专利名称：一种甲状腺髓过氧化物酶基因外显子i的基因序列的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，公开了一种先天性甲状腺功能低下病人的髓过氧化物酶的基因序列，其具有如下的特征，与正常人的对应序列相比，其在外显子1中第9位的核苷酸序列由A变为G，这种序列可以用于先天性甲状腺功能低下病人的筛选和诊断。
背景技术：
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发明内容
先天性甲状腺功能低下是一种比较常见的遗传性疾病，在人群中的发病率为1/3000-4000。若不能早期及时发现，可以引起智力低下。中国已经通过立法，对所有的新生儿都需进行强制性的筛查，以期望早期发现甲低的患儿。对早期发现的甲低的新生儿，可以通过补充甲状腺素而使绝大部分的患儿的智力发育不受任何影响，可以使患儿过上正常的生活。因此，对先天性甲低患儿的筛选是一种利国利民的举措。
对出生新生儿的筛选是一种事后的筛选，即在疾病发生之后的筛选。目前随着基因检测技术，特别是基因芯片技术的发展，使得对多种先天性疾病的一次检测成为可能。而在对各种先天性疾病的检测过程中，知道所需要检测的目的基因的变异序列，是一个关键的必需的步骤。只有在知道变异序列的情况下，才能利用诸如基因芯片等类的技术对相关的变异基因及其相对应的疾病进行检测。
甲状腺素是正常发育所必需的一种激素，其在人体合成的部位在甲状腺。甲状腺素的合成是一个十分复杂的过程，参与该过程的基因有数十个之多。其生成和灭活受到严格的控制。
甲状腺髓过氧化物酶基因位于人染色体2的2P24-25的位置，共有17个外显子，整个序列约分布在150kb的片段上。甲状腺髓过氧化物酶是一种膜结合蛋白，负责对甲状腺球蛋白中的酪氨酸的碘化和偶联，其是有933个氨基酸的糖蛋白。目前已经报道了几乎涉及每一个外显子的编码序列的变异。编码序列的变异可以使甲状腺髓过氧化物酶的翻译缺失或活性丧失或缺如，而使甲状腺素的合成受到阻碍。
甲状腺髓过氧化物酶外显子1参与髓过氧化物酶转录的控制，其编码基因序列的变异，可以引起甲状腺髓过氧化物酶的合成缺如，从而导致甲状腺素合成的障碍。本发明首次报道了一种发生在先天性甲低病人甲状腺髓过氧化物酶外显子1中的核苷酸序列的变异。在所检测的57份标本中，总共有4份标本出现了第9位核苷酸由A变为G的变异。这种变异引起了甲状腺髓过氧化物酶表达的变异，而导致先天性甲状腺功能低下的发生。
经甲状腺素、甲状腺素促激素测定和甲状腺同位素扫描证实的甲状腺功能低下的病人，平时体检化验时收集到的血凝块，经病人或监护人同意，用来分离染色体DNA，进行甲状腺髓过氧化物酶编码基因的研究。
1.染色体DNA的分离将1毫升血液所获得的血凝块中加入1/2体积的10毫摩尔三羟氨基甲烷盐酸(pH8.0)，1毫摩尔的乙二胺四乙酸(pH8.0)和0.1％的十二烷基磺酸钠，和蛋白酶K，使其终浓度微400微克/毫升，在摄氏55度消化16小时。在消化4小时后，再加入一次等量的蛋白酶K。然后加入1/10体积的3摩尔的醋酸钾，混匀，再分别加入等体积的酚，酚/氯仿和氯仿各抽提一次。收取上清，加入2倍体积的无水乙醇，置零下摄氏20度16小时，于16000转/分钟离心，收集沉淀，并用70％的酒精洗沉淀一次。弃上清，将沉淀溶于100微升10毫摩尔三羟氨基甲烷盐酸(pH8.0)，1毫摩尔的乙二胺四乙酸(pH8.0)中。
2.根据已知的正常人的甲状腺髓过氧化酶外显子I基因序列，分别设计了只与外显子互补的聚合酶链反应(PCR)的引物序列15’agg caa tta a gg cgc cca t3’序列25’ttt ttt cct ctt ctc agc caa 3’并根据外显子I周围的内含子序列，设计了只与内含子互补的PCR引物序列35’ATCCAAGCGCAGAGTCAGTT3’序列45’CCCAAATTACAGCCACTCTT3’3.甲状腺功能低下染色体标本的扩增将所获得的临床已经明确的58份甲状腺功能低下的染色体DNA用序列1和序列2组成的引物对进行扩增。PCR扩增的条件为摄氏94度30秒，52度30秒，72度30秒，45个循环。最后一个循环在72度延伸5分钟。所获得的标本经8％的聚丙稀酰胺电泳，发现除4份标本外，其余均有82碱基对的目标DNA片段。
4.可能有变异的DNA片段的扩增将4份用序列1和序列2构成的引物对不能扩增的染色体DNA，分别用序列1和序列4，序列3和序列2组成的引物对进行扩增。PCR扩增的条件为摄氏94度30秒，52度30秒，72度30秒，45个循环。最后一个循环在72度延伸5分钟。所获得的标本经8％的聚丙稀酰胺电泳，发现序列3和序列2组成的引物对可以扩增对应的标本而获得对应的目标DNA，而序列1和序列4构成的引物对不能扩增相应的标本而获得相应的目标DNA片段。说明在序列1所在的位置可能有核苷酸突变。
5.将序列3和序列2所构成的引物对扩增所获得的PCR产物(序列5)，经纯化后，用序列3作为引物，并以其余甲状腺功能低下的病人和甲状腺功能正常的人的染色体DNA的扩增产物为对照(序列6)，测序获得如下序列序列55’aggcaattga ggcgcccatt tcagaagagt tacagccgtgaaaattactc agcagtgcagttggctgaga agaggaaaaa a 3’序列65’aggcaattaa ggcgcccatt tcagaagagt tacagccgtgaaaattactc agcagtgcag ttggctgaga agaggaaaaa a 3’与正常人相比，所检测的4例甲状腺功能低下的病人的甲状腺髓过氧化物酶的外显子1的第9位核苷酸由A→G。
6.利用所测定的核苷酸序列设计引物，可以用于变异的甲状腺髓过氧化物酶基因外显子I的检测，使用这种PCR引物，正常的标本无扩增产物，只有变异的基因序列测能得到扩增。
序列75’agg caa ttg a gg cgc cca t3’序列7和序列2组成PCR引物对，对标本进行扩增。PCR扩增的条件为摄氏94度30秒，52度30秒，72度30秒，45个循环。最后一个循环在72度延伸5分钟。所获得的标本经8％的聚丙稀酰胺电泳，发现除4份变异的标本有82碱基对的目标DNA片段外，其余均为阴性。
7.利用所获得的核苷酸序列合成寡核苷酸探针，序列同序列7，用同位素磷32标记，将制备的病人的染色体DNA用DdeI进行限制性酶切，所获得的片段进行琼脂糖电泳，转到硝酸纤维素膜上，用同位素标记的探针杂交，经同位素显色，只有在有核苷酸序列变异的标本中出现阳性带。
权利要求
1.一种先天性甲状腺功能低下病人的髓过氧化物酶的基因序列，其具有如下的特征，与正常人的对应序列相比，其在外显子1中第9位的核苷酸序列由A变为G。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其可以用来设计聚合酶链反应的引物，用来特异性扩增有变异的基因序列。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其可以用来设计核苷酸探针，用来通过杂交来检测有变异的基因序列。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种先天性甲状腺功能低下病人的髓过氧化物酶的基因序列，其具有如下的特征，与正常人的对应序列相比，其在外显子1中第9位的核苷酸序列由A变为G，这种序列可以用于先天性甲状腺功能低下病人的筛选和诊断。
文档编号C12N15/11GK1654649SQ20041003944
公开日2005年8月17日 申请日期2004年2月13日 优先权日2004年2月13日
发明者刘吉荣, 张霆, 戴耀华, 李莉, 张帅民, 刘爱华, 于娟娟, 陈功, 庞丽华, 滕红红, 张玉敏, 李淑华, 裘蕾 申请人:首都儿科研究所