合在同一阅读框内从而使得本发明的多肽最初翻译为含有信号肽的融合蛋白。在预期宿主细胞中发挥作用的信号肽可以增进所表达多肽的胞外分泌。可在分泌离开细胞时将信号肽从多肽上切除。
可以在本发明多肽的氨基及羧基端融合其他的肽序列，用以提高多肽的表达或者促进蛋白质的纯化。
在一个实施方案中，本发明包括含有本发明所述核酸的宿主细胞。本发明的另一实施方案是一种制备重组宿主细胞的方法，该方法包括将本发明载体导入宿主细胞。在另一个实施方案中，提供了制备多肽的方法，该方法包括将本发明宿主细胞培养于能够产生多肽的条件下。一个实施方案中，对所述多肽进行回收。本发明所述方法包括制备至少一种本发明所述倍半萜烯合成酶的方法，该方法包括培养含有本发明所述核酸的宿主细胞，然后回收积聚的倍半萜烯合成酶。
适于表达本发明多肽的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。适用于细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体的描述参见，例如，Pouwels et al.，Cloning VectorsALaboratory Manual，Elsevier，New York，(1985)。另外还可以采用无细胞翻译系统，用源自本发明所述DNA构建体的RNA制备公开的多肽。
原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，大肠杆菌或杆菌。适于转化的原核细胞包括，例如，大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞属的其他菌种、链霉菌、以及葡萄球菌。原核宿主细胞中，例如大肠杆菌中，所述多肽可以含有有助于重组多肽在原核细胞中表达的N-末端甲硫氨酸残基。可以将N-末端甲硫氨酸残基从表达的重组多肽上切除。
适用于原核宿主细胞的表达载体的实例包括从可商购的质粒如克隆载体pET质粒(Novagen，Madison，WI，USA)或pBR322(ATCC37017)得到的载体。pBR322中含有氨苄青霉素及四环素抗性基因，因而提供了鉴定转化细胞的便捷方法。就使用pBR322构建表达载体而言，可以将合适的启动子和编码一种或多种本发明所述多肽的DNA序列插入pBR322载体。其他可商购的载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM-1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)。其他可商购的载体包括为蛋白表达专门设计的载体；这些载体包括用于与麦芽糖结合蛋白融合的蛋白质表达的pMAL-p2和pMAL-c2载体(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。
重组原核宿主细胞表达载体常用的启动子序列包括细菌噬菌体T7启动子(Studier F.W.and Moffatt B.A.，J.Mol.Biol.189113，1986)、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang et al.，Nature 275615，1978；和Goeddel et al.，Nature 281544，1979)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.，Nucl.Acids Res.84057，1980；和EP-A-36776)、以及tac启动子(Maniatis，MoLecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，p.412，1982)。一种特别有用的原核宿主细胞表达系统使用λ噬菌体PL启动子和cl857ts热敏感抑制序列(thermolabilerepressor sequence)。可从美国典型培养物保藏中心(″ATCC″)获得的其中引入PL启动子衍生物的质粒载体，包括质粒pHUB2(存在于大肠杆菌JMB9菌株(ATCC 37092))和pPLc28(存在于大肠杆菌RR1菌株(ATCC 53082))。
另外还可以将本发明所述多肽表达于酵母宿主细胞、优选来自酵母属(例如，酿酒酵母)。其他酵母属也可使用，例如毕赤酵母属或克鲁维酵母属(例如，乳酸克鲁维酵母)。酵母载体通常含有来自2μ酵母质粒复制序列起点、自主复制序列(ARS)、启动子区域、聚腺苷酸化用序列、转录终止序列和可筛选标志基因。其中适于酵母载体的合适启动子包括，例如，金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.2552073，1980)的启动子，或其它糖酵解酶的启动子(Hess et al.，J.Adv.Enzyme Reg.7149，1968；和Holland etal.，Biochem.174900，1978)，例如烯醇化酶，甘油酸-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、葡糖磷酸异构酶和葡糖激酶。其他适于酵母表达的载体和启动子的描述参见Hitzeman，EPA-73,657或Fleer et.al.，Gene，107285-195(1991)；和vanden Berg et.al.，Bio/Technology，8135-139(1990)。另一种替代方案是葡萄糖-抑制ADH2启动子，其描述见Russell et al.(J.Biol.Chem.2582674，1982)和Beier et al.(Nature 300724，1982)。通过将来自pBR322中在大肠杆菌中负责筛选和复制的DNA(Ampr基因和复制起始位点)插入上述酵母载体，可以构建出在大肠杆菌和酵母中均可复制的穿梭载体。
本发明的一个实施方案是经过修饰以含有本发明所述核酸的非人生物体。可以通过本领域已知的任一种基因转移方法对所属非人生物体和/或宿主细胞进行修饰，包括，例如，使用递送载体，如脂质及病毒载体、裸露DNA、电穿孔及微粒介导基因转移。在一个实施方案中，所述非人生物体是植物、昆虫或微生物。
例如，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备至少一种倍半萜烯合成酶的方法，该方法包括将经修饰以含有至少一种核酸的宿主培养在利于所述至少一种倍半萜烯合成酶产生的条件下，其中所述的至少一种核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。
在另一个实施方案中，所述宿主是一种植物(如烟草)、动物或微生物，还包括但不限于菌体细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。在本申请中，植物细胞和动物细胞包括用植物和动物作为宿主。例如，在本方明的一些实施方案中，表达是在经过基因修饰后的非人生物体中进行。
在一个实施方案中，使用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统表达本发明的重组多肽。用于在昆虫细胞中制备异源蛋白的杆状病毒系统的综述见Luckow and Summers，Bio/Technology 647(1988)。另外还可以使用从哺乳动物来源建立的细胞系。合适的宿主细胞系的实例包括COS-7猴肾细胞系(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.，Cell23175，1981)，L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和BHK(ATCC CRL 10)细胞系，以及源自非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCC CCL 70)的细胞系CV-1/EBNA-1(ATCC CRL 10478)，描述见McMahan et al.(EMBO J.102821，1991)。
为将DNA导入哺乳动物细胞而建立的方法现已公开(Kaufman，R.J.，Large Scale Mammalian Cell Culture，1990，pp.15-69)。其他使用可商购的试剂例如Lipofectamine(Gibco/BRL)或Lipofectamine-Plus的方法，也可用于转染细胞(Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417，1987)。此外，可以使用常规方法通过电穿孔转染哺乳动物细胞，例如Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2ed.Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描述的方法。可以用细胞毒性物质抗性作为筛选方法筛选得到稳定的转化体。Kaufman et al.，Meth.In Enzymology 185487-511，1990中描述了几种筛选方案，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)抗性。适于DHFR筛选的宿主细胞株有CHO细胞株DX-B11，该细胞株是DHFR缺陷型的(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，1980)。可以将能表达DHFR cDNA的质粒导入细胞株DX-B11，这时只有那些含有该质粒的细胞才能在合适的筛选培养基中生长。
哺乳动物细胞表达载体用的转录及翻译调控序列可以从病毒基因组切取。常用的启动子序列和增强子序列源自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接(位点)以及聚腺苷酸化位点，可用于提供哺乳动物宿主细胞表达用的其他基因元件。病毒早期和晚期启动子特别有用，因为它们容易以片段形式从病毒基因组获得，片段中还含有病毒复制起点(Fiers et al.，Nature 273113，1978；Kaufman，Meth.in Enzymology，1990)。
现已有数种本领域已知的用于制备转基因植物的方法。这些方法包括，但不限于植物原生质体电穿孔、脂质体介导的转化、聚乙二醇介导的转化、植物细胞的微注射以及使用病毒进行的转化。在一个实施方案中，使用的是粒子轰击定向基因转移。
粒子轰击定向基因转移为转化植物组织提供了一个实例。该技术中，包被了DNA的粒子或微抛射体被射出穿越细胞的物理屏障。粒子轰击可用于将DNA导入DNA包被粒子可穿透的任一靶组织，但是为了稳定转化，必须使用可再生的细胞。通常，粒子由金或钨制成。可以使用CaCl2或乙醇沉淀的方法将DNA包被在粒子上，这些方法都是本领域已知的常规方法。
DNA包被粒子用粒子枪射出。合适的粒子枪可从Bio-RadLaboratories(Hercules，CA)购买。粒子的穿透由改变参数来控制，例如爆裂强度、粒子大小或者粒子到达靶组织必须行经的距离。
包被粒子用的DNA包括适于驱动目的基因表达的表达框，其中含有与目的基因可操作连接的启动子。
粒子轰击定向基因转移方法的描述参见Tomes等人的美国专利US5,990,387。
在一个实施方案中，本发明的cDNA可用产生正义或反义RNA的方法表达。反义RNA就是与基因编码mRNA(正义RNA)反向互补的RNA。驱动反义RNA表达的载体是这样一种载体，cDNA以相对于启动子而言“相反方向”放入其中从而使得非编码链(而不是编码链)被转录。反义RNA的表达被用于下调该反义RNA互补mRNA编码的蛋白质的表达量。产生反义RNA的载体可用于制备转基因植物，如上所述。
在一个实施方案中，转染后的DNA整合入非人生物体的染色体从而得到稳定的重组系统。本领域已知的任一染色体整合方法都可用于实施本发明，包括但不限于，重组酶介导的表达框置换(recombinase-mediated cassette exchange)(RMCE)、病毒位点特异性染色体插入、腺病毒以及原核注射。
本发明的另一实施方案是制备萜类化合物和倍半萜烯化合物的方法，例如，使用本发明所述核苷酸及多肽。实施例包括用于制备至少一种萜类化合物的方法，该方法包括让至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体与核酸编码的至少一种多肽接触，该核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶，然后将制备得到的至少一种萜类化合物分离出来。另一实施例是制备至少一种萜类化合物的方法，该方法包括让至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体与至少一种基本如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽接触，然后将制备得到的至少一种萜类化合物分离出来。
本申请中使用的脂肪族焦磷酸酯萜烯前体是任意的脂肪族焦磷酸酯化合物，其是用于制备至少一种萜烯的前体，包括但不限于，牻牛儿基焦磷酸酯(GPP)，法呢基焦磷酸酯(FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯(GGPP)。
在一个实施方案中，所述的至少一种萜类化合物选自倍半萜烯。在一个实施方案中，所述的脂肪族焦磷酸酯萜烯前体是法呢基焦磷酸酯。在另一个实施方案中，所述的至少一种倍半萜烯选自二环吉马烯((E，E)-3，7，11，11-四甲基-二环[8.1.0]十一-2，6-二烯)、荜澄茄醇((1R，4S，5R，6R，7S，10R)-7-异丙基-4，10-二甲基-三环[4.4.0.0(1，5)]癸-4-醇，朱栾倍半萜((+)-(1R)-1，2，3，5，6，7，8，8A-八氢-7-异丙烯基-1@，8A@-二甲基萘)、α-荜澄茄油烯、吉马烯D和δ-杜松烯(rel-(1R，8AS)-1，2，3，5，6，8A-六氢-1-异丙基-4，7-二甲基萘)(图2)。本发明的萜类化合物可以用本领域使用的任一方法分离，包括但不限于层析、提取及蒸馏。
在一个实施方案中，可以通过改变合成酶与脂肪族焦磷酸酯萜烯前体(例如法呢基焦磷酸酯)接触时的pH值来调整产物分配或形成的实际产物。在一个实施方案中，pH为7。另一实施方案中，pH小于7，例如，6、5、4和3。
另外，本发明还提供了一种生物体(例如，微生物或植物)，该生物体用于构建一种平台，用于以高水平生产倍半萜烯合成酶底物(例如，FPP)以及将本发明核酸导入该生物体。例如，将至少一种编码倍半萜烯合成酶的本发明所述核酸引入制备FPP的非人生物体，从而完成FPP向倍半萜烯的转化以及随后的倍半萜烯的代谢产生。在一个实施方案中，这样就得到一种用于高水平生产倍半萜烯的平台。
在一个实施方案中，本发明所述核酸可用于制备编码倍半萜烯合成酶的其他核酸。例如，本发明提供了一种鉴定倍半萜烯合成酶的方法，该方法包括用本发明所述核酸构建DNA文库，从该文库中筛选出编码至少一种倍半萜烯合成酶的核酸。本发明所述核酸的文库可以用本领域已知的任一方法构建，其中用本发明核酸作为起始位点制备DNA序列，包括但不限于DNA重构(DNA shuffling)。在该方法中，用功能试验发现编码倍半萜烯合成酶的目标核酸从而从所述文库中筛选倍半萜烯合成酶。倍半萜烯合成酶的活性可以用例如本申请所述方法测定。在一个实施方案中，使用高通量筛选分析编码多肽的活性。
本申请中的“核苷酸探针”是指能够通过形成一种或多种化学键、通过互补碱基配对或者通过形成氢键，与互补序列的目标核酸结合的寡核苷酸或多核苷酸。如上所述，所述寡核苷酸探针可以含有天然(即A，G，C或T)或者修饰碱基(7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷等)。此外，核苷酸探针中的碱基可以通过磷酸二酯键以外的键连接，只要其不妨碍杂交即可。因此，寡核苷酸探针中可以含有通过磷酸二酯键以外的肽键连接的连续碱基。
本申请中的“目标核酸”是指能够与所述核苷酸探针或分子特异性杂交的核酸。可以设计探针测定目标核酸的存在与否以及目标核酸的含量。目标核酸的序列与将相应探针中导向目标的核酸序列互补。正如本领域技术人员理解的那样，所述探针还可以含有与目标不能特异性杂交的其他核酸或其他部分，例如标记物。术语目标核酸可以是探针指向的较大核酸中的特定的核苷酸序列也可以是全序列(例如，基因或mRNA)。本领域技术人员可以认识到各种条件下的所有用途。
除操作实施例或者另有说明之外，所有表示组分含量、反应条件的数值以及说明书和权利要求中使用的数值应理解为全部用“约”进行了限定。因此，除有相反说明外，说明书和权利要求中的所有数值参数都是近似值，可以根据本发明期望获得的理想特性来变动。绝对无意限制等同原则在权利要求范围上的应用，所以每一个数字参数都应该是根据有效数字的数目和常规舍入法得到的。
尽管表示本发明较宽范围时使用的数值范围和参数是近似值，但是特定实施例中列出的数值却是尽可能精确的。但是，任一数值中都必然含有因各自测量存在的标准差所不可避免带来的一定误差。下列实施例是为了阐述本发明但决不对本发明的范围构成限制。百分比是根据重量计算出的。
下列实施例是为了阐述本发明但决不对本发明的范围构成限制。
实施例材料用柚子(葡萄柚)皮作为本申请所述试验的起始原材料。皮(果皮外部有颜色的部分)内含有油腺，油腺是萜烯生物合成的部位。用新鲜采摘的成熟果实在Simone Gatto(Sicily)制得新鲜的柚子皮。将皮(3-4mm厚)剥离后，立即冷冻，而且在运输过程和随后的所有步骤中都保持冷冻以防降解。
实施例1用RT-PCR分离倍半萜烯合成酶cDNA。
将植物倍半萜烯合成酶的推导氨基酸序列进行比对，鉴定保守区并设计植物倍半萜烯合成酶-特异性寡核苷酸。为了获得较高的序列同源性，将序列分成两组(图4)。第一组包括下列酶的序列源自蕃茄(Lycopersicon esculentum)cv.VFNT cherry(Colby et al，1998)的吉马烯C合成酶、源自欧薄荷(Mentha x piperita)(Crock et al，1997)的(E)-β-金合欢烯合成酶、源自北美冷杉(Steele et al，1998)的δ-芹子烯合成酶、源自香橙(GenBank登记号AF288465)的倍半萜烯合成酶、源自烟草(Facchini和Chappell，1992)和辣椒(Back et al，1998)的5-表-马兜铃烯合成酶、源自马铃薯和Hyoscyamus muticus(Back and Chappel，1995)的vetispiradiene合成酶。第二组包括下列酶的序列源自亚洲棉(Chenet al.1995)的(+)-δ-杜松烯合成酶，源自黄花蒿的紫穗槐-4，11-二烯合成酶(Mercke et al，2000)和表-雪松醇合成酶(Merck et al，1999)以及源自北美冷杉(Steele et al，1998)的γ-葎草烯合成酶。最高序列同源性发现于序列的中间部分。选择三个含有足够保守氨基酸的区域，设计这些区域的特异性简并寡核苷酸(即，从每一比对组得到两个正向和一个反向引物)(图4)。
用从Hot Borate技术制备柚子皮得到的总RNA以及正向和反向简并引物的不同组合，进行RT-PCR。提取总RNA用的Hot Borate方法是由Wan and Wilkins(Wan et al.(1994)Anal.Biochem.223，7-12.)改进得到的。在液氮中将这些组织用研钵和杵研磨成细粉。将得到的细粉加入5ml提取缓冲液(200mM硼酸盐、30mM EGTA，10mMDTT，1％SDS，1％脱氧胆酸钠、2％PVP，0.5％乙基苯基聚乙二醇(NP40))80℃预热。将上述混合物用UltraturaxTM匀浆器均质化，然后用两层MiraclothTM滤膜(Calbiochem)过滤。将混合物在0.5mg/ml蛋白酶K(用于蛋白质/核糖核酸酶消化)存在条件下42℃孵育90分钟。然后加入KCl至1M终浓度，置于冰上孵育1小时，将混合物置于4℃离心机中10000g离心10分钟。回收上清，加入1/3体积的8M LiCl。将混合物4℃孵育过夜，然后4℃下10000g离心20分钟。弃上清，用2M LiCl洗涤沉淀，用上述条件再次离心。然后，将沉淀重悬于无RNase的蒸馏水，然后加入0.15倍体积的2M乙酸钾溶液和2.5倍体积的无水乙醇。-20℃下孵育2小时沉淀RNA，然后照前述条件离心。用80％乙醇洗涤RNA沉淀，然后重悬于无RNase的蒸馏水。
RNA浓度由260nm处的OD值估测。用琼脂糖凝胶通过查证核糖体RNA条带的整齐度测定RNA纯度。
用Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒和Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪进行RT-PCR。常用反应混合物50μl终体积中含有10μl 5cQiagen OneStep RT-PCR缓冲液、400μM每一dNTP、400nM每一引物、2μl Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme Mix、1μl RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega Co.)和1μg总RNA。热循环仪条件为50℃、30分钟(反转录)；95℃、15分钟(DNA聚合酶活化)；94℃、45秒，42-45℃、10秒(根据使用引物而定)，72℃、45-90秒(根据待扩增DNA片段长度而定)共40个循环；然后72℃、10分钟。
用1％琼脂糖凝胶测算PCR产物的大小。将出现在预期大小对应位置上的条带从凝胶上切割下来，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，然后用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆入pCR2.1-TOPO载体。然后对插入的cDNA进行DNA测序，将该序列用BLASTX算法(Altschul et al 1990)与GenBank非冗余蛋白质数据库(non redundant protein database)(NCBI)进行比对。
对预期长度(80-240bp大小)PCR产物进行DNA测序和Blast搜索表明有三种倍半萜烯合成酶片段，命名为GFTpsA、GFtpsB和GFTpsC。180-bp的GFTpsA片段用引物TpsVF1和TpsVR3扩增，115-bp的GFtpsB片段用TpsVF2和TpsVR3扩增，115-bp的GFTpsA片段用TpsVF1和TpsVR3扩增。推导的氨基酸序列表明这三种片段之间差异显著(图5)。
实施例2用5′/3′-RACE分离倍半萜烯合成酶cDNA为了分离倍半萜烯合成酶的全长序列，首先使用5′/3′-RACE方法，用MarathonTMcDNA扩增试剂盒(Clontech)，从纯化自Hot Borate技术制备总RNA的1μg mRNA起始。合成cDNA的质量较差，基本上都是很小的cDNA(平均大小为0.5Kb)。但是，用该cDNA，通过基因特异性引物得到了GFTpsB和GFTpsC的3’末端，GFTpsB使用GFTpsBRF1和GFTpsBRF2，GFTpsC使用GFTpsCRF1和GFTpsCRF2(参见表1)。用硫氰酸胍/苯酚提取方法制备的mRNA得到了较高质量的cDNA，平均大小为2Kb，从而可以用基因特异性引物GFTpsCRR1和GFTpsRR2(参见表1)分离GFTpsC的5′-末端序列，从而完成该克隆的全长序列。GFTpsB的5′-末端和GFTpsA的5′-末端及3′-末端用该方法不能获得。
硫氰酸胍/苯酚提取法采用Chomczynski和Sacchi所述技术，使用ThermoHybaid的RNACleanTM溶液(Chomczynski，P.，and Sacchi，N.，(1987)Anal.Biochem.162，156-159.)。简而言之，在液氮中将2g冷冻组织用研钵和杵研磨成细粉。将得到的细粉转移到20mlRNACleanTM溶液，将悬液用UltraturaxTM匀浆器均质化，然后用MiraclothTM滤膜(Calbiochem)过滤。加入0.1倍体积的氯仿后，将试管置于冰上，然后4℃下12000g离心20分钟。回收上层水相，加入1倍体积的异丙醇。-20℃孵育20分钟后，将样品在4℃下12000g离心20分钟。将得到的白色沉淀大块用70％乙醇洗涤，室温干燥。将这种含有总RNA的沉淀立即用FastTrack2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen)通过oligodT-纤维素亲和层析进行mRNA纯化。按照厂商推荐方法进行，除下述改动外在将总RNA重悬于裂解缓冲液后，将样品由65℃改为100℃下加热。
cDNA 3′和5′末端快速扩增(RACE)用MarathonTMcDNA扩增试剂盒(Clontech)完成。该方法从合成第一链cDNA开始，用oligo(dT)引物从mRNA起始。第二链合成后，将特异性衔接子连接于双链cDNA(ds cDNA)末端。该方法提供了一种衔接子连接的ds cDNA的非克隆文库。用纯化的柚子mRNA(1μg)作为起始材料。用琼脂糖凝胶测算cDNA的质和量。
使用Advantage2聚合酶Mix，用基因特异性和衔接子特异性寡核苷酸的组合扩增cDNA的3’-或5’-末端。常规RACE反应混合物50μl终体积中含有5μl 10×cDNA PCR反应缓冲液(clontech)、200nM每一dNTP、1μl Advantage2聚合酶Mix、200μM衔接子特异性引物(Clontech)、200μM基因特异性引物(参见表1)和5μl经50-250倍稀释后的衔接子连接的cDNA。扩增在Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪中进行。热循环仪条件为94℃、1分钟；94℃、30秒，72℃、2-4分钟，共5个循环；94℃、30秒，70℃、2-4分钟，共5个循环；94℃、30秒，68℃、2-4分钟，共20个循环。必要时用巢式衔接子特异性引物(Clontech)和巢式基因特异性引物进行第二轮扩增。
按照上文RT-PCR产物使用的方法，对扩增产物进行评定、亚克隆及序列分析。
表13′/5′-RACE试验中使用的引物
发现用3′-RACE得到的部分GFTpsB cDNA与公共数据库(GeneBank登记号AF288465)中的及分离自香橙的推定萜烯合成酶cDNA之间具有高度序列同一性。这种萜烯合成酶的特异性引物设计为根据香橙(C.junos)萜烯合成酶非编码区设计一个正向和反向引物对(junosF1和junosR1)，根据含有起始和终止密码子在内的编码区设计一正向和反向引物对(junosF2和junosR2)。用引物对junosF1和junosR1对柚子MarathonTMcDNA文库进行PCR扩增没有得到任何扩增子。用引物对junosF2和junosR2扩增出了一1.6Kb的片段。DNA测序证实该PCR产物是GFTpsB克隆的1669-bp全长倍半萜烯合成酶(图6)。
实施例3cDNA文库筛选和EST测序为了得到PCR方法获得的部分克隆的全长cDNA，构建了从柚子皮mRNA制备的cDNA文库。
用Uni-ZAPXR文库构建试剂盒(Stratagene)，按照厂商推荐方法，从7.5μg柚子皮mRNA(用硫氰酸胍/苯酚法制得)起始进行cDNA合成和文库构建。文库的初始滴度为2×107PFU(噬斑形成单位)，插入片段的平均长度为1.1Kb。
使用两种方法从上述cDNA文库分离编码cDNA的倍半萜烯合成酶EST测序以及用DNA探针筛选。就EST(已表达序列标志)测序而言，使用文库的一部分，用Stratagene的大量切除法(massexcision protocol)切除Uni-ZAP XR载体中的pBluescript噬菌粒。随机挑取得到的转化菌落(576)，纯化质粒。对于每一克隆都用T3引物进行一测序反应。首先对序列进行编辑除去载体序列，然后用BLASTX算法(Altschul et al 1990)与GenBank非冗余蛋白质数据库(NCBI)进行比对。
用地高辛(DIG)标记的DNA探针对文库进行筛选。该探针是用PCR DIG(地高辛)探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR扩增将D1G-dUTP掺入DNA片段而合成的。从一等份文库中扩增出149-bp的GFTpsA-来源DNA探针，使用的引物为正向引物GFTpsAproF(SEQ ID NO51)(5′-ACGATTTAGGCTTCCCTAAAAAGG-3′)和反向引物GFTpsAproR(SEQ ID NO52)(5′-TATTATGGAATATTATGCACACCAC-3′)。从pET-GFTpsB2-2质粒中扩增出1036-bp的GFTpsB-来源探针，使用的引物为正向引物junosF2(SEQ ID NO53)(5′-AAATGTCCGCTCAAGTTCTAGCAACGG-3′)和反向引物GFTpsBRR2(SEQ ID NO54)(5′-GTTTGAGCTCTTCAAAGAAACC-3′)。从pET-GFTpsC质粒中扩增出1008-bp的GFTpsC-来源DNA探针，使用的是正向引物GFTpsCpetF1(SEQ IDNO55)(5′-ATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCC-3′)和反向引物GFTpsCRR1(SEQ ID NO56)(5′-GTTGCTAATATCCCACCTTTTGATAGC-3′)。
探针在40℃下在Dig Easy Hyb杂交溶液(Roche Diagnostics)中杂交出噬斑挑取物(plaques lifts)，噬斑挑取物制备自含有5,000-25,000PFU的平板。通过化学发光检测膜上的探针-目标杂合体，使用抗-地高辛-碱性磷酸酶(Roche Diagnostics)和CDP-Star碱性磷酸酶底物(Roche Diagnostics)，用VersaDoc Imaging System(BioRad)显色。
从琼脂糖平板上挖髓取出阳性信号的噬菌体，进行第二轮筛选，如果必要在进行第三轮筛选，直至获得单一噬斑阳性信号。体内切割阳性分离物，按照上述方法对插入片段测序。
用从GFTpsA、GFTpsB和GFTpsC制备的DNA探针对文库进行筛选。该方法生产出三种不同倍半萜烯合成酶cDNA。其中两种此前已有克隆一种克隆名为GF2-30-1，是GFTpsC cDNA的5’-末端300-bp截短形式；第二种名为9-13-6，是GFtpsA的部分克隆，与其他倍半萜烯合成酶相比5’-末端截短了大约168-bp。与上述通过RT-PCR得到的部分GFTpsA克隆相比，9-13-6克隆提供了618-bp 5’-末端附加序列的信息。在其3’-末端，9-13-6克隆也是不完整的。大约丢失了680个核苷酸，取而代之的是一功能未知的600-bp片段。筛选获得的第三种编码cDNA的倍半萜烯合成酶，GF2-5-11，其编码出一种新的名为GFTpsD的倍半萜烯合成酶。该克隆5’-末端截短，但是用表1中的引物通过5′-RACE回收到了所丢失的414-bp。然后，从MarathonTMcDNA文库扩增出全长GFTpsD，并将其克隆入上述细菌表达载体。几种全长GFTpsDcDNA的DNA序列分析发现有两种倍半萜烯合成酶密切相关，只有极小的序列差异，将其命名为GFTpsD1和GFTpsD2(图6)。这两种变体的推导氨基酸序列彼此间相差4个碱基。
就EST测序方法而言，对576个克隆进行了测序。其中只有3个克隆编码推定萜烯合成酶-样蛋白，更确切地说，是两种不同的倍半萜烯合成酶-样蛋白和一种单萜合成酶-样蛋白。两个倍半萜烯合成酶-样克隆中的一个(克隆GF002-G3)此前被鉴定为克隆GFTpsD1。第二个克隆(克隆GF006-G7)是一种截短的cDNA，其编码一种新的名为GFTpsE的倍半萜烯合成酶。该克隆在5’-末端也是截短的(大约800bp)，但是该丢失的片段可以按照下述两个步骤通过5′-RACE扩增得到。第一个5′-RACE使用引物GFTpsERR1和GFTpsERR2(参见表1)提供了500个附加的5’-末端核苷酸，第二个5′RACE使用引物GFTpsERR3和GFTpsERR4(参见表1)提供了丢失的5’-末端DNA序列，重构得到了全长GFTpsE cDNA(图6)。
实施例4质粒构建和酶表达表达质粒的构建将cDNA亚克隆入pET11a表达质粒(Novagen)，进行倍半萜烯合成酶的功能表达。就GFTpsB，GFtpsD和GFTpsE而言，通过PCR扩增全长cDNA，以向5’-末端导入其中含有起始密码子的Nde1位点，在3’-末端紧接终止密码子之后导入BamH1位点。就GFTpsB而言，使用正向引物GFTpsBNde1(SEQ ID NO57)5′-GCATGTTCCATATGTCCGCTCAAGTTCTAGCAACGGTTTCC-3′(Nde1位点用斜体表示，起始密码子用下划线标出)和反向引物GFTpsBBam(SEQ ID NO58)5′-CGCGGATCCTCAGATGGTAACAGGGTCTCTGAGCACTGC-3′(BamH1位点用斜体表示，起始密码子用下划线标出)。同样，正向引物GFTpsDNde1(SEQ ID NO59)5′-GCATGTTCCATATGTCGTCTGGAGAAACATTTCGTCC-3′和反向引物GFTpsDBam(SEQ ID NO60)5′-CGCGGATCCTCAAAATGGAACGTGGTCTCCTAG-3′用于GFTpsD；以及正向引物GFTpsENde1(SEQ ID NO61)5′-GCATGTTCCATATGTCTTTGGAAGTTTCAGCCTCTCCTG-3′和反向引物GFTpsEBam(SEQ ID NO62)5′-CGCGGATCCTCATATCGGCACAGGATTAATAAACAAAGAAGC-3′用于GFTpsE。
扩增反应是使用Pfu DNA聚合酶(Promega)在含下列物质的50μl终体积中进行的5μl Pfu DNA聚合酶10×缓冲液、每一种dNTP各200μM、正向和反向引物各0.4μM、2.9单位Pfu DNA聚合酶以及5μl经100倍稀释的cDNA(按照上述方法用MarathonTMcDNA扩增试剂盒(Clontech)制备)。热循环条件为95℃、2分钟；95℃、30秒，55℃、30秒，72℃、4分钟，共25个循环；然后72℃、10分钟。PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)洗脱，接着用Nde1和BamH1消化，然后将其连接入经同样消化后的pET11a质粒。
就GFTpsC-pET11a表达载体的构建而言，分别进行两次PCR扩增，使插入片段与Nde1和BamHI粘性末端侧接。第一次PCR在同上所述条件下进行，使用正向引物GFTpsCpETF1(SEQ ID NO63)5′-TAATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCCTC-3′和反向引物GFTpsCpETR1(SEQ ID NO64)5′-AAAAGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3′，第二次PCR使用正向引物GFTpsCpETF2(与GFTpsCpETF1相比5’-末端少了AT)(SEQ ID NO65)5′-ATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCCTC-3′和反向引物GFTpsCpETR2(与GFTpsCpETR1相比5’-末端多出了GATC)(SEQ ID NO66)5′-GATCAAAAGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3′。将两次PCR产物用上述方法纯化后合并，通过下述操作变性煮沸5分钟然后冰上冷却5分钟。将得到的cDNA直接连接入pET11a质粒。
起初将连接产物转化入JM109大肠杆菌细胞，通过限制性酶切消化和DNA测序验证构建体。
倍半萜烯合成酶表达就蛋白表达而言，将含倍半萜烯合成酶cDNA的pET11a质粒和pET11a空质粒转化入BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)。将得到的单菌落接种5ml LB培养基。37℃孵育5-6小时后，将培养物转移到20℃孵箱，放置1小时平衡。加入0.5mM IPTG诱导蛋白质的表达，然后将培养物在20℃孵育过夜。
第二天，离心收集细胞，重悬于0.5ml提取缓冲液(50mMMOPSO pH7，5mM EDTA，5mM EDTA，10％甘油)，然后超声处理3次，每次30秒。18,000g离心30分钟沉淀细胞碎片，回收含可溶蛋白的上清液。通过下述操作对倍半萜烯合成酶的表达进行评估将蛋白提取物用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离，然后用考马氏亮蓝染色，然后与用空质粒转化细胞得到的蛋白提取物进行比较。
所有构建体都观察到了一具有预期计算分子量的明显条带，但是用空质粒转化的大肠杆菌得到的可溶性蛋白中没有出现该条带。
实施例4酶功能测定酶促试验在密封的玻璃试管中进行，使用终体积中含50-100μl蛋白提取物的提取缓冲液，该提取缓冲液补加了15mM MgCl2和100-250μM FPP(Sigma)。培养基上层用1ml戊烷覆盖，试管置于30℃孵育过夜。回收含有倍半萜烯的戊烷相，用第二体积的戊烷提取培养基。将合并后的戊烷级分在氮中浓缩，用Hewlett-Packard6890Series GC系统的气相色谱分析，使用内径0.25mm长30m的SPB-1(Supelco)毛细管层析柱。载气为恒定流速1.6ml/min的He气。注射按2∶1的比例分开进行，注射器温度设定为200℃，烤箱(oven)程序设定为从80℃(保持0分钟)开始以7.5℃/分钟的速率升至200℃(保持0分钟)，接着以20℃/分钟的速率升至280℃(保持2分钟)。检测使用火焰离子化检测器。在权威标准能够获得的情况下，化合物识别是根据与权威标准具有相同保留时间进行的。为了证实产物身份(identities)，使用Hewlett-Packard6890GC-四极质谱检测器，用安装有内径0.25mm长30m的SPB-1(Supelco)毛细层析柱的组合毛细(combined capillary)GC-MS对样本进行分析。烤箱程序设定为从80℃(保持0分钟)以7.5℃速率升至200℃，He气流的恒定流速为1.5ml/min。用2200V电压的电子倍增器记录70eV时的光谱。
用该试验测定不同重组酶的酶活性，使用可溶性蛋白级分，以法呢基-二磷酸酯作为底物。从所测的所有克隆获得倍半萜烯合成酶活性，生成的产物用保留时间以及气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)(图7)来定性。GFTpsB cDNA编码出的倍半萜烯合成酶，产生主产物二环-吉马烯(图3)和至少15种次要的倍半萜烯链烯烃或氧化的倍半萜烯例如δ-杜松烯(图3)(由二环-吉马烯热重排得到的二环-榄香烯(图3)，也出现在了GC图中)。GFTpsC cDNA编码出一种生成多产物的倍半萜烯合成酶，主产物鉴定为荜澄茄醇(图3)。该酶还生产出了占相当大比例的3种其他倍半萜烯-(-)-α-荜澄茄油烯和2种氧化后的倍半萜烯，以及少量的至少11种倍半萜烯链烯烃或氧化后的倍半萜烯。GFtpsD编码出的倍半萜烯合成酶，可以生产出主产物朱栾倍半萜。10个其他的小峰也被鉴定为倍半萜烯链烯烃或醇。其中，β-榄香烯是吉马烯A的热降解产物。GFTpsE编码出的倍半萜烯合成酶，生产出的是倍半萜烯化合物与δ-杜松烯(图3)的复合混合物，其中δ-杜松烯以微弱优势成为含量最丰富的组分。另外，从GFTpsE生成的产物中还鉴定出了荜澄茄醇和吉马烯D(图3)。
上述试验中，分离的倍半萜烯合成酶表现出生成多产物的特性。例如，荜澄茄醇合成酶和δ-杜松烯可以生成占相对较大比例的3或5种产物。二环吉马烯合成酶产生了主产物倍半萜烯和几种微量的次产物。
权利要求
1.一种分离的核酸，其选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6或SEQ ID NO7所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQID NO1或SEQ ID NO2所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。
2.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸含有基本上如SEQ ID NO6或SEQ ID NO7所示核苷酸序列的核酸。
3.权利要求2所述的分离的核酸，其中所述核苷酸序列与SEQID NO6或SEQ ID NO7之间具有至少85％的同一性。
4.权利要求3所述的分离的核酸，其中所述核苷酸序列与SEQID NO6或SEQ ID NO7之间具有至少90％的同一性。
5.权利要求4所述的分离的核酸，其中所述核苷酸序列与SEQID NO6或SEQ ID NO7之间具有至少95％的同一性。
6.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸含有SEQ IDNO6的核苷酸序列。
7.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸含有SEQ IDNO7的核苷酸序列。
8.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸编码基本上如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的多肽。
9.权利要求8所述的分离的核酸，其中所述多肽与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2之间具有至少85％的同一性。
10.权利要求9所述的分离的核酸，其中所述多肽与SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之间具有至少90％的同一性。
11.权利要求10所述的分离的核酸，其中所述多肽与SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之间具有至少95％的同一性。
12.权利要求11所述的分离的核酸，其中所述核酸编码SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的多肽。
13.一种由权利要求1所述核酸编码的多肽。
14.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸能够在中度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交。
15.权利要求14所述的分离的核酸，其中所述核酸能够在高度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交。
16.权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸分离自柑桔类植物。
17.权利要求16所述的分离的核酸，其中所述柑桔类植物是柚子或橙子。
18.一种载体，含有权利要求1所述的核酸。
19.权利要求18所述的载体，其中所述载体是病毒载体或质粒。
20.一种宿主细胞，含有权利要求1所述的核酸。
21.一种经修饰以含有权利要求1所述核酸的非人生物体。
22.权利要求21所述的非人生物体，其中所述非人生物体是采用电穿孔或粒子介导基因转移修饰的。
23.权利要求21所述的非人生物体，其中所述生物体是植物或微生物。
24.一种制备重组宿主细胞的方法，该方法包括将权利要求18所述载体导入宿主细胞。
25.一种制备多肽的方法，该方法包括将权利要求20所述宿主细胞培养于能够产生所述多肽的条件下。
26.权利要求25所述的方法，其中所述宿主细胞选自菌体细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。
27.权利要求25所述的方法，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞和微生物细胞。
28.一种分离的多肽，含有基本如SEQ ID NO1或SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
29.权利要求28所述的多肽，其中所述的氨基酸序列与SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之间具有至少85％的同一性。
30.权利要求29所述的多肽，其中所述的氨基酸序列与SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之间具有至少90％的同一性。
31.权利要求30所述的多肽，其中所述的氨基酸序列与SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之间具有至少95％的同一性。
32.一种制备至少一种倍半萜烯合成酶的方法，该方法包括将经修饰以含有至少一种核酸序列的宿主在能够产生所述至少一种倍半萜烯合成酶的条件下培养，其中所述的至少一种核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。
33.权利要求32所述的方法，其中所述核酸含有基本上如SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQID NO10所示的核苷酸序列。
34.权利要求32所述的方法，其中所述核酸含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的核苷酸序列。
35.权利要求32所述的方法，其中所述核酸编码基本上如SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQID NO5所示的多肽。
36.权利要求32所述的方法，其中所述核酸编码SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的多肽。
37.权利要求32所述的方法，其中所述的宿主是植物或微生物。
38.权利要求32所述的方法，其中所述的宿主选自菌体细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。
39.一种制备至少一种萜类化合物的方法，该方法包括A)让至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体与由核酸编码的至少一种多肽接触，该核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶；B)分离A)中制得的至少一种萜类化合物。
40.权利要求39所述的方法，其中所述至少一种萜类化合物选自倍半萜烯。
41.权利要求39所述的方法，其中所述至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体是法呢基焦磷酸酯。
42.权利要求41所述的方法，其中所述至少一种倍半萜烯选自二环吉马烯、荜澄茄醇、朱栾倍半萜、α-荜澄茄油烯、吉马烯D和δ-杜松烯。
43.权利要求41所述的方法，其中所述至少一种倍半萜烯选自二环吉马烯、荜澄茄醇、朱栾倍半萜和δ-杜松烯。
44.权利要求39所述的方法，其中所述核酸含有基本上如SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQID NO10所示的核苷酸序列。
45.权利要求39所述的方法，其中接触时的pH值为7。
46.权利要求39所述的方法，其中接触时的pH值小于7。
47.权利要求39所述的方法，其中所述至少一种萜类化合物是通过选自提取和蒸馏的至少一种方法分离的。
48.权利要求39所述的方法，其中所述至少一种多肽是通过培养含有所述核酸的宿主细胞制备的，其中所述宿主细胞选自菌体细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。
49.权利要求39所述的方法，其中所述至少一种多肽是通过培养含有所述核酸的宿主细胞制备的，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞和微生物细胞。
全文摘要
本发明涉及倍半萜烯合成酶及其制备和使用方法。一个实施方案中，本发明提供了含有文中所述核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列编码至少一种倍半萜烯合成酶。另一实施方案中，本发明还提供了倍半萜烯合成酶及其制备和使用方法。例如，本发明的倍半萜烯合成酶可用于将法呢基焦磷酸酯转化为各种氧化的和脂肪族倍半萜烯，包括朱栾倍半萜、二环－吉马烯、荜澄茄醇和δ－杜松烯。
文档编号C12N9/00GK1703507SQ200380100941
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月2日 优先权日2002年10月4日
发明者米歇尔·沙尔克, 安东尼·克拉克 申请人:弗门尼舍有限公司