专利名称：一种黑曲霉菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其用途，具体地说是涉及一种黑曲霉菌株(Aspergillusniger)，及将其用于固态发酵生产饲用复合酶的用途。
背景技术：
近几十年来，由于人口的迅速增加和生活水平的不断提高，肉蛋奶的需求量也在逐年增加。饲料是畜禽的食物，如何提高饲料的利用率、如何保护环境和保障农牧业的持续、健康、稳定发展已成为人类迫切需要解决的重要问题。由微生物发酵生产的饲用复合酶是一类无毒无害、无污染残留的绿色饲料添加剂，其中非淀粉多糖酶(主要包括木聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶和甘露聚糖酶)是饲料酶的重要组分，在粗纤维含量较高的饲料添加适量的非淀粉多糖酶可以明显的提高饲料利用率和养殖效益，同时还可以减少环境污染。
微生物发酵生产饲用复合酶的关键在于除了选择合适的培养条件使菌种发挥最佳的生产性能外，还要筛选出能获得高产酶的菌种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能高产饲用复合酶的黑曲霉菌株。
本发明的另一目的在于提供所述的黑曲霉菌株在固态发酵生产饲用复合酶中的用途。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)MAFIC-005，于2003年12月8日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCCNo.1067。
本发明提供的黑曲霉菌株(CGMCC No.1067)MAFIC-005具有以下微生物学特性1、形态学的特性
菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃6天直径为45～60毫米；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。
2、培养学的特性分生孢子头球形至辐射形，直径150～450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎(1000～3000)微米×(12～20)微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40～70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基(10～20)微米×(4.5～7.0)微米，瓶梗(6～9)微米×(2.5～3.0)微米，分生孢子球形或近球形，直径3.0～4.5微米，壁粗糙。
使用本发明的黑曲霉菌株用于固态发酵生产饲用复合酶中的方法，包括如下步骤1)配制培养基按下列重量比例配制培养基(以干物质计算)麦麸85.0％；甜菜渣2.0％；苹果皮粉2.0％；硫酸铵4.0％；棉粕粉4.0％；豆饼粉2.0％；磷酸二氢钾1.0％；2)制备种曲将50g含水量为50％的上述培养基的料曲于三角瓶(500ml容量)中在121℃消毒灭菌40～50分钟，冷却后接种2ml含有2～8×108个/ml的本发明的黑曲霉菌株的孢子液，瓶口用16层无菌医用纱布封口，在28～32℃恒温培养4天。
3)固态发酵将含水量为50～65％的上述培养基的料曲在110～121℃消毒灭菌40～150分钟；冷却后接种0.5～2.0％的种曲(按重量比计算)，在24～32℃和85％以上的相对湿度条件下培养3～4天，然后在45～50℃条件下气流干燥24～48小时；得到发酵产物——饲用复合酶。
本发明提供的黑曲霉菌株在固态发酵生产饲用复合酶中可以同时高产木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶。这种固态发酵复合酶可以广泛应用在各种畜禽饲料中，特别是反刍动物饲料中。不仅提高了经济效益，同时也保护生态环境，推动我国畜牧业持续、健康发展。
具体实施例方式
实施例1、黑曲霉菌株(Aspergillus niger)MAFIC-005的获得本发明的提供的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)MAFIC-005的诱变选育过程为1.出发菌种的筛选配制固体马铃薯琼脂培养基，于121℃40分钟消毒灭菌后，倾倒在直径为9cm的无菌平皿内，凝固后待用；所述的固体马铃薯琼脂培养基是按下面的配比配制而成去皮马铃薯100克、果胶10克、羧甲基纤维素钠10克、硫酸铵5克、蒸馏水1000ml、青霉素10ppm，pH 6.7～7.0。
在无锡一玉米地取土样1.0克，加入无菌水稀释，配制成浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、和10-7的菌悬液，分别均匀涂布在固体马铃薯琼脂培养基上，每个平皿内均匀涂布0.5ml。28～30℃恒温培养6天，在10-5稀释度的固体培养基平皿上分离获得一株黑曲霉(Aspergillus niger)作为出发菌种，进行后续的诱变筛选。
2.诱变选育对出发菌种进行诱变筛选和三角瓶固态发酵，分析测定其生产性能，主要分析其木聚糖酶和纤维素酶的产量。
诱变选育过程出发菌种→紫外诱变→γ射线诱变→NTG诱变每次诱变后进行平皿分离筛选，挑选20～30个单菌落，做三角瓶固态发酵试验，测定产酶能力，以木聚糖酶和葡聚糖酶的产量为主要检测指标，选择2～3株酶活产量高的菌种作为高产菌种做重复试验，选择一株产量最高的菌种作为下一段诱变的出发菌种。
紫外灯的功率为15W，照射距离为20cm，照射时间为10分钟。用无菌生理盐水制备孢子菌悬液，菌悬液的孢子浓度为106～107个/ml，液层的厚度为0.3～0.5cm。照射后在增菌液(果胶2克、羧甲基纤维素钠2克、硫酸铵2克、酵母粉1克、蒸馏水1000ml、pH值6.8～7.0)中28～30℃静息培养8小时，然后稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，28～30℃恒温培养6天。挑选单菌落，三角瓶固态发酵，测定生产性能，挑选一株高产菌种作为下一步诱变的出发菌。
γ射线来源于Co60，待处理的菌悬液孢子浓度为105～106个/ml，照射剂量为600～800居里。照射后在增菌液中28～30℃静息培养8小时，然后稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，28～30℃恒温培养6天。挑选单菌落，三角瓶固态发酵，测定生产性能，挑选一株高产菌种作为下一步诱变的出发菌。
NTG诱变剂的浓度为300～500ppm，待处理的菌悬液孢子浓度为105～106个/ml，作用时间为20～30分钟，作用温度为35～40℃。诱变后的孢子液在增菌液中28～30℃静息培养8小时，然后稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，28～30℃恒温培养6天。挑选单菌落，三角瓶固态发酵，测定生产性能，挑选一株高产菌种作为下一步诱变的出发菌。
整个诱变循环共进行4轮，最终获得一株遗传性能比较稳定的非淀粉多糖酶高产菌种。经中国科学院微生物研究所鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)MAFIC-005，于2003年12月8日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1067。
得到的黑曲霉菌株(CGMCC No.1067)MAFIC-005具有以下微生物学特性1、形态学的特性菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃6天直径为45～60毫米；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。
2、培养学的特性分生孢子头球形至辐射形，直径150～450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎(1000～3000)微米×(12～20)微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40～70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基(10～20)微米×(4.5～7.0)微米，瓶梗(6～9)微米×(2.5～3.0)微米，分生孢子球形或近球形，直径3.0～4.5微米，壁粗糙。
实施例2、在三角瓶中培养种曲培养基配比(干物质计算)麦麸85.0％；甜菜渣2.0％；苹果皮粉2.0％；硫酸铵4.0％；棉粕粉4.0％；豆饼粉2.0％；磷酸二氢钾1.0％。
料曲含水量为50.0％。
料曲分装在500ml三角瓶中，装料量为50克/瓶。在121℃消毒灭菌40分钟，冷却后接种斜面菌种的孢子液(2×108个/ml，每瓶接种2ml)。瓶口用16层无菌医用纱布封口，在32℃恒温培养4天，得到种曲。
实施例3、在三角瓶中固态发酵生产饲用复合酶培养基配比同实施例2，料曲含水量为50％。
料曲分装在500ml三角瓶中，装料量为50克/瓶。在115℃消毒灭菌80分钟，冷却后接种1.0g实施例2中培养的种曲，在32℃和85％以上的相对湿度条件下培养4天，然后在48℃条件下气流干燥24小时；得到发酵产物——饲用复合酶，其干曲含水量在8.0％以下，粉碎过60目筛，测定样品酶活，结果参见表1。
实施例4、在托盘中固态发酵生产饲用复合酶培养基配比同实施例2，料曲含水量为60％。
料曲在121℃消毒灭菌50分钟，冷却后接种实施例2培养的种曲，每1000克料曲(以干物质计算)接种5g实施例2中培养的种曲。混合均匀，分装在20×20cm2的托盘中，料曲厚度为3.0～3.5cm。然后在28℃恒温培养72小时，培养箱内的空气相对湿度控制在85％以上。培养结束在45℃条件下气流干燥48小时，得到发酵产物——饲用复合酶，其干曲含水量在9.0％以下，粉碎过60目筛，测定样品酶活，结果参见表1。
实施例5、在托盘中固态发酵中试生产饲用复合酶培养基配比同实施例2，投料量为300kg/批，料曲起始含水量为65％。
料曲在110℃消毒灭菌150分钟，冷却后接种3000g实施例2中培养的种曲。均匀混合，分装在40×60cm2的托盘中，料曲的厚度为3.5～4.0cm。托盘分散在托架上，垂直间距为20～25cm。培养过程中曲房空气的相对湿度控制在85％以上，在24℃恒温培养84小时后转移到干燥房，在50℃条件下气流干燥48小时，得到发酵产物——饲用复合酶，其料曲含水量在9.0％以下，粉碎过60目筛，测定酶活，结果参见表1。
酶活定义及测定结果各种酶活定义为木聚糖酶活力在40℃和pH5.5条件下，每分钟内从浓度为5mg/ml的木聚糖(SigmaX0627)溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位u。
β-葡聚糖酶活力在40℃和pH5.5条件下，每分钟内从浓度为4mg/ml的β-葡聚糖(Sigma G6513)溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位u。
纤维素酶活力在40℃和pH5.5条件下，每分钟内从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位u。
果胶酶活力在40℃和pH5.5条件下，每分钟内从浓度为4mg/ml的聚半乳糖(SigmaP9135)溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位u。
表1产品酶活的测定结果酶活(u/g)三角瓶培养 培养箱托盘培养中试托盘发酵木聚糖酶 6270 6402 5423β-葡聚糖酶 3750 3812 3245纤维素酶 61.2 64.3 46.5果胶酶 142165 125由表1可以看出，采用本发明提供的黑曲霉菌株进行固态发酵获得的饲用复合酶含有多种非多糖淀粉酶活性，在中试生产条件下，每克干曲中木聚糖酶的活力可达到5423u、β-葡聚糖酶的活力达到3245u、纤维素酶的活力达到46.5u、果胶酶活力达到125u。该方法生产饲用复合酶成本低廉，每公斤不超过8元，提高了经济效益，同时也保护生态环境，推动了我国畜牧业持续、健康发展。
权利要求
1.一种黑曲霉菌株(Aspergillus niger)MAFIC-005，于2003年12月8日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1067。
2.如权利要求1所述的黑曲霉菌株，其具有以下微生物学特性1)形态学的特性菌落在查氏培养基上生长迅速，25℃6天直径为45～60毫米；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色；2)培养学的特性分生孢子头球形至辐射形，直径150～450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎(1000～3000)微米×(12～20)微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40～70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基(10～20)微米×(4.5～7.0)微米，瓶梗(6～9)微米×(2.5～3.0)微米，分生孢子球形或近球形，直径3.0～4.5微米，壁粗糙。
3.一种权利要求1所述的黑曲霉菌株在固态发酵生产饲用复合酶中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种黑曲霉菌株(Aspergillusniger)MAFIC－005，其保藏号为CGMCC No.1067。该菌株是从无锡一玉米地的土样中筛选分离获得的菌株作为出发菌株，经多次诱变选育得到的。本发明提供的黑曲霉菌株在固态发酵生产饲用复合酶中可以同时高产木聚糖酶、β－葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶。这种固态发酵复合酶可以广泛应用在各种畜禽饲料中，特别是反刍动物饲料中。不仅提高了经济效益，同时也保护生态环境，推动我国畜牧业持续、健康发展。
文档编号C12N1/15GK1651569SQ20041003921
公开日2005年8月10日 申请日期2004年2月5日 优先权日2004年2月5日
发明者李德发, 陆文清, 朴香淑, 王凤来, 邢建军, 程志斌, 邓萍, 臧建军, 李俊波, 汪祖荣 申请人:中国农业大学