专利名称：从微生物菌体回收高纯度聚羟基链烷酸酯的方法
技术领域：
本发明涉及从微生物细胞中分离·回收具有生物降解性的聚酯类树脂的方法以及该树脂粒子的凝聚方法。
背景技术：
聚羟基链烷酸酯(以后简称为PHA)是在很多种微生物的细胞内，作为能量积蓄物质而生成、积蓄的热塑性聚酯。由微生物将天然的有机酸或油脂生产成为碳源的PHA，是通过土中或水中的微生物完全地生物降解，并纳入自然界的碳循环过程，因此被称为对生态系统几乎没有不良影响的环境调和型塑料材料。近年，合成塑料从环境污染、废弃物处理、石油资源的观点来看，已到了成为严重社会问题的程度，PHA作为对环境无污染的绿色塑料备受关注，并热切地期望其实用化。另外，在医疗领域，也认为可以利用于作为不需要回收的植入物材料、药物载体等生物体适用性塑料，并期待实用化。
微生物生产的PHA由于通常作为颗粒体在微生物细胞内蓄积，为了使PHA作为塑料利用，则需要从微生物细胞内分离取出PHA的工序。作为从微生物细胞中分离精制PHA的已知方法，如果大致区分，可以分为通过使用PHA可溶性有机溶剂从微生物细胞中提取PHA的方法，和破碎或可溶化而除去PHA以外的细胞构成成分而得到PHA的方法。
在初期的研究中，大量报道了利用通过有机溶剂的提取进行PHA的分离精制方法(特开昭55-118394号公报、特开昭57-65193号公报、特开昭63-198991号公报、特开平02-69187号公报、特开平07-79788号公报)。在这些报告中，作为PHA的溶解度最高的有机溶剂，使用氯仿等卤素化合物，但是，将PHA溶解于该溶剂中时，溶液的粘性变得非常高，操作困难。因此，在PHA的提取时，需要在聚合物浓度为2～3％左右的极稀的条件下进行处理，因此需要非常大量的溶剂。另外，为了从溶剂层以高的回收率使PHA结晶析出，还另外需要上述溶剂的4～5倍容量的大量的甲醇或己烷等不良溶剂，因此，工业生产需要大规模的设备。另外，由于溶剂的使用量庞大，则溶剂回收成本和损失溶剂的成本增加，从不能廉价制造PHA等理由来看，此方法不能实用化。
另一方面，还报道了各种将PHA以外的细胞构成成分通过化学处理或物理破碎处理使之可溶化并除去，将PHA按颗粒体原样的状态回收的方法。
作为化学处理微生物细胞(下面也称为菌体)的方法，在J.Gen.Microbiology，1958年，第19卷，p.198-209中记载了用次氯酸钠处理菌体悬浮液将PHA以外的菌体构成成分可溶化，从而获得PHA的方法。此方法中，虽然使PHA以外的菌体构成成分的可溶化，但是与此同时由于引起PHA的显著的分解，导致了对制品的加工的限制。另外，由于在PHA内残留不能忽视的氯的臭味，故被认为作为制品不为优选，由此可以看出不适合于实际应用。在特公平04-61638号公报中，示出了将热处理和酶、表面活性剂同时使用的回收法，此方法中，通过酶处理溶解菌体时，由于游离的核酸悬浮液变得非常的粘稠，因此需要预先将悬浮液在100℃或100℃以上加热，分解核酸。可是，通过在100℃或100℃以上的加热，PHA显著地低分子化，使得不能够应用于制品。另外，此方法不仅非常的复杂、需要很多的工序，而且得到的PHA的纯度大致为88％，最大也仅为97％左右。另外，还提出了将含有PHA的微生物菌体用表面活性剂处理之后，将从菌体放出的核酸用过氧化氢在80℃下处理3小时进行分解，分离99％纯度的PHA的方法(特表平08-502415号公报)、和将含有PHA的微生物悬浮液在pH不到2的强酸性下、在50℃或50℃以上加热后，分离PHA的方法(特开平11-266891号公报)。在这些热处理条件下，由于PHA的分子量显著降低，即使纯度提高了，也变得不能应用于制品。
另一方面，作为使用物理破碎的方法，报导了高压破碎或组合高压破碎与添加碱的方法。Bioseparation，1991年，第2卷，p.95-105中，虽然没有记载聚合物的纯度和回收率，但由于在含有聚-3-羟基丁酸(PHB)的菌体悬浮液中添加碱后，将pH返回中性，进行高压破碎，菌体构成成分在PHB级分中残存，可以预想纯度不会高。在特开平07-31487号公报中公开了，添加碱后在80℃加热，搅拌1小时后使用离心分离回收聚合物的方法；特开平07-31488号公报中公开了，在70℃进行高压破碎的方法；特开平07-31489号公报中，公开了被认为是发展了Bioseparation，1991年，第2卷，p.95-105的方法，即，在添加碱后，在70℃或70℃以上进行高压破碎的方法。这些方法中，由于在高温下进行处理，根据条件，可以发现PHA的分子量有显著降低的倾向，而且纯度也降低至66～85％左右，不能应用于实际的工业化工艺中。
从上述可知，从培养后的菌体将PHA进行不发生低分子化、而且高纯度收率良好地、在工业上廉价地回收是极其困难的。
可是，不使用溶剂提取，即，在将PHA以外的菌体构成成分通过化学处理或物理处理使之可溶化并除去，PHA以颗粒体的原样状态回收的方法中，得到的PHA通常是直径数微米的微细粒子。从液体介质中分离这样的微细粒子时，与粒子更大的场合相比是困难的。另外，考虑到这些微粒引起粉尘爆炸的危险性和/或呼吸时在肺中的积蓄等，在使用时需要注意。
为了避免这样的问题，作了使PHA凝聚，粒度变大的尝试，例如，开发了通过加热或碱金属盐的凝聚法等。作为加热凝聚的方法，是将含有PHB的悬浮液加热到PHB的熔点附近(180℃)，使之凝聚的方法(Bailey，Neil A.；George，Neil；Niranjan，K.；Varley，Julie.Biochemical Engineering group，University Reading，「IChemE Res.Event，Eur.Conf.Young Res.Chem.Eng.」，(英国)，第2版，Institution of Chemical Engineers，1996年，第1卷，p.196-198)。另外，特表平07-509131号公报中，公开了在悬浮于水中的3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(3HV)的共聚物(以下称为PHBV)中，将适当的温度和压力的蒸汽直接注入，通过在120～160℃加热搅拌，提高PHBV的粒度的方法。这些方法由于需要在高温下加热，PHA的分子量降低明显，而且由于需要具有耐压性的特别的装置，所以不实用。另外，作为添加碱金属盐凝聚PHA的方法，公开了用2价的阳离子凝聚的方法(J.Biotechnol.，1998年，第65(2，3)卷，p.173-182、特表平05-507410号公报)，但是这些方法，由于聚合物的凝聚强度未必强、以及在聚合物中混入金属盐等，故不为优选。另外，还报道了通过向PHB悬浮液中吹入超微细气泡使PHB凝聚，使絮状物浮上来的方法(参照Spec.Publ.-R.Soc.Chem.，1994年，158卷(Separations for Biotechnology 3)，p.113-119)。可是，据此得到的凝聚体为2～45μm，不能说充分大。
故此，现在的现状是，抑制PHA分子量降低，并且能够有效地进行凝聚的方法仍然不知道。
如上所述，对于来自微生物的生物降解性聚合物的PHA的开发，在从微生物细胞回收PHA的工序、另外视需要而凝聚PHA粒子的工序中，廉价并且适合于工业化的各工艺过程还没有确立，这成为了实用化的大的障碍。
发明的概要如上所述，在从微生物细胞回收PHA的工序中，以前的方法不能说是廉价并且适合于工业化的工艺。另外，本发明者们预备研究的结果表明，如用上述的次氯酸、过氧化氢、酸、大量的碱等的化学处理，或需要在高温下反应的以前的方法，特别是PHA为含有2种或2种以上的单体成分的共聚物时，与均聚物的PHB相比，发现分子量有更加明显降低的倾向，无论如何也不能利用。
因此，本发明的目的在于提供一种PHA的分离精制方法，进而得到PHA粒子的凝聚体的方法。该方法是为解决原有技术的上述问题，从培养的含有PHA的微生物细胞中有效地除去PHA粒子以外的细胞构成成分，使用很少的工序，就能够以高收率得到不引起严重的分子量降低、高纯度的PHA的PHA的分离精制方法，进而得到PHA粒子的凝聚体的方法。
本发明者们对从工业上有利的微生物细胞回收PHA的方法进行了深刻的研究，结果发现，使用微生物生产PHA之后，将含有PHA的微生物细胞的水性悬浮液在比较低的温度下，边进行搅拌和物理的破碎处理边添加碱，接着，回收PHA，将该PHA在水性悬浮液或湿润状态下，用酶和/或表面活性剂处理，另外，将该PHA通过用亲水性溶剂和/或水洗净，可以高纯度并且高效地回收PHA。另外还发现，将PHA悬浮于亲水性溶剂和/或水中，通过在该悬浮液的沸点或沸点以下的温度下搅拌使之凝聚，可以使PHA的粒度变大。通过这些方法，成功地解决了至今为止极难避免的PHA的分子量降低问题，并以90％或90％以上的收率回收了纯度99％或99％以上的PHA，另外，通过凝聚，避免了使用困难和/或粉尘爆炸的危险性，以至完成了PHA的制造方法。由于本发明的完成，使来自微生物菌体的生物降解性聚合物的实用化成为可能。
即，本发明涉及从含有PHA的微生物细胞回收PHA的方法。该回收方法包括(a)在含有PHA的微生物细胞的水性悬浮液中，边进行搅拌和物理的破碎处理边添加碱，破碎该细胞，同时使该细胞中的PHA以外的细胞物质可溶化或乳化，接着将PHA从悬浮液中分离的工序；(b)将分离的PHA用酶和/或表面活性剂进行处理，将附着在PHA上的杂质可溶化或分解后可溶化，接着用亲水性溶剂和/或水洗净PHA的工序。
另外，本发明涉及上述的回收PHA的方法，该方法还具有(c)将洗净的PHA悬浮于亲水性溶剂和/或水中，通过在该悬浮液的沸点或沸点以下的温度下搅拌，使PHA凝聚加大粒度，接着将凝聚的PHA从悬浮液中分离的工序。
附图的简单说明
图1是为了实施本发明的聚-3-羟基链烷酸的分离精制的菌体破碎装置的说明图。
符号的说明1菌体破碎装置2搅拌装置3 pH检测控制装置4泵5管路6 pH调整剂贮存槽7 pH计8管路9破碎装置10泵11菌体破碎槽发明的详述以下举出优选的实施方案，对本发明进行更加详细地说明。
本发明的聚羟基链烷酸酯的回收方法包括(a)和(b)的工序。
(a)在含有聚羟基链烷酸酯的微生物细胞的水性悬浮液中，边进行搅拌和物理的破碎处理边添加碱，破碎该细胞，同时使该细胞中的聚羟基链烷酸酯以外的细胞物质可溶化或乳化，接着将聚羟基链烷酸酯从悬浮液中分离的工序；(b)将分离的聚羟基链烷酸酯用酶和/或表面活性剂进行处理，将附着在聚羟基链烷酸酯上的杂质可溶化或分解后可溶化，接着用亲水性溶剂和/或水洗净聚羟基链烷酸酯的工序。
首先，本发明中所谓的聚羟基链烷酸酯(PHA)，是羟基链烷酸酯的聚合物的总称。作为羟基链烷酸成分，没有特别的限定，具体地，可以举出3-羟基丁酸(3HB)、3-羟基戊酸(3-hydroxyvalerate)(3HV)、3-羟基丙酸、4-羟基丁酸、4-羟基戊酸、5-羟基戊酸、3-羟基戊酸(3-hydroxypentanoate)、3-羟基己酸(3HH)、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸等。
本发明的PHA，既可以是这些羟基链烷酸的均聚物，也可以是2种或2种以上共聚的共聚物。特别是在原有的方法中具有分子量容易降低倾向的共聚物时，在如后面所述的本发明的回收方法中，其分子量几乎不降低这点上非常适用。
作为PHA的具体例，可以例示3HB的均聚物PHB、3HB和3HV的2成分共聚物PHBV、3HB和3HH的2成分共聚物PHBH(参照专利第2777757号公报)、3HB和3HV及3HH的3成分共聚物PHBHV(参照专利第2777757号公报)。特别是，作为生物降解性聚合物的分解性和具有柔软的性质这点上，优选具有作为单体单元3HH的共聚物，更加优选的为PHBH。
当为PHBH时，对于构成的各种单体单元的组成比没有特别的限定，但从显示良好的加工性的方面来看，优选3HH单元为1～99mol％的，更加优选3～30mol％。另外，PHBHV的场合，对于构成的各种单体单元的组成比没有特别的限定，但是合适的是例如，3HB单元的含量为1～95mol％、3HV单元的含量为1～96mol％、3HH单元的含量为1～30mol％的范围。
从实用性方面看，PHA优选用凝胶色谱法将聚苯乙烯作为分子量标准的重均分子量为1万或1万以上，更加优选5万或5万以上，进一步优选10万或10万以上，特别优选20万或20万以上。
作为用于本发明的微生物，只要是能够在细胞内蓄积PHA的微生物就没有特别的限定。可以举出，例如，气单胞菌属(Aeromonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、固氮菌属(Azotobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、盐杆菌属(Halobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红螺菌属(Rhodospirillum)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、动胶菌属(Zoogloea)等微生物。另外，具体地，作为气单胞菌属，可以举出，例如豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)等，作为产碱菌属，可以举出，例如解脂产碱菌(Alcaligenes lipolytica)、广泛产碱菌(Alcaligenes latus)等，作为罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)，可以举出，例如富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)等。
这些微生物，通过调整培养条件，可以在细胞内蓄积PHA。
另外，在这些微生物中，可以使用导入了参与PHA合成的基因组的转化体。此时，作为宿主不作特别的限定，上述微生物以外，还可以举出大肠杆菌(埃希氏菌属(Escherichia))、酵母的念珠菌属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)、嗜草菌属(Yarrowia)(WO0188144)等微生物。
在本发明使用的上述微生物中，气单胞菌属的豚鼠气单胞菌，或导入了来自该豚鼠气单胞菌的PHA合成酶组基因的转化体，具有优异的合成PHBH的能力，故为优选。特别是，更加优选在富养罗尔斯通氏菌中，导入了来自豚鼠气单胞菌的PHA合成酶组基因的转化体。
作为该微生物的一例，可以优选使用在富养罗尔斯通氏菌中，导入了来自豚鼠气单胞菌的PHA合成酶组基因的Ralstonia eutrophaPHB-4/pJRDEE32d13菌株。另外，该Ralstonia eutropha PHB-4/pJRDEE32d13株是用真养产碱菌AC32(Alcaligenes eutrophus AC32)的名称，保藏号FERMBP-6038，保藏日为平成9年8月7日、保藏单位为日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，根据布达佩斯条约进行的国际保藏。
在本发明中，将上述的微生物在适宜的条件下培养，使用在其细胞内蓄积了PHA的微生物细胞。对于其培养方法没有特别的限定，可以使用例如特开2001-340078号公报所示的本技术领域的普通技术人员公知的方法。
在回收PHA上，培养后的微生物细胞中的PHA含有率当然是优选高的，在适用于工业水平方面来看，优选干燥细胞中的PHA含有率为50重量％或50重量％以上。如果从以后的分离操作、分离聚合物的纯度等考虑，干燥细胞中的PHA含有率更加优选60重量％或60重量％以上，特别优选70重量％或70重量％以上。
培养结束后虽然可以直接进入工序(a)，但也可以通过离心分离、膜分离等业内人士已知的方法回收菌体后，或者通过加热使菌体死亡后再回收菌体，然后再进入工序(a)。在此，加热时的温度优选50～70℃。
在本发明的工序(a)中，重要的是一边进行含有PHA的微生物细胞的水性悬浮液的搅拌和物理的破碎处理，一边在该水性悬浮液中添加碱。即，实际上是如下的工艺(1)配制含有PHA的微生物细胞的水性悬浮液；(2)一面搅拌该水性悬浮液，首先开始物理的破碎处理；(3)接着，一边继续搅拌和物理破碎处理，一边添加碱。
如果不进行物理破碎处理就向菌体悬浮液中添加碱，则核酸以及菌体细胞壁、细胞膜、不溶性蛋白质等与PHA一起从微生物细胞中流出。本发明者们发现，此时，特别是由于游离的核酸导致悬浮液的粘度急剧上升，根据条件，连悬浮液的搅拌都变得不能进行，PHA的回收也变得不可能了。另外，本发明者们还发现，在回收PHA时，如果首先添加碱使悬浮液的pH达到10或10以上后，再进行物理的破碎(例如通过高压均化器进行菌体破碎和乳化)时，则容易产生PHA的分解，相反，如果相比于添加碱，先进行物理的破碎时，则意外地难以产生PHA的分解。
因此，本发明的回收方法，在工序(a)中，由于一旦开始物理的破碎后，再一边进行物理的破碎一边徐徐地添加碱，进行PHA以外的不溶物质(细胞物质)的可溶化或乳化，由此则可以不使PHA分解，又可以从悬浮液中容易地分离·回收PHA。
在工序(a)中使用的含有PHA的微生物细胞的水性悬浮液，是指使上述得到的含有PHA的微生物细胞悬浮于水中的悬浮液。
另外，该微生物细胞的悬浮浓度，优选按1L的水性悬浮液中的干燥菌体换算为500g/L或500g/L以下，从微生物细胞悬浮液的搅拌的难易来看，更加优选300g/L或300g/L以下。作为下限，优选80g/L或80g/L以上。
作为上述水性悬浮液的搅拌方法，没有特别的限定，但是为了使添加的碱高效地扩散，并且从细胞中流出的高粘度的DNA高效地破碎，优选使用乳化分散机或超声波破碎机进行搅拌。更加优选的为乳化分散机，例如，可以使用英国希尔巴森(Silverson)公司制造的希尔巴森混合器、日本国埃姆·特克尼克(M-TECHNIQUE)公司制造的CLEAR MIX、日本国株式会社荏原制作所制造的Ebara Milder等，但并不是仅限于此。
在本发明中，作为进行物理破碎处理的装置，没有特别的限定，可以举出高压均化器、超声波破碎机、乳化分散机、玻璃珠辗磨机(bead mill)等，其中优选高压均化器，更加优选将聚合物的水性悬浮液导入到具有微小开口部的耐压性容器中，通过施加高压从开口部挤出的类型。由这样的耐压性容器和加压机构构成的装置，可以优选使用例如，意大利尼罗森阿比(NiroSoavi)公司制造的高压均化器。另外还可以使用布兰柳倍(Bran+Luebbe)连续式细胞破碎机(德国Bran+Luebbe社制)、Microfluidizer(美国Microfluidics社制)等，但并不是仅限于这些。
这样的高压均化器，由于对微生物细胞赋予大的剪切力，有效地破坏了微生物细胞，促进聚合物的分离。另外，由于该装置在开口部施加高压，瞬间地产生高温，因此视需要，一般通过低温恒温循环槽冷却含有微生物细胞的悬浮液，防止温度的上升，优选在20～40℃进行破碎处理。像这样在比较低的温度下进行处理时，PHA的分子量几乎不降低。因此，在本发明优选的实施方案中，优选一边在20～40℃下进行物理破碎一边添加碱的方法。
在工序(a)中使用的碱只要是破坏含有PHA的微生物的细胞壁，能够使该细胞中的PHA流出到细胞外，则没有特别的限定。作为碱，可以举出，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等碱金属的氢氧化物；碳酸钠、碳酸钾等碱金属的碳酸盐；碳酸氢钠、碳酸氢钾等碱金属的碳酸氢盐；乙酸钠、乙酸钾等有机酸的碱金属盐；硼砂等碱金属的硼酸盐；磷酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸三钾、磷酸氢二钾等碱金属的磷酸盐；氢氧化钡等碱土金属的氢氧化物；氨水等，但并不是仅限于这些。这些可以单独使用，也可以2种或2种以上并用。其中，从适合于工业生产、以及价格方面来看，优选碱金属的氢氧化物、碱金属的碳酸盐，更加优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、碳酸钠等。
在本发明的工序(a)中，优选在添加碱时控制pH。能够将PHA以外的来自菌体的不溶物(细胞物质)更加有效地可溶化，并且几乎不会对PHA自身带来不良影响，优选的pH的范围为pH9～13.5，更加优选pH10～13。pH比13.5大时，有PHA的分子量变得容易降低的倾向，pH不到9时，有破碎效果变得容易降低的倾向。
因此，可以优选采用一边控制pH为所希望的值，一边在微生物细胞的悬浮液中，连续地或者断续地添加碱的方法。在本发明中，通过这样地控制pH，在防止象一次性添加碱时那样的pH变得过高的同时，经常通过维持某种程度以上的碱条件，使不溶性蛋白质能够保持可溶化状态，因此不需要使悬浮液达到高温，作为结果，可以更加有效地防止PHA的分子量降低。
在进行工序(a)时的温度，从更加有效地防止PHA的分子量降低这点来看，优选10～45℃，更加优选20～40℃。
如上面所述，在工序(a)中，如果一边维持pH9～13.5的任意的pH一边进行高压破碎等物理的破碎，则能够在20～40℃这样的低温下处理，即使是PHBH的场合，也可以抑制分子量降低在10％或10％以下。也就是说，特别优选在pH9～13.5、温度20～40℃的条件下进行工序(a)。如果在这样合适的碱性环境下破碎微生物细胞，则能够得到再现性更高的结果。
从PHA的悬浮液的分离，可以通过例如，离心分离、膜分离、过滤器过滤等进行。
下面，使用进行工序(a)所用的优选的装置的示意1，对工序(a)进行更加详细地说明。当然，本发明并不是仅局限于这些装置例。
在图1中的符号1表示在整体上的本发明的菌体破碎装置。符号6是存贮碱药剂用的pH调整剂贮存槽，该pH调整剂贮存槽6内的药剂，由泵4通过管路5供给菌体破碎槽11，视需要调整菌体破碎槽11内的微生物细胞悬浮液的pH。另外，在菌体破碎槽11中，设置搅拌装置2，该搅拌装置2是为了将由pH调整剂贮存槽6供给到菌体破碎槽11中的pH调整剂在菌体破碎槽11内的微生物细胞悬浮液中均一地搅拌混合。另外，在菌体破碎槽11中，还设置由pH计7和pH检测控制装置3构成的pH检测控制手段，该检测控制手段是为了控制泵4的供给量，以便检测菌体破碎槽11内的微生物细胞悬浮液的pH，以使pH成为规定的值。这里，菌体破碎槽11可以兼作低温恒温循环槽，使微生物细胞悬浮液保持在所希望的温度。
在图1中，菌体破碎槽11内的微生物细胞悬浮液，通过泵10供给破碎装置9，由该破碎装置9将作为粘度上升的原因的核酸高效地破碎，通过管路8供给菌体破碎槽11内。通过搅拌装置2，添加的碱迅速地扩散，微生物细胞悬浮液变得均一，可以严密地调整微生物细胞悬浮液的pH。在此，为了不受碱浓度部分地变为高浓度而导致的聚合物水解，优选充分地进行搅拌。另外，作为控制的pH的上下的波动幅度，优选在设定值的上下各1以内，更加优选为上下各0.5以内，预计了该上下波动幅度的pH，优选控制在上述优选的pH范围9～13.5。
在破碎装置9中，可以使用上述的高压均化器、超声波破碎机、乳化分散机、玻璃珠辗磨机(ビ一ズミル)等装置。另外，也可以将同种类的或不同种类的破碎机2台或2台以上，并联或串联设置。在搅拌装置2中，为了使添加的碱高效地扩散，并且使从细胞中流出的高粘度的DNA高效地破碎，优选使用上述的乳化分散机或超声波破碎机。这些机器也可以制造成串联混合器类型，例如，可以将图1的泵10和搅拌装置2兼用，此时具有使构造变得简单的优点。另外，pH计7和pH检测控制装置3可以使用广泛应用的机器。
接着，在本发明中的工序(b)是酶以及表面活性剂中的任一个、或者将它们并用进行处理的PHA精制法。
在本发明中，对于在工序(a)中得到的比较高纯度的PHA，通过进行工序(b)的处理，如后面所述，可以获得更加显著的效果。
在工序(a)中得到的PHA粒子中，一般可以认为附着有蛋白质类、作为菌体细胞壁成分的肽聚糖、脂质类、多糖类、核酸类、其他的碳水化合物类。本发明的工序(b)就是以除去上述的附着成分的至少几个，来提高PHA的纯度为目的而进行的。
在本发明中，为了更加提高工序(b)的处理效果，并不是使工序(a)分离的PHA干燥后使用，而是优选将工序(a)分离的PHA以原样的悬浮于水中的状态、或者通过例如离心分离或膜分离分离回收后，以在水中润湿的原样状态用于下面的工序(b)。
在工序(b)中，通过酶进行处理时，作为使用的酶，可以举出蛋白质分解酶、脂质类分解酶、细胞壁分解酶、DNA分解酶等。作为这些酶的具体例，可以举出下述的酶，这些可以单独使用，也可以2种或2种以上并用。
(1)蛋白质分解酶(蛋白水解酶)蛋白水解酶(Alcalase)、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶等(2)脂质类分解酶脂肪酶类、磷脂酶类、胆碱酯酶类、磷酸酶等(3)细胞壁分解酶溶菌酶、淀粉酶、纤维素酶、麦芽糖酶、蔗糖酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-糖苷酶等(4)DNA分解酶核糖核酸酶等本工序所用的酶，并不是仅限定于上述的酶，只要是可以应用于工业制品的，则可以是任意的酶。另外，也可以使用一般市售的洗涤用酶洗濯剂等。
另外，还可以是含有例如酶和酶稳定剂或再污染防止剂等的酶组合物，并不限定于只是酶。
作为酶，在除去附着在PHA上的不溶性蛋白质或不溶性肽聚糖的目的中，优选从蛋白质分解酶以及细胞壁分解酶中选择的至少一种，更加优选蛋白质分解酶。
作为优选的蛋白质分解酶，在上述列举的之中，作为工业上可以使用的酶，可以举出蛋白水解酶A、蛋白水解酶P、蛋白水解酶N(以上，天野エンザイム社制)、枯草杆菌蛋白酶(Alkalase)、洒维奈斯(Savinase)、エバラ一ゼ(Everlase)(以上，ノボザイム社制)等，从分解活性方面来看，适合使用。另外，作为优选的细胞壁分解酶，可以举出上述列举之中的溶菌酶。可是，并不是仅局限于这些。
进行酶处理时，其处理当然应该是在比酶变性的温度低的温度下进行。很多场合，酶的变性温度比65℃低。对于几种酶，其变性温度比65℃高，因此，在使用这样的酶时，虽然可以使用比65℃高的处理温度，但是考虑在高温下的PHA的分子量降低时，酶处理温度优选50℃或50℃以下，更加优选20℃～50℃。
酶处理时间优选进行到达到所需要的处理度，通常为0.5～2小时。
酶的使用量依赖于酶的种类以及活性，虽然没有特别的限定，但相对于聚合物100重量份，优选0.001～10重量份，从成本方面考虑，更加优选0.001～5重量份。
本发明的方法，与对含有PHA的菌体本身进行酶处理，破碎菌体的原有的方法(特公平04-61638号公报)相比较，由于只要是添加足够将PHA中残存的极少的不溶物可溶化的酶量就可以，所以具有可以经济、廉价地制造的优点。
在本发明的工序(b)中，为了除去附着在PHA粒子上的不纯物，可以使用作为可溶化剂的表面活性剂。
作为本发明使用的表面活性剂，可以举出阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂等。这些可以单独使用，也可以2种或2种以上并用。
作为阴离子表面活性剂，可以举出烷基硫酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基或链烯基硫酸酯盐、烷基或链烯基醚硫酸酯盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸盐或其酯、烷基或链烯基醚羧酸盐、氨基酸型表面活性剂、N-酰基氨基酸型表面活性剂等。其中，优选烷基的碳原子数为12～14的烷基硫酸盐、烷基的碳原子数为12～16的直链烷基苯磺酸盐、烷基的碳原子数为10～18的烷基硫酸酯盐或烷基醚硫酸酯盐。另外，作为抗衡离子，优选钠、钾等碱金属、镁等碱土金属、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等烷醇胺，但并不是仅限于此。
作为阳离子表面活性剂，可以举出烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐等。
作为两性表面活性剂，可以举出羰基三甲铵基乙内盐(carbobetaine)型、磺基三甲铵基乙内盐型表面活性剂等。
作为非离子表面活性剂，可以举出聚氧化烯烃(优选氧化乙烯)烷基或链烯基醚、聚氧化烯烃(优选氧化乙烯)烷基或链烯基苯基醚、聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基或链烯基醚、聚氧化乙烯聚氧化丙烯二醇、聚乙二醇、聚氧化乙烯烷基胺、高级脂肪酸链烷醇酰胺、烷基葡糖苷、烷基葡萄糖酰胺、烷基氧化胺等。其中，优选亲水性高的表面活性剂，以及与水混合时产生的液晶形成能低或不生成液晶的表面活性剂，另外，从生物降解性比较良好这点看，优选使用碳原子数10～14的聚烷氧基醚、碳原子数10～14的聚氧化乙烯烷基醚、聚乙二醇等，但并不是仅限于此。
在上述表面活性剂中，具体地，从价格、使用量、添加效果方面看，优选十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、油酸钠等阴离子表面活性剂；聚乙二醇、碳原子数10～14的聚氧化乙烯烷基醚等非离子表面活性剂。另外，优选这些2种或2种以上并用。
以上举出的表面活性剂一般使用市售的洗涤用洗涤剂，可以将适当的洗涤用洗涤剂作为表面活性剂使用。
另外，从洗净性来看，优选阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂。在以洗净·除去蛋白质为目的时，优选使用阴离子表面活性剂，另外，以洗净·除去脂肪酸或油脂为目的、或者与酶并用时，优选使用非离子表面活性剂。另外，即使是含有阴离子表面活性剂以及非离子表面活性剂两种也没有关系。含有两种的场合，阴离子表面活性剂/非离子表面活性剂的重量比优选1/100～100/10，更加优选5/100～100/20，进一步优选5/100～100/100，特别优选5/100～50/100。
表面活性剂的添加量，没有特别的限定，相对于聚合物100重量份，优选0.001～10重量份，从成本上考虑，更加优选0.001～5重量份。
另外，在表面活性剂处理中，处理温度没有特别的限定，但从促进PHA以外的菌体构成成分的可溶化来看，优选20～50℃的范围。另外，处理时间优选为1分钟～2小时。
作为本发明优选的实施方案，从能够获得更高的精制效果来看，可以举出酶处理和表面活性剂并用。
酶处理和表面活性剂并用时，酶处理的使用量以及表面活性剂的使用量，分别与上述相同。另外，该并用时的处理温度优选为20～50℃，处理时间优选为1分钟～2小时。
本发明者们确认了2剂并用的显著效果，作为其理由，可以认为是因为表面活性剂将通过酶分解游离并成为不溶性的分解物有效地除去，或者，通过表面活性剂蛋白质的结构发生变化，变得容易受酶作用分解。此时，可以分别配制表面活性剂和酶，适当地混合使用，但是由于市售的酶配合的洗涤用洗涤剂为表面活性剂与酶的混合物，故也可以将其不作任何处理原样地使用。
在本发明的(b)工序中，酶、表面活性剂进行什么样的处理，特别是可以根据想要除去的杂质的种类、成本、其他的工艺上的制约、作为目的的PHA的纯度等的理由或目的适当自由地选择。
酶处理可以分为几个阶段实施，例如在最初的阶段，使用单一的酶，接着可以使用相同或者不同的酶。另外，使用一种或一种以上的酶时，只要不是互相吸收，使用将它们混合的酶在1阶段处理PHA是方便的。另外，如上所述，也可以表面活性剂和酶处理同时进行。此外，优选在酶处理、表面活性剂处理的同时进行搅拌。
在本发明中，在工序(b)中，由上述处理得到的PHA粒子，为了脱脂·脱臭·脱色，通过亲水性溶剂和/或水进行洗净。
作为工序(b)中使用的亲水性溶剂，没有特别的限定，具体的可以举出甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃等。这些亲水性溶剂中，特别优选经济、廉价并且具有洗净效果的甲醇和乙醇。
另外，上述亲水性溶剂也可以与水混合使用。使用水和亲水性溶剂的混合溶剂时，其混合体积比(水/亲水性溶剂)优选4/6～0.5/9.5左右。
作为用于洗净的上述溶剂的量，没有特别的限定，优选与聚合物体积相等的量或相等的量以上的量。
洗净时的温度，优选为20以上低于60℃。
通过用上述亲水性溶剂和/或水洗净PHA，则可以分离纯度更加提高的PHA。
在本发明中，在此工序(b)结束的阶段，可以回收高纯度的PHA，可以作为成型材料等使用。
另外，在工序(b)中得到的PHA，由于是粒径为数微米左右的微粒子，故从分离性、使用性等来看，更加希望在下面的工序(c)中，将PHA凝聚至适当的粒径。
本发明的工序(c)，是通过将由工序(b)精制的PHA悬浮于亲水性溶剂和/或水中，将该悬浮液在其沸点或沸点以下的温度下，进行搅拌这样的简单的操作，使PHA粒子凝聚，加大其粒径的工序。
作为在工序(c)中使用的亲水性溶剂，没有特别的限定，可以举出，例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丁醇等醇类；丙酮、甲乙酮等酮类；四氢呋喃、二氧杂环己烷等醚类；乙腈、丙腈等腈类；二甲基甲酰胺、乙酰胺等酰胺类；二甲亚砜、吡啶、哌啶等。
其中，从溶剂的除去性良好这点看，优选甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丁醇、丙酮、甲乙酮、四氢呋喃、二氧杂环己烷、乙腈、丙腈等。另外，从入手容易这点看，更加优选甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丁醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈等。
更加优选的为使用用于工序(b)的PHA洗净的溶剂，据此可以连续的转移到凝聚操作，溶剂槽用1种就可以维持，从而可以削减设备费。因此，可以举出甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃等作为更加优选溶剂。这其中，特别优选经济、廉价并且具有洗净效果的甲醇和乙醇。
另外，上述亲水性溶剂也可以与水混合使用。
也就是说，作为悬浮液的分散介质，可以只是亲水性溶剂、只是水、亲水性溶剂与水的混合溶剂的任意一种，优选的为亲水性溶剂与水的混合溶剂。为了获得更加充分的凝聚效果，混合溶剂中的亲水性溶剂的浓度优选10重量％或10重量％以上，更加优选20重量％或20重量％以上。另外，亲水性溶剂的上限为99重量％或99重量％以下，优选98重量％或98重量％以下，更加优选97重量％或97重量％以下。
工序(c)的悬浮液中的PHA的浓度没有特别的限定，优选1g/L或1g/L以上，更加优选10g/L或10g/L以上，特别优选30g/L或30g/L以上。另外，从确保PHA悬浮液的流动性这点来看，上限优选500g/L或500g/L以下，更加优选300g/L或300g/L以下，特别优选200g/L或200g/L以下。
在本发明的工序(c)中，作为搅拌装置，可以举出搅拌槽等，产生涡流的装置，但并不是特别限定的。
在本发明的工序(c)中，作为凝聚时的温度，优选室温(约24℃)或室温以上，更加优选40℃或40℃以上，特别优选60℃或60℃以上。上限没有特别的限定，可以选择直到该悬浮液的沸点的任意的温度。
另外，工序(c)也可以在常压或高压的任一种条件下进行。
在本发明的工序(c)中，通常由于可以在几分钟左右的极短时间使凝聚发生，只要在凝聚后立刻通过过滤等离析PHA，则没有担心由于温度使PHA的分子量降低的必要。
通过本发明的工序(c)的凝聚方法，可以加大PHA的粒径。例如，可以得到重量平均直径10μm或10μm以上，优选50μm或50μm以上，更加优选100μm或100μm以上的凝聚体。上限没有特别的限定，但重量平均直径为5000μm或5000μm以下，优选3000μm或3000μm以下。
伴随着粒径的增大，通过过滤的回收变得容易，在工业生产上可以减轻设备费。在此，对过滤方法没有特别的限定，例如，可以使用过滤器过滤机、篮筐式分离机等。
由本发明的方法得到的PHA，视需要可以配合颜料、染料等着色剂、无机类或有机类粒子、玻璃纤维、晶须、云母等填充剂、抗氧剂、紫外线吸收剂等稳定剂、润滑剂、脱模剂、防水剂、抗菌剂、其他的次要的添加剂等，可以成为PHA树脂组合物。
该PHA树脂组合物可以成形为各种纤维、线、绳索、纺织品、编织品、无纺织布、纸、薄膜、片、管、板、棒、容器、袋、部件、发泡体等形状。另外，还可以加工双向拉伸膜。成形品可以适用于农业、渔业、林业、园艺、医学、卫生品、衣料、非衣料、包装以及其他的领域。特别是，由于通过本发明的方法得到的PHA为非常高纯度的，故可以很好的利用于在以前的方法中不能使用的要求高纯度的领域，如膜、医学、卫生品等领域，在这点上是优异的。
以上，通过本发明的回收方法，可以从含有PHA的微生物细胞中，高效地回收至今非常难以达到的高纯度的PHA，并能够在工业上廉价地生产、提供PHA。
实施发明的最佳方案用下面的实施例进一步说明本发明，但本发明并不是仅局限于这些。
另外，下面给出各种物性的测定方法。
(3HH摩尔％的测定方法)将培养结束的微生物细胞中的PHA(PHBH)通过氯仿萃取和己烷结晶析出回收后，供分析。3HH摩尔％的测定是按照特开2001-340078号公报的实施例1记载的方法进行的。即，使PHBH悬浮于2ml的硫酸-甲醇混合液(15∶85)中，加入2ml的氯仿，在100℃加热140分钟。冷却后，添加1ml的蒸馏水，搅拌后回收氯仿层。将其用岛津制作所制造的气相色谱GC-17A(GLサイエンス社制NEUTRA BOND柱)进行组成分析。
(PHA中残留氮量的测定方法)在即将测定前，将回收的PHA(PHBH)在50℃下减压干燥5小时，使用达伊亚伊恩斯茨鲁梅恩茨(Dia Instruments)社制的微量氮分析装置TN-10，测定全体氮量。在本发明中，将测定的氮浓度乘以6.38作为蛋白质换算。
(PHA的平均分子量的测定方法)将10mg回收的干燥PHA溶解于5ml氯仿中后，通过过滤除去不溶物。将此溶液使用装有Shodex K805L(300×8mm，2根连接)(昭和电工社制)的岛津制作所制造的GPC系统，用氯仿作为移动相进行分析。分子量标准样品使用市售的标准聚苯乙烯。关于培养结束后的微生物细胞中的PHA的分子量，与上述的3HH摩尔％的测定相同，通过从含有PHA的微生物细胞进行氯仿萃取和己烷结晶析出回收PHA，同样地测定。
(粒度的测定)PHA粒子的平均粒径，用微孔道(マイクロトラツク)粒度计(日机装制，FRA)将PHA的水悬浮液调整至规定的浓度，将对应于全部粒子的50％积蓄量的粒径作为平均粒径。
(实施例1)(1)工序(a)处理将导入了来自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的PHA合成酶组基因的富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(保藏号FERM BP-6038)，按照特开2001-340078号公报的实施例1记载的方法进行培养，进行PHBH的生产。培养结束后，通过离心分离回收微生物细胞，得到按干燥菌体重量计100g/L的水性悬浮液。回收微生物细胞中的PHBH的平均分子量为140万，3HH组成为6.8摩尔％。
将此水性悬浮液用图1的菌体破碎装置在碱性条件下进行物理破碎。在菌体破碎槽11中，加入600ml含有PHA的微生物细胞的水性悬浮液，将反应槽与意大利尼罗森阿比(ニロンアビ)公司制造的高压均化器PA2K型(破碎装置9)连接，在600～700kgf/cm2的压力下进行匀浆。从10分钟后，通过徐徐地添加10％的氢氧化钠，将细胞水性悬浮液配制成pH为12.5，一边维持此pH，一边使悬浮液在菌体破碎槽11和破碎装置9之间循环。此间，菌体破碎槽11的温度通过恒温循环泵保持在30℃。设定了pH控制，该pH控制是将pH电极(pH计7)浸于菌体破碎槽11的悬浮液中，并连接到丸菱バイオエンジ社制造的实验控制器(ラボコントロ一ラ一)MDL-6C型(pH检测控制装置3)，该悬浮液的pH达到设定值或设定值以下时，蠕动泵(泵4)启动，向该悬浮液中加入氢氧化钠水溶液以使pH达到设定值。在菌体破碎槽11和破碎装置9之间循环10次后，将悬浮液离心分离(9500g，30分钟)，得到PHBH级分。通过离心分离得到的PHBH级分用水洗净2回，最后得到按干燥PHBH重量计为100g/L的水性悬浮液，用于下面的工序。
(2)工序(b)处理在上述(1)得到的PHBH悬浮液各60ml中，加入下面的被检测试剂。另外，下面的被检测试剂的添加量，全部为相对于悬浮液中的聚合物重量的重量％。
①5重量％的十二烷基硫酸钠(SDS)(Wako Pure Chemical社制)②0.08重量％的蛋白水解酶N(天野エンザイム社制)③5重量％的SDS和0.08重量％的蛋白水解酶N④5重量％的SDS和0.08重量％的卵白溶菌酶(Wako Pure Chemical社制)⑤5重量％的SDS和0.08重量％的蛋白水解酶N以及0.08重量％的卵白溶菌酶⑥5重量％的洗涤用合成洗涤剂(商品名アタツク，花王株式会社制)(按酶成分含有约0.5重量％计算)将各自的该悬浮液在pH7.0、50℃下搅拌1小时。然后，通过离心分离回收PHBH，用60ml水洗净2回后，用60ml乙醇洗净2回，在50℃下减压干燥，得到PHBH粉体。
另外，将上述(1)得到的PHBH用乙醇洗净2回后，减压下干燥，将得到的PHBH粉体作为工序(b)的无处理样品。结果如表1所示。
表1
PHBH通过工序(b)显示99.5％或99.5％以上的纯度，与无处理相比较，可以确认其效果。虽然单独使用SDS也有效果，但与酶并用更加提高了纯度。另外，市售的合成洗涤剂也具有高的效果，而且由于廉价，可以断定优选使用。
(实施例2)用全流程(工序(a)～(c))实施与实施例1(1)同样地通过离心分离回收培养的富氧罗尔斯通氏菌，得到此菌体按干燥重量计为100g/L的水性悬浮液。回收菌体中的PHBH的平均分子量为约147万，3HH组成为5.1摩尔％。使用400ml此悬浮液，按照实施例1(1)记载的方法，一边维持pH约为12.5，一边进行高压破碎。处理结束后，通过离心分离，回收PHBH级分，将其用水洗净2次。
将得到PHBH级分作成按聚合物干燥重量计为100g/L的水性悬浮液。在此悬浮液中，相对于聚合物重量添加0.2重量％的蛋白水解酶N、0.2重量％的溶菌酶、4重量％的SDS，在pH为7.0、50℃的条件下搅拌1小时。处理结束后，用水将PHBH洗净2次。
将得到的PHBH级分作成200g/L的水性悬浮液，在该悬浮液中加入290ml的95％的乙醇使之悬浮，接着离心分离使PHBH沉淀。除去290ml的上清液，在聚合物级分中再加入290ml的95％的乙醇使PHBH悬浮。此乙醇洗净共计进行2次后，加入290ml的95％的乙醇作成悬浮液。将此PHBH悬浮液用15分钟慢慢地加入到290ml的70℃的95％的乙醇中，从添加结束时开始，再进行10分钟的搅拌，使PHBH凝聚。通过使用桐山滤纸(58号)(桐山制作所制)的过滤，进行凝聚的PHBH的回收。将滤纸上的PHBH用120ml(与PHBH容量相等)的95％的乙醇洗净2次，将得到的PHBH在50℃下真空干燥。PHBH的纯度分析结果如表2所示。
表2
其结果，得到56g(从工序(a)前的回收率为93％)纯度99.91％的PHBH。另外，工序(c)后的平均分子量为142万，比工序(a)前的平均分子量只减少极小的3.4％。
工业实用性通过使用本发明的含有工序(a)和工序(b)的PHA的回收方法，能够从产生聚羟基链烷酸酯的微生物菌体细胞中高纯度并且高效地回收聚羟基链烷酸酯，能够提供在工业上廉价地生产。另外，通过进一步进行工序(c)，可以得到PHA粒子的凝聚体。
权利要求
1.一种回收聚羟基链烷酸酯的方法，该回收方法是包含下述(a)及(b)工序的、从含有聚羟基链烷酸酯的微生物细胞中回收聚羟基链烷酸酯的方法，(a)在含有聚羟基链烷酸酯的微生物细胞的水性悬浮液中，边进行搅拌和物理的破碎处理边添加碱，破碎该细胞，同时使该细胞中的聚羟基链烷酸酯以外的细胞物质可溶化或乳化，接着将聚羟基链烷酸酯从悬浮液中分离的工序；(b)将分离的聚羟基链烷酸酯用酶和/或表面活性剂进行处理，将附着在聚羟基链烷酸酯上的杂质可溶化或分解后可溶化，接着用亲水性溶剂和/或水洗净聚羟基链烷酸酯的工序。
2.按照权利要求1记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，该回收方法还具有下述(c)工序，(c)将洗净的聚羟基链烷酸酯悬浮于亲水性溶剂和/或水中，通过在该悬浮液的沸点或沸点以下的温度下搅拌，使聚羟基链烷酸酯凝聚加大粒度，接着将凝聚的聚羟基链烷酸酯从悬浮液中分离的工序。
3.按照权利要求1或2记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，所述聚羟基链烷酸酯是从3-羟基丁酸、3-羟基戊酸、3-羟基丙酸、4-羟基丁酸、4-羟基戊酸、5-羟基戊酸、3-羟基戊酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸以及3-羟基癸酸中选择的羟基链烷酸酯单体中的至少2种共聚形成的共聚物。
4.按照权利要求3记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，所述聚羟基链烷酸酯是3-羟基己酸和上述其他的羟基链烷酸单体中的至少1种的共聚物。
5.按照权利要求4记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，所述聚羟基链烷酸酯是3-羟基己酸和3-羟基丁酸的共聚物。
6.按照权利要求1～5中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，在工序(a)中，用高压均化器进行物理的破碎处理。
7.按照权利要求1～6中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，在工序(a)中，一边控制pH，一边连续地或者断续地添加碱。
8.按照权利要求7记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，在工序(a)中，pH控制在9～13.5之间。
9.按照权利要求1～8中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，在工序(a)中使用的碱为从氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂以及碳酸钠中选择的至少1种。
10.按照权利要求1～9中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，在工序(b)中使用的酶为从蛋白质分解酶、脂质类分解酶、细胞壁分解酶以及DNA分解酶中选择的至少1种。
11.按照权利要求1～10中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，在工序(b)中使用的表面活性剂为从阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂以及非离子表面活性剂中选择的至少1种。
12.按照权利要求1～11中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，在工序(b)中，用于洗净的亲水性溶剂为从甲醇、乙醇、丙酮、乙腈以及四氢呋喃中选择的至少1种。
13.按照权利要求2～12中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，在工序(c)中使用的亲水性溶剂为从甲醇、乙醇、丙酮、乙腈以及四氢呋喃中选择的至少1种。
14.按照权利要求1～13中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其特征在于，含有聚羟基链烷酸酯的微生物是从气单胞菌属(Aeromonas)、产碱菌属(Alcaligenes)、固氮菌属(Azotobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、盐杆菌属(Halobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红螺菌属(Rhodospirillum)、假单胞菌属(Psuedomonas)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、动胶菌属(Zoogloea)、埃希氏菌属(Escherichia)、念珠菌属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)、嗜草菌属(Yarrowia)中选择的微生物。
15.按照权利要求14记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其中，含有聚羟基链烷酸酯的微生物是豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)。
16.按照权利要求1～15中的任一项记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其中，含有聚羟基链烷酸酯的微生物是导入了来自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的聚羟基链烷酸酯合成酶组基因的转化体。
17.按照权利要求16记载的聚羟基链烷酸酯的回收方法，其中，含有聚羟基链烷酸酯的微生物是导入了来自豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的聚羟基链烷酸酯合成酶组基因的富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种从含有PHA的微生物菌体中有效地除去PHA粒子以外的菌体构成成分，能够以高收率得到不引起严重的分子量降低、高纯度的PHA的PHA的分离·精制方法，进而得到PHA粒子的凝聚体的方法。本发明的PHA的回收方法，是通过将含有PHA的微生物细胞的水性悬浮液在低温下进行物理破碎和碱添加，有效地破碎菌体细胞，回收PHA后，用酶和/或表面活性剂进行处理。另外，可以将PHA悬浮于亲水性溶剂和/或水中，通过在该悬浮液的沸点或沸点以下的温度搅拌，使之凝聚，加大PHA的粒度。
文档编号C12P7/62GK1738904SQ20048000230
公开日2006年2月22日 申请日期2004年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者柳田义文, 小川典子, 上田恭义, 小坂田史雄, 松本圭司 申请人:株式会社钟化