生物传感器的制作方法

专利名称：生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及对试样溶液中所含的底物(测定对象)进行测定的生物传感器。本发明特别涉及对试样溶液中的葡萄糖浓度进行测定的生物传感器。
背景技术：
利用生物传感器获得的底物浓度等测定值的测定误差由试样溶液中所含的测定对象物(底物)以外的其它物质引起。
例如，为了对血液试样中的葡萄糖浓度进行测定而使用电流检出型电化学传感器的情况下，血液中所含的抗坏血酸(维生素C)、尿酸、乙酰氨基苯酚等易氧化的化学物质被该传感器的电极(工作极)电化学氧化而产生的电流与对应于葡萄糖的电流重叠，所以葡萄糖浓度的测定值产生了正误差。
这些化合物的血中浓度因人而异，即使是同一个人，因为时间的变化，也很难预先推测出将要产生的测定误差并进行修正。
产生上述误差的化学物质被称为易氧化性阻碍物质(Oxidizable InterferingCompounds；以下简称为OIC)，该技术领域中为除去这些物质产生的影响，尝试了各种对策。
对策1为例如美国专利第6340428号揭示的方法，该方法中除了工作极及配极之外，在生物传感器的基板上设置了对OIC进行测定的第三电极，藉此对OIC的影响进行修正。
此外，作为除去OIC的影响的方法，开发了在工作极上设置阻断OIC向工作极扩散的膜，藉此抑制OIC的电流的方法及生物传感器。这种生物传感器的例子例如有Wang，J.等著的[因铑催化的碳糊传感器和选择性渗透的聚(邻苯二胺)涂层的结合而选择性和灵敏度有所提高的第一代酶电极(enhanced selectivity andsensitivity of first-generation enzyme electrodes based on the coupling of rhodinizedcarbon paste transducers and permselective poly(o-phenylenediamine)coatings)，电解分析，8卷，1996年，p1127-1139]所揭示的使用了聚(邻苯二胺)膜的生物传感器。
另一方面，由于血液中所含的血细胞和蛋白等肽易吸附于电极表面，即使这些肽吸附于电极表面也会引起电流阻碍。这些吸附性阻碍物质(以下简称为AIC)如果吸附于葡萄糖传感器的电极(工作极)，则实效的电极面积减少，其结果是，基于与葡萄糖有关的氧化还原反应的电流减少，在测定中产生负误差。该电流减少的程度根据AIC在电极表面的吸附程度而变化。由于该吸附程度还随试样溶液中的AIC浓度而变化，所以很难对电流下降的程度进行预测，并修正产生的误差。
为了排除AIC的影响，尝试了各种对策。例如，揭示了在生物传感器的电极系上设置血细胞分离用滤纸，藉此通过物理方法有效除去血细胞等的方法(例如，参考美国专利第6033866号)。
此外，通过在生物传感器的电极系表面涂布羧甲基纤维素等亲水性高分子，也可抑制血细胞和蛋白等AIC的吸附(例如，参考日本专利特开平3-202764号公报)。
发明的揭示但是，上述以往的生物传感器中，如果以含有OIC和AIC的流体作为试样溶液，则对工作极中的上述OIC的氧化的抑制及上述AIC对电极(工作极)表面的吸附的抑制并不一定完全，在底物浓度的测定中仍会发生测定误差，估计会出现试样溶液中的底物浓度比实际浓度低或高的问题。或者，为了进行OIC的氧化电流的修正及AIC的过滤，出现传感器结构变得复杂的问题。
本发明的目的是解决这些以往技术中存在的问题，提供能排除生物传感器中的测定误差、可迅速且高精度地对试样溶液中的底物进行测定的结构简单的生物传感器。
为了解决上述以往存在的问题，本发明提供了能够正确且重现性良好地测定试样溶液中的底物浓度的生物传感器，该生物传感器具备包含至少一对电极的电极系、用于支承上述电极系的至少一块绝缘性基板、至少在上述电极系的工作极上设置的第一反应层及设置于上述第一反应层上的第二反应层。
上述生物传感器中，第一反应层包含含有可结合或吸附于电极的官能团及疏水性烃基的有机化合物。第二反应层包含可与第一反应层的疏水性部分结合或吸附的亲水亲油性类脂。
此外，本发明的生物传感器的特征是，具备被负载于第一反应层及第二反应层构成的二成分膜的试剂系，该试剂系至少包含膜结合型吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶及电子传递体。
较好的实施方式中，第一反应层及第二反应层分别形成为单分子层。
较好的实施方式中，上述有机化合物为以下的通式(1)、(2)或(3)表示的化合物，HS-(CH2)n-X(1)X-(CH2)n-S-S-(CH2)n-X (2)S-(CH2)n-X (3)上述通式(1)、(2)及(3)中，n为1～20的整数，X为甲基、苯甲基、氨基苯甲基、羧基苯甲基或苯基，n更好为5～15的整数。
较好的实施方式中，上述亲水亲油性类脂为L-α-磷脂酰胆碱，β-油酰-γ-棕榈酰。
较好的实施方式中，上述电子传递体为1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓(phenazinium)。
较好的实施方式中，上述工作极含有金、铂或钯。
较好的实施方式中，上述电极系的配极不含有金、铂或钯的任一种。
较好的实施方式中，上述电极系的工作极的整个表面和配极的表面的一部分被上述二成分膜覆盖。更好的是配极的未被二成分膜覆盖的部分的面积大于工作极的面积。
较好的实施方式中，只有上述电极系的工作极的表面被二成分膜覆盖。
较好的实施方式中，上述一对电极分别被支承于互相对向设置的2块绝缘性基板的对向面上，藉此在其间形成上述试样溶液的供给通路。
较好的实施方式中，上述试剂系中还含有pH缓冲剂。
本发明还提供了生物传感器的制造方法。本发明的生物传感器的制造方法包括在绝缘性基板上形成包含至少一对电极的电极系的步骤；至少在上述电极系的工作极上设置第一反应层的步骤，该步骤中使包含含有可结合或吸附于电极的官能团及疏水性烃基的有机化合物的溶液与上述工作极接触；以及在上述第一反应层上设置第二反应层的步骤，该步骤中使含有亲水亲油性类脂的溶液与上述第一反应层接触；上述含有有机化合物的溶液及上述含有亲水亲油性类脂的溶液中的至少一种包含电子传递体，上述含有亲水亲油性类脂的溶液还含有膜结合型吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，第一反应层及第二反应层分别形成为单分子层。
更好的实施方式中，上述有机化合物为以下的通式(1)、(2)或(3)表示的化合物，HS-(CH2)n-X(1)X-(CH2)n-S-S-(CH2)n-X (2)S-(CH2)n-X (3)上述通式(1)、(2)及(3)中，n为1～20的整数，X为甲基、苯甲基、氨基苯甲基、羧基苯甲基或苯基，n更好为5～15的整数。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，上述亲水亲油性类脂为L-α-磷脂酰胆碱，β-油酰-γ-棕榈酰。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，上述电子传递体为1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，上述工作极含有金、铂或钯。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，上述电极系的配极不含有金、铂或钯的任一种。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，上述电极系的工作极的整个表面和配极的表面的一部分被上述第一及第二反应层覆盖。更好的是配极的未被上述第一及第二反应层覆盖的部分的面积大于工作极的面积。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，只有上述电极系的工作极的表面被第一及第二反应层覆盖。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，上述一对电极分别被支承于互相对向设置的2块绝缘性基板的对向面上，藉此在其间形成上述试样溶液的供给通路。
本发明的生物传感器的制造方法的较好的实施方式中，上述含有有机化合物的溶液及上述含有亲水亲油性类脂的溶液中的至少一种还含有pH缓冲剂。
本发明的基础是本发明者发现，利用含有结合于基体上的电极表面的硫原子的有机化合物膜及设置于该有机化合物膜上的亲水亲油性类脂膜构成的二成分膜，吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶(以下简称为PQQ-GDH)能够稳定地被固化于上述电极表面。
作为有效防止OIC对在电极表面引发的氧化还原反应的影响及AIC在电极表面吸附的影响，且与电极之间只选择性地进行与葡萄糖有关的氧化还原反应的手段，本发明使用了设置于电极上的上述二成分膜和与该二成分膜结合或吸附的酶，即膜结合型PQQ-GDH。据本发明者所知，这种二成分膜和膜结合型PQQ-GDH用于葡萄糖传感器的例子在本发明以前还没有出现过。
这样，通过使用在形成于电极上的二成分膜中固定了PQQ-GDH的生物传感器用电极，且使适当的电子传递体在该二成分膜中组合使用，能够实现可对作为底物的葡萄糖进行高选择性地电化学氧化的体系。
一般，根据其反应方式，催化葡萄糖的选择性氧化反应的酶大致被分为葡萄糖氧化酶(GOx)及葡萄糖脱氢酶(GDH)。众所周知，GDH包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖型GDH(NAD-GDH)和PQQ-GDH。
此外，已知的是PQQ-GDH又包括以往适用于生物传感器的公知的水溶性PQQ-GDH和与此不同的膜结合型PQQ-GDH(例如，参考Oubrie等.，The EMBOJournal Vol.18 No.19 pp.5187-5194，1999以及松下等.，Biochemistry 1989，28(15)，6276-80)。膜结合型PQQ-GDH是指其蛋白质分子表面具有疏水性区域、该疏水性区域例如通过疏水互相作用与细胞膜这样的脂质双层的疏水性部分进行高亲和性的结合、实现了生物体内稳定地固定于生物体膜的PQQ-GDH。另一方面，GOx及NAD-GDH目前还未知有这种膜结合型酶存在，只能利用其水溶性酶。
这些酶，即GOx、NAD-GDH及PQQ-GDH中，膜结合型PQQ-GDH最适合固定于本发明的以含硫的有机化合物/亲水亲油性类脂为主成分的二成分膜。这是因为膜结合型能够将催化葡萄糖的选择性氧化反应的酶稳定地结合或吸附于上述二成分膜的疏水性部分。另一方面，水溶性酶由于在酶分子表面没有实质性的疏水性区域，所以很难以高亲和性与上述二成分膜的疏水性部分结合。
本发明提供了排除以含有OIC及AIC的流体为试样溶液的生物传感器中的因上述OIC在工作极被氧化而产生的测定误差，以及因该AIC吸附于电极(工作极)表面而产生的测定误差，能够迅速且高精度地对试样溶液中的底物进行测定的结构简单的生物传感器。
本发明的生物传感器利用上述二成分膜抑制了OIC在工作极的氧化及AIC对电极(或工作极)表面的吸附，且通过实现所用酶和工作极之间的电子传递，排除了目前未解决的底物浓度测定中的测定误差。特别需要说明的是，本发明不会因为氧而引起来自PQQ-GDH的电子的接收，所以还具有不会发生以往使用葡萄糖氧化酶时的溶存氧对葡萄糖氧化产生影响的现象的优点。
对附图的简单说明

图1为本发明的实施方式之一的生物传感器的除去了试剂系的分解立体图。
图2为本发明的实施方式之一的生物传感器的长度方向的截面图。
图3为表示本发明的实施方式之一的生物传感器的制作流程的一部分和本发明的简单原理的模式图。
图4表示本发明的生物传感器所用的电子传递体的例子，(A)表示电子传递体(由图中的A表示)与聚合物主链结合的形态，(B)表示电子传递体(全部)之间互相结合形成聚合物链的形态。
图5为表示本发明的实施方式之一获得的电流对Hct的依赖性的图。
图6为表示本发明的实施方式之一获得的电流对抗坏血酸浓度的依赖性的图。
图7为本发明的实施方式之一的生物传感器的除去了试剂系的分解立体图。
实施发明的最佳方式本发明的实施方式之一的生物传感器具备包含至少一对电极的电极系；至少一块支承上述电极系的绝缘性基板；至少在上述电极系的工作极上设置的第一反应层，该第一反应层包含含有可结合或吸附于电极的官能团及疏水性烃基的有机化合物；设置于上述第一反应层上的第二反应层，该第二反应层含有可结合或吸附于该第一反应层的疏水性部分的亲水亲油性类脂；以及负载于上述第一及第二反应层构成的二成分膜的试剂系，该试剂系至少含有膜结合型吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶及电子传递体。
以下，参考附图对本发明进行说明。
图1是本发明的实施方式之一的生物传感器的除去了二成分膜及内包于其中的试剂系的状态下的分解立体图。基板1上设置了工作极2及配极3。为了形成这些电极，在玻璃制电绝缘性基板1上放置电极图案掩膜，该掩膜由覆盖需形成电极图案的基板部分以外的基板表面的树脂形成，可在其上进行金等金属的溅射。这种方法是本领域常用的方法。本申请中，“工作极”是指主要引发电子传递体的氧化反应的电极(阳极)，“配极”是指主要引发其它反应的电极(阴极)。但是，将还原反应用于底物的检测及/或定量时，所指阳极和阴极则与上述相反。
如美国专利第6340428号所述，例如在树脂制基板1上通过丝网印刷印刷金属浆料也可形成电极图案，可用这种方法替代上述方法。为使金和玻璃很好地粘合，可在金和玻璃之间形成铬层以提高两者间的粘合性。这些工作极2及配极3分别通过簧片(lead)4和5与生物传感器外部的测定用端子电连接。本说明书中，为了便于说明有时并不特别区分工作极2及配极3，而是简单地称为电极。从图1可看出，电极和簧片大多数情况下采用同样的材料一体形成，但这种情况下，本发明中的电极是指与这种结构中的试样溶液接触的部分。
以下，参考图2及图3进行说明。图2为本发明的实施方式之一的生物传感器的长度方向的截面图。图3为表示本发明的实施方式之一的生物传感器的制作流程的一部分和本发明的简单原理的模式图。
在形成于基板1上的工作极2上形成含有硫原子的有机化合物膜10，在该膜10上再形成亲水亲油性类脂膜11。作为试剂系的PQQ-GDH这样的酶及1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓这样的电子传递体被内包于膜10及膜11形成的二成分膜。
如图3所示，含有硫原子的有机化合物膜10通过硫原子(图中用S表示)与工作极2结合。上述通式表示的有机化合物具有疏水性部分(图3中用一条折线表示)。上述有机化合物为了与上述亲水亲油性类脂一起在基板上形成均一的二成分层，最好使用该疏水性部分均一成长的化合物。这样易于在基板上形成上述有机化合物的单分子层，其结果是，二成分层形成均一，能够获得稳定的阻断效果。形成上述疏水性部分的烃链的长度依赖于上述通式(1)、(2)或(3)中的n的大小。n较好为1～20的整数，更好为5～15的整数。从易于排除OIC对电流的阻碍，同时易于检测基于葡萄糖的氧化还原的电流的观点出发，最合适的n可从上述范围内适当选择。
含有硫原子的有机化合物较好为上述通式(1)、(2)或(3)表示的化合物。可例举乙基硫醇、丙基硫醇、丁基硫醇、戊基硫醇、己基硫醇、庚基硫醇、辛基硫醇、壬基硫醇、癸烷硫醇、十一烷硫醇、十二烷硫醇、十三烷硫醇、十四烷硫醇、十五烷硫醇、十六烷硫醇、十七烷硫醇、十八烷硫醇、十九烷硫醇、二十烷硫醇及它们分别对应的二硫化物(相同结构的上述硫醇具有S-S偶合结构)，以及它们的末端为苯甲基、氨基苯甲基、羧基苯甲基或苯基等的硫醇及二硫化物等。这些有机化合物可作为市售品从本领域普通技术人员周知的供货商处获得。上述硫醇化合物及二硫化物化合物会不可逆地牢固地吸附、结合于金属表面，实质上形成单分子膜的倾向很强，所以很好。另外，由于这种单分子膜形成的薄膜具备有规律的构型，所以利用该膜表面和亲水亲油性类脂的亲和性，有利于在其上再形成亲水亲油性类脂膜。
进一步参考图3，用含有硫原子的有机化合物膜10覆盖基板1上的工作极2后，再在其上由具有疏水性部分(图3中用两根折线表示)和亲水性部分(图3中用空心椭圆表示)的亲水亲油性类脂均一地形成单层膜11。其步骤如后所述。从图3可看出，亲水亲油性类脂的疏水性部分通过疏水互相作用与上述含有硫原子的有机化合物的疏水性部分结合，形成二成分膜(10、11)。二成分膜中内包有分散嵌合的电子传递体12。另外，膜结合性PQQ-GDH通过疏水互相作用以高亲和性与二成分膜的疏水性部分结合，被埋入膜中。实施例中，该亲水亲油性类脂使用了L-α-磷脂酰胆碱，β-油酰-γ-棕榈酰，但也可使用其它的亲水亲油性类脂。该疏水性部分的长度在形成二成分膜时，可选择能够埋入酶的程度的长度。该长度依赖于所用酶的大小及其疏水区域的大小。
如上所述，本发明使用的上述亲水亲油性类脂较好为L-α-磷脂酰胆碱，β-油酰-γ-棕榈酰。因为L-α-磷脂酰胆碱，β-油酰-γ-棕榈酰的两根疏水链的长度比较一致，所以亲水亲油性类脂膜11的厚度均一，能够获得更稳定的对OIC 15及AIC 14的阻断效果。可用于本发明的其它适合的亲水亲油性类脂可例举L-α-磷脂酸、L-α-磷脂酰胆碱、L-α-磷脂酰乙醇胺及L-α-磷脂酰-DL-甘油各自的二油酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二月桂酰、二肉豆蔻酰、二亚油酰衍生物等磷脂或糖质、胆汁酸等。这种亲水亲油性类脂可作为市售品从本领域普通技术人员周知的供货商处获得。
如果使用上述二成分膜，则能够完全(或几乎完全)阻断OIC 15对生物传感器电极表面的扩散，在PQQ-GDH和葡萄糖的反应后，能够选择性地仅进行电子传递体12和工作极2的反应这样一系列的反应。其结果是，能够排除因在工作极2OIC15被氧化而产生的测定误差，从而可进行高精度的测定。此外，能够完全(或几乎完全)阻断AIC 14对工作极2表面的吸附。另外，由于AIC 14对亲水亲油性类脂11的亲和性比AIC 14对金属的亲和性明显要低，所以可减少因工作极2表面吸附AIC 14而造成的测定误差，从而可进行高精度的测定。
这里，对本发明所用的二成分膜进行进一步的说明。
首先，关于含有硫原子的有机化合物膜10，硫原子在该有机化合物中起到确保与电极的粘合的作用。此外，从上述通式(1)、(2)或(3)可看出，上述有机化合物具有以-(CH2)n-X表示的疏水性部分。如前所述，该疏水性部分通过疏水互相作用与亲水亲油性膜11的疏水性部分以高亲和性结合，起到稳定地维持二成分膜的作用。因此，从上述研究可理解，本发明中可用于形成膜10的化合物并不限定为上述含有硫原子的有机化合物，也可同样使用与之功能等价的其它化合物。即，只要是具有实现与电极的稳定粘合的官能团和与亲水亲油性类脂的高亲和性结合的疏水性部分的化合物，都可用于形成本发明的二成分膜。另外如前所述，这种功能等价的化合物最好具有可在电极表面上形成单分子层的结构。这样可使层的厚度均一，能够获得更稳定的阻断OIC的效果。但是，膜10并不一定要是单分子层。例如，膜10也可以是具有部分上述有机化合物分子的官能团不与电极相连、且上述分子的疏水性部分被插入实质性的单分子层的间隙状态的层。或者，因基板及电极的表面粗糙度的影响，可考虑构成膜10的层作为整体采用波纹结构，或层的一部分或全部采用形成了多分子层的结构。上述情况下，仍能取得本申请的发明效果。本说明书中，用“第一反应层”一词总括形成于电极上的含有硫原子的有机化合物膜10及与之功能等价的膜的概念。
另外，关于形成于上述膜10上的亲水亲油性类脂膜11，亲水亲油性类脂的疏水性部分起到利用疏水互相作用与形成上述第一反应层的化合物的疏水性部分以高亲和性结合的作用。这里，膜11并不一定要是图3所示的单分子层。例如，膜11也可以是具有部分上述亲水亲油性类脂分子的疏水性基团的前端不与膜10相连、且上述分子的疏水性部分被插入实质性的单分子层的间隙状态的层。或者，因基板及电极的表面粗糙度的影响，可考虑构成膜11的层作为整体采用波纹结构，或层的一部分或全部采用形成了多分子层的结构。上述情况下，仍能取得本申请的发明效果。上述情况下，仍能取得本申请的发明效果。本说明书中，用“第二反应层”一词总括形成于第一反应层上的亲水亲油性类脂膜10及与之功能等价的膜的概念。
“二成分膜”主要是指由形成于电极上的第一反应层和第二反应层构成的膜的概念。其代表例如图2及图3的模式图所示，是提供与细胞膜这样的脂质双层相似的环境的膜。如从天然的细胞膜等所见，能够获得膜结合性酶被埋入二成分膜中的状态。但是如前所述，由于膜10及膜11并不一定要是单分子层，所以二成分膜也并不一定要是图3所示的由2个单分子层组合而成的二分子层。此外，在第一反应层和第二反应层的交界部分附近也可具备具有上述官能团的有机化合物的分子和亲水亲油性类脂分子复杂地混合·分散的结构。本发明的二成分膜能够实现可有效防止OIC对在电极表面引起的葡萄糖的氧化还原反应的影响及吸附于电极表面的AIC的影响、且与电极之间能够选择性地仅进行与葡萄糖有关的氧化还原反应的功能。本发明的二成分膜中还可含有实现上述酶和工作极2之间的电子传递的电子传递体12。
作为本发明所用的电子传递体12，使用了可将电子从PQQ-GDH传递至工作极2的化合物。本发明所用的电子传递体12为1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓这样的化合物，由于其分子的平面性较高，被插入到膜的内部，所以存在于工作极附近，能够进行高效的电子传递，所以较好。此外，吩嗪衍生物、吩噻嗪衍生物(标准天蓝及硫堇等)及醌衍生物等的分子的平面性同样较高，所以较好。这些化合物可作为市售品从本领域普通技术人员公知的供货商处获得。
此外，上述电子传递体12也可以是与聚合物主链结合的形态(参考图4A)，或者是其本身的一部分或全部形成聚合物链的形态(参考图4B)。这种电子传递体可作为市售品从本领域普通技术人员公知的供货商处获得。
电子传递体12可使用其中的1种或2种以上。此外，上述只是一例，用于本发明的实施的电子传递体12并不仅限于上述例子。
以下，对在电极上形成二成分膜的方法进行说明。
如图2的模式图所示，工作极2的几乎整个表面最好都被含硫原子的有机化合物膜10覆盖。含硫原子的有机化合物膜10的覆盖可通过将工作极2的表面浸入上述有机物溶液的方法或在工作极2表面滴下该溶液的方法完成。或者，将表面暴露于上述有机物蒸气中也可进行同样的覆盖。但是，如图1及图2所示，在工作极2和配极3被设置于同一基板上时，仅工作极表面或配极的一部分和工作极的整个或几乎整个表面被覆盖的情况下，为了正确规定上述有机化合物溶液的覆盖区域，最好进行以下操作。
即，在与工作极2及根据需要与配极3具有几乎相同形状的面上涂布少量上述有机化合物溶液，该面是树脂制棒状部件的面，它可形成所希望的与工作极2及配极3的接触面积。然后，使该部件的该表面与包含工作极2的表面及根据需要还包含配极3的所希望的区域接触，藉此能够将涂布于上述部件表面上的上述有机化合物溶液转印至工作极2的表面上。这样能够正确地规定被有机化合物膜覆盖的电极上的区域，保持生物传感器的测定精度。这种所谓的转印法在本领域被经常使用，是本领域普通技术人员周知的技术。
用亲水亲油性类脂进一步被覆已经覆盖了工作极表面的含硫原子的有机化合物膜10时，可将上述表面已被含硫原子的有机化合物膜覆盖的工作极浸入到亲水亲油性类脂的介质(脂质体)分散液中。
将PQQ-GDH及电子传递体埋入上述亲水亲油性类脂膜内时，有效的方法是在各膜的形成过程中使PQQ-GDH及电子传递体溶存。
本发明的实施中含有作为测定对象的底物的试样溶液较好为含葡萄糖的试样溶液。可例举血液、血浆、血清、细胞间质液、唾液和尿等生物体试样溶液或食品和饮料等。此外，也可采用以通常的实验室水平被使用的电解液、被用于环境测定的液体等。特别在葡萄糖的测定中，大多数情况下采用全血、血浆或尿等除了葡萄糖以外还含有OIC和AIC的液体作为试样溶液。
这里，包含于试样溶液中的底物的测定指标可以是随电化学反应而变化的输出，例如，可采用电流和通电电荷量。
本发明的生物传感器中，工作极2较好的是含有金、铂或钯。这样可使施加于工作极2的电位稳定，所以能够实现精度更高的测定。
从上述含硫原子的有机化合物的吸附牢固的观点考虑，工作极2最好含有金、钯、铂等贵金属和银、铜、镉等其它过渡金属。因此，如果以实质上仅有工作极2被上述有机化合物膜10覆盖为目的，则配极3中最好不含这些金属。
此外，配极3的表面的至少一部分最好不被含硫原子的有机化合物膜10及亲水亲油性类脂膜11覆盖。这样，配极3的表面未被上述膜覆盖的部分与被上述膜覆盖的部分相比，试样溶液中所含的需还原的物质更容易到达，所以配极3的还原反应(阴极反应)容易进行，能够进行更稳定的测定。此外，配极3中的未被含硫原子的有机化合物膜10及亲水亲油性类脂膜11覆盖的部分的面积最好比工作极2的面积大。另外，配极3上最好实质上不存在含硫原子的有机化合物膜10及亲水亲油性类脂膜11。最好实质上只有工作极2被含硫原子的有机化合物膜10及亲水亲油性类脂膜11覆盖。这样，可使配极3的还原反应更顺利地进行，并可实现更稳定的测定。
参考图1，按照图1的点划线所示的位置关系在以上制得的基板1上粘合具有槽6的隔板7及具备气孔8的盖板9，制得本发明的生物传感器。在隔板7的槽6部分形成试样溶液供给通路。生物传感器端部的槽6的开放端部为对应于试样溶液供给通路的试样溶液供给口。
使试样溶液与成为图1所示结构的生物传感器的试样溶液供给通路的槽6的开放端接触，试样溶液通过毛细管现象被导入试样溶液供给通路内，通过试剂系的作用进行酶反应。这样，如果在设置了电极系的基板1上组装隔板7及盖板9构成的盖板部件形成试样溶液供给通路，则因为能够使含有作为测定对象的底物的试样溶液对生物传感器的供给量一定，所以可使测定精度有所提高。此外，设置了试样溶液供给通路的生物传感器中，也可在盖板部件侧设置pH缓冲剂。
另外，如图7所示，也可用配极3或工作极2中的任一方和与其对应的簧片5或4一起形成的绝缘性基板2来替代盖板9。这种情况下，由于由基板1、隔板7及基板2形成试样溶液供给通路，所以能够使试样溶液对生物传感器的供给量一定，能够提高测定精度。这种形态的生物传感器的例子在美国专利第6,458,258号中有所记载。
也可以不形成上述试样溶液供给通路，仅由基板1构成生物传感器。这种情况下，试剂系设置于电极系上或其近旁。这种形态的生物传感器的例子在上述日本专利特开平3-202764号公报有所记载。
以下用实施例对本发明进行说明，但这些实施例仅是本发明的例示，本发明并不仅限于此。
实施例1本发明的生物传感器的制作a.蛋白体悬浮液的调制以下的调制方法仅是一个例子，并不仅限于此。
首先，按照以下步骤调制L-α-磷脂酰胆碱，β-油酰-γ-棕榈酰(以下简称为PCOP)(从和光纯药工业株式会社获得)的脂质体。将PCOP溶于圆底烧瓶内的三氯甲烷中，使其浓度达到10mM。然后，用旋转蒸发器在减压下使溶剂完全蒸发。接着，用2-丙醇再次溶解烧瓶中的PCOP使其浓度达到40mM，将所得溶液0.5mL加入到含0.15M的NaCl的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.3)10mL中。对该溶液剧烈搅拌10分钟，获得PCOP脂质体的悬浮液。
然后，为了在上述脂质体中组合入酶和电子传递体，在上述PCOP脂质体的悬浮液10mL中加入1mg的PQQ-GDH(来自乙酸钙不动杆菌，按照上述松下等(1989)记载的方法精制)和30mg作为电子传递体的1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓(以下简称为MMP)(从株式会社同仁化学研究所获得)，对该溶液剧烈搅拌10分钟。以下，将所得到的含PQQ-GDH和MMP的PCOP脂质体悬浮液记为MMP-蛋白体悬浮液。
b.基板的制作另一方面，为了在基板上制作工作极及配极，首先在玻璃制的电绝缘性基板1上设置树脂制电极图案掩膜，然后从其上溅射铬形成铬层。再在其上溅射金形成工作极2和簧片4及配极3和簧片5。
c.电极的加工通过上述转印法，按照以下步骤用正辛基硫醇(以下称为OT)覆盖以上形成的工作极2。首先，在具有与基板1上的工作极2几乎相同形状的平面的棒状树脂制器具的该平面上少量涂布OT的乙醇溶液(浓度5mM)。然后，将该涂布了OT的面与工作极2的几乎整个表面重合，在重合前必须非常注意位置的调节。上述棒状器具一直放置于工作极2上直至OT溶液残存于工作极2上并被吸入工作极表面才从工作极2拿开。
这样就形成了分子内含有硫原子的有机化合物膜10，即OT膜，1小时后，依次用乙醇和超纯水对工作极2进行洗涤。将所得基板1在10mM的MMP水溶液中浸1小时，促使MMP浸入OT膜内。用超纯水对基板1充分洗涤后，将基板1在上述MMP-蛋白体悬浮液中浸8小时，进行工作极2上的OT膜10和MMP-蛋白体17的融合(参考图3)。
用超纯水对上述基板1进行洗涤并使其干燥后，在基板1组装隔板7及盖板9，制得图2所示的生物传感器。
此外，作为比较例，在基板1的工作极2的表面滴下1mg的PQQ-GDH和30mg的MMP溶于10mL的20mM的Tris-HCL缓冲液(pH＝7.3)而形成的溶液1μL，使其干燥后，在基板1组装上隔板7及盖板9，制得生物传感器。
实施例2AIC对本发明的生物传感器的影响将含有一定量的D-葡萄糖(400mg/dL)的血液作为试样溶液，将其供给至以上制得的本发明的实施方式之一的生物传感器及比较例的生物传感器的试样溶液供给通路的开口部，即隔板7的槽8的开放端部。采用血液中的红细胞容积比(血细胞比率，以下简称为Hct)分别为25、40、60％的不同的试样溶液。经过一定时间(反应时间25秒)后，对应于配极3向工作极2施加500mV的电压，测定5秒后流过的电流值。如图5所示，比较例的生物传感器出现随着Hct的增加电流下降的倾向。
这就暗示了吸附于工作极表面的红细胞量有随着Hct增加而增多的倾向，因该倾向使电极反应受到抑制。其结果是，葡萄糖浓度虽然相同，但电流值因Hct的存在而发生变化，产生了测定误差。
本实施例的生物传感器不论Hct是多少都能够获得几乎相同的电流值。因此，红细胞对工作极2表面的吸附受到存在于工作极2表面的OT及PCOP膜的抑制。被有机化合物OT和PCOP膜覆盖的电极表面的物性与未覆盖的金的表面有很大的变化。或者，电极的界面因覆盖膜的末端基团而带正或负电。
因为这些变化中的两方或任一方的效果，都能够抑制血细胞的吸附。此外，进入OT就PCOP膜内的MMP具有实现PQQ-GDH和工作极间的电子传递的能力。这样，通过OT和PCOP膜的覆盖，能够排除因AIC的吸附而造成的测定误差。
实施例3OIC对本发明的生物传感器的影响接着，在Hct为40％的血液中添加OIC之一的抗坏血酸，与原来血液中所含的量合并将整体浓度调整为1、1.5、2mM。使用这些血液，与上述同样测定电流值。如图6所示，比较例的生物传感器随着抗坏血酸浓度的增加电流有增大的倾向。这暗示了在工作极进行了抗坏血酸的氧化反应。其结果是，葡萄糖浓度虽然相同，但电流值因抗坏血酸浓度而发生变化，产生了测定误差。
另一方面，本实施例的生物传感器不论抗坏血酸浓度如何都能够获得几乎相同的电流值。这是因为工作极2的金电极表面被具有较长分子链的有机化合物OT和PCOP膜覆盖，该膜能够抑制抗坏血酸接近金电极表面的结果。这样，通过OT和PCOP膜的覆盖，不仅能够排除AIC的吸附造成的误差，还能够排除因OIC的电化学氧化而造成的测定误差。
实施例4参比电极的使用本实施例中，将试样溶液供给按照与实施例1同样的步骤制得的本发明的实施方式之一的生物传感器后，马上通过氯化钾和琼脂形成的盐桥使银/氯化银电极与试样溶液供给口附近的试样溶液接触。银/氯化银电极的电位稳定，可作为参比电极使用。
将含有一定量的D-葡萄糖(400mg/dL)、Hct不同的血液作为试样溶液供给至生物传感器的试样溶液供给通路的开口部，即隔板7的槽8的开放端部。经过25秒后，对应于银/氯化银电极对工作极2施加500mV的电压，测定5秒后流过的电流值。
其结果是，不论Hct是多少都能够获得几乎同样的电流值。相同条件下的电流值的不一致程度要比实施例2获得的结果小。因此，说明向生物传感器系统中导入参比电极，能够进一步提高测定值的稳定性。
采用Hct为40％、抗坏血酸浓度为1、1.5、2mM的血液，与上述同样测定电流值。其结果是，不论抗坏血酸浓度如何都能够获得几乎同样的电流值。相同条件下的电流值的不一致程度要比实施例3获得的结果小。因此，说明向生物传感器系统中导入参比电极，能够使对应于抗坏血酸浓度的变化的测定值的稳定性进一步得到提高。
实施例5正辛基二硫化物的使用本实施例中，用正辛基二硫化物替代OT，按照实施例1所示的方法制得生物传感器。采用与实施例2及3中所述同样的方法，测定对血液中的葡萄糖的响应值。
其结果是，本实施例与实施例2及3同样，不论Hct及抗坏血酸浓度如何都能够获得几乎同样的电流值。OT是正辛基二硫化物的S-S键打开而获得的化合物。可知具有这种对应关系的硫醇和二硫化物形成了同样的膜。
实施例6形成于不同基板上的工作极及配极本实施例中，在盖板9上形成了配极3。如实施例1所述，对工作极2的表面进行修饰。采用与实施例2及3所述同样的方法，进行对血液中的葡萄糖的响应值的测定。
其结果是，本实施例与实施例2及3同样，不论Hct及抗坏血酸浓度如何都能够获得几乎同样的电流值。因此说明在多个基板上形成电极的情况下，也能够获得同样的效果。本实施例中，工作极2和配极3存在于不同的基板上。因此，在制作配极3不被膜覆盖、实质上只有工作极2被膜覆盖的传感器时，能够采用将配置了工作极2的基板1浸入OT溶液或将基板1上的工作极2表面暴露于OT蒸气的方法。本实施例的传感器与在同一面上设置了工作极和配极的传感器相比，能够容易地制得实质上只有工作极被膜覆盖的传感器。
实施例7铂或钯的使用本实施例中使用铂或钯，制得工作极2及配极3。在玻璃制的电绝缘性基板1上设置树脂制电极图案掩膜，形成铬层。然后，通过溅射铂或钯分别形成各电极。接着，与实施例1所述的方法同样，覆盖工作极2表面。采用与实施例2及3所述同样的方法，进行对血液中的葡萄糖的响应值的测定。
其结果是，使用铂的情况下，电流值对Hct显现出一些依赖性，但即使抗坏血酸浓度发生变化，也显示几乎相同的电流值。另一方面，用铂替代金，与实施例1中记载的比较例同样制得的生物传感器中，电流对Hct及抗坏血酸浓度的依赖性更大。
从以上事实可知，用铂作为工作极的材料时，通过本发明的膜的覆盖能够获得对OIC、AIC的影响的抑制效果。此外，使用钯作为工作极的材料时，与使用金时获得的结果相比，观测到相同程度的对Hct及抗坏血酸浓度的非依赖性，这说明钯也是非常适用于本发明的电极材料。
实施例8pH缓冲剂的效果对生物传感器系统中还包含了pH缓冲剂时的生物传感器特性进行评价。本实施例制得的生物传感器除了在含有作为试剂系的PQQ-GDH及电子传递体的亲水亲油性类脂膜11内负载有作为pH缓冲剂的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的混合物之外，其它与实施例1所用的相同。
在生物传感器的空间部供给含有一定量的D-葡萄糖(400mg/dL)、Hct不同的血液作为试样溶液。经过一定时间后，对应于配极3对工作极2施加500mV的电压，测定此时流过的电流值。其结果是，所得电流值对Hct无依赖性。
与实施例2及3所得的结果相比，电流值对抗坏血酸浓度的依赖性几乎无变化，对Hct的依赖性有所减少。即，对应于相同的葡萄糖浓度获得了对Hct的依赖性更少的一定的电流值。
获得这种结果的理由如下所述。使生物传感器系统内包含pH缓冲剂，能够稳定生物传感器内的试样溶液的pH。因此，存在于电极上的膜的末端基团的荷电状态稳定化，试样溶液的对血液中的AIC的吸附的抑制效果都是一定的。
此外，这种pH的稳定，也使酶活性稳定，试样溶液的一定时间后生成的电子传递体的还原体的量也是一定的。pH的稳定化导致的上述两方面或一方面的稳定化效果，能够使电流值对Hct的依赖性减少。本实施例的特别理想的稳定化效果在测定液的pH为4～9时显现。因此，较好的pH范围为4～9。从酶活性最稳定的观点考虑，更好的pH范围为5～8。
上述实施例2～8中进行了电流值的测定，即使在测定电荷量替代电流值的情况下，也能够显现出与上述电流值同样的倾向。
此外，上述实施例中对电极系施加的电压为500mV，但施加的电压值并不限于该值。只要是使电子传递体在工作极中被氧化的电压即可。
上述实施例中的反应时间为25秒或55秒，虽然电压施加时间和电流检测时间在5秒后，但并不限于这些时间，只要是能够获得可观测的程度的电流的时间即可。
另外，根据需要最好将上述试剂系或试剂系中所含的试剂中的一种或多种固定于工作极，藉此使酶、电子传递体不溶化或非溶出化。这种情况下，可采用利用与膜之间的范德瓦耳斯力的互相作用的方法、共价键法、交联固定法或使用了配位键和特异结合性的互相作用的固定化方法。实施本发明的过程中，特别好的是在电极上的含硫原子的有机化合物膜上以共价键固定上述试剂的方法。
膜结合型PQQ-GDH作为本发明的实施中较适合的酶被记载，但并不表示适合本发明使用的酶仅为膜结合型PQQ-GDH。膜结合型PQQ-GDH以外的其它酶，即，只要是分子表面的至少一部分具有疏水性区域、可与上述二成分膜的疏水性部分以高亲和性结合的酶(或可实现被埋入二成分膜的形态的酶)、且催化葡萄糖的选择性氧化反应的酶同样可使用。当然，对应于不同的酶，构成理想的二成分膜的成分的组合可有所变化。
通过使上述试剂系中含有PQQ-GDH以外的酶，也能够进行葡萄糖以外的底物的测定。例如，通过在试剂系中追加具有将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的功能的转化酶，就能够进行蔗糖的定量。
上述实施例中，作为电极及其图案的制作方法采用了通过掩膜的溅射法，但并不仅限于此，例如，也可以将由溅射法、离子电镀法、蒸镀法、化学蒸镀法中的任一种方法制得的金属膜与光刻法及腐蚀组合进行图案的制作。图案的形成还可通过用激光进行金属的修整而完成。在基板上用金属糊状物实施丝网印刷也可形成电极图案。此外，也可直接在绝缘性基板上粘合图案化的金属箔。
这些电极系的形状、配置、个数等并不仅限于上述实施例所述的内容。例如，工作极和配极可分别形成于不同的绝缘性基板上(参考图7)，工作极和配极也可分别形成多个。此外，簧片及端子的形状、配置、个数等也并不限于上述实施例所述的内容。
以提高测定精度为目的，为了易于将含有作为测定对象的底物的溶液量规定为一定量，最好将隔板作为上述生物传感器的构成要素包含其中。但是，本发明的生物传感器与能够采集一定体积的试样溶液的器具组合使用时，隔板及盖板构成的盖板部件并不是必须的。这些隔板、盖板或用于基板的材料并不仅限于实施例中作为基板材料使用的玻璃，其它材料，例如硅及其氧化物等无机材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)及聚丙烯(PP)等树脂这样的电绝缘性材料同样也可用于本发明的生物传感器的实施。
产业上利用的可能性如上所述，本发明的生物传感器是不受试样溶液中所含的AIC及OIC的影响、能够迅速且高精度地进行试样溶液中的底物的测定的结构简单的生物传感器。本发明的生物传感器特别适合作为检测试样溶液中的葡萄糖浓度的一次性生物传感器使用。
权利要求
1.生物传感器，其特征在于，具备包含至少一对电极的电极系；用于支承上述电极系的至少一块绝缘性基板；至少在上述电极系的工作极上设置的第一反应层，该第一反应层包含含有可结合或吸附于电极的官能团及疏水性烃基的有机化合物；设置于上述第一反应层上的第二反应层，该第二反应层包含可与该第一反应层的疏水性部分结合或吸附的亲水亲油性类脂；以及被负载于由上述第一反应层及第二反应层构成的二成分膜的试剂系，该试剂系至少包含膜结合型吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶及电子传递体。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，第一反应层及第二反应层分别形成为单分子层。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述有机化合物为以下的通式(1)、(2)或(3)表示的化合物，HS-(CH2)n-X (1)X-(CH2)n-S-S-(CH2)n-X(2)S-(CH2)n-X (3)上述通式(1)、(2)及(3)中，n为1～20的整数，X为甲基、苯甲基、氨基苯甲基、羧基苯甲基或苯基。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述亲水亲油性类脂为L-α-磷脂酰胆碱，β-油酰-γ-棕榈酰。
5.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述电子传递体为1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓。
6.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述工作极含有金、铂或钯。
7.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述电极系的配极不含有金、铂或钯的任一种。
8.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述电极系的工作极的整个表面和配极的表面的一部分被上述二成分膜覆盖。
9.如权利要求8所述的生物传感器，其特征还在于，上述配极的未被上述二成分膜覆盖的部分的面积大于上述工作极的面积。
10.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，只有上述电极系的工作极的表面被上述二成分膜覆盖。
11.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述一对电极分别被支承于互相对向设置的2块绝缘性基板的对向面上，藉此在其间形成上述试样溶液的供给通路。
12.如权利要求1所述的生物传感器，其特征还在于，上述试剂系中还含有pH缓冲剂。
13.生物传感器的制造方法，其特征在于，包括在绝缘性基板上形成包含至少一对电极的电极系的步骤；至少在上述电极系的工作极上设置第一反应层的步骤，该步骤中使包含含有可结合或吸附于电极的官能团及疏水性烃基的有机化合物的溶液与上述工作极接触；以及在上述第一反应层上设置第二反应层的步骤，该步骤中使含有亲水亲油性类脂的溶液与上述第一反应层接触；上述含有有机化合物的溶液及上述含有亲水亲油性类脂的溶液中的至少一种包含电子传递体，上述含有亲水亲油性类脂的溶液还含有膜结合型吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶。
14.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，第一反应层及第二反应层分别形成为单分子层。
15.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，上述有机化合物为以下的通式(1)、(2)或(3)表示的化合物，HS-(CH2)n-X (1)X-(CH2)n-S-S-(CH2)n-X(2)S-(CH2)n-X (3)上述通式(1)、(2)及(3)中，n为1～20的整数，X为甲基、苯甲基、氨基苯甲基、羧基苯甲基或苯基。
16.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，上述亲水亲油性类脂为L-α-磷脂酰胆碱，β-油酰-γ-棕榈酰。
17.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，上述电子传递体为1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓。
18.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，上述工作极含有金、铂或钯。
19.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，上述电极系的配极不含有金、铂或钯的任一种。
20.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，上述电极系的工作极的整个表面和配极的表面的一部分被上述第一及第二反应层覆盖。
21.如权利要求20所述的方法，其特征还在于，上述配极的未被上述第一及第二反应层覆盖的部分的面积大于上述工作极的面积。
22.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，只有上述电极系的工作极的表面被上述第一及第二反应层覆盖。
23.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，上述一对电极分别被支承于互相对向设置的2块绝缘性基板的对向面上，藉此在其间形成上述试样溶液的供给通路。
24.如权利要求13所述的方法，其特征还在于，上述含有有机化合物的溶液及上述含有亲水亲油性类脂的溶液中的至少一种还含有pH缓冲剂。
全文摘要
本发明涉及生物传感器，该传感器具备包含至少一对电极的电极系；用于支承上述电极系的至少一块绝缘性基板；至少在上述电极系的工作极上设置的第一反应层，该第一反应层包含含有可结合或吸附于电极的官能团及疏水性烃基的有机化合物；设置于上述第一反应层上的第二反应层，该第二反应层包含可与该第一反应层的疏水性部分结合或吸附的亲水亲油性类脂；以及被负载于由上述第一反应层及第二反应层构成的二成分膜的试剂系，该试剂系至少包含膜结合型吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶及电子传递体。
文档编号C12Q1/00GK1692278SQ200380100538
公开日2005年11月2日 申请日期2003年12月19日 优先权日2002年12月20日
发明者中南贵裕, 池田信, 吉冈俊彦 申请人:松下电器产业株式会社