重组抗体及组合物及其制备和使用方法

专利名称：重组抗体及组合物及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及抗体，包括人狂犬病毒中和抗体的核酸和氨基酸序列，以及使用重组表达载体对其进行的制备。更具体地，本发明涉及针对狂犬病毒的抗体混合物的应用，该混合物可在受试者暴露于狂犬病毒后用于预防治疗。
背景技术：
狂犬病是由于中枢神经系统受到狂犬病毒的感染而引起的急性神经性疾病，狂犬病毒是棒状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)中的病毒。在于病毒的古老以及疾病的可怕性而具有重要历史意义的狂犬病毒一直是人类和动物感染的重要威胁，因为其在各种野生动物中存在着广泛的宿主。在世界的大部分地区，狂犬病毒在地区物种中是地方病，而不同地区的病毒变异体之间相似性很小。虽然在包括联合王国，澳大利亚，日本，以及各个岛屿上没有地方性狂犬病，英国和澳大利亚也已发现了狂犬病和蝙蝠相关的狂犬相关病毒。
尽管抗体能够提供即时免疫，被动免疫已被广泛地用于治疗传染性疾病，包括狂犬病(Casadeval，A.，Emerg.Infect.Dis.2002，8833-41)。根据世界卫生组织(WHO)指导方针，3类狂犬病的暴露需要狂犬病暴露后预防(PEP)，这些暴露被定义为或单次或多次经皮咬伤或黏膜被患有狂犬病动物的唾液污染(Human rabiesprevention-United States，2000Recommendations of the AdvisoryCommittee on Immunization Practices.MMWR 2000)。狂犬病的暴露后预防包括疫苗和抗狂犬病免疫球蛋白(RIG)的给药。目前，从狂犬病毒免疫的人(人RIG[HRIG])或狂犬病毒免疫的马(马RIG[ERIG])的血清样品中制备用于暴露后预防的RIG。由于与ERIG的使用相关的潜在不良效应(例如过敏性休克)，在美国仅使用HRIG，暴露于狂犬病动物的人(每年～39,000人)接受HRIG和狂犬病毒(RV)疫苗的治疗(Human rabies prevention-United States，2000Recommendations ofthe Advisory Committee on Immunization Practices.MMWR 2000)。然而，在发展中国家，因为没有足够量的可供使用的HRIG和ERIG或因为它们，特别是HRIG，过于昂贵，所有PEP中＜1％包括了RIG的给药(Human rabies prevention-United States，1999Recommendations of theAdvisory Committee on Immunization Practices(ACIP).MMWR Recomm.Rep.1999，481-21)。此外，一些动物保护团体对于饲养动物用于血清制备的行为进行了声讨(Human rabies prevention-United States，1999Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices(ACIP).MMWR Recomm.Rep.1999 481-21)。另外，由已知或未知病原体造成HRIG污染的可能性是管理机构关心的问题。通过制备人RV-中和单克隆抗体(MAbs)可以克服经济有效而安全的RIG在全球有限的供应，该抗体可被用于与生物反应器技术结合的高产表达系统(例如使用transfectomas的系统)。
一旦个体暴露于狂犬病毒，可以通过合适的治疗包括被动和主动免疫，容易地防止疾病(Human rabies prevention-United States，2000Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.MMWR 2000)。人们相信抗体的被动给药对于在进入位点中和病毒以及干扰病毒向中枢神经系统(CNS)的扩散很重要(Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，897252-6)。这两种作用很可能为发展对病毒的主动免疫提供时间，该免疫最终清除病毒。
RV-中和鼠或人单克隆抗体(MAbs)的给药在鼠的暴露后预防中显得很有效(WHO consultation on a monoclonal antibody cocktail forrabies post exposure treatment，WHO，2002年5月23-24日；Schumacher等，J.Clin.Invest.1989 84971-5；Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90)。随着人单克隆抗体制备技术的进步，考虑在人体中使用鼠单克隆抗体可能是不必要的。在人体中使用鼠单克隆抗体可能带来问题，因为它们对于人而言是是免疫原性的且其半衰期是有限的，可能造成血清病或过敏性休克。此外，人单克隆抗体和Fc受体之间的相互作用和相应的鼠试剂之间的作用相比可能是更合适的。
目前，使用从混合人血清或从免疫的马中制备的抗体治疗受试者。但是，这些试剂中没有任何试剂是可以轻易获得、完全安全或生物活性稳定的。
对于暴露于狂犬病毒的个体的暴露后预防治疗需要新的方法。同样需要新的方法治疗存在暴露于狂犬病毒的风险的受试者。本发明满足了这些需要。

发明内容
本发明为狂犬病的治疗和预防提供了狂犬病毒中和抗体的混合物。本发明还提供了含有编码抗狂犬病抗体的核酸的重组棒状病毒表达系统以及这些抗体的组合物和在哺乳动物细胞内制备这些抗体的方法。
在此提供的重组狂犬病毒中和人抗体包括人抗体SOJA、SOJB和SO57。这三个抗体也分别被称作MAb JA、MAb JB.1和MAb 57。
本发明因此提供了包含一种药学上可接受的载体和至少两种狂犬病毒中和人抗体的药物组合物，其中至少两种抗体中的至少一种选自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链和具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQ IDNO1基本上同源的序列的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链和具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQ IDNO4基本上同源的序列的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链和具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQ IDNO9基本上同源的序列的抗体重链的抗体。
本发明提供了对需要治疗的受试者治疗或预防狂犬病毒感染的方法。该方法包括对受试者以至少两种重组狂犬病毒中和人抗体的有效量给药，其中抗体选自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链和具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQ IDNO1基本上同源的序列的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链和具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQ IDNO4基本上同源的序列的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链和具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQ IDNO9成分同源的序列的抗体重链的抗体。
在一个具体实施方案中，至少两种，更优选三种抗体选自前述组。
在一个具体实施方案中，用至少三种不同的重组狂犬病毒中和人抗体进行给药。
在一个具体实施方案中，抗体以至少两种不同组合物的方式分别给药。
在一个具体实施方案中，重组狂犬病毒中和人抗体对至少两种或多种狂犬病毒呈现中和活性。
在本发明的一个方面中，不同的重组狂犬病毒中和人抗体以大约等摩尔浓度给药。
在一个具体实施方案中，用重组狂犬病毒中和人抗体给药，其中各重组狂犬病毒中和人抗体以与给药的其它重组狂犬病毒中和人抗体大约相等的蛋白量给药。一方面，重组狂犬病毒中和人抗体的给药量在大约0.001mg/kg体重至大约100mg/kg体重之间。在本发明的另一方面中，重组狂犬病毒中和人抗体的给药量在大约0.01mg/kg体重至大约60mg/kg体重之间。
在另一个具体实施方案中，重组狂犬病毒中和人抗体的给药量基于重组狂犬病毒中和人抗体混合物的狂犬病毒中和活性。一方面，混合物活性在大约1IU/kg体重至大约50IU/kg体重之间。
在一个具体实施方案中，本发明提供了通过重组狂犬病毒中和抗体混合物给药对受试者进行治疗的方法，其中受治疗的病毒为一种狂犬病毒街毒。在一些具体实施方案中，病毒选自银毛蝠狂犬病毒、土狼狂犬病毒街毒/墨西哥狗狂犬病毒和狗狂犬病毒。
在另一个具体实施方案中，本发明提供了通过重组狂犬病毒中和抗体混合物的给药对受试者进行治疗的方法，其中受治疗的病毒是狂犬病毒固定毒。
接受治疗的受试者优选是人。
在一个具体实施方案中，本发明提供了重组棒状病毒表达载体，包含编码疱疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列，且进一步包含含有编码重组狂犬病毒中和人抗体的抗体轻链和抗体重链的核酸序列的核酸。在另一个具体实施方案中，核酸序列编码狂犬病毒中和人抗体的轻链而不是重链。在另一个具体实施方案中，核酸序列编码狂犬病毒中和人抗体的重链而不是轻链。一方面，抗体是SOJA单克隆抗体。另一方面，抗体是SOJB单克隆抗体。再一方面，抗体是SO57单克隆抗体。一方面，核酸只编码抗体轻链。另一方面，核酸仅编码抗体重链。
在本发明的实践中，提供了包含本发明重组棒状病毒表达载体的哺乳动物宿主细胞。在本发明的一个具体实施方案中，哺乳动物宿主细胞是BSR细胞、幼仓鼠肾细胞、VERO细胞、或中国仓鼠卵巢细胞。
本发明还提供了使用本发明的重组棒状病毒表达载体在哺乳动物宿主细胞中制备重组狂犬病毒中和人抗体的方法。本方法包括用本发明的重组棒状病毒表达载体感染哺乳动物细胞，该载体包含含有编码重组狂犬病毒中和人抗体的抗体轻链和抗体重链的核酸序列的核酸，以及在允许抗体表达的条件下培养哺乳动物细胞。一方面，抗体是SOJA单克隆抗体。另一方面，抗体是SOJB单克隆抗体。再一方面，抗体是SO57单克隆抗体。一方面，核酸仅编码抗体轻链。另一方面，核酸仅编码重链。
在本发明的一个具体实施方案中，制备重组狂犬病毒中和人抗体的哺乳动物细胞是BSR细胞、幼仓鼠肾细胞、VERO细胞、或中国仓鼠卵巢细胞。
缩写和简写形式在本说明书中使用以下缩写和简写形式。
“BHK”指幼仓鼠肾。
“BSR”指BHK细胞亚克隆。
“CHO”指中国仓鼠卵巢。
“CNS”指中枢神经系统。
“COSRV”指犬类狂犬病毒变体。
“CVS”指标准攻击毒株(challenge-virrus standard)。
“DRV-4”指狗狂犬病毒4。
“EBV-2”指欧洲蝙蝠病毒2。
“ED50”指50％受治疗动物被保护的有效量。
“ERIG”指马狂犬病免疫球蛋白。
“G”指糖蛋白。
“GSP”指基因特异性启动子。
“HRIG”指人狂犬病免疫球蛋白。
“huMAb”指人单克隆抗体。
“Ig H”指免疫球蛋白重链。
“Lg L”指免疫球蛋白轻链。
“IU”指国际单位。
“MAb”指单克隆抗体。
“MIC LD50”指杀死50％的颅内受感染小鼠的病毒剂量，即，小鼠颅内LD50。
“MOI”指感染的多重性。
“PCR”指聚合酶链式反应。
“PEP”指暴露后预防。
“RIG”指狂犬病免疫球蛋白。
“rhuMAb”指重组人单克隆抗体。
“RhV”指棒状病毒载体。
“RV”指狂犬病毒。
“SHBRV”指银毛蝠狂犬病毒。
“VNA”指病毒中和抗体。
“VSV”指疱疹性口炎病毒。
“WHO”指世界卫生组织。
定义本申请中使用的定义以说明为目的不对本发明的范围进行限制。
在此使用的冠词“一”指该冠词的一或多于一个(即至少一个)的语法宾语。举例来说，“一种成分”指一种或多于一种成分。
在此使用的各“氨基酸”由其全称表示、通过其相应的三字母代码表示、或由其相应的单字母代码表示，如下表所示

在此使用的表达“氨基酸”包括天然的和合成的氨基酸，以及D型和L型氨基酸。“标准氨基酸”指在天然生成的肽中经常发现的20种L-氨基酸中的任何一种。“非标准氨基酸”指除了标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是通过合成制备的还是从天然来源衍生出来的。在此使用的“合成氨基酸”也包括化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)以及取代物。本发明的肽所包含的氨基酸，特别是位于羧基末端或氨基末端的氨基酸，可通过甲基化、酰胺化、乙酰化或由能够改变肽的循环半衰期而对肽活性不发生负面影响的其它化学基团取代而进行修饰。此外，在本发明的肽中可以出现或不出现二硫键。
术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”交替使用，可指代游离氨基酸和肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文可以明显看出该术语指游离氨基酸或肽的残基。
氨基酸具有以下普遍的结构 根据侧链R可将氨基酸分为七类(1)脂肪族侧链，(2)含有羟基(OH)的侧链，(3)含有硫原子的侧链，(4)含有酸性或酰胺基团的侧链，(5)含有碱性基团的侧链，(6)含有芳香环的侧链，以及(7)脯氨酸，其侧链与氨基基团结合的亚氨基酸。
用于描述本发明的肽化合物的命名法沿袭传统习惯，其中氨基基团和羧基基团分别位于各氨基酸残基的左边和右边。在表示所选的本发明特定具体实施方案的结构式中，尽管没有特别表示，除非特别说明，应当明白氨基和羧基末端基团以其在生理pH值呈现的形式存在。
在此使用的“抗体”，包括多克隆和单克隆抗体；重组抗体；以及嵌合、单链、人源化抗体，以及人抗体。“抗体”不仅包括完整的抗原结合免疫球蛋白分子，还包括其与抗原结合的片段，如Fv、Fab、Fab’以及F(ab’)2片段、单链Fv或免疫球蛋白表达文库的产物。
在此使用的“抗体重链”指存在于所有抗体分子中的两类多肽链中较大的一类。
在此使用的“抗体轻链”指存在于所有抗体分子中的两类多肽链中较小的一类。
在此使用的关于狂犬病毒中和重组抗体的“生物活性”指用作狂犬病毒活性中和剂的能力。
在此使用的狂犬病毒中和抗体的“有效量”或“治疗有效量”是在暴露于狂犬病的受试者体内足以抑制狂犬病毒感染进程的量或在有暴露于狂犬病风险的受试者体内足以预防狂犬病毒进程的量。
使用的关于狂犬病毒中和抗体mRNA的术语“表达”指狂犬病毒中和重链或轻链核酸序列的转录，造成狂犬病毒中和抗体mRNA的合成。使用的关于狂犬病毒中和抗体的“表达”指狂犬病毒中和抗体mRNA的翻译，造成狂犬病毒中和抗体的合成。
在此使用的“同源”指两个聚合分子之间的亚单元序列相似性，例如在两个核酸分子如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或在两个多肽分子之间。当两分子中的亚单元位点被相同的单体亚单元占据，例如两DNA分子中的位置均被腺嘌呤占据，在该位点它们就是同源的。两序列间的同源性是匹配或同源位点数目的直接函数；例如如果两序列中一半的位点(例如，长度为10个亚单元的聚合物中的5个位点)是同源的，两序列为50％同源的；如果90％的位点(例如10个中的9个)是匹配或同源的，两序列为90％同源的。举例来说，DNA序列3’ATTGCC 5’和3’TATGGC 5’为50％同源的。
在此使用的核酸分子的“亚单元”是核苷酸，多肽的“亚单元”是氨基酸。
在此使用的“同源性”与“等同性”同义。
在此使用的术语“抑制”指相对于对照值以至少10％的比例抑制或阻断活性或功能。优选地，活性与对照值相比被抑制或阻断50％，更优选地为75％，甚至更优选地为95％。
“分离的”指通过人的行为从天然状态改变的或离开的。例如，天然存在于活体动物内的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存材料中部分或完全分离出的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以充分纯化的形式存在，或存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。
在此使用的关于狂犬病毒的“中和”，指在暴露于狂犬病的受试者体内降低或抑制狂犬病毒的感染进程或在有暴露于狂犬病毒风险的受试者体内降低或预防进程。
“核酸”指聚核苷酸，包括聚核糖核苷酸和聚脱氧核糖核苷酸。
在此使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交替使用，指由氨基酸残基通过肽键共价连接组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少2个氨基酸，对于可以组成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有设限。
“药学上可接受的”指对于人或动物应用在生理学上可容忍的。
在此使用的“药物组合物”包括用于人或动物的配方。
“预防性的”或“预防的”治疗是对没有出现狂犬病毒暴露或感染的症状或仅出现早期症状的受试者进行的治疗。进行预防的或预防性的治疗的目的是降低发展狂犬病毒感染相关病原体的风险。
在此使用的“狂犬病毒相关紊乱”指狂犬病毒的存在和狂犬病临床症状之间存在关联的紊乱。
在此使用的关于重组人抗体“狂犬病毒中和”指能够降低狂犬病毒感染细胞或引起狂犬病程度的抗体或抗体的混合物。“狂犬病毒中和”和“狂犬病毒中和活性”可以交替使用。
在此使用的“样品”指取自受试者的生物样品，包括正常组织样品、血液、唾液、粪便或尿液。样品还可以是取自受试者的其它任何含有感兴趣的化合物或细胞的材料。
在此使用的“受试者”可以是人或非人动物。非人动物包括，例如家畜和宠物，如绵羊、牛、猪、犬科、猫科和鼠科哺乳动物以及爬行动物、鸟类和鱼。优选地，受试者是人。
“充分纯化的”指由于去除了初始存在的其它化合物(例如其它肽、核酸、碳水化合物、脂肪)或其它细胞而在性质上基本上同源的肽或核酸序列。“充分纯化的”不意味着将人工的或合成的混合物与其它化合物一起排除，也不排除对生物活性不发生干扰的杂质的存在，以及例如因为不完全纯化、稳定剂的加入或配制药学上可接受的制剂而可能存在的杂质。
在此使用的“基本上同源的氨基酸序列”包括与参照抗体链的氨基酸序列至少具有大约95％同源性，优选地至少有大约96％同源性，更优选地至少有大约97％同源性，甚至更优选地至少有大约98％同源性，以及最优地至少具有大约99％或更高同源性的氨基酸序列。氨基酸序列的相似性或等同性可以通过采用BLASTP和TBLASTN程序计算，这些程序采用BLAST(基本局部相似性比对搜索工具)2.0.14运算法则。用于这些程序的默认设置适用于为本发明目的而识别充分相似的氨基酸序列。
“基本上同源核酸序列”指与参照核酸序列对应的核酸序列，其中对应序列编码的肽与参照核酸序列编码的肽具有基本上相同的结构和功能；例如，仅有不会显著影响肽功能的氨基酸发生改变的情况下。优选地，充分相似的核酸序列编码由参照核酸序列编码的肽。充分相似的核酸序列和参照核酸序列之间的等同性的百分比为至少大约50％、65％、75％、85％、95％、99％或更高。核酸序列的充分相似性可以通过比较两序列的序列等同性确定，例如通过物理/化学方法(即杂交法)或通过计算机算法的序列相似性比对。确定核苷酸序列和参照核苷酸序列充分相似的合适的核酸杂交条件为50℃的7％十二烷基磺酸钠SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA，并于50℃用2X标准柠檬酸钠(SSC)、0.1％SDS洗涤；优选地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中并于50℃用1X SSC、0.1％SDS洗涤；优选地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中并于50℃用0.5X SSC、0.1％SDS洗涤；以及更优选地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中并于65℃用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。合适的用于确定两核酸序列之间充分相似性的计算机算法包括GCS程序包(Devereux等，1984 Nucl.Acids Res.12387)以及BLASTN或FASTA程序(Altschul等，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990 87145509-13；Altschul等，J.Mol.Biol.1990 2153403-10；Altschul等，1997 NucleicAcids Res.253389-3402)。这些程序提供的默认设置适于为本发明目的确定核酸序列间的充分相似性。
在此使用的术语“治疗(动词)”或“治疗(名词)”指进行狂犬病毒中和抗体或化合物的给药以降低经受狂犬病毒感染的效应或症状的频率，减轻症状的严重性，或防止效应或症状的发生。
具体实施例方式
在本发明的实践中，通过对需要治疗的受试者进行重组狂犬病毒中和人抗体的给药对狂犬病毒感染进行了治疗或预防。重组狂犬病毒中和人抗体与各种狂犬病毒株的糖蛋白特异性的结合。使用两种或多种不同抗体的暴露后治疗可以在进入位点中和狂犬病毒并能防止病毒扩散进中枢神经系统(CNS)。因为病毒复制几乎专门地限制在神经细胞中，用本发明的抗体在病毒进入CNS前中和及清除病毒是有效的暴露后预防。
在本发明的实践中，用重组狂犬病毒中和人抗体混合物的暴露后预防治疗对狂犬病毒相关紊乱进行治疗。该治疗获得安全的水平以及重复了HRIG的保护活性。
在一个具体实施方案中，用两种或多种不同的重组狂犬病毒中和人抗体对受试者给药。重组狂犬病毒中和人抗体不必以单一组合物给药。例如，各不同的重组狂犬病毒中和人抗体可以通过分离的组合物给药，或重组狂犬病毒中和人抗体以含有两种或多种重组狂犬病毒中和人抗体的组合物形式一同给药。另一方面，将三种或更多种不同的重组狂犬病毒中和人抗体给予受试者。
在本发明的一个具体实施方案中，通过至少两种不同的重组狂犬病毒中和人抗体的给药，在暴露于狂犬病毒的受试者体内防止了狂犬病毒感染、或狂犬病临床症状的发展。在本发明的另一个具体实施方案中，通过至少两种不同重组狂犬病毒中和人抗体的给药，在存在暴露于狂犬病毒的风险的受试者体内预防了狂犬病毒的感染。
被选择用于给药的人抗体混合物优选地应当1)是IgG同型抗体；2)中和多于一种狂犬病毒株，优选地为数种及其它狂犬病毒；以及3)其抗原决定簇识别专一性存在差异，以防止中和一抗性变体的逃脱(WHO consultation on a monoclonal antibody cocktail for rabies postexposure treatment，WHO，2002年5月23-24日)。
在本发明的一个具体实施方案中，重组狂犬病毒中和人抗体衍生自杂交瘤JA、JB和J57的单克隆抗体。重组狂犬病毒中和人抗体分别命名为“SOJA”、“SOJB”和“SO57”。各人抗体中和多于一种狂大病毒株1)人单克隆抗体SO57中和RV固定毒株(例如Pitman-Moore、标准攻击毒株[CVS]以及Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)和街毒株(例如狗RV4[DRV-4]和银毛蝠狂犬病毒18[SHBRV-18])(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90)；2)人单克隆抗体SOJB中和欧洲蝙蝠病毒2(EBV-2)；以及3)人单克隆抗体SOJA中和EBV-2、Lagos蝙蝠病毒和Mokola病毒(Champion等，J.Immunol.Methods 2000 23581-90；Hanlon等，Vaccine 2001 193834-42)。这表明这三种人单克隆抗体识别不同的抗原决定簇。
单克隆抗体SOJA包括含有氨基酸序列SEQ ID NO2(Genbank进入号AAO17825)的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID NO1(Genbank进入号AAO17823)的重链。单克隆抗体SOJB包括含有氨基酸序列SEQ ID NO6(Genbank进入号AAO17826)的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID NO4(Genbank进入号AAO17822)的重链。单克隆抗体SO57包括含有氨基酸序列SEQ ID NO7(Genbank进入号AAO17824)的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID NO9(Genbank进入号AAO17821)的重链。
单克隆抗体SOJA的轻链由含有核酸序列SEQ ID NO10(Genbank进入号AY172961)的核酸编码且重链由含有核酸序列SEQ ID NO11(Genbank进入号AY172959)的核酸编码。单克隆抗体SOJB的轻链由含有核酸序列SEQ ID NO5(Genbank进入号AY172962)的核酸编码且重链由含有核酸序列SEQ ID NO3(Genbank进入号AY172958)的核酸编码。单克隆抗体SO57的轻链由含有核酸序列SEQ ID NO12(Genbank进入号AY172960)的核酸编码且重链由含有核酸序列SEQID NO8(Genbank进入号AY172957)的核酸编码。
在本发明的一个具体实施方案中，使用的重组狂犬病毒中和人抗体轻链或抗体重链是与参照抗体轻链或抗体重链的氨基酸序列具有实质的序列同源性或等同性的抗体轻链或抗体重链。参照氨基酸序列是SEQ ID NOs1、2、4、6、7和9。基本上同源的氨基酸序列指与参照肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多氨基酸序列等同性或相似性的肽或肽的部分。
多于一个核酸序列能编码特定的氨基酸序列。因此，多于一个核酸序列能编码一抗体轻链且多于一个核酸序列能编码一抗体重链。由于在某些情况下核苷酸可以在不造成初始编码氨基酸序列改变的情况下由其它核苷酸取代，简并序列可以在遗传密码意义内简并。
在一个优选具体实施方案中，给药的不同重组狂犬病毒中和人抗体是SOJA、SOJB和SO57。重组SOJA和SO57 IgG1抗体是IgG1抗体，而SOJB是IgG3抗体。
根据一些具体实施方案，重组抗体是单链抗体，其中重链可变区域和轻链可变区域由一间隔基团(spacer group)优选地为肽连接。单链重组抗体可进一步包含效应分子和/或信号序列，这些序列促进制备抗体的宿主细胞对抗体的加工。
在一个具体实施方案中，重组狂犬病毒中和人抗体通过重组DNA技术制备，该技术包括在允许重组抗体表达的条件下培养转化后的宿主细胞并分离抗体。
一方面，通过培养宿主细胞制备重组狂犬病毒中和人抗体，该宿主细胞已被转化了含有表达框的杂交载体。该表达框含有启动子和编码重组抗体的核酸序列。另一方面，启动子与编码信号肽的第一核酸序列连接，该序列在合适的阅读框内与编码重组抗体的第二核酸序列连接。启动子控制表达。随后分离重组狂犬病毒中和人抗体。
通过体外制备技术可以获得相对纯的抗体制剂，该技术可以使制备扩大以产生大量的需要的抗体。本领域已知细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞培养技术，包括均匀悬浮式培养，例如在气举式反应器或连续搅拌反应器内，或固定或截留细胞培养，例如在中空纤维、微囊体内、在琼脂糖微粒或陶瓷芯上。
可通过本领域技术人员已知的其它技术制备抗体，包括例如标准重组核酸技术和化学合成技术。
随后根据实施例中说明的分析方法以及本领域技术人员已知的方法可对纯化后抗体的生物学活性进行分析。
在一个具体实施方案中，包含核酸的杂交载体可用于制备抗体，该核酸进一步地包含编码重组狂犬病毒中和人抗体的核酸序列。选择性地，杂交载体包含复制原点或自主复制序列、一个或多个显性标记序列、表达控制序列、信号序列和附加的限制性酶切位点。
编码抗体轻链、抗体重链或两者的重组表达载体系统可以与相容宿主细胞一起行使两项功能。一项功能是促进编码抗体链的核酸的克隆，即制备可利用量的核酸(克隆载体)。另一项功能是通过保持为染色体外遗传因子或整合进宿主染色体在合适的宿主内进行重组基因构建体的复制和表达(表达载体)。克隆载体包括上述的重组核酸构建体、复制原点或自主复制序列、显性标记序列和选择性地，信号序列和附加的限制性酶切位点。表达载体还包含重组核酸转录和翻译所必需的表达控制序列，由此制备重组狂犬病毒中和人抗体。
使用重组技术，可以构建高水平表达(大约60pg/细胞)狂犬病毒中和人抗体的狂犬病毒载体(Morimoto等，J.Neurovirol.6373-812000；Morimoto等，J.Immunol.Methods 252199-206 2001；Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-3549 2000)。
在一个具体实施方案中，重组人抗体由棒状病毒(RhV)表达系统制备，该系统从疫苗株狂犬病毒载体表达系统制备。制备狂犬病毒中和人抗体的RhV表达系统具有以下特征1)因为本发明的RhV表达系统不会引起细胞病变，受感染细胞可以长时间(＞2周)连续制备抗体，该状况实现了经济有效的单克隆抗体制备；2)多种哺乳动物细胞培养物易受到重组RhV表达系统的感染，因此已被批准用作疫苗或抗体制备的细胞系(例如Vero非洲绿猴细胞和CHO细胞)可用于RhV对单克隆抗体的制备；以及3)使用UV照射或不改变抗体活性的化学试剂(例如非离子去污剂或乙醇)可以轻易地破坏RhV。此外，可以修饰RhV使其含有疱疹性口炎病毒糖蛋白(G)蛋白基因，而不是携有负责RV病原性的主要决定子的狂犬病毒G基因(Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 973544-49；Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983 8070-4)。因此，制备狂犬病毒中和人抗体的重组棒状病毒表达系统仅呈现有限的生物安全顾虑。
编码人抗体重链和轻链肽的重链和轻链抗体序列可被插入重组棒状病毒表达系统中糖蛋白基因和聚合酶基因之间经修饰的位点(Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-3549 2000)。此外，该重组棒状病毒表达系统能感染各种哺乳动物细胞系且不是溶细胞的，由此允许使用常规用于制备狂犬病疫苗的细胞培养技术(Morimoto等，J.Neurovirol.6373-81 2000；Morimoto等，J.Immunol.Methods 252199-206 2001；Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-35492000)。
在一个具体实施方案中，通过构建含有外源的如来自猿猴病毒40(SV 40)或其它病毒源的复制原点的载体或通过宿主细胞的染色体机制提供复制原点或自主复制序列。
在另一个具体实施方案中，载体中的选择标记实现了对含有载体的宿主细胞的选择。选择标记包括赋予重金属如铜或抗生素如Geneticin(G-418)或潮霉素抗性的基因或弥补宿主细胞遗传缺陷如缺乏胸苷激酶、次黄嘌呤磷酰基转移酶、二氢叶酸还原酶等的基因。
在一些具体实施方案中，重组抗体的分泌被定向。例如信号序列可以是前序列或引导重组抗体分泌的分泌前导序列、剪切信号等。引导重组抗体分泌的信号序列的例子为衍生自ompA基因、pelB基因(果胶酸酯裂解酶)基因或phoA基因的序列。
抗体序列的转录由启动子和转录起始和终止以及稳定mRNA所必需的序列调节，以及选择性地，由增强子和进一步的调节序列调节。根据宿主细胞的性质可以使用多种启动子序列。强启动子且同时被很好调节的启动子是最有用的。例如翻译起始序列是Shine-Dalgarno序列。转录起始和终止以及稳定mRNA所必需的序列通常分别来自病毒或真核cDNA例如表达宿主的非编码5’-区域和3’-区域。增强子是源自病毒的转录激活DNA序列，例如来自猿猴病毒、多瘤病毒、牛乳突淋瘤病毒或莫氏(Moloney)肉瘤病毒的，或源自基因组的，特别是鼠的。
载体的各种核酸片段可操作地连接，即这些片段相邻并相互形成具有功能的关系。适用于在E.coli菌株中复制和表达的载体的实施例是噬菌体例如λ噬菌体的衍生物、或质粒例如特别是质粒ColE1及其衍生质粒例如pMB9、pSF2124、pBR317或pBR322以及衍生自pBR322的质粒例如pUC9、pUCK0、pHRil48和pLc24。合适的载体包含完整的复制子、标记基因、限制性核酸内切酶识别序列，因此外源DNA以及如果合适，表达控制序列以及选择性的信号序列和增强子可被插入这些位点。
例如微生物启动子是由温度敏感抑制子控制的噬菌体λ的强左向启动子PL。同样合适的还有E.coli启动子例如由lac抑制子调节并由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的lac(乳糖)启动子，由trp抑制子调节并由例如色氨酸饥饿诱导的trp(色氨酸)启动子，以及由lac抑制子调节的tac(杂交trp-lac启动子)。
多种载体也适于在酵母中的复制和表达且载体含有酵母复制起点和酵母的选择性遗传标记。这些载体中的一组包含所谓ars序列(自主复制序列)作为复制原点。这些载体在转化后在酵母细胞内保持在染色体外且自主复制。此外，可以使用含有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)全部或部分2μm质粒的载体。这些载体将通过重组整合进已经存在于细胞内的2μm质粒，或自主复制。在要实现高的转化频率和高拷贝数目时，2μm序列特别适用。
例如，适于在酵母内表达的表达控制序列是那些高水平表达的酵母基因的表达控制序列。因此，可以使用的启动子有TRP1基因、ADHI或ADHII基因、酸性磷酸酯酶(PHO3或PHO5)基因、异细胞色素(isocytochrome)基因的启动子或糖酵解通路中的启动子，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶基因的启动子。
优选的适于在哺乳动物细胞内复制和表达的载体来自衍生自病毒源DNA的启动序列，例如来自猿猴病毒40(SV40)、鲁斯氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、牛乳突淋瘤病毒(BPV)、乳多空泡病毒(papova-virus)BK突变体(BKV)、棒状病毒、狂犬病毒、或鼠或人细胞巨化病毒(CMV)。可选择地，载体可以包含来自哺乳动物表达产物的启动子，例如肌动蛋白、胶原蛋白、肌浆球蛋白等，或与所需基因序列正常相关的天然启动子和控制序列，即免疫球蛋白H-链或L-链启动子。
其它载体适用于原核和真核宿主且基于病毒复制系统。特别优选的是含有猿猴病毒启动子例如pSVgpt或pSVneo的载体，载体进一步包含增强子，例如与免疫球蛋白基因序列正常相关的增强子，特别是鼠Ig H-或L-链增强子。
可以按照不同的方法获得完整的四聚体轻链和重链抗体。在一个具体实施方案中，抗体轻链和抗体重链在相同的细胞中共表达实现胞内结合和抗体轻链与抗体重链连接形成完整的四聚体轻链和重链抗体。
在一个具体实施方案中，编码抗体轻链的核酸和编码抗体重链的核酸出现在两个相互兼容的表达载体上，其中各核酸受到不同或相同启动子的控制。在该具体实施方案中，表达载体共转化或分别转化。
在本发明的具体实施方案中，用重组弹状表达系统转化宿主细胞，该表达系统含有编码所需重组抗体的抗体轻链和/或抗体重链的核酸序列。因此，一方面，核酸序列能编码单链重组抗体。
合适宿主的实施例为细菌，特别是大肠杆菌菌株例如E.coliX1776、E.coli Y1090、E.coli HB 101、E.coli W3110、E.coli HB101/LM1035、E.coli JA 221、E.coli DH5α、E.coli K12或E.coli CC118菌株，枯草杆菌、嗜热杆菌、假单胞菌、嗜血杆菌、链球菌及其它，以及酵母例如酿酒酵母如酿酒酵母GRF 18。进一步适用的宿主细胞是更高等生物的细胞，特别是已建立的人或动物连续细胞系，例如人胚胎肺纤维原细胞L132、人恶性黑素瘤Bowes细胞、Hela细胞、被SV40病毒转化的非洲绿猴COS-7肾细胞、BHK细胞、BSR细胞、VERO细胞、或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或源自淋巴的细胞，例如淋巴瘤、骨髓瘤、杂交瘤、三体瘤(trioma)或四体瘤(quadroma)细胞，例如PAI、Sp2/0或X63-Ag8.653细胞。
在一个具体实施方案中，制备了转化后的宿主细胞，其中合适的受体宿主细胞被杂交载体转化，且使用本领域已知标准选择转化后的细胞。按照文献中的说明进行微生物的转化，例如对酿酒酵母(A.Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929 1978)、枯草杆菌(Anagnostopoulos等，J.Bacteriol.81741 1961)和大肠杆菌(M.Mandel等，J.Mol.Biol.53159 1970)的转化。
相应地，例如E.coli细胞的转化步骤包括用Ca2+对细胞进行预处理从而允许DNA的摄入以及将细胞与杂交载体培育。随后例如通过将细胞转移至选择性培养基可以实现对转化后细胞的选择，该培养基根据载体DNA的标记序列的性质可以将转化细胞从亲代细胞中分离出来。优选地，使用的培养基不允许不含载体的细胞的生长。例如酵母细胞的转化包含步骤有使用葡糖苷酶酶解去除酵母细胞壁，在聚乙二醇和Ca2+离子存在下用载体处理获得的原生质，以及将原生质埋入琼脂再生细胞壁。优选地，以允许上述转化细胞的再生和选择同时进行的方法制备再生琼脂。
对更高级的真核细胞例如哺乳动物细胞系的转化通过诸如感染或转染的方法实现。使用传统技术进行转染，例如磷酸钙沉淀、微注射、原生质体融合、电穿孔法，即通过能瞬间提高细胞膜通透性的短电脉冲，或在帮助化合物例如二乙氨乙基葡聚糖、二甲亚砜、甘油或聚乙二醇等的存在下引入DNA。在转染步骤之后，通过例如在根据选择标记性质所选择的选择性培养基中培养细胞识别和选择被转染细胞，例如含有相应的抗生素的标准培养基如Dulbecco改良细胞培养基(DMEM)、最低必需培养基、RPMI 1640培养基等。
在一优选具体实施方案中，重组棒状病毒表达系统包括使用核酸感染哺乳动物细胞例如BSR细胞、CHO细胞、VERO细胞和BHK细胞或其它经批准用于抗体制备的细胞，该核酸包含编码抗体轻链或抗体重链或编码两者的核酸序列。细胞可以在允许制备本发明抗体的条件下培养。抗体可以使用本领域已知技术分离和纯化。
用于给药的重组狂犬病毒中和人抗体的抗体轻链或抗体重链可以被其它物质修饰。使用其它物质修饰抗体的方法，特别是标记，是本领域技术人员所熟知的。抗体修饰可以改变抗体活性，例如通过改变其特征诸如体内组织分配、肽的降解速率或狂犬病毒中和活性。修饰还可以赋予化合物额外的特性，例如被观测、操作或定位的能力。
重组狂犬病毒中和人抗体可用聚合和大分子结构(例如脂质体、沸石、树枝状聚合物、磁性微粒以及金属珠)或靶基团(例如信号肽序列、配体、外源凝集素或抗体)加以修饰。修饰物可以例如通过化学方法(例如通过共价键、静电作用、范德华力、氢键、离子键、螯合作用等)或通过物理包埋与链相结合。例如抗体可以用标记物修饰(例如具有磁共振活性的物质；辐射密度物质；荧光物质；放射性物质；超声可探测物质；可见、红外或紫外光可探测物质)。合适的标记物包括例如异硫氰酸荧光素、肽发色团如藻红蛋白或藻蓝蛋白等；生物发光肽如源自北美萤火虫(Photinus pyrali)的荧光素酶；或源自海肾(Renilla reniformi)的荧光蛋白。
本发明的一方面，抗体可以包含天冬氨酸(D)残基以提高抗体的溶解度。另一方面，可以通过添加加合物如蔗糖或聚乙二醇以延长抗体寿命。
本领域技术人员在考虑到受试者的身材和体重、疾病渗透程度、受试者年龄、健康状况和性别、给药途径、以及给药是局部的还是系统的等因素后可以容易地确定对受试者给药的重组狂犬病毒中和人抗体的有效量。一般地，对受试者的抗体给药量依赖于需要被中和的狂犬病毒的量和抗体呈现的狂犬病毒中和活性量。本领域技术人员可以推导出给药的合适剂量和计划以适应特定情况和受试者的需要。例如，根据受试者暴露的狂犬病毒量或受试者存在暴露风险的狂犬病毒量可以估计用于共同给药的各抗体的合适剂量。典型地，抗体剂量在大约0.001mg/kg和大约100mg/kg体重之间。在某些特定具体实施方案中，剂量在大约0.01mg/kg和大约60mg/kg体重之间。
应当明白有效量将依赖于受药者的年龄、性别、健康状况和体重，同期治疗的种类，如果有的话，治疗的频率以及需要实现的效应性质。最优选的剂量将根据受试者个体裁定，本领域技术人员在没有不当实验的情况下可以理解和确定该剂量。
重组狂犬病毒中和人抗体的混合物可以等摩尔浓度对需要该治疗的受试者给药。在另一个实施例中，抗体可以非等摩尔浓度给药。在其它实施例中，抗体可以相对于每千克体重的等质量蛋白给药。例如，抗体可以根据受试者的体重等量给药。在另一个实施例中，抗体可以非等量给药。在其它实施例中，各抗体的给药量可以根据抗体的中和活性。例如，给药的混合物的狂犬病毒中和活性可在大约1IU/kg体重和大约50IU/kg体重之间。
一般地，狂犬病毒中和人抗体混合物给药的计划和时间根据所进行步骤可接受的操作确定。
当在体内使用时，抗体优选地作为药物组合物给药，该组合物包含一种混合物和一种药学上可接受的载体。药物组合物中存在的抗体量可以在0.001至99.9wt％，更优选地在大约0.01至99.0wt％，以及甚至更优选地在0.1至50wt％。为了实现好的血浆浓度，抗体或抗体的混合物例如可作为含有0.1至1.0％活性试剂的溶液通过静脉注射给药。
所有不同的重组狂犬病毒中和人抗体的给药不必在单个组合物中一同给药。不同的重组狂犬病毒中和人抗体可以在分开的组合物中给药。例如，如果对三种不同抗体给药，三种不同抗体可以三种在分开的组合物中给药。此外，各抗体可以同时给药，或抗体可以依次连续给药。这样，重组狂犬病毒中和人抗体混合物可以以单个组合物给药，或以包含一种或多种重组狂犬病毒中和人抗体的多种组合物给药。
重组狂犬病毒中和人抗体和包含这些化合物的药物组合物可以通过经设计可使化合物具有生理学效应的任何方法给药。可以以肠道或非肠道给药；例如口服、直肠、潴泡内(intracistemally)、阴道内、腹腔内、局部(例如粉剂、软膏或滴液)给药。肠道内给药为优选。特别优选的肠道内给药方法包括血管内给药(例如静脉内高剂量注射、静脉灌注、动脉内高剂量注射、动脉灌注和用滴药导管滴入脉管系统)、靶组织周边和靶组织内注射、皮下注射或沉积包括皮下灌注(例如通过渗透泵)、肌肉内注射、腹腔内注射以及例如通过导管或其它放置装置直接应用在靶区域。
药学上可接受的载体包括生理学上可容忍或可接受的稀释剂、赋形剂、溶剂或佐剂。组合物优选地是无菌的和非致热性的。合适载体的实施例包括但不限于水、常规盐、右旋糖、甘露醇、乳糖或其它糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸、乙醇、多羟基化合物(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(例如橄榄油)、可注射有机酯例如油酸乙酯、乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇及山梨醇酐酯、微晶纤维素、甲羟基铝(aluminum methahydroxide)、膨润土、高岭土、琼脂以及黄蓍胶或这些物质的混合物等。
药物组合物还可以包含少量的无毒辅助药物或赋形剂以及/或添加剂，例如润湿剂、乳化剂、pH缓冲试剂、抗菌和抗真菌试剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)。合适的添加剂包括但不限于生理学上生物相容的缓冲液(例如氨基丁三醇盐酸)、螯合剂(例如DTPA或DPTA双酰胺)或钙螯合络合物(例如钙-DPTA或钙钠DPTA双酰胺)的加入(例如0.01至10摩尔百分比)或选择性地加入(例如1至50摩尔百分比)钙或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)。如果需要，可以使用吸收增强或延缓试剂(例如脂质体、单硬脂酸铝或凝胶)。组合物可以制备成传统形式，抑或是液体溶液或悬浮剂、在注射前适于形成溶液或悬浮剂的固体形式或乳剂。肌肉内、腹腔内、皮下或静脉内组合物是例如等渗水溶液或悬浮剂，选择性地在使用之前不久从冻干或浓缩制剂制备。油悬浮剂包含作为油性成分的常规用于注射的蔬菜、合成或半合成油。药物化合物可以是无菌的且含有例如用于保存、稳定、润湿、乳化或溶解成分的添加剂、调节渗透压的盐、调节粘度的缓冲液和/或化合物，例如羧基纤维素钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮或凝胶。根据本发明的药物化合物可以以本领域熟知的技术方式制备。
在抗体通过注射或直接使用进行给药时，注射或直接使用可以是一剂或多剂。在化合物的给药是通过灌注时，灌注可以是在延长的时间区间内的单剂持续剂或多次灌注。
本发明不应被理解为仅限于在此说明的实验和方法，而应理解为也包括其它实验和分析。本领域的技术人员将明白其它的实验和方法可用于实现在此说明的步骤。
没有进一步的说明，应当相信本领域的普通技术人员通过使用之前的说明和之后的说明性实施例能够制备和利用重组狂犬病毒中和人抗体并操作权利要求的方法。因此以下的操作实施例特别指出了本发明的优选实施方案，但不应理解为以任何方式对公开的其它内容的限制。
实施例1-抗狂犬病毒重组表达人抗体(rhuMAbs)的制备和病毒中和活性抗体cDNA的制备三个杂交瘤，JA、JB和J57分泌命名为“SOJA”、“SOJB”和“SO57”的人单克隆抗体。这些单克隆抗体的生成和分析的具体细节在其它地方已被报道(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90；Champion等，J.Immunol.Methods 2000 23581-90)。从JA、JB和J57杂交瘤中分离免疫球蛋白重链(Ig H)和免疫球蛋白轻链(Ig L)mRNA，使用棒状病毒载体(RhV)在BSR或CHO细胞中高水平表达抗体。
为获得Ig H和Ig L mRNA的完整核酸序列，根据生产商的建议，使用Tri-Reagent手册(Sigma)和RNeasy RNA提取试剂盒(Qiagen)从各杂交瘤细胞系中分离总RNA。
使用cDNA末端快速扩增试剂盒(GIBCO-BRL)和Ig H和Ig L基因恒定区3’端的基因专一性引物(GSPs)扩增Ig L和Ig H cDNA片段。简言之，使用ThermoScript反转录酶(Life Technology)和GSP在55℃对2.5μg总RNA反转录60分钟。随后用核糖核酸酶H降解mRNA，且使用GlassMAX离心管(spin cartridges)纯化cDNA。在用脱氧核苷末端转移酶和dCTP在cDNA上加上dC尾巴后，用精简锚定引物(GIBCO-BRL)和第二GSP对cDNA进行PCR扩增以获得巢式产物。使用第三GSP对PCR产物再扩增，并用凝胶电泳纯化产物并测序。作为最后一步，用DNASTAR软件(DNAstar)和国家生物技术信息中心的网站工具对序列进行分析。
为克隆全长的Ig H和Ig L cDNAs，使用10pmol寡dT引物、200单位Superscript II以及20单位核糖核酸酶抑制剂在含有第一链缓冲液、200μM dNTP和10mM二硫苏糖醇的40μl的反应体系中对1μg的总RNA进行反转录。随后使用Expand高保真PCR系统(Roche)和10pmol与Ig L和Ig H cDNAs的5’端和3’端互补的引物对5μl反转录反应物进行扩增。
对克隆的Ig cDNAs进行测序且GenBank的进入号如下SOJA IgL，AY172961(SEQ ID NO10)；SOJA Ig H，AY172959(SEQ ID NO11)；SOJB Ig L，AY172962(SEQ ID NO5)；SOJB Ig H，AY172958(SEQ ID NO3)；SO57 Ig L，AY172960(SEQ ID NO12)；以及SO57 Ig H，AY172957(SEQ ID NO8)。为了基因组装，使用对应于cDNAs的5’端(JAHF，5′-AAACGTACGATGGAGTTTGGG-CTGAGCTGGCTT-3′(SEQ ID NO13)；JBHF，5′-AACGTACGA-TGGACACACTTTGCTCCACGCTCCT-3′(SEQ ID NO14)；以及J57HF，5′-AAACGTACGACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCT-3′(SEQ ID NO15))的引物以及与各Ig H cDNAs的3’端互补和与由狂犬病毒转录中止/起始信号组成的连接序列互补的HR引物5′-GCTAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGACTCATTTACCCGGGGACAGGG A-3′(SEQ ID NO16)对JA、JB和J57 Ig H的cDNAs进行扩增(Morimoto等，J.Immunol.Methods 2001 252199-206)。
使用LF引物以及cDNAs的3’端引物(JALR，5′-AAAGCTAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3′(SEQ IDNO18)；JBLR，5′-AAAGCTAGCCTATGAACATTCTGTAGGGGCCA-CTGT-3′(SEQ ID NO19)以及J57LR，5′-AAATCTAGACTATGAACA-TTCTGTAGGGGCCAC-3′(SEQ ID NO20))对Ig L的cDNA进行再扩增，LF引物包含连接区域和对不同轻链cDNAs的5’端的具有专一性的区域(5′-GGTAAATGAGTCATGAAAAAAACTAACACCCC-TAGCNNNNNNNNNN NNNNNNNNNN-3′(SEQ ID NO17)，其中N是cDNA轻链的5’端)。
重组棒状病毒载体的构建使用前述的狂犬病毒载体制备重组棒状病毒载体(RhV)(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 20009714680-14685)。狂犬病毒糖蛋白基因(GenBank进入号NP 056796)的膜外和跨膜结构域(GenBank进入号NC 001542)由疱疹性口炎病毒糖蛋白基因(VSV G)(GenBank进入号J02428)的膜外和跨膜结构域取代(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-14685；Schnell等，J.Virology 1996 702318-2323；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 924477-4481)，在载体中生成嵌合的糖蛋白基因。生成的质粒命名为pSN-VSV-G。
狂犬病毒糖蛋白基因带有负责狂犬病毒的病原性的主要决定子(Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983 8070-74)。通过使用疱疹性口炎病毒糖蛋白基因膜外和跨膜序列替换狂犬病毒糖蛋白基因膜外和跨膜序列，形成了只存在有限的生物安全顾虑的重组棒状病毒表达系统。
为构建pSN-VSV-G载体，狂犬病毒G的胞质尾巴从pSN用引物RP8，5′-CCTCTAGATTACAGTCTGGTCTCACCCCC-3′(XbaI，粗体)(SEQ ID NO21)和RP29，5′-CCCGGGTTAACAGAAGA-GTCAATCGATCAGAAC-3′(HpaI，粗体)(SEQ ID NO22)PCR扩增(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-14685)。VSV G基因的膜外和跨膜结构域(GenBank进入号J02428)用引物RP33，5′-TTAAGTTAACCAAGAATAGTCCAATGA-3′(HpaI，粗体)(SEQ ID NO23)和RP34，5′-TCTCGAGCCCGGGACTATGAAGTGCCTT-TTGTAC-3′(XbaI，粗体)(SEQ ID NO24)从pVSV-XN1扩增(Schnell等，J.Virology 1996702318-2323)。两PCR产物均用HpaI酶切并连接。连接产物用引物RP8和RP34再次扩增，且将PCR产物克隆进pSN的XmaI和XbaI位点。生成的质粒命名为pSV-VSV-G(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-1468)。
进一步修饰上述质粒pSN-VSV-G(此后称作pSPBN)从而允许插入和表达包含编码抗体轻链序列、重链序列或两者的核酸。使用PCR策略在糖蛋白(G)基因和聚合酶(L)基因之间引入BsiWI和NheI位点对质粒进行修饰(见例如Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 20009714680-1468和Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 973544-3549)。生成的重组棒状病毒载体被称作RhV。
包含轻链和重链核酶序列的质粒和重组病毒的制备通过PCR连接以上制备的Ig H和Ig L的cDNAs，且用BsiWI和NheI酶切生成的Ig L+连接子+Ig H cDNA并插入上述质粒pSPNB的相应位点。插入三种不同的Ig L+Ig H cDNAs，生成质粒pSPBN-SOJA、pSPBN-SOJB以及pSPBN-SO57。
通过哺乳动物细胞制备抗体由上述质粒产生的重组病毒按别处说明的方法(Morimoto等，J.Neurovirol.20006373-81)回收并用于以0.1MOI感染幼仓鼠肾(BHK)细胞的亚克隆BSR细胞或感染CHO细胞。在感染后，用Cellgro-FREE培养基(Mediatech)在34℃培养细胞。在培养3天后，收集组织培养上清并进行UV照射将病毒灭活。
表1证实了由受感染BSR细胞分泌至组织培养上清液中的三种不同重组表达人抗体的量。可以看出由包含编码SOJA、SOJB或SO57抗体的核酸的重组病毒感染的各BSR细胞以大约40μg/ml/48小时的速率生成重组人抗体。BSR细胞或CHO细胞的感染导致高水平的制备(≤40μg/ml/48小时)。
表1 抗狂犬病毒重组表达人单克隆抗体(rhuMAbs)的制备和病毒中和活性

注“CVS”是标准攻击毒株；“DRV-4”是狗狂犬病毒4；“HRIG”是人狂犬病免疫球蛋白；“SHBRV-18”银毛蝠狂犬病毒。
a在测试前，将纯化的rhuMAbs和rhuMAb混合物(SOJA∶SOJB∶SO57蛋白质比例1∶1∶1)调节至1mg/ml的蛋白浓度。
bHRIG按生产商制备的进行使用(150IU/ml；Bayer)。
亲和层析对抗体的纯化随后从培养上清中纯化出分泌至组织培养基中的各重组人抗体且将各样品校准并调整至相同的蛋白含量。
使用蛋白A柱(蛋白A琼脂糖凝胶，Amersham Pharmacia Biotech)纯化IgG1抗体。简言之，经过0.45μm膜过滤使上清澄清并用1N NaOH将pH调整至8.0。上清以大约100cm/小时的线性流速经过柱体。用PBS(pH 8)洗涤后，用0.1M柠檬酸溶液将抗体从柱上洗脱并对PBS进行透析。
IgG3抗体用蛋白G柱(蛋白G琼脂糖凝胶，Amersham PharmaciaBiotech)纯化。含有IgG3的上清通过0.45μm膜过滤澄清且用1N NaOH将pH调至7.0。上清以大约11cm/小时的线性流速流经柱体。在用PBS洗涤后，用0.1M甘氨酸缓冲液，pH 3.0将抗体从柱上洗脱并随后对PBS进行透析。
透析后的抗体制剂的蛋白浓度用以下蛋白质检测实验确定(Bio-Rad Laboratories，Hercules CA)。将100μl样品加入5ml染料浓缩剂的1/5稀释液并在室温放置10分钟。在各试验中包括阴性PBS对照和各种牛血清白蛋白(BSA)标准。在放置后，用分光光度计在595nm对样品读数。测试样品的蛋白浓度参考BSA标准的吸收值计算。所有抗体制剂的纯度用还原条件下的12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定。纯化后的抗体在SDS-PAGE上出现两条主带，对应于分离出的免疫球蛋白重链和轻链。
病毒中和活性由包含重组狂犬病毒中和人抗体的重组棒状病毒表达系统感染的哺乳动物细胞产生的病毒中和活性量由快速荧光聚焦抑制实验(RFFIT)确定(Morimoto等，J.Immunol.Methods 2001 252199-206)。确定病毒滴度降低是否为真的一种方法是当病毒滴度降低＞100个感染单位实现的时候(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-3090)。此外，病毒中和抗体(VNA)滴度可以以国家健康研究所的参考血清作为标准用国际单位表达。中和活性典型地表达为单位每克蛋白或单位每毫升。用于病毒中和的狂犬病毒株在别处有所说明(Dietzschold等，J.Hum.Virol.2000 350-7；Morimoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998953152-6)。用RFFIT分析各转化细胞系的上清样品中狂犬病毒中和抗体的存在。在96孔平底板(Nunc)中稀释上清样品(50μl)。在各测试样品中加入已知能造成指示细胞80-90％感染的狂犬病毒稀释液，将板在37℃培养1小时。在各实验中包括了阴性培养基和阳性狂犬病免疫血清对照样品。在培养后，在各孔中加入30μl浓度为1.8×106细胞/ml的BHK细胞并在37℃将培养物过夜培养。随后用冰冷的PBS将板洗涤一次并用冰冷的90％丙酮在-20℃固定20分钟。在固定后，去除丙酮将板风干。为检测受感染的BHK细胞，将40μl FITC抗狂犬病核蛋白单克隆球蛋白(Centocor，Malvern PA)在37℃加入各孔45分钟。随后用蒸馏水将板洗涤3次并在荧光显微镜下检测。
对已从培养物上清中纯化出的各重组人抗体测试它们中和狂犬病毒固定株(例如CVS-N2c和CVS-11)和街毒株(例如SHBRV-18和DRV-4)的能力。如同快速荧光聚焦抑制实验所测试的，三种重组人抗体在中和不同狂犬病毒的能力上呈现出质和量上的差异(表1)。此外，通过含有等摩尔浓度的三种重组人抗体的混合物获得的狂犬病毒株的病毒中和抗体(VNA)滴度相对率与从HRIG获得的相似，除了抗SHBRV-18 HRIG VNA滴度略高之外。
实施例2 用抗狂犬病人单克隆抗体混合物对小鼠的暴露后预防为确定SOJA、SOJB和SO57的重组人抗体混合物在体内的保护活性，用10LD50狂犬病毒CVS-N2c鼻腔内感染雌性Swiss Webster小鼠(10只/组)。1小时后，小鼠接受混合物或HRIG的单次治疗。各治疗后小组接受含有不同活性的混合物。制备的混合物中SOJA∶SOJB∶SO57蛋白比例为1∶1∶1。各抗体或抗体混合物的活性以国际单位(IU)表示。通过对WHO标准抗血清的滴定确定抗体的IU。小鼠接受的混合物的范围在0-20IU/kg体重之间。随后对小鼠进行5周观察确定它们是否发展了狂犬病的临床症状。计算接受SOJA∶SOJB∶SO57混合物治疗的动物和接受HRIG治疗的动物的治疗有效量，在该剂量50％动物受到保护避免致命攻击(ED50)。
如果狂犬病的临床症状变得明显，用CO2中毒对小鼠实施安乐死。在疑似患有狂犬病的动物脑组织印模上进行直接荧光抗体实验对狂犬病的诊断进行确认。
用重组狂犬病毒中和人抗体混合物进行的暴露后预防治疗在体内预防了致命的狂犬病毒感染(表2)。此外，发现人抗体混合物的保护活性与HRIG的保护活性相当(表2)。在使用20IU/kg时混合物保护了10只小鼠中的8只没有发展狂犬病的临床症状，但在2.5IU/kg的浓度下，没有任何小鼠受保护未发展狂犬病临床症状。小鼠发展狂犬病症状的ED50剂量是3.38IU/kg的HRIG和4.47IU/kg的rhuMAB混合物。
表2.用人狂犬病毒免疫球蛋白(HRIG)和抗狂犬病重组表达人单克隆抗体(rhuMAB)混合物进行小鼠的暴露后预防

aHRIG或混合物的给药量。bSOJA∶SOJB∶SO57蛋白比例1∶1∶1。数据表示为出现狂犬病临床症状的小鼠数目/测试小鼠数目。
实施例3-用重组抗狂犬病人单克隆抗体混合物进行仓鼠的暴露后预防在仓鼠暴露后预防模型中进一步检测重组人抗体混合物的功效。
用50μl取自天然感染狂犬病的山狼的唾液腺组织匀浆攻击2月大(100克；10只/组)的雌性叙利亚仓鼠(Harlan-Sprague-Dawley)。在左腓肠肌对动物进行接种。在用狂犬病毒接种4小时后，在10只仓鼠中起始含有20IU/kg rhuMAb混合物(如实施例2中所述)的暴露后预防治疗。用50微升抗体制剂在动物接种病毒的相同位点进行一次给药。没有接受暴露后预防治疗混合物的10只仓鼠作为对照动物。
此后，每日观察动物共90天。如果在一只动物中的狂犬病临床症状变得明显，通过CO2中毒对该动物施行安乐死。在安乐死后对狂犬病的诊断进行确认。使用直接荧光抗体实验对狂犬病诊断进行确认，该实验在疑似患有狂犬病的动物脑组织压模上进行。
用SOJA/SOJB/SO57抗体混合物给药的所有10只仓鼠均存活。但是，所有的对照动物均死于狂犬病。使用的病毒剂量含有～106.8MICLD50/ml浓度的犬类RV变体(COSRV)，该变体在美国/墨西哥接壤地区流行，因此成为公共健康的重要关注。预计该剂量在肌肉内接种后导致80-100％的死亡率。
在此引用的各专利、专利申请以及公开物的公开内容由此完整地作为参考加以引用。
尽管参考特定具体实施方案对本发明进行了公开，很明显的，在不悖离本发明的真正精神和范围的基础上本领域的其它技术人员可以实现其它具体实施方案和本发明的变化。所附权利要求书应当被理解为包括所有这些具体实施方案和等同的变化。
序列表<110>托马斯杰斐逊大学(Thomas Jefferson University)<120>重组抗体及组合物及其制备和使用方法<130>EP05-2817-XC20<150>US 10/461,148<151>2003-06-13<160>24<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>474<212>PRT<213>人<400>1Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly His Ser Thr Tyr Leu Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Glu Val Thr Met Ile Val Val Leu Asn115 120 125Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys145 150 155 160Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr165 170 175
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290 295 300Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro305 310 315 320Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr325 330 335Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val340 345 350Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala355 360 365Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg370 375 380Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly385 390 395 400Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro405 410 415Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser420 425 430Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln435 440 445Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His450 455 460Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470 475<210>10<211>705<212>DNA<213>人<400>10atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120ctcgcctgca gggccagtca gactgctagc aggtacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ccagactcct catctatgat acatccaaca gggccactgg catcccagcc 240aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctct ccatcagcag cctggagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtttcaact ggccgtggac gttcggccaa 360gggaccaagg tggaattcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705<210>11
<211>1425<212>DNA<213>人<400>11atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120tgtgcagcct ctggattcac ctttagcaac tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtgctagtg gtcatagcac atatttggca 240gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agatcgagag 360gttactatga tagttgtact taatggaggc tttgactact ggggccaggg aacccgggtc 420accgtctcct ccgcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 480agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 600ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 660ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 780ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 900aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1200cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1320aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aatga 1425<210>12<211>729<212>DNA<213>人<400>12atgagtgtcc ccaccatggc ctgggctctg ctcctcctca gcctcctcac tcagggcaca 60ggatcctggg ctcagtctgc cctgactcag cctcgctcag tgtccgggtc tcctggacag 120tcagtcacca tctcctgcac tggaaccagc agtgatattg gtggttataa ctttgtctcc 180tggtaccaac aacacccagg caaagccccc aaactcatga tttatgatgc cactaagcgg 240ccctcagggg tccctgatcg cttctctggc tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc 300atctctgggc tccaggctga ggatgaggct gattattact gctgctcata tgcaggcgac 360tacaccccgg gcgtggtttt cggcggaggg accaagctga ccgtcctagg tcagcccaag 420gctgccccct cggtcactct gttcccgccc tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc 480
acactggtgt gtctcataag tgacttctac ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca 540gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag accaccacac cctccaaaca aagcaacaac 600aagtacgcgg ccagcagcta cctgagcctg acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc 660tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc accgtggaga agacagtggc ccctacagaa 720tgttcatag 729<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13aaacgtacga tggagtttgg gctgagctgg ctt 33<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14aacgtacgat ggacacactt tgctccacgc tcct 34<210>15<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15aaacgtacga ccatggactg gacctggagg ttcct35<210>16<211>49<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>16tgctaggggt gttagttttt ttcatgactc atttacccgg ggacaggga 49<210>17<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，其中n是轻链cDNAs的5’端<221>misc_feature<222>(1)...(56)<223>n＝A，T，C or G<400>17ggtaaatgag tcatgaaaaa aactaacacc cctagcnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 56<210>18<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18aaagctagcc taacactctc ccctgttgaa gctc 34<210>19<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19aaagctagcc tatgaacatt ctgtaggggc cactgt 36<210>20
<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20aaatctagac tatgaacatt ctgtaggggc cac 33<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21cctctagatt acagtctggt ctcaccccc 29<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>22cccgggttaa cagaagagtc aatcgatcag aac 33<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23ttaagttaac caagaatagt ccaatga 27<210>24
<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24tctcgagccc gggactatga agtgcctttt gtac 3权利要求
1.一种药物组合物，含有药学上可接受的载体和至少两种重组狂犬病毒中和人抗体，其中至少两种抗体中的至少一种选自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQID NO1基本上同源的序列的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQID NO4基本上同源的序列的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQID NO9基本上同源的序列的抗体重链的抗体。
2.如权利要求1所述的药物组合物，包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQID NO1基本上同源的序列的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQID NO4基本上同源的序列的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQID NO9基本上同源的序列的抗体重链的抗体。
3.如权利要求2所述的药物组合物，包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9的抗体重链的抗体。
4.一种在需要治疗的受试者体内治疗或预防狂犬病毒感染的方法，包括以至少两种重组狂犬病毒中和人抗体的有效量对受试者给药，其中至少两种抗体中至少一种选自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQID NO1基本上同源的序列的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQID NO4基本上同源的序列的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQID NO9基本上同源的序列的抗体重链的抗体。
5.如权利要求4所述的方法，其中至少两种重组狂犬病毒中和人抗体呈现出对不同狂犬病毒的中和活性。
6.如权利要求5所述的方法，其中用至少两种不同重组狂犬病毒中和人抗体分别给药。
7.如权利要求5所述的方法，其中用至少三种不同重组狂犬病毒中和人抗体给药。
8.如权利要求4所述的方法，其中重组狂犬病毒中和人抗体包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQID NO1基本上同源的序列的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQID NO4基本上同源的序列的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQID NO9基本上同源的序列的抗体重链的抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其中重组狂犬病毒中和人抗体包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9的抗体重链的抗体。
10.如权利要求5所述的方法，其中重组狂犬病毒中和人抗体以大约等摩尔浓度的混合物给药。
11.如权利要求5所述的方法，其中重组狂犬病毒中和人抗体以大约等重量给药。
12.如权利要求11所述的方法，其中给药的抗体量在大约0.001mg/kg体重至大约100mg/kg体重之间。
13.如权利要求12所述的方法，其中给药的抗体量在大约0.01mg/kg体重至大约60mg/kg体重之间。
14.如权利要求5所述的方法，其中至少三种不同重组狂犬病毒中和人抗体包含大约1IU/kg体重至大约50IU/kg体重之间的狂犬病毒中和活性。
15.如权利要求5所述的方法，其中狂犬病毒是狂犬病毒固定毒株或街毒株。
16.如权利要求15所述的方法，其中狂犬病毒街毒株选自银毛蝠狂犬病毒、山狼狂犬病毒街毒/墨西哥狗狂犬病毒以及狗狂犬病毒。
17.如权利要求16所述的方法，其中银毛蝠狂犬病毒是银毛蝠狂犬病毒-18。
18.如权利要求16所述的方法，其中狗狂犬病毒是狗狂犬病毒-4。
19.如权利要求5所述的方法，其中受试者是人。
20.如权利要求5所述的方法，其中至少两种重组狂犬病毒中和人抗体肠道外给药。
21.如权利要求20所述的方法，其中肠道外给药方式选自血管内给药、组织周边和组织内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮下沉积和皮下灌注。
22.一种重组棒状病毒表达载体，包含(i)编码疱疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列；以及(ii)编码重组狂犬病毒中和人抗体的抗体轻链或抗体重链或抗体轻链和抗体重链两者的核酸序列。
23.如权利要求22所述的重组棒状病毒表达载体，其中载体进一步包含编码启动子序列的核酸序列，所述序列与(i)编码疱疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列；以及(ii)编码重组狂犬病毒中和人抗体的抗体轻链、或抗体重链、或抗体轻链以及抗体重链两者的核酸序列可操作地连接。
24.如权利要求23所述的重组棒状病毒表达载体，其中载体编码抗体轻链，所述抗体轻链选自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链。
25.如权利要求23所述的重组棒状病毒表达载体，其中载体编码抗体重链，所述抗体重链选自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQ ID NO1基本上同源的序列的抗体重链；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQ ID NO4基本上同源的序列的抗体重链；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQ ID NO9基本上同源的序列的抗体重链。
26.一种宿主哺乳动物细胞，包含重组棒状病毒表达载体，所述载体选自如权利要求22、23、24和25所述的重组棒状病毒表达载体。
27.如权利要求26所述的宿主哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞选自BSR细胞、幼仓鼠细胞、VERO细胞和中国仓鼠卵巢细胞。
28.一种在哺乳动物细胞中制备重组狂犬病毒中和人抗体的方法，包含在允许重组狂犬病毒中和人抗体表达的条件下培养如权利要求26所述的细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其中重组狂犬病毒中和人抗体在哺乳动物细胞内制备，所述哺乳动物细胞选自BSR细胞、幼仓鼠细胞、VERO细胞以及中国仓鼠卵巢细胞。
30.至少两种重组狂犬病毒中和人抗体的混合物在制备用于治疗和预防需要治疗的受试者体内的狂犬病毒感染的药物上的应用，其中至少一种抗体选自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQID NO1基本上同源的序列的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQID NO4基本上同源的序列的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQID NO9基本上同源的序列的抗体重链的抗体。
31.如权利要求30所述的抗体混合物的应用，其中至少两种重组狂犬病毒中和人抗体呈现出对不同狂犬病毒的中和活性。
32.如权利要求30所述的抗体混合物的应用，其中混合物包含至少三种不同的重组狂犬病毒中和抗体。
33.如权利要求32所述的抗体混合物的应用，其中抗体包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或与SEQID NO1基本上同源的序列的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或与SEQID NO4基本上同源的序列的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或与SEQID NO9基本上同源的序列的抗体重链的抗体。
34.如权利要求33所述的抗体混合物的应用，其中抗体包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1的抗体重链的抗体；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4的抗体重链的抗体；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7的抗体轻链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9的抗体重链的抗体。
全文摘要
为狂犬病毒中和抗体在对暴露于狂犬病毒的受试者进行暴露后预防治疗中的应用提供了方法和组合物。包含狂犬病毒中和抗体混合物的组合物以及编码这些抗体的核苷酸和氨基酸序列可用于对暴露于狂犬病毒的受试者的治疗。本发明还提供了使用重组表达载体在哺乳动物细胞内制备重组狂犬病毒中和人抗体的方法。
文档编号C12N15/00GK1805757SQ200480016584
公开日2006年7月19日 申请日期2004年6月10日 优先权日2003年6月13日
发明者道格拉斯·C·胡珀, 伯恩哈德·迪奇奥德 申请人:托马斯杰斐逊大学