专利名称：用不能形成芽孢的微生物来生产泛酸盐/酯的方法
泛酸盐/酯是复合维生素B的一员，而且是哺乳动物，包括人类的营养必需物，例如，它来自食物源，作为水可溶性维生素补充剂或作为饲料添加剂。在细胞中，泛酸盐/酯主要用于辅酶A和酰基载体蛋白质的生物合成。这些必需的辅酶在酰基部分的代谢中发挥作用，所述酰基部分与这些分子的4’-磷酸泛酰巯基乙胺部分的巯基形成硫酯。
由很多化学物质通过化学合成已常规合成了泛酸盐/酯。但是，化学合成所需要的底物昂贵，并且外消旋的中间产物必须要光学分解。因此，已使用细菌或微生物体系，所述体系能生产用在泛酸盐/酯生物合成工艺中的酶。具体而言，生物转化工艺已被评价是有利于生产泛酸的优选异构体的方式。此外，直接的微生物合成方法近来已被分析是方便D-泛酸盐/酯生产的方式。
专利申请WO 01/21772、WO 02/057474和WO 02/061108描述了一种用B.subtilis 168菌株来生产泛酸盐/酯的方法，所述菌株对在泛酸盐/酯生产中所涉及的生物合成基因具有更高的表达水平。这些基因包括panB、panC、panD、panE(ylbQ)、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA和serA。为获得对这些基因的更高表达水平，已使用本领域已知的标准遗传重组方法。这些工程菌株的泛酸盐/酯的产量在48小时的补料分批发酵中在37g/l至85g/l之间。
从环境和政府调节的角度看，重要的是如果经遗传改造的微生物在发酵工艺过程中或在生物质的处理期间从生产厂逸出，它们不具有在自然环境中存活的能力。为此，在发酵工艺中使用B.subtilis的芽孢形成缺陷型菌株(例如，核黄素-US 5837528；生物素-US 6057136)。典型地，spo0A突变用于阻止芽孢形成。spo0A基因对调控芽孢形成的起动的蛋白进行编码。spo0A通过点突变、阅读框移位突变或缺失突变的失活在最早阶段阻止了芽孢形成，从而产生不再能抵抗化学溶剂、辐射和/或热的菌株。除spo0A突变以外，WO 97/03185描述了一种生产商业上重要的酶的方法，其中利用了Bacillus licheniformis spoIIAC的突变，该基因对芽孢形成特异性转录sigma因子σF进行编码，以获得不能形成芽孢的Bacillus属B.subtilis之外的细菌。
在B.subtilis和其它相关的Gram阳性细菌中，内生芽孢形成(芽孢形成)的过程由数个阶段组成。进入芽孢形成的阶段由磷酸化的Spo0A(Spo0A～P)，一种对DNA结合具有基本应答的调节子控制(Fawcett等，2000)。Spo0A～P起两个关键作用(Phillips and Strauch，2002)。在低细胞内浓度时，Spo0A～P抑制abrB的转录，从而提高了对转变状态相关的基因表达的AbrB依赖型调节。如果接着Spo0A～P浓度达到较高的临界水平，它则激活进入和参与芽孢形成所需要的基因(sinI、spoIIG、spoIIE、spoIIA等)。因为Spo0A～P抑制abrB的转录，并且AbrB抑制sigH的转录，因此Spo0A～P间接地激活了σH的调节子中的基因，σH是另一种控制在芽孢形成的早期阶段和稳定生长阶段中所涉及的基因(spo0A、spo0F、spoIIA、phrC、phrE等)转录的sigma因子(Britton等，2002)。增加或降低Spo0A～P和AbrB水平的基因和基因产物包括但不限于abrB、kapB、kbaA、kinA、kinB、kinC、kinD、kinE、kipA、kipI、obg、phrC、phrE、rapA、rapB、rapE、sigH、spo0A、spo0B、spo0E和spo0F。影响启动子位点的Spo0A～P依赖型结合以激活基因表达的蛋白质的例子包括但不限于Spo0JA和Spo0JB。增加或降低Spo0A～P和AbrB水平的信号的例子包括但不限于营养信号、代谢信号、DNA状态信号、细胞密度信号(信息素和群体感应分子)和细胞周期信号。
这些步骤之后，细胞不对称地分裂产生两个大小不等、发育结果不同的区室(compartment)(Piggot and Losick，2002)。较小的区室，即前芽孢发育成芽孢，而较大的区室，即母细胞为芽孢的发育提供营养。当芽孢的形态形成完成时，母细胞裂解，释放出成熟的芽孢。分化涉及四个细胞特异性sigma因子(σF、σE、σG和σK)的作用。σF和σE因子在不对称分裂(极性分割，阶段II)之后很快被激活，σF引导前芽孢中的基因表达(Margolis等，1991)，σE引导母细胞中的基因表达(Dirks and Losick，1991)。以后，在芽孢形成中，前芽孢中σF被σG所替代，母细胞中σE被σK所替代(Losick and Stragier，1992；Li and Piggot，2001)。
σE源自被称为前σE的非活性前蛋白质(LaBell等，1987)。前σE的合成开始于分割之前(Satola等，1992)，但从前σE到成熟σE的蛋白水解加工发生在母细胞不对称分裂之后。该反应由芽孢形成特异性的蛋白酶SpoIIGA介导，它从前σE氨基末端上切下27个氨基酸(Stragier等，1988；Jonas等，1988；Peters和Haldenwang，1994)。在加工之前，前芽孢中在σF控制下产生的分泌出的信号蛋白(SpoIIR)激活SpoIIGA(Londono-Vallejo and Stragier，1995；Hofmeister等，1995；Karow等，1995)。关于σE和其它sigma因子的激活的其它信息，参见Helmann and Moran(2002)。
将芽孢形成突变与其它突变组合到单种细菌中，已显示产生了意想不到的基因激活。例如，编码γ-谷氨酰转肽酶的基因ggt的表达在不存在Spo0A～P下会减少，在双abrB和spo0A-无效突变体中，ggt的表达可以比野生型表达水平增加三至四倍(Xu and Strauch，1996)。此类菌株也不能形成芽孢。但是，并没有发现这些菌株可以以与对照细胞相似或更高的水平来生产泛酸盐/酯。具体而言，Xu and Strauch中所述的细胞不能过量生产泛酸盐/酯化合物。
有意思的是，WO 01/21772、WO 02/057474和WO 02/061108中所述的经遗传改造的泛酸盐/酯生产B.subtilis 168菌株对于芽孢形成来说都是野生型的。没有提供表示在芽孢形成缺陷型菌株中生产泛酸盐/酯的实施例。
本发明的一个目的是提供能够过量生产泛酸盐/酯的芽孢形成缺陷型微生物。本发明的另一目的是提供制备芽孢形成缺陷型微生物的方法，该方法还适合用于Bacillus subtilis。
已发现通常使用的spo0A突变导致泛酸盐/酯产量的显著降低。但是也已经发现，缺乏SigE活性或同时缺乏Spo0A和AbrB的Bacillus subtilis细胞完全没有芽孢形成，并显示出在与对照细胞类似或更高水平下的泛酸盐/酯产量。
因此，本发明涉及能够过量生产泛酸盐/酯化合物的芽孢形成缺陷型微生物。该微生物可以被修饰成使得SigE的活性相比该微生物的未经修饰形式有降低。SigE是基因spoIIGB编码的基因产物。降低的SigE活性可能是由spoIIGB表达的缺乏、spoIIGA编码的蛋白酶表达的降低或缺乏、其它上游调控基因或蛋白质表达的降低或缺乏等所导致的。优选地，对该微生物的修饰包括引起SigE活性降低的突变。更优选地，该突变影响一种或多种选自由基因spoIIGA、spoIIGB、spoIIR和spoIIAC组成的组的基因。
还已发现，通过使用组成型或诱导型启动子来增加spo0A基因的表达，也增加在过量生产泛酸盐/酯的B.subtilis菌株中的泛酸盐/酯产量。由于该菌株仍形成芽孢，所以引入sigE突变将导致B.subtilis菌株生产出与spo0A过量生产亲本菌株相似的量的泛酸盐/酯，并且不形成芽孢。在本发明的一种优选的实施方式中，具有降低的SigE活性和较高Spo0A～P水平的微生物因此能够生产更多的泛酸盐/酯，而不形成芽孢。
在本发明的另一方面，该微生物可以被修饰成使得Spo0A和AbrB的活性相比较该微生物的未经修饰形式有降低。Spo0A和AbrB是由spo0A和abrB基因分别编码的基因产物。降低的Spo0A和AbrB活性可能是由基因表达的缺乏、信号(营养、代谢、DNA状态、细胞密度[信息素和群体感应分子]和细胞周期的信号)的降低或缺乏、其它上游调控基因或蛋白质表达的降低或缺乏等所导致的。优选地，对该微生物的修饰包括引起Spo0A/AbrB活性降低的突变。更优选地，该突变影响选自由abrB、kapB、kbaA、kinA、kinB、kinC、kinD、kinE、kipA、kipI、obg、phrC、phrE、rapA、rapB、rapE、scoC、sigH、sinR、sinI、spo0A、spo0B、spo0E、spo0F、spo0JA和spo0JB所组成的组的一种、两种或更多种基因。
微生物可以是真核的或原核的。优选地，微生物是原核的。该原核微生物可以是Gram阳性或Gram阴性的。Gram阳性微生物包括但不限于属于Bacillus、Corynebacterium、Lactobacillus、Lactococci和Streptomyces属其中之一的微生物。优选地，微生物属于Bacillus属。例子是Bacilluslicheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacilluspuntis、Bacillus halodurans等。最优选地，微生物是Bacillus subtilis。本发明的微生物的对应野生型形式是芽孢形成微生物。
“泛酸盐/酯化合物”优选是泛酸盐/酯。泛酸盐/酯化合物还包括泛酸盐/酯生物合成的生物合成途径中的中间产物化合物，例如pantoate、α-ketopantoate、α-酮异戊酸酯等。
本发明包括任何对微生物基因进行的导致sigE基因产物(SigE蛋白质)功能降低的突变。SigE功能可以在本领域技术人员已知的芽孢形成测定中测定出。本发明的微生物可以在其spoIIGB(sigE)基因上具有突变，导致功能性sigE基因产物不表达或表达降低。本发明还包括在已知用于激活spoIIGB(sigE)的基因上的任何突变。这些包括但不限于spoIIGA、spoIIR和spoIIAC(sigF)(Helmann and Moran，2002)。本发明的微生物可以在其spoIIGA基因上具有突变，导致功能性spoIIGA基因产物不表达或表达降低。本发明的微生物可以在其spoIIR基因上具有突变，导致功能性spoIIR基因产物不表达或表达降低。本发明的微生物可以在其spoIIAC基因上具有突变，导致功能性spoIIAC基因产物不表达或表达降低。
术语“表达”指核酸序列的转录和/或随后的被转录序列到氨基酸序列的翻译。核酸的表达减少可以通过将突变引入基因来获得，例如通过使基因缺失；核苷酸的增加或减少，使得通过阅读框的移位来使被编码的蛋白质活性减少或失活，或通过引入终止密码子使得翻译在成熟前终止；修饰调控序列，例如启动子、核糖体结合位点，以及本文中所述的其它技术。
“突变”可以是基因序列中的缺失、取代或增加。突变可以是破坏、阅读框移位突变或无义突变。突变可以是影响到基因的整条序列或其一部分的破坏。突变可以影响到基因的编码或非编码序列，例如启动子。突变可能导致基因转录的完全缺乏或翻译在成熟前终止。同样，突变可以定位在先前的(或“上游”)基因中，这会通过被称为是极性的方法破坏邻近(或“下游”)基因的转录。或者，突变可能具有下述效果翻译出的蛋白质较之野生型蛋白质带有使得该蛋白质不具有功能的突变。
向基因中引入合适突变的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括但不限于向细菌染色体引入点突变(Cutting and Vander Horn，1990)；移掉染色体DNA的片断，用抗生素抗性基因替换该片断(Perego，1993)；直接插入可转座元件，例如转座子Tn917或mini Tn10(Youngman，1990；Petit et al.，1990)或质粒，例如pMUTIN(Vagner et al.，1998)。
优选地，其sigE基因产物功能减少的芽孢形成缺陷型微生物能够过量表达spo0A，更优选地，它过量表达spo0A。对spo0A的过量表达可以如本文所述的来获得。
基因的表达增加或过量表达可以以一系列方式来实现。一种获得过量表达一种或多种基因的微生物的方法是改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点，例如通过加入强启动子、诱导型启动子或多个启动子，或者通过移除调控序列，使得表达成为组成型的。下文描述进一步的技术。
“启动子”是基因转录起始位点上游的DNA序列，涉及对RNA聚合酶和/或其它起动基因转录的蛋白质的识别和结合。通常，启动子确定在什么条件下表达基因。
“诱导型启动子”导致基因的mRNA合成在特定条件下暂时启动。(i)启动子可能主要受辅助因子，例如阻遏子或激活子的调控。阻遏子是抑制启动子活性的序列特异性DNA结合蛋白。在防止阻遏子与启动子的操纵序列结合的诱导剂的存在下，转录可以从该启动子起动。来自Gram阳性微生物的此类启动子的例子包括但不限于，gnt(葡糖酸盐/酯操纵子的启动子)；来自Bacillus licheniformis的penP；glnA(谷氨酰胺合成酶)；xylAB(木糖操纵子)；araABD(L-阿拉伯糖操纵子)和Pspac启动子，这是可以由诱导剂，例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)控制的SPO1/lac杂交启动子(Yansura and Henner，1984)。激活子也是序列特异性DNA结合蛋白，但它诱导启动子活性。来自Gram阳性微生物的此类启动子的例子包括但不限于，双组分体系(PhoP-PhoR、DegU-DegS、Spo0A-Phosphorelay)、LevR、Mry和GltC。(ii)次级sigma因子的产生可以主要负责来自特定启动子的转录。来自Gram阳性微生物的例子包括但不限于，由芽孢形成特异性sigma因子(σF、σE、σG和σK以及一般性应激sigma因子，σB)激活的启动子。σB介导的应答由能量限制和环境应激来诱导(Hecker and Vlker，1988)。(iii)衰减作用和抗终止作用也会调控转录。来自Gram阳性微生物的例子包括但不限于，trp操纵子和sacB基因。(iv)表达载体中其它受调控的启动子基于来自噬菌体φ105的温度敏感型免疫阻遏子(Osbourne et al.，1985)和带来蔗糖诱导性的sacR调控体系(Klier and Rapoport，1988)。
“组成型”启动子是允许基因在几乎所有环境条件下表达的启动子，即引导恒定的、非特异性的基因表达的启动子。“强组成型启动子”引起mRNA以相对于天然宿主细胞的高频率启动。强组成型启动子是公知的，并且可以根据宿主细胞中要控制的特定序列来选择合适的启动子。来自Gram阳性微生物的这种强组成型启动子的例子包括但不限于，SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。来自Gram阴性微生物的启动子的例子包括但不限于，tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR和λ-PL。
本发明还包括对一个或多个基因的任何突变，导致Spo0A和AbrB的功能降低。Spo0A和AbrB的功能可以在γ-谷氨酰转肽酶的酶测定(Xuand Strauch，1996)中并通过本领域技术人员已知的微阵列技术进行测定。此外，Spo0A功能可以在芽孢形成测定中进行测定；AbrB功能可以用与AbrB调控启动子(spo0VG、tycA、abrB等)融合的lacZ报道基因测定。微生物可以在其spo0A基因上具有至少一处突变，并且在其abrB基因上具有至少一处突变。突变导致功能性spo0A基因产物的表达降低或不表达，以及功能性abrB基因产物的表达降低或不表达。
导致Spo0A功能降低的对一个或多个基因的突变包括对已知能激活spo0A的基因的突变。这些包括但不限于，spo0B、spo0F、kinA、kinB、kinC、kinD、kinE和sigH。本发明的微生物可以在其spo0B上具有突变，导致功能性spo0B基因产物的表达降低或不表达。本发明的微生物可以在其spo0F上具有突变，导致功能性spo0F基因产物的表达降低或不表达。
在本发明的一种特定实施方式中，可以组合导致SigE功能降低的突变和导致Spo0A和AbrB功能降低的突变。因此，本文中所述的各种突变和修饰的优选实施方式可以组合起来。在进行必要的修正后，这适用于下文所述的方法。
本发明的微生物能够在合适的条件下过量生产泛酸盐/酯化合物。本文中使用的术语“过量生产泛酸盐/酯化合物”指，相比较所述微生物的野生型形式，本发明的微生物生产的泛酸盐/酯化合物显著增加。优选地，泛酸盐/酯的过量生产指每升培养基产出至少50mg、100mg、200mg、500mg、1g、3g、5g或10g的泛酸盐/酯。
在一种实施方式中，当本发明的微生物群在实施例II所述的条件下被培养时，每升培养基中产出至少100mg、优选至少125mg、更优选至少140mg、更优选至少200mg、还更优选至少300mg、甚至更优选至少400mg、最优选至少500mg的泛酸盐/酯。在该实施例中，描述了在最少培养基中进行的培养。或者，当本发明的微生物群在实施例IV或V所述的条件下被培养时，每升培养基中可以产出至少100mg、优选至少125mg、更优选至少140mg、更优选至少200mg、还更优选至少300mg、甚至更优选至少400mg、最优选至少500mg的泛酸盐/酯。
另一方面，当本发明的微生物群在实施例III所述的条件下被培养时，每升培养基中产出至少5g、优选至少7.5g、最优选至少10g的泛酸盐/酯。
由本发明的芽孢形成缺陷型微生物生产泛酸盐/酯的水平可与对照细胞的泛酸盐/酯生产水平相当。因此，当在相同条件下培养时，由本发明的微生物群生产出的泛酸盐/酯化合物的量可以比非芽孢形成缺陷型的相应微生物群生产的泛酸盐/酯化合物的量的50％、优选75％、更优选100％要高。当在实施例II所述的条件下培养时，优选地，由本发明的微生物群生产出的泛酸盐/酯化合物的量比非芽孢形成缺陷型的相应微生物群生产的泛酸盐/酯化合物的量的50％、优选75％要高。当在如实施例III所述的条件下培养时，优选地，由本发明的微生物群生产出的泛酸盐/酯化合物的量比非芽孢形成缺陷型的相应微生物群生产的泛酸盐/酯化合物的量的50％、优选75％、最优选100％要高。当在如实施例IV所述的条件下培养时，优选地，由本发明的微生物群生产出的泛酸盐/酯化合物的量比非芽孢形成缺陷型的相应微生物群生产的泛酸盐/酯化合物的量的50％、优选75％、最优选100％要高。当在如实施例V所述的条件下培养时，优选地，由本发明的微生物群生产出的泛酸盐/酯化合物的量比非芽孢形成缺陷型的相应微生物群生产的泛酸盐/酯化合物的量的50％、优选75％、最优选100％要高。
“非芽孢形成缺陷型的相应微生物”优选是没有经过使得SigE功能或Spo0A和ArbB功能降低的修饰的微生物。例如，如果本发明的微生物在其spoIIGA基因处具有突变，那么非芽孢形成缺陷型的相应微生物是与本发明的微生物几乎相同的微生物，除了在其spoIIGA基因处不具有突变。这同样适用于在其它基因处的突变。
泛酸盐/酯化合物的过量生产可以通过一系列方式获得。制备过量生产泛酸盐/酯的Bacillus subtilis菌株的方法在例如WO 01/21772、WO02/057474和WO 02/061108中有描述。一种获得过量生产泛酸盐/酯的微生物的方法是对泛酸盐/酯生物合成途径中涉及的一个或多个基因进行过量表达。术语“过量表达的”或“过量表达”包括基因产物的表达水平高于对该微生物进行修饰之前表达的水平，或高于在未经修饰的同等微生物中表达的水平。在一种实施方式中，本发明的微生物过量表达选自panB、panC、panD、panE、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA和sera、ylmA以及甘氨酸切割途径中所涉及的gcv基因中的一个或多个基因。
在微生物中基因的过量表达可以根据本文中所述的任何一套方法来进行，包括但不限于，对基因进行去调节和/或对至少一个基因进行过量表达。在一种实施方式中，微生物可以被遗传操纵，例如遗传工程改造，以使基因产物过量表达的水平高于在对该微生物进行修饰之前的表达水平，或高于在未经过修饰的同等微生物中表达的水平。遗传操纵可以包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调控序列或位点，例如通过加入强启动子、诱导型启动子或多种启动子，或者通过移除调控序列，使得表达呈组成型；修饰特定基因的染色体位置；改变与特定基因邻近的核酸位点，例如核糖体结合位点或转录终止子；增加特定基因的拷贝数；修饰蛋白质，例如特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译中涉及到的调控蛋白质、阻遏子、增强子、转录激活子等；或者任何其它本领域中常规的使特定基因表达去调节的传统方法(包括但不限于，使用反义核酸分子，例如以阻止阻遏子蛋白的表达)。合适的启动子的例子有但不限于，Pveg、P15和P26(Lee et al.，1980，Mol.Gen.Genet.18057-65and Moran et al.，1982，Mol.Gen.Genet.186339-46)。
在另一种实施方式中，可以对微生物进行物理上或环境上的操作，使基因产物过量表达的水平高于对该微生物进行操作之前表达的水平，或高于在未经过操作的同等微生物中表达的水平。例如，可以使用这种试剂处理微生物，或在这种试剂的存在下培养微生物，该试剂已知或被怀疑能增加特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译，使得转录和/或翻译增强或增加。或者，可以在选定的温度下培养微生物，该温度能增加特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译，使得转录和/或翻译增强或增加。
术语“去调节的”或“去调节”包括对微生物中至少一个基因的修饰加以改变，使得微生物中该基因产物的水平或活性被改变或被修饰。优选地，至少一个基因被改变或被修饰，使得基因产物增强或增加。
本发明还涉及制备能够过量生产泛酸盐/酯化合物的芽孢形成缺陷型微生物的方法。可以对能够过量生产泛酸盐/酯化合物的微生物进行修饰，使其调控SigE功能的基因含有突变，并且可选地，Spo0A的功能增加。根据该实施方式，所述方法包括(a)提供能过量生产泛酸盐/酯化合物的微生物，(b)可选地，在所述微生物中引入导致Spo0A功能增加的DNA序列(例如，启动子)或突变，以及(c)在步骤(a)或(b)的微生物中引入降低SigE功能的突变，从而得到芽孢形成缺陷型微生物。
步骤(b)和(c)的顺序可以改变。
或者，所述方法可以包括(a)提供能过量生产泛酸盐/酯化合物的微生物，(b)在步骤(a)的微生物中引入降低Spo0A功能和降低ArbB功能的突变，从而得到芽孢形成缺陷型微生物。
在另一种实施方式中，可以在进行使得泛酸盐/酯化合物过量生产的突变之前，引入对sigE基因的突变或对spo0A基因和arbB基因的突变。根据该实施方式，所述方法包括(a)提供不能过量生产泛酸盐/酯化合物的微生物，(b)向步骤(a)的微生物中引入降低SigE活性的突变或向步骤(a)的微生物中引入降低Spo0A活性和降低ArbB活性的突变，从而得到芽孢形成缺陷型微生物，以及(c)对步骤(b)中获得的芽孢形成缺陷型微生物进行修饰，使其能够过量生产泛酸盐/酯化合物。
如果在该方法的步骤(b)中引入了导致SigE活性降低的突变，该方法可以包括如下可选的步骤向步骤(a)、(b)或(c)的微生物中引入导致Spo0A功能增加的DNA序列(例如，启动子)或突变。
本发明的另一方面是生产泛酸盐/酯化合物的方法，所述方法包括(a)在生产泛酸盐/酯化合物的条件下，培养根据本发明的微生物；以及(b)可选地，从细胞培养基中回收泛酸盐/酯化合物。
本发明的方法包括在生产泛酸盐/酯化合物的条件下，培养经过修饰的微生物的步骤。术语“培养”包括对本发明的活的微生物进行保持和/或培育。在一种实施方式中，本发明的微生物在液体培养基中培养。在另一种实施方式中，微生物在固体培养基或半固体培养基中培养。优选地，本发明的微生物在液体培养基中培养，该培养基中包含有对所述微生物的保持和/或生长所必须的或有利的营养物质。此类营养物质包括但不限于，碳源或碳底物，例如复合碳水化合物，例如豆类或谷物粗粉、淀粉、糖、糖醇、烃、油、脂肪、脂肪酸、有机酸和醇；氮源，例如来自谷物、豆类和块茎的植物蛋白质、蛋白胨、肽和氨基酸，来自动物来源，例如肉、奶、动物副产物(例如，胨、肉类提取物和酪蛋白水解产物)的蛋白质、肽和氨基酸；无机氮源，例如尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，例如磷酸、其钠盐和钾盐；痕量元素，例如镁、铁、锰、钙、铜、锌、硼、钼和/或钴盐；以及生长因子，例如氨基酸、维生素、生长促进剂等。
优选在受控的pH下对微生物进行培养。在一种实施方式中，在6.0至8.5之间的pH下，更优选在pH约为7下培养微生物。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来保持理想的pH。
优选地，还在受控的通风条件和受控的温度下对微生物进行培养。在一种实施方式中，受控温度包括15至70C之间的温度，优选是20至55℃之间的温度，更优选是30至45℃或30至50℃之间的温度。
可以通过传统的培养方法，例如静止培养、试管培养、振荡培养、通风旋转培养(aeration spinner culture)或发酵在液体培养基中连续地或间歇地培养微生物。优选地，在发酵罐中对微生物进行培养。本发明的发酵工艺包括分批、补料分批和连续的发酵方法。各种此类方法已开发出，并且是本领域公知的。
培养通常持续的时间要足以生产出所期望量的泛酸盐/酯化合物。
在本发明的另一方面，该方法还包括回收泛酸盐/酯化合物的步骤。术语“回收”包括从培养基中离析、提取、收获、分离或纯化所述化合物。化合物的离析可以按照本领域中已知的任何传统离析或纯化的一套方法来进行，这些方法包括但不限于用传统树脂进行处理，用传统吸附剂进行处理，改变pH，溶剂提取，透析，过滤，浓缩，结晶，重结晶，pH调节，冻干等。例如，从培养基中回收泛酸盐/酯化合物可以通过首先将微生物从培养基中移出而进行。然后将培养基通过阳离子交换树脂，以除去不想要的阳离子，然后再通过阴离子交换树脂，以去除不想要的无机阴离子和酸性比目标化合物(例如，泛酸盐/酯)更强的有机酸。得到的泛酸盐/酯可以随后转化为本文所述的盐。
通常，当所得的制剂基本不含其它组分时，化合物就是“经离析的”。在一种实施方式中，该制剂中目标化合物的纯度超过大约80％(按干重计)(例如，全部培养基、组分或发酵副产物小于大约20％)，更优选地超过大约90％，甚至更优选地超过大约95％，最优选地超过大约98％-99％。
在另一种实施方式中，并不从微生物或培养基中纯化出目标化合物。整个培养物或培养物上清液可以用作产物的来源。在一种特定实施方式中，培养物或培养物上清液未经修饰即使用。在另一实施方式中，对培养物或培养物上清液进行浓缩、干燥和/或冻干。
本文中所述的本发明的各种实施方式可以交叉组合。
下述非限制性的实施例将对本发明进行进一步的阐述。
实施例一般方法菌株和质粒。本发明的Bacillus subtilis菌株源自菌株1A747(BacillusGenetic Stock Center，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210USA)，它是B.subtilis 168(trpC2)的原营养型衍生菌株。氯霉素抗性基因(cat)盒从质粒pC194(GeneBank M19465，Cat# 1E17 Bacillus GeneticStock Center，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210 USA)获得。B.subtilis细菌噬菌体SPO1的P15启动子(Lee et al.，1980，Mol.Gen.Genet.18057-65)从质粒pX123roDTD-SPO1-15获得，这是含有来自RB50∷[pRF69]∷[pRF93](Perkins et al.，1999，J.Ind.Microbiol.Biotech.228-18)的SPO1-15启动子的质粒pX12(Hümbelin et al.，1999，J.Ind.Microbiol.Biotech.221-7)的衍生物。芽孢形成基因的突变源自菌株SWV215[trpC2 pheA1 spo0A∷kan](Xu and Strauch，1996，J.Bacteriol.1784319-4322)、BHI[trpC2 pheA1 spo0HΔHindIII-EcoRI∷cat](BHI是Healy et al.，1991，Mol.Microbiol.5477-487中提到的BH100的衍生物)、650[trpC2 ilvB2 leuB16 spoIIAABC∷cat](Prágai et al.，2004，J.Bacteriol.1861182-1190)、731[trpC2 spoIIIG∷ermC](Partridge and Errington，1993，Mol.Microbiol.8945-955)和901[trpC2 spoIIGA∷aphA-3](Wu andErrington，1994，Science264572-575)。abrB基因的突变源自菌株SWV119[trpC2 pheA1 abrB∷tet](Xu and Strauch，1996)。对于spo0A基因的过量表达，从菌株AH1763[trpC2 metC3 spo0A∷neoamyE∷Pspacspo0A(cat)]获得Pspacspo0A融合体(Henriques，A，个人交流)。
培养基。用于B.subtilis的标准最低限度培养基(MM)含有1XSpizizen盐、0.04％谷氨酸钠和0.5％葡萄糖。标准固体完全培养基是Tryptone Blood Agar Broth(胰蛋白胨血琼脂培养基，TBAB，Difco)。标准液体完全培养基是Veal Infusion-Yeast Extract培养基(VY，小牛肉浸出液-酵母提取物培养基)。上述培养基的组分如下所示TBAB培养基33g Difco Tryptone Blood Agar Base(Catalog #0232)、1L水。高压灭菌。
VY培养基25g Difco Veal Infusion Broth(Catalog # 0344)、5gDifco Yeast Extract(Catalog #0127)、1L水。高压灭菌。
最低限度培养基(MM)100ml 10X Spizizen盐；10ml 50％葡萄糖；1ml 40％谷氨酸钠，用水定容至1L(qsp 1L water)。
10X Spizizen盐140g K2HPO4；20g(NH4)2SO4；60g KH2PO4；10g柠檬酸三钠·2H2O；2g MgSO4·7H2O；用水定容至1L。
P-培养基100ml 10X PAM；100ml 10X Spizizen盐；10ml 50％葡萄糖；790ml灭菌蒸馏水。
P-琼脂培养基100ml 10X PAM；100ml 10X Spizizen盐；10ml 50％葡萄糖；790ml灭菌蒸馏水，其中含有15g琼脂。
10X泛酸盐/酯测定培养基(10X PAM)73g Difco泛酸盐/酯测定培养基(Catalog #260410)，1L水。高压灭菌。
10X VFB最低限度培养基(10X VFB MM)2.5g谷氨酸钠；15.7gKH2PO4；15.7g K2HPO4；27.4g Na2HPO4·12H2O；40g NH4Cl；1g柠檬酸；68g(NH4)2SO4；用水定容至1L。
痕量元素溶液1.4g MnSO4·H2O；0.4g CoCl2·6H2O；0.15g(NH4)6Mo7O24·4H2O；0.1g AlCl3·6H3O；0.075g CuCl2·2H2O；用水定容至200ml。
Fe溶液0.21g FeSO4·7H2O；用水定容至10ml。
CaCl2溶液15.6g CaCl2·2H2O；用水定容至500ml。
Mg/Zn溶液100g MgSO4·7H2O；0.4g ZnSO4·7H2O；用水定容至200ml。
VFB MM培养基100ml 10X VFB MM；10ml 50％葡萄糖；2ml痕量元素溶液；2ml Fe溶液；2ml CaCl2溶液；2ml Mg/Zn溶液；882ml灭菌蒸馏水。
VFB MMGT培养基100ml 10X VFB MM；100ml 0.5M Tris(pH6.8)；44ml 50％葡萄糖；2ml痕量元素溶液；2ml Fe溶液；2ml CaCl2溶液；2ml Mg/Zn溶液；748ml灭菌蒸馏水。
VF发酵分批培养基在溶液中就地灭菌的0.75g谷氨酸钠4.71gKH2PO4；4.71g K2HPO4；8.23g Na2HPO4·12H2O；0.23g NH4Cl；1.41g(NH4)2SO4；11.77g酵母提取物(Merck)；0.2ml Basildon消泡剂；定容至1L。
向发酵罐中加入作为经高压灭菌的溶液27.3g葡萄糖·H2O；定容至1L。
向发酵罐中加入作为经过滤灭菌的溶液2ml痕量元素溶液；2mlCaCl2溶液；2ml Mg/Zn溶液；2ml Fe溶液；定容至1L。
VF发酵补料培养基660g葡萄糖·H2O；定容至1L。高压灭菌。加入2g MgSO4·7H2O；14.6mg MnSO4·H2O；4mg ZnSO4·H2O；定容至1L(经高压灭菌的)。
泛酸盐/酯测定。利用三种生物方法和一种物理方法(HPLC)测定泛酸盐/酯生物测定I-平板生物测定利用已知方法，使用来自Salmonellatyphimurium的指示剂，在琼脂平板上测定泛酸盐/酯。菌株DM3(panC355)(D.Downs，University of Wisconsin at Madison，Madison，Wisconsin USA)仅对泛酸盐/酯具有应答。将10ml含有107个细胞/ml S.typhimurium DM3(panC355)指示剂菌株和40μg/ml 2，3，5-三苯基四唑氯(Fluka；Catalog # 93140)的P-琼脂培养基平铺到标准带盖培养皿中作为底部琼脂的20ml P-琼脂培养基上。使用灭菌移液枪头，将培养于TBAB琼脂上的单个菌落的细菌转移到生物测定P-琼脂平板上。在37℃下经整晚的培育后，在产出多于～10mg/l泛酸盐/酯的B.subtilis菌落周围形成可观察到的紫色S.typhimurium DM3环。环的大小与B.subtilis菌株的泛酸盐/酯生产情况相关。
生物测定II-试管生物测定利用试管培养物在液体中测定泛酸盐/酯。为测定B.subtilis培养物，灭菌过滤出上清液，利用1X泛酸盐/酯测定培养基(PAM)在试管中制备稀释液。稀释液的总体积为5.0ml。向这些稀释液试管中加入0.1ml DM3指示剂贮液(在1X PAM中)的200倍稀释液。然后在滚筒型摇床上在37℃下对试管进行18-24小时的培养。在600nm处读取浑浊度读数(OD600)，将其与已知量的泛酸盐/酯的标准曲线相比较。具体而言，通过如下步骤制得标准曲线将经过认定的泛酸盐/酯稀释至0.8、4、20、50和100μg/l的水平，向每份稀释液中加入如上制得的指示剂，在37℃下放置18-24小时(与未知样品同样的培育时间)后测量浑浊度。标准曲线的线性部分用来生成对数回归方程。然后，该方程用来计算未知样品中泛酸盐/酯的浓度，其中利用经稀释样品的OD600值。
生物测定III-96孔微滴定板生物测定还使用96孔微滴定板形式在液体中测定泛酸盐/酯。向96孔微滴定板的每个孔内装入180μl含有5.5×105个细胞/ml S.typhimurium DM3的泛酸盐/酯测定培养基(PAM)。为测定B.subtilis培养物，将60μl经过滤灭菌的培养物上清液加到第1列，第B-H行的孔中。混合之后，将60μl样品转移到第2列的邻近孔中。重复上述4倍稀释步骤，直到第12列。在第12列将样品混合之后，移去60μl样品，这样每个孔都含有180μl样品。将粘附膜置于平板上以避免蒸发，并在37℃下以300rpm的振荡速度对培养物进行17小时的培养。在600nm处读取浑浊度读数，将其与已知量的泛酸盐/酯(Pan)的标准曲线相比较。通过将60μl Pan标准物(100mg/ml)加入每个微滴定板的第1列第A行的孔中，制得标准曲线。如上对未知样品的那样，对Pan标准物进行稀释、培养和浑浊度测量。
HPLC测定使用装有恒温自动进样器和二极管阵列检测仪的Agilent1100 HPLC系统，在Phenomenex LUNA C8柱上对样品进行色谱分析。柱的大小为150×4.6mm，颗粒大小为5微米。柱温保持恒定为20℃。移动相是0.1％乙酸(A)和甲醇(B)的混合物。采用15分钟的梯度洗脱，从1％B至45％B。流速为1ml/min。利用UV吸收在220nm下监测泛酸盐/酯，泛酸盐/酯大约在9.6min时洗脱出。该方法的校正范围为1至100mg/l泛酸盐/酯。
分子和遗传技术。标准的遗传和分子生物技术通常是本领域已知的，以前已有描述。DNA转化、PBS1普遍性转导和其它的标准B.subtilis遗传技术也通常是本领域已知的，以前已有描述(Harwood and Cutting，1992)。
芽孢形成测定。从B.subtilis培养物中取1ml样品，并在灭菌蒸馏水中制备10倍的稀释液系列。在80℃下进行20分钟的热处理后，将稀释液涂布到TBAB琼脂上，在37℃下培养20小时，然后确定1ml原培养物中“耐热”菌落形成单元(cfu)的数量。通过用耐热芽孢的效价(cfu/ml)除以热处理前细菌细胞的效价(cfu/ml)，计算出芽孢形成频率。
发酵。在带搅拌的罐式发酵罐中对生产泛酸盐/酯的菌株进行培养，例如在最初装有1.4升含葡萄糖/盐溶液的VF发酵分批培养基的BIOFLO3000 New Brunswick 2升容器中进行培养。通过NBS Biocommand 32商用软件(New Brunswick Scientific Co.，Inc.，Edison，NJ，USA)进行计算机控制；Lucullus软件(Biospektra AG，Schlieren，Switzerland)用于数据采集和控制葡萄糖补料。
为制备用于发酵的接种体，使用两步接种(two-seed)培养方案。第一步接种由下述步骤组成用50μl冰冻的细菌贮备培养物去接种25ml含有10g/l山梨糖醇的VY培养基，并在37℃对培养物进行6小时的培养。然后用1OD的细胞来接种60ml含有10g/l山梨糖醇的VF发酵分批培养基(无葡萄糖)，并对该第二步接种物在37℃下进行8-12小时的培养。然后将第二步接种物用于接种发酵容器，其用量通常是最初培养基体积的4-5％。冰冻的细菌贮液通过如下步骤制得在VY培养基中将细菌培养至指数后期(OD600＝0.8-1.0)，加入灭菌甘油至最终浓度为20％，然后在干冰上冷冻1ml样品，并将冰冻的细菌贮藏在-80℃下。
发酵期间，通过自动加入氢氧化铵溶液(28％水溶液)使反应器中pH保持恒定为6.8。发酵温度为39℃。通过搅拌器的自动级联(400rpm至1000rpm之间)，以及将空气流手动保持在1-2vvm之间，获得15％的最小溶解氧(pO2)浓度。如果需要的话，手动加入消泡剂(Basildon)。
发酵可以是分批工艺，但是优选地是碳水化合物受限的补料分批工艺。因此，在最初的葡萄糖耗尽之后，这通常在6-8小时的工艺时间后，向反应器中提供给定的VF发酵补料溶液(见上文)。此时，以14g/h的速率开始恒定加入补料溶液。
实施例I本实施例描述了对过量生产泛酸盐/酯的B.subtilis菌株的构造。
B.subtilis菌株PA12聚合酶链式反应(PCR)用来在B.subtilis原营养型菌株1A747的panBCD操纵子的启动子区域中产生缺失突变，其中birA和panB之间的215bp长的核苷酸区域被来自Staphylococcus aureus的氯霉素抗性(cat)盒(GeneBank M58515)所取代。为此，首先以与panB的转录方向相反的取向在pBR322质粒(GeneBank J01749)的NheI和ClaI位点之间引入cat盒。然后产生两条PCR片段“臂”将0.2μl 100mM的panB/up2/for/R1和panB/up2/rev/ClaI引物或panB/down2/for/Nhe1和panB/down2/rev/Bam引物(表1)溶液加入到50μl反应体积中的0.1μg1A747染色体DNA中，所述50μl反应体积中含有1μl 40mM的dNTP’s、5μl 10X缓冲液和0.75μl PCR酶(Taq和Tgo)，如生产商(Expand High fidelity PCR系统-Roche Applied Science)所述的。该PCR反应进行30个循环，退火温度为58℃，延伸时间为60秒。所得片段分别被称为F1和F2，对其进行纯化，随后将其分别插入到EcoRI和ClaI位点之间(对F1而言)和NheI和BamHI位点之间(对F2而言)。将连接的DNA转入到E.coli TOP10细胞(Invitrogen)中，在100μg/ml的浓度针对氨苄青霉素抗性进行筛选。这得到E.coli质粒pPA5。然后通过DNA转化，再将ΔpanBp∷cat缺失盒引入到B.subtilis 1A747的染色体上，并利用标准条件，在含有5μg/ml氯霉素(Cm)的TBAB琼脂平板上针对氯霉素抗性(Cmr)进行筛选。在panB启动子区域具有缺失的单个Cmr菌落被离析出，并命名为PA1(ΔpanBp∷cat)。如预料的，PA1也是泛酸盐/酯营养缺陷型(Pan-)，这要求在最低限度培养基中有泛酸盐/酯，以用于生长。利用panB/up2/for/R1和panB/down2/rev/Bam引物(表1)，再使用标准反应条件，通过诊断性PCR验证缺失突变。
表1.用于产生含有ΔpanBp∷cat缺失突变的B.subtilis菌株的引物
下一步是引入panB基因上游的强组成型启动子。文献中描述了许多这种启动子，包括从B.subtilis的SP01细菌噬菌体获得的那些，P15和P26(Lee et al.，1980)。长侧翼同源性聚合酶链式反应(LFH-PCR)用来产生含有panB的核糖体结合位点(RBS)上游的P15的DNA片段。为此，首先产生两条PCR片段“臂”将0.2μl 100mM的PlpanBCD和P2panBCD引物或P3panBCD和P4panBCD引物(表2)溶液加到50μl反应体积中的0.1μg 1A747染色体DNA中，该50μl反应体积含有1μl 40mM dNTP’s、5μl 10X缓冲液和0.75μl PCR酶(Taq和Tgo)，如生产商(Expand High fidelity PCR系统-Roche Applied Science)所述的。该PCR反应进行30个循环，退火温度为55.7℃，延伸时间为45秒。所得片段分别被称为F3和F4，对其进行纯化，并将其作为引物再用于第二轮PCR。将F3和F4片段稀释50倍，并各取1μl加入到50μl反应体积中的0.1μg线性化质粒pX123roDTD-SPO1-15(含有P15启动子)中。在最初10个循环中，退火温度为63℃，延伸时间为6分钟。在后20个循环中，每个循环后将延伸时间再延长20秒。然后将所得产物作为模板用于第三轮PCR。将PCR产物稀释50倍，并取1μl将其与0.2μl 100mM的P1panBCD和P4panBCD引物溶液混合在50μl上述含有dNTP’s、缓冲液和酶的反应体积中。该PCR反应参数与第二轮PCR中所用的一致。然后通过DNA转化，再将最终的PCR片段转化进panB启动子缺失菌株PA1中，并使用标准条件，在最低限度培养基琼脂平板上针对泛酸盐/酯原营养型(Pan+)进行筛选。这些Pan+菌落也对氯霉素敏感(Cms)，这证实了启动子盒的插入。离析出含有由P15启动子表达的panBCD操纵子的单个Pan+Cms菌落，将其命名为PA12(P15panBCD)。使用P15seq和P4panBCD引物(表2)，再使用标准反应条件，通过诊断性PCR，验证panB基因上游P15启动子的存在。在摇瓶培养物中，PA12在VFB MM培养基中产生大约100mg/l的泛酸盐/酯，在VFB MMGT培养基中产生大约250mg/l的泛酸盐/酯(基于HPLC/MS测定)，而1A747对照产生的泛酸盐/酯少于1g/l。使用VF培养基和生长条件，在标准补料分批发酵中，PA12在48小时处生产出约10-14g/l的泛酸盐/酯。
表2.用于产生含有P15panBCD表达盒的B.subtilis菌株的引物
B.subtilis菌株PA49为构造还含有panE基因(ylbQ)上游的强组成型启动子的菌株，首先构造缺失突变。对panE基因的检查表明存在两个潜在的起始位点起始位点1(5’-AAATTGGGTG-3’(RBS)-7nt-ATG)，它覆盖BspHI位点，并在起始位点2(5’-GGAGG-3’(RBS)-5nt-TTG)上游33bp处，起始位点2覆盖BsaXI位点。因此，使用S.aureus的红霉素抗性(Emr)基因(GeneBank V01278)，通过LFH-PCR，构造panElylbQ启动子区域的219bp的缺失。为此，首先产生两条PCR片段“臂”将0.2μl 100mM的P1panE和P2panE/Er引物或P3panE/Er/2和P4panE引物(表3)溶液加到50μl反应体积中的0.1μg 1A747染色体DNA中，该50μl反应体积含有1μl 40mM dNTP’s、5μl10X缓冲液和0.75μl PCR酶(Taq和Tgo)，如生产按商(Expand High fidelity PCR系统-Roche Applied Science)所述的。该PCR反应进行30个循环，退火温度为55.7℃，延伸时间为45秒。所得片段分别被称为F1和F2，对其进行纯化，并将其作为引物再用于第二轮PCR。将F1和F2片段稀释50倍，并各取1μl加到50μl反应体积中的0.1μg线性化质粒pDG646(含有erm盒Guérout-Fleury et al.，1995)中。在最初10个循环中，退火温度为63℃，延伸时间为6分钟。在后20个循环中，每个循环后将延伸时间再延长20秒。然后将得到的产物作为模板用于第三轮PCR。将PCR产物稀释50倍，取1μl，并将其与0.2μl100mM的P1panE和P4panE引物溶液混合于上述50μl含有dNTP’s、缓冲液和酶的反应体积中。PCR反应参数与第二轮PCR中所用的一致。然后将最终的PCR片段转化进PA4(Trp+菌落，通过用1A747染色体DNA进行转化，从B.subtilis CU550 trpC2 ilvC4 leu-124获得)中，得到泛酸盐/酯营养缺陷型Emr菌落。该菌株称为PA5(ΔpanEp∷erm ilvC leuC)。通过诊断性PCR来验证缺失的结构。随后，通过转化PA1染色体DNA(非聚集浓度的，non-congressional concentration)，将panB启动子缺失引入PA5，产生PA6(ilvC leuC ΔpanBP∷cat ΔpanEp∷erm)。
表3.用于产生含有ΔpanEp∷erm缺失突变的B.subtilis菌株的引物
下一步要同时引入panB和panE上游的强组成型P15启动子。再次使用LFH-PCR，以产生含有panB的开放阅读框上游的P15和含有panE的开放阅读框上游的P15的DNA片段。为此，利用用于构造PA12的相同PCR方案(见上文)，使用P1panB和P2panB/P15引物(F1)和P3panB/P15和P4panB引物(F2)(表1和2，P15panB的构造)，和P1panE和P2panE/P15(F1)和P3panE/P15和P4panE(F2)(表3和4，P15panE的构造)，针对panB和panE构造两条PCR片段“臂”。
表4.用于产生含有P15panE表达盒的B.subtilis菌株的引物
然后通过DNA转化，将最终的P15panB和P15panE PCR片段转化进panB和panE启动子缺失菌株PA6(ilvC leuC ΔpanBp∷cat ΔpanEp∷erm)中，并使用标准条件，在最低限度培养基琼脂平板上针对泛酸盐/酯原营养型(Pan+)进行筛选。回收到的Pan+菌落也是Cms的和对红霉素敏感的(Ems)，这证实了启动子盒的插入。离析出含有从P15启动子表达的panE基因和panBCD操纵子的单个Pan+CmsEms菌落，将其命名为PA32。使用P15seq和P4panB引物(表1和2)，再使用标准反应条件，通过诊断性PCR，验证panB基因上游的P15启动子的存在。用P15seq和P4panE引物(表3和4)，在panE基因上进行了同样的对照。但是，随后对panE前面的P15启动子进行测序，表明P15启动子部分缺失。
为了用正确的构造来替换掉部分缺失的P15panE基因，通过DNA转化，使用来自PA5(ΔpanEp∷erm ilvC leuC)的染色体DNA将ΔpanEp∷erm突变重新引入PA32，并针对红霉素抗性进行筛选。这样得到菌株PA41(P15panBCD ΔpanEp∷erm ilvC leuC)。然后将如前文所述的通过LFH-PCR产生的P15panE DNA片段转化进PA41，并针对Pan+原营养型进行筛选。这样得到菌株PA43(ilvC leuC P15panBCD P15panE)。然后，用标准程序，使用在野生型B.subtilis 1A747上制得的PBS1噬菌体溶解产物，将该Ilv-Leu-营养缺陷型菌株再转导进Ilv+Leu+原营养型。这样得到菌株PA49(P15panBCD P15panE)。
在摇瓶培养物中，PA49在VFB MMGT培养基中产出平均大约为400mg/l的泛酸盐/酯(基于HPLC/MS测定)。
实施例II本实施例描述了对含有芽孢形成缺陷型突变spo0A、spo0H、spoIIA(sigF)spoIIG(sigE)和spoIIIG(sigG)的过量生产泛酸盐/酯的B.subtilis菌株的构造和测试。
对芽孢形成有缺陷的B.subtilis突变体的构造通过转化分别来自菌株SWV215(spo0A∷kan)、BHI(spo0HΔHindIII-EcoRI∷cat)、650(spoIIAABC∷cat)、901(spoIIGA∷aphA-3)和731(spoIIIG∷ermC)的染色体DNA，将芽孢形成缺陷型突变引入到1A747(野生型菌株)和过量生产泛酸盐/酯的菌株PA12中。按照Bron(1990)，通过“Groningen”方法提取染色体DNA，对B.subtilis菌株进行转化。在含有0.3μg/ml红霉素(Em)和25μg/ml林肯霉素(Lm)的TBAB琼脂培养基上，对转化子进行针对ermC基因的筛选；在含有6μg/ml Cm的TBAB琼脂培养基上，对cat基因进行筛选；在含有10μg/ml卡那霉素(Km)的TBAB琼脂培养基上，对kan和aphA-3基因进行筛选。转化效率大约为5×104转化子/μg染色体DNA，并由此产生下述菌株(i)来自SWV215 DNA的卡那霉素抗性(Kmr)转化子，命名为1A747_spo0A和PA12_spo0A；(ii)来自BHI DNA的Cmr转化子，命名为1A747_sigH和PA12_sigH；(iii)来自650 DNA的Cmr转化子，命名为1A747_sigF和PA12_sigF；(iv)来自901 DNA的Kmr转化子，命名为1A747_sigE和PA12_sigE；(v)来自731 DNA的红霉素/林肯霉素抗性(Emr/Lmr)转化子，命名为1A747_sigG和PA12_sigG；Spo0A和sigma H(σH)是芽孢形成最初步骤的关键调控子，除此之外，它们还在空间结构的形成中有着最重要的作用，充当在B.subtilis菌落相关表面上芽孢形成的位点(Branda et al.，2001)。因此，缺乏Spo0A的1A747_spo0A和PA12_spo0A在TBAB琼脂平板上产生粘液状的没有结构的菌落，而缺乏σH的1A747_sigH和PA12_sigH则显示出相似但不严重的表型(在琼脂表面上分布不集中)。相反，缺乏sigma F(σF)、sigmaE(σE)、sigma G(σG)的其它突变体形成的菌落与野生型菌株的菌落外型非常相似。
芽孢形成缺陷型突变对B.subtilis中泛酸盐/酯生产和芽孢形成的影响。
从上述每种转化实验中，取25个独立离析出的菌落，利用平板环状(plate halo)试验，对其泛酸盐/酯生产情况进行测试。对每个突变体而言，在摇瓶培养物中分析其环的尺寸代表了大部分待测菌落情况的两个菌落。用在补充有适当抗生素的TBAB平板上生长的单个菌落去接种在250ml带隔板Erienmeyer瓶中的20ml VFB MM。在37℃下以250rpm的振荡速率对细菌进行培养。当培养物达到稳定生长阶段后期(～18小时培养后)时，在600nm下测量细胞浑浊度(OD600)，并利用芽孢形成测定来确定“耐热性”cfu的数量。然后经0.45μm孔径的过滤器进行过滤来移去细胞，并利用生物测定方法和HPLC测定方法测定消耗的培养基中泛酸盐/酯的含量。结果显示，突变体1A747_spo0A、PA12_spo0A、1A747_sigH和PA12_sigH的泛酸盐/酯总产量相比较亲本菌株降低了2至3倍(表5)，这表明Spo0A和σH功能的缺乏不利地影响了泛酸盐/酯的生产。在缺乏σF或σE的突变体中，泛酸盐/酯的生产与对照水平在实验误差范围内近似，这表明在后阶段阻止芽孢形成的突变对泛酸盐/酯的生产没有或只有很小的影响。如通过培养物的OD600测量所确定的，所有突变体的细胞生物质与亲本对照都近似。亲本菌株1A747和PA12的芽孢形成频率大约为0.3-1％。在缺少Spo0A、σH和σE的突变体中，没有检测到芽孢。但是，在1A747_sigF和PA12_sigF的培养物中检测到少量的耐热细胞(表5)，这表明spoIIAABC基因的突变不会导致芽孢形成的完全丢失。基于上述结果，仅有在sigma E基因中含有突变的菌株既能生产对照水平的泛酸盐/酯，又是完全不形成芽孢的细菌。
含有σG突变的菌株产生其它spo突变体没有展现过的独特表型。当引入到1A747野生型细胞中时，得到的突变体产出正常水平的泛酸盐/酯，而且没有芽孢。但是，在经工程改造的PA12菌株中，得到的菌株产出非常低水平的泛酸盐/酯，同时没有芽孢(表5)。上述结果暗示，通过erm基因对σG的破坏，阻碍了泛酸盐/酯的高水平表达，这或者通过防止表达其蛋白质产物在泛酸盐/酯的生产或排出中所涉及到的Sigma G转录基因来实现，或者通过极性阻止下游基因的转录来实现。对spoIIIG下游DNA序列的检查揭示了单个基因ylmA的存在，它可随spoIIIG共转录。ylmA基因可能编码未知的ATP结合蛋白，该蛋白可以作为ABC转运蛋白的组分之一发挥作用。因此，该蛋白质单独的或与经工程改造的pan和/或ilv生物合成基因一起的过量表达使得泛酸盐/酯产量增加。此外，Spo-Pan-表型的阻遏子宿主突变恢复了泛酸盐/酯生产，使得菌株生产出更多的泛酸盐/酯。
表5.芽孢形成缺陷型突变对B.subtilis中泛酸盐/酯生产和芽孢形成的影响
实施例III本实施例描述了对含有芽孢形成缺陷型突变spo0A或spoHG(sigE)的过量生产泛酸盐/酯的B.subtilis菌株进行的发酵。
使用2升实验室规模的发酵罐，在标准补料分批发酵中对sigE突变体(PA12_sigE)、spo0A突变体(PA12_spo0A)及其亲本PA12进行48小时的培养。在发酵期间测量细菌的泛酸盐/酯水平和芽孢形成频率。如表6所示，泛酸盐/酯产量在sigE突变体和亲本中近似，但是spo0A突变体中减少了大约85％。泛酸盐/酯相对于葡萄糖的产率在sigE突变体和亲本菌株之间也相似。在亲本中检测到芽孢，但在两种突变体中没有检测到。
表6.B.subtilis菌株PA12、PA12_spo0A和PA12_igE在2升的实验台规模发酵中培养48小时的芽孢形成和泛酸盐/酯生产情况。
通过这些仅表现本发明的特定实施方式的实施例，已对本发明进行了阐述。这不应视为是限制本发明，因为阅读本说明书后，许多实施方式对于技术人员来说是显而易见的。
实施例IV本实施例描述了对含有spo0A和abrB中无效突变的过量生产泛酸盐/酯的B.subtilis菌株的构造和测试。
通过转化来自菌株SWV215(spo0A∷kan)和SWV119(abrB∷tet)的染色体DNA，将abrB和spo0A的单突变和双突变引入到过量生产泛酸盐/酯的菌株PA49中。在含有10μg/ml Km的TBAB琼脂培养基上针对kan基因进行筛选；并且，在含有10μg/ml四环素(Tc)的培养基上针对tet基因进行筛选。转化效率为对spo0A∷kan而言，2×103转化子/μgDNA；对abrB∷tet而言，4×102转化子/μg DNA；对spo0A∷kan和abrB∷tet双突变体而言，4转化子/μg DNA。得到如下菌株(i)来自SWV215DNA的Kmr转化子，命名为PA1030；(ii)来自SWV119 DNA的四环素抗性(Tcr)转化子，命名为PA1037；(iii)来自SWV215和SWV119DNA的Kmr和Tcr转化子，命名为PA1051。
对每种突变体而言，取四个菌落分析在摇瓶培养物中的泛酸盐/酯生产和芽孢形成。用在补充有适当抗生素的TBAB平板上生长的单个菌落去接种10ml补充有适当抗生素的VY培养基。在37℃下，以250rpm的振荡速率培养细菌整晚(～17h)。将过夜的培养物稀释(1∶100)于20mlVFB MMGT中，培养至指数生长中期(OD600＝0.6-0.8)。用上述培养物对30ml VFB MMGT进行接种，起始浑浊度为OD600＝0.03，并在250ml带隔板Erlenmeyer瓶中，在37℃下以250rpm的振荡速率培养细菌。18小时培养后，在600nm下测量细胞浑浊度(OD600)，并利用芽孢形成测定来确定“耐热性”cfu的数量。然后经过0.45μm孔径的过滤器进行过滤来移去细胞，并利用HPLC测定方法测定消耗的培养基中泛酸盐/酯的含量。结果显示，如通过培养物的OD600测量所确定的，所有突变体的细胞生物质与亲本对照都近似。PA1030(spo0A∷kan)和PA1037(abrB∷tet)的泛酸盐/酯总产量相比较亲本菌株PA49下降了3至4倍(图7)，这表明Spo0A(如实施例II中也显示的)和AbrB功能的缺乏会对泛酸盐/酯的生产造成负面影响。但是，双突变体PA1051(spo0A∷kan abrB∷tet)生产的泛酸盐/酯比PA49对照多40％，而且不产生芽孢。基于上述结果，在双abrB和spo0A无效突变体中泛酸盐/酯的产量可以增加到野生型表达水平以上。
表7.B.subtilis菌株PA49、PA1030、PA1037和PA1051在摇瓶培养物中生长的芽孢形成和泛酸盐/酯生产情况。
实施例V本实施例描述了对过量表达spo0A并含有芽孢形成缺陷型突变(spoIIGA)的过量生产泛酸盐/酯的B.subtilis菌株的构造和测试。
对携带Pspac-spo0A和sigE无效突变的B.subtilis菌株的构造。
实施例II中已显示Spo0A的缺乏会使得泛酸盐/酯产量相比较亲本菌株降低2至3倍。为调查spo0A基因的过量表达对泛酸盐/酯生产的影响，通过转化来自菌株AH1763(amyE∷Pspac-spo0A[cat])的染色体DNA，将IPTG诱导型的Pspac-spo0A融合体引入到PA49的amyE基因中。在含有6μg/ml Cm的TBAB琼脂培养基上对转化子进行筛选，并将得到的Cmr菌株命名为PA1025。然后通过转化来自菌株901(spoIIGA∷aphA-3)的染色体DNA，将spoIIGA中的芽孢形成缺陷型突变引入到PA1025中。在含有6μg/ml Cm的TBAB琼脂培养基上针对cat基因对转化子进行筛选，在含有10μg/ml Km的培养基上针对aphA-3基因进行筛选，得到的Cmr和Kmr菌株命名为PA1064。
spo0A的过量表达对B.subtilis中泛酸盐/酯生产情况的影响。
用PA49、PA1025和PA1064的单个菌落去接种10ml补充有适当抗生素的VY培养基。在37℃、250rpm的振荡下，对细菌培养过夜(～17h)。将过夜的培养物稀释(1∶100)于20ml VFB MMGT中，并培养至指数生长中期(OD600＝0.6-0.8)。用上述培养物对30ml VFB MMGT和30ml含有10mM IPTG的VFB MMGT进行接种，起始浑浊度OD600＝0.03，并在250ml带隔板的Erlenmeyer瓶中，在37℃、250rpm的振荡下对细菌进行培养。18小时培养后，在600nm下测量细胞浑浊度(OD600)，并用芽孢形成测定来确定“耐热性”cfu的数量。然后经过0.45μm孔径的过滤器进行过滤来移去细胞，并用HPLC测定方法测定消耗的培养基中泛酸盐/酯的含量。结果显示，如通过培养物的OD600测量所确定的，所有突变体的细胞生物质与亲本对照都近似。在不存在IPTG诱导剂的情况下，PA1025(Pspacspo0A)和PA1064(Pspacspo0A spoIIGA∷aphA-3)的泛酸盐/酯总产量与亲本PA49菌株近似(表8)。当用10mM IPTG从Pspac启动子来诱导spo0A的表达时，PA1025产生的泛酸盐/酯较之亲本对照多70％，芽孢多10倍，而PA1064生产的泛酸盐/酯也比PA49对照多70％，并且它是芽孢形成缺陷型的。
表8.B.subtilis菌株PA49、PA1025和PA1064在摇瓶培养物中生长的芽孢形成和泛酸盐/酯生产情况。
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<223>引物P4panBCD<400>10cggatatgct tcaaaatctt cattagg27<210>11<211>25
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P15seq<400>11ctactatttc aacacagcta tctgc 25<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P1panE<400>12ggcagcctgt ggtttcaggt gg 22<210>13<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P2panE/Er<400>13attatgtctt ttgcgcagtc ggccgtctgc ttatcaacta taaaacgc 48<210>14<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P3panE/Er/2<400>14cattcaattt tgagggttgc caggcctatt atttgtcact ttatcacg 48<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P4panE<400>15ccagtctttc gcgccacatg tcc 23<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P2panE/P15<400>16ggactgatct ccaagcgatg ggaatttttt aaataaagcg tttacaatat 50
<210>17<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P3panE/P15<400>17tcgagaatta aaggagggtt tcatatgaaa attggaatta tcggcggag 49
权利要求
1.一种芽孢形成缺陷型微生物，所述微生物能够过量生产泛酸盐/酯化合物。
2.如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物已经过修饰，使得它呈现出降低的SigE活性。
3.如权利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物具有至少一处突变，所述突变影响选自由spoIIGA、spoIIGB、spoIIR和spoIIAC所组成的组中的至少一个基因。
4.如权利要求l至3中任一项所述的微生物，其中所述微生物过量表达spoOA基因。
5.如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物已经过修饰，使得它呈现出降低的SpoOA活性和降低的AbrB活性。
6.如权利要求5所述的微生物，其中所述微生物具有至少一处影响spoOA基因的突变和至少一处影响abrB基因的突变。
7.如权利要求1至6中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于Bacillus属。
8.如权利要求1至7中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于Bacillus subtilis种。
9.如权利要求1至8中任一项所述的微生物，其中所述泛酸盐/酯化合物是泛酸盐/酯。
10.如权利要求1至9中任一项所述的微生物，其中所述微生物的群落在含有最低限度培养基的摇瓶培养物中能够生产至少100mg泛酸盐/酯每升培养基。
11.如权利要求1至10中任一项所述的微生物，其中所述微生物的群落在补料分批发酵中能够生产至少5g泛酸盐/酯每升培养基。
12.如权利要求1至11中任一项所述的微生物，其中所述微生物生产的泛酸盐/酯化合物的量比相应的非芽孢形成缺陷型微生物生产的所述泛酸盐/酯化合物的量的50％要高。
13.如权利要求1至12中任一项所述的微生物，其中所述微生物过量表达一种或多种选自由panB、panC、panD、panE、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA、serA、ylmA和gcv基因所组成的组中的基因。
14.一种用于生产泛酸盐/酯化合物的方法，所述方法包括(a)在泛酸盐/酯化合物能被生产出的条件下，对如权利要求1至13中任一项所述的微生物进行培养；以及(b)可选地，从细胞培养基中回收泛酸盐/酯化合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中以补料分批发酵方式来培养所述微生物的群落。
16.一种制备能够过量生产泛酸盐/酯化合物的芽孢形成缺陷型微生物的方法，所述方法包括(a)提供能够过量生产泛酸盐/酯化合物的微生物，(b)向步骤(a)的微生物中引入导致SigE活性降低的突变，或者向步骤(a)的微生物中引入导致SpoOA活性降低和AbrB活性降低的突变，从而获得芽孢形成缺陷型微生物；或者(a)提供不能过量生产泛酸盐/酯化合物的微生物，(b)向步骤(a)的微生物中引入降低SigE活性的突变或向步骤(a)的微生物中引入降低SpoOA活性和降低ArbB活性的突变，从而得到芽孢形成缺陷型微生物，以及(c)对步骤(b)中获得的芽孢形成缺陷型微生物进行修饰，使得它能够过量生产泛酸盐/酯化合物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述导致SigE活性降低的突变影响选自由spoIIGA、spoIIGB、spoIIR和spoIIAC组成的组中的至少一个基因。
18.如权利要求16或17所述的方法，还包括如下步骤向所述微生物中引入导致spoOA过量表达的DNA序列或突变。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述导致SpoOA活性降低和AbrB活性降低的突变影响spoOA基因和abrB基因。
20.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述微生物属于Bacillus属。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述微生物属于Bacillus subtilis种。
22.如权利要求16至21中任一项所述的方法，其中所述泛酸盐/酯化合物是泛酸盐/酯。
23.如权利要求1至13中任一项所述的微生物在制备泛酸盐/酯化合物中的用途。
全文摘要
本发明提供了能够过量生产泛酸盐/酯的芽孢形成缺陷型微生物。影响SigE功能的基因突变，或者影响Spo0A功能以及AbrB功能的基因突变，使得微生物不能形成芽孢，但却基本保持它们过量生产泛酸盐/酯的能力。本发明的微生物特别适用于泛酸盐/酯的工业生产。
文档编号C12P13/02GK1809631SQ200480017144
公开日2006年7月26日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年6月18日
发明者约翰·伯金斯, 佐尔谭·普里盖 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司