专利名称：产氢细菌及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种产氢细菌新种以及产氢细菌新种(Ethanologenbacterium hitB49)的筛选方法。
背景技术：
生物制氢技术作为可再生的清洁能源生产，在世界上已引起高度重视。微生物产氢机制分为两种类型光合法生物制氢和发酵法生物制氢。提供充分的光能是光合微生物产氢的必要条件，由于光的穿透能力有限，若要提供足够的光源需要消耗大量的能源，更重要的是光源的维护与管理十分复杂，并且所占空间较大，使得实现产业化氢气生产难度很大。发酵微生物产氢有着无需光照，产氢稳定等优点，具有更为广阔的前景。
目前，发酵法生物制氢技术在国际上仍处于实验室研究阶段，究其原因，是因为人们将主要精力投入到光合产氢微生物的研究中。尽管大多数发酵产氢菌株的产氢率比光合微生物要高，如阴沟肠杆菌IIT-BT08最大产氢速率为29.63mmol/g·h，但仍需进一步提高产氢能力。但尚未分离到较理想的产氢细菌。没有合适理想的产氢细菌分离培养基可能是制约新的菌种被分离的最大颈瓶。在目前对高效产氢细菌的分离工作，所分离到的高效产氢发酵菌株大多是梭菌属和肠杆菌属，这可能是由于在分离中所应用的分离基础培养基较不理想，更适合这两个属的细菌生长。陈晓蕾(1998)使用培养基I和Fumiaki Taguchi(1993)使用的PY培养基都分离到了一定量的细菌种类和数量，但仍不是十分理想。所以进一步研究出新的厌氧发酵细菌培养基是十分必要的，是能否分离到高效产氢菌株的前提保证。
产氢细菌的丁酸型发酵的应用最为普遍，即在pH＞6条件下，发生以乙酸、丁酸、H2和CO2为主要产物的产氢发酵。由于发酵产氢细菌产氢过程中主要副产物是有机酸，使得反应器内pH下降，抑制微生物产氢，因此常需采取一定方法调节pH，这即不经济，又容易因失误而导致反应器生态系统受到破坏。所以，开展嗜酸或具有较强耐酸能力的产氢细菌研究是十分必要的。Yokoi曾分离到一株较耐酸的产氢细菌(产气肠杆菌HO-39)，能在pH4.0条件下厌氧生长，而嗜酸产氢细菌的分离至今未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高产氢能力、强耐酸能力的产氢细菌(保藏日期2004.5.25，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.1153。)及其筛选方法，该产氢细菌命名为哈工大产乙醇杆菌B49(Ethanologenbacterium hit B49)，保藏编号为CGMCCNo.1153。产氢细菌CGMCC1153的筛选方法，它使用常规的分离、纯化和筛选过程，筛选过程中所使用的培养基为葡萄糖20g；胰蛋白胨4g；牛肉膏2g；酵母汁1g；NaCl 4g；K2HPO41.5g；L-半胱氨酸0.5g；FeSO4.7H2O 0.1g；MgCl20.1g；微量元素10ml；维生素10ml；刃天青0.2％w/v pH6～6.4；上述微量元素为MnSO4.7H2O 0.01g；ZnSO4.7H2O 0.05g；H3BO30.01；N(CH2COOH)34.5g；CaCl2.2H2O 0.01g；Na2MoO40.01g；CoCl2.6H2O 0.2g；AlK(SO4)20.01g；定容1000mL；上述维生素为钴铵素0.01g；抗坏血酸0.025g；核黄素0.025g；柠檬酸0.02g；吡多醛0.05g；叶酸0.01g；对氨基苯甲酸0.01g；肌酸0.025g；定容1000mL。本发明所述的产氢细菌新种Ethanologenbacterium hit B49(其样品已送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保存号为CGMCC No.1153)，是从连续流生物制氢反应器CSTR中取出一定量产氢发酵活性污泥，通过自主设计的培养基，采用改进的Hungate厌氧技术分离获得。是一株既有高效的产氢效率和耐酸特征的细菌，该株细菌为实现生物制氢产业化提供了宝贵的出发菌株，对生物制氢技术实现工业化生产具有重大理论意义和经济价值，有利于实际工程应用，有很大推广价值。本发明产氢细菌哈工大产乙醇杆菌B49在筛选过程中使用了发明人自主研制的培养基配方，具有适于产氢细菌分离、生长和发酵的优点。本发明产氢细菌CGMCC 1153的生理生化和分子生物学鉴定结果证实为一新种，它的生物学特点如下1、菌株的形态特征产氢细菌CGMCC1153为单胞生长的规则杆菌(长1～5.5μm，宽0.3～0.4μm)；周生鞭毛(8～12μm)；革兰氏阳性菌；无荚膜；无芽孢；乳白色圆形菌落(直径1～3cm)见图1。
2、菌株的生理生化特征产氢细菌CGMCC1153为专性厌氧细菌，可以在28～43℃，pH3.3～8.5条件下生长；37℃和pH4.8分别为最适生长条件，代时为7.2h。可以利用柠檬酸生长，牛乳石蕊试验、M.R.、V.P.、明胶试验均为阳性，硝酸盐试验和H2S试验均呈阴性。产氢细菌CGMCC1153为专性厌氧杆菌，代谢特征为乙醇发酵，酵解葡萄糖的主要发酵产物为乙醇、乙酸、H2、CO2和少量的乳酸，乙醇和乙酸的百分含量占挥发酸和醇总量的90％以上，乙醇含量不低于挥发酸和醇总量的45％。最大比产氢速率为32.28mmolH2/g drycell·h，单位体积产氢速率为2382.5mL/L培养液，该菌株属高效产氢细菌，具有很好耐酸能力，可在pH3.3～8.5条件下生长。
3、菌株的分子生物学鉴定结果16S rRNA序列GenBank注册号为AF481148，与其最相近种属纤维素梭菌(Clostridium Cellulosi)的相似性为94％，为一新种细菌。
所属分类学“属”为一新属，命名为产乙醇杆菌属(Ethanologenbacteriumssp.)，为首次命名的分类学新属。其特征是该属细菌为专性厌氧生长，革兰氏阳性菌；杆菌；周生鞭毛；无芽孢；代谢特征为乙醇发酵；通过16S rRNA基因序列比对分析与其最相近种属梭菌属的纤维素梭菌(Clostridium Cellulosi)的相似性为94％。
图1是本发明产氢细菌CGMCC 1153的电子显微镜结构形态示意图。
保藏日期2004.5.25，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.1153。
具体实施例方式具体实施方式
一产氢细菌，命名为哈工大产乙醇杆菌B49(Ethanologenbacterium hit B49)，保藏编号为CGMCC No.1153。
产氢细菌CGMCC1153的筛选方法，它使用常规的分离、纯化和筛选过程。
一、分离、纯化和筛选从生物制氢反应器中取出10ml产氢发酵活性污泥，放入充满氮气的三角瓶中，加入玻璃珠，在振荡器上振荡1～2h，然后用无菌水进行倍比稀释，再接种于固体培养基中，制成滚管，培养7～14d，用无菌毛细管挑取单菌落，转接入固体培养基中；重复以上操作3～10次，直至管内菌落和显微镜下的细胞形态一致；将分离纯化的发酵细菌转接于液体培养基中，35℃、120r/min振荡培养5～8d，用1mL无菌注射器从其气相中取样，检测其气相成分中是否有氢气存在，如果有，即为产氢菌；上述过程所使用的培养基为葡萄糖20g；胰蛋白胨4g；牛肉膏2g；酵母汁1g；NaCl 4g；K2HPO41.5g；L-半胱氨酸0.5g；FeSO4.7H2O 0.1g；MgCl20.1g；微量元素10ml；维生素10ml；刃天青0.2％w/v；pH 6～6.4；所述微量元素为MnSO4.7H2O 0.01g；ZnSO4.7H2O 0.05g；H3BO30.01；N(CH2COOH)34.5g；CaCl2.2H2O 0.01g；Na2MoO40.0lg；CoCl2.6H2O 0.2g；AlK(SO4)20.01g；定容1000mL；所述维生素为钴铵素0.01g；抗坏血酸0.025g；核黄素0.025g；柠檬酸0.02g；吡多醛0.05g；叶酸0.01g；对氨基苯甲酸0.01g；肌酸0.025g；定容1000mL。
在上述液体培养基中加入1％(W/V)琼脂即成为固体培养基。
二、高效产氢菌株优选将筛选出的产氢菌株，重复分离、纯化操作，待其产气稳定后，测其产氢能力，并将产氢能力高的菌株，重复分离操作，用无菌毛细管挑取在固体培养基中产生气泡较大的细菌菌落进行纯化，反复上述步骤，直至滚管中细菌稳定产生大而多的气泡为止。富集后，再测其产氢能力。反复多次，直至优选出产氢能力最高的菌株为止。
三、细菌的生理生化分析细菌的生长用紫外分光光度计，在600nm处测定样品的吸光度值，作为菌浊。不同菌浊的细菌干重测定是将样品在5000r/min下离心，弃上清液，用无菌纯水洗细菌沉淀2次，80℃干燥12h，用精密电子天平称其重量。形态学鉴定和碳源利用指标测定参照文献方法(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京科学出版社，2001.)四、菌株分类鉴定提取细菌基因组DNA后进行16S rDNA序列扩增，用于扩增的PCR反应引物为通用引物正向引物BSF8/205′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物BSR1541/15225′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′，分别对应于大肠埃希氏菌(E.coli)16SrRNA的8～27和16S rRNA的1522～1541碱基。PCR反应体系(50μL)如下10×buffer(mg2+)5μL、2.5mmol/L dNTP 5μL、20pmol/L引物各1μL、ExTaq DNA酶0.25μL。PCR扩增条件95℃ 5min；94℃ 1min；60℃ 30S；72℃ 1min，30个循环；72℃ 8min。用pMD18-T载体克隆，进行序列测定。
五、产氢细菌哈工大产乙醇杆菌B49发酵产氢工艺发酵产物的分析挥发酸和醇类测定，使用GC122型气相色谱仪，取1mL培养液，离心5000r/min，取上清液进样，柱长2m，担体GDX103，60～80目，氢火焰检测器，氮气作载气，流速60mL/min，氢气流速为50mL/min，空气流速为490mL/min，汽化室210℃，柱和检测室190℃。氢气和二氧化碳测定，使用SC-II型气相色谱仪，柱长2m，担体为TDS-01，60～80目，热导池检测器，氮气作载气，流速为70mL/min，柱和检测室150℃。通过静态试验优化发酵工艺。确定影响发酵工艺的最适底物、最佳生长和产氢温度、PH值、氧化还原电位(ORP)、金属离子等参数。
利用产氢细菌哈工大产乙醇杆菌B49进行产氢的方法，它使用常规的产氢方法，以糖蜜和葡萄糖为底物，发酵产氢温度为35℃，生长pH为4.5，产氢pH为4.0。
附件序列表产氢细菌新种哈工大产乙醇杆菌B49(Ethanologenbacterium hit B49)的16SrRNA序列(GenBank注册号为AF481148)<110>哈尔滨工业大学<120>产氢细菌及其筛选方法<160>1<210>1<211>1465<212>RNA<213>产乙醇杆菌属(Ethanologenbacterium ssp.)<400>1aaggaattga cgggggcccg cacaagcagt ggagtatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 900aagaacctta ccaggtcttg acatccaccg aatcccccag agatggggga gtgcccttcg 960gggagcggtg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020aagtccctca acgagcgcaa cccttgtgaa tagttgctac gaaagagcac tctattcaga 1080ccgccgttga caaaacggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1140ctgggctaca cacgtactac aatggccatc aacagaggga agcaaggccg cgaggtggag 1200cgaaccccta aaaatggtct cagttcagat tgcaggctga aacccgcctg catgaagatg 1260gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320accgcccgtc acaccatgag agccggggac acccgaagtc ggttgggtaa ccgtaaggag 1380cccgccgccg aaggtggaat cggtaattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg 1440aaggtgcggc tggatcacct cctta146权利要求
1.一株产氢细菌，命名为哈工大产乙醇杆菌B49(Ethanologenbacterium hitB49)，保藏编号为CGMCC No.1153。
2.根据权利要求1所述的产氢细菌，其特征在于所述产氢细菌哈工大产乙醇杆菌B49GenBank注册号为AF481148，它的16S rRNA序列如下aaggaattga cgggggcccg cacaagcagt ggagtatgtg gtttaattcg aagcaacgcg900aagaacctta ccaggtcttg acatccaccg aatcccccag agatggggga gtgcccttcg960gggagcggtg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020aagtccctca acgagcgcaa cccttgtgaa tagttgctac gaaagagcac tctattcaga 1080ccgccgttga caaaacggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1140ctgggctaca cacgtactac aatggccatc aacagaggga agcaaggccg cgaggtggag 1200cgaaccccta aaaatggtct cagttcagat tgcaggctga aacccgcctg catgaagatg 1260gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320accgcccgtc acaccatgag agccggggac acccgaagtc ggttgggtaa ccgtaaggag 1380cccgccgccg aaggtggaat cggtaattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg 1440aaggtgcggc tggatcacct cctta 1465。
3.一种产氢细菌的筛选方法，它使用常规的分离、纯化和筛选过程，其特征在于筛选过程中所使用的培养基为葡萄糖20g；胰蛋白胨4g；牛肉膏2g；酵母汁1g；NaCl 4g；K2HPO41.5g；L-半胱氨酸0.5g；FeSO4.7H2O 0.1g；MgCl20.1g；微量元素10ml；维生素10ml；刃天青0.2％w/v；pH6～6.4；上述微量元素为MnSO4.7H2O 0.01g；ZnSO4.7H2O 0.05g；H3BO30.01；N(CH2COOH)34.5g；CaCl2.2H2O 0.01g；Na2MoO40.01g；CoCl2.6H2O 0.2g；AlK(SO4)20.01g；定容1000mL；上述维生素为钴铵素0.01g；抗坏血酸0.025g；核黄素0.025g；柠檬酸0.02g；吡多醛0.05g；叶酸0.01g；对氨基苯甲酸0.01g；肌酸0.025g；定容1000mL。
全文摘要
产氢细菌及其筛选方法，涉及一种产氢细菌新种、产氢细菌新种的筛选方法。尽管大多数发酵产氢菌株的产氢率比光合微生物要高，但仍需进一步提高产氢能力。产氢细菌，命名为哈工大产乙醇杆菌B49(Ethanologenbacterium hit B49)，保藏编号为CGMCC No.1153。产氢细菌的筛选方法，它在筛选过程中所使用的培养基为新型培养基。本发明的菌株是一株既有高效的产氢效率和耐酸特征的细菌，该株细菌为实现生物制氢产业化提供了宝贵的出发菌株，对生物制氢技术实现工业化生产具有重大理论意义和经济价值，有利于实际工程应用。本发明具有适于产氢细菌分离、生长和发酵的优点。
文档编号C12N1/20GK1644679SQ20041004383
公开日2005年7月27日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者任南琪, 林明, 邢德峰, 李建政, 李永峰, 丁杰, 王相晶, 秦智, 李秋波 申请人:哈尔滨工业大学