用于调节cns活性的组合物和方法

专利名称：用于调节cns活性的组合物和方法
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hh基因家族通过基因筛选在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中鉴定出第一个hedgehog基因(Nusslein-Volhard、C.和Wieschaus、E.(1980)Nature287、795-801)。该筛选鉴定许多影响胚胎发育和幼虫发育的突变。在1992和1993年，报道了果蝇hh基因的分子性质(C.F.、Lee等(1992)Cell71、33-50)，从此以后，已经从各种脊椎动物物种分离出几种hedgehog同源物。虽然在果蝇和其它无脊椎动物中仅发现一种hh基因，但在脊椎动物中存在多种hh基因。hh基因的脊椎动物家族包括至少四个成员，即，单个果蝇hh基因的种内同源基因。在PCT公开WO 95/18856和WO 96/17924中描述了示例的hh基因和蛋白。这些成员中的三个，即在本文中称为desert hedgehog(Dhh)、sonic hedgehog(Shh)和indian hedgehog (Ihh)，明显存在于所有脊椎动物中，包括鱼、鸟类和哺乳动物。第四个成员在本文中称为tiggie-winkle hedgehog(Thh)，看起来对于鱼是特异性的。Dhh主要在睾丸中表达，在小鼠胚胎发育和成年啮齿动物和人中都有表达；Ihh参与胚胎发生过程中的骨发育以及成体内的骨形成；而如上文所述的Shh主要参与形态发生和神经诱导活性。各种Hedgehog(Hh)蛋白由一个信号肽、一个高度保守的N末端区以及一个更多样化的C末端结构域组成。除分泌途径中的信号序列切割外，Hh前体蛋白进行依赖于C末端部分保守序列的内部自蛋白水解切割。所述自切割得到19kD的N末端肽和26-28kD的C末端肽，所述N末端肽与合成其的细胞的细胞表面紧密缔合，而所述C末端肽在体内和体外都可自由扩散。生物化学研究已经显示，所述Hh前体蛋白的自切割通过一种内部硫酯中间体进行，所述内部硫酯中间体随后在亲核取代中被切割。有可能所述亲核物质是小亲脂分子，与所述N-肽的C末端共价结合，将其粘连到细胞表面。粘连的结果是在Hh生产细胞的表面产生高局部浓度的N末端Hh肽。所述N末端肽对于果蝇和脊椎动物中的短程和长程Hh信号传递活动是必需而足够的。
Hedgehog在发育和分化中的作用信号传递分子Hh家族的成员介导无脊椎动物和脊椎动物发育过程中许多重要的短程和长程模式化过程。在苍蝇体内，单个hh基因调节体节和成虫盘的模式化，其通过诱导二级信号而诱导长程作用。与此不同，在脊椎动物中，hh基因家族参与控制左右不对称、CNS中的极性、体节和肢、器官发生、软骨发生和精子发生。过去几年已经在脊椎动物中克隆了一些hh基因。在这些基因中，Shh受到了最多的实验关注，因为它在作为模式相邻组织的信号源的不同组构中心中表达。最近的证据表明，Shh参与这些相互作用，在实验室中，在小鼠、大鼠、鸡、和斑马鱼中观察到了这些相互作用。Shh似乎在中枢神经系统(″CNS″)的发育中起重要作用。Hh蛋白家族及其在发育中的作用的详细说明可以参见美国公开No.2003-0139457，在此全文引入其公开内容作为参考。已知与Hh多肽直接相互作用的一种蛋白是由patched基因编码的(Chen、Y.等(1996)Cell 87553)。patched基因最初是在果蝇中鉴定为体节极性基因，即，影响细胞分化的一组发育基因之一。Patched蛋白具有两个大的细胞外结构域、十二个跨膜区段和几个胞质区段。见Hooper、J.E.等(1989)Cell 59751；和Nakano、等(1989)Nature 341508；Johnson、R.L.等(1996)Science 2721668；和Hahn、H.等(1996)Cell 85841。遗传研究和功能研究证明，patched是Hh信号传递级联的一部分，所述Hh信号传递级联是在进化上保守的调节多种下游基因表达的途径。见Perrimon、N.(1995)Cell 80517；和Perrimon、N.(1996)Cell86513。认为Patched与smoothened基因编码的另一种跨膜蛋白一起参与Hh受体复合物。已经克隆了patched的人同源物，并且作图于染色体9q22.3。参见，Johnson，同上；和Hahn，同上。smoothened基因编码跨膜蛋白，所述蛋白位于受体下游，通过该蛋白，将Hh信号传递到细胞内信号。Alcedo、J.等(1996)Cell86(2)22l-232；van den Heuvel、M.等(1996)Nature 382547-551。也在Hh信号传递途径中发现了gli-1、gli-2和gli-3基因编码的蛋白。Gli-1是转录激活因子，Gli-3是转录阻抑因子。Dai、P.等(1999)J.Biol.Chem.2748143-8152。
抑郁根据国家精神健康研究所的报道，每年大约1千9百万美国成人患有一些形式的抑郁，相当于大约十分之一的成人。女性经历抑郁发作的几率是男性的两倍。但是，认为男性的抑郁是被低估的，通常被多种身体主诉掩盖，例如，乏力、疼痛、食欲不良或睡眠障碍。抑郁在美国影响了2.5％的儿童和8.3％的少年。尽管完全发作的抑郁最通常在中年起病，但轻度抑郁或心境恶劣可以在儿童或少年时起病。儿童和少年的抑郁通常与行为问题、焦虑或物质滥用共存。根据美国精神病杂志的研究，单独的年龄因素似乎对抑郁没有任何显著影响。但是，抑郁在老年人中容易被低估。抑郁的症状有时被误认为痴呆，并且，在老年人中普遍认为抑郁的丑陋表现是个人的弱点。缺乏抑郁治疗的医疗保险也可能导致低估。目前已知三类主要的抑郁重性抑郁或单相抑郁；心境恶劣，即持续的低水平抑郁；和双相抑郁，也称作双相情感障碍或躁狂抑郁。另一类称作躁郁性气质，其特征在于躁狂和抑郁状态，但强度和持续时间都不足以使其诊断为双相情感障碍或重性抑郁。重性抑郁持续至少两周，其间患者经历以下抑郁体征中的至少四种有时导致体重减轻或增长的食欲改变；失眠，或不经常出现的嗜睡；谈话和进行其它任务减慢，或相反，不安静和不能静坐；大多数时间精神差或感觉累；感觉无聊或过度的不适当的内疚。心境恶劣是低水平的抑郁，其在成人中持续至少两年，在儿童和少年中持续一年。抑郁的情绪两个月以上不消失，观察到以下症状中的至少两种过度饮食或失去食欲；失眠或嗜睡；精神差或感觉累；不自信；不能集中精神或不能做决定；绝望。双相情感障碍通常包括亢奋或躁狂行为的一次或多次发作。其通常包括抑郁发作。在躁狂发作期间，患者通常在一周或更长的时间中感觉非常亢奋、膨胀或激惹，伴随以下症状中的至少三种宏伟的想法或高涨的自信；比正常情况需要的睡眠少得多；急需谈话；思维奔逸和不专心；活动增加，可以倾注于某种目标或表达为兴奋；寻求快乐的欲望，可能集中为过度性行为、花钱过度或多种计划，通常导致损失惨重的结果。抑郁具有许多潜在原因。通常不是由单一因素诱导，而是由一些因素的组合诱导，例如，遗传弱点、某些形式的压力或脑化学的改变。已经提示了压力和抑郁之间的联系，某些类型的压力具有更大的影响，如早年的创伤或损失(如儿童的身体或性虐待、父母死亡或所爱的人的影响)。研究表明，经历这些事件，增加了在以后发生抑郁的风险。抑郁也可以复发。研究表明，重性抑郁是一种高复发的疾病。参见，例如，Solomon、D.A.等(2001)Am.J.Psychiatry 158(5)819-20；Stoudemire、A.(1997)J.Neuropsychiatry Clin.Neurosci.9(2)208-21。其它形式的抑郁，如双相情感障碍也被认为是高复发的。遗传研究表明，尽管没有单基因能够促进抑郁，但基因变异的组合可能使人更容易患某种形式的该疾病。抑郁的遗传成分还没有完全清楚。在双相情感障碍中观察到了最清楚的遗传关联(如直系亲属经历了躁狂，导致双相情感障碍发生改变12％)。专家认为，当产生弱点的基因变异与环境因素相互作用并且被环境因素扩大时，可能导致抑郁，所述环境因素包括早年创伤或损失或长期压力。抑郁或躁狂的症状也可能是某些药物，如类固醇或血压药物的副作用。医学疾病或药物被认为是所有抑郁中的大约10％-15％的原因。最了解的情绪障碍的原因是甲状腺激素失衡。甲状腺激素过多，或甲状腺机能亢进，可以诱发躁狂症状。甲状腺机能减退是身体中甲状腺激素产生过少的一种状况，其通常导致疲倦和抑郁，并且影响了数百万的美国人，主要是妇女或老年人。情绪障碍的其它可能的医学原因包括退化性神经状况，如多发性硬化、帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病；中风；某些营养缺陷，如缺乏维生素B12；其它导致激素失衡的内分泌紊乱，如甲状旁腺或肾上腺的活性过度或不足；某些免疫病，如狼疮；某些传染病，如单核细胞增多症、肝炎和人类免疫缺陷病毒(HIV)；某些癌症，如胰腺癌或脑癌。但是，抑郁的起病和这些医学状况以及相关压力的之间因果关系还不清楚。研究表明，患有持续至少6年的慢性抑郁的老年人发生所有类型癌症的风险高88％。其它研究表明，抑郁减慢由于健康原因住院的老年人的恢复。暗示了阿尔茨海默病和抑郁之间的联系在抑郁患者中很明显的是患阿尔茨海默病或经历精神衰弱的风险更高，但仅仅是在接受8年以上教育的那些人当中。此外，激素也可能在抑郁中起作用。雌激素和孕酮可能在一些患有经前综合征(″PMS″)的女性的抑郁中起作用。70％的初产妇在分娩后10天内经历的产后抑郁，即称作“淡蓝色”的易流泪、焦虑和情绪反覆，是另一种形式的抑郁症，其仅仅影响女性。在男性中，随着年龄的增长，睾丸酮水平的降低似乎与抑郁、激惹、焦率、精力差、不能集中和记性差，以及睡眠紊乱相关。研究表明了抑郁患者脑中的神经和生化改变，这可以解释抑郁的症状，如过度睡眠、食欲不振、兴奋、疲倦或冷漠。严重抑郁或躁狂患者脑中行使脑的正常功能的神经递质的平衡可能被破坏，或者失衡。例如，受体可能对特定神经递质过度敏感或不敏感，导致对特定量的神经递质的反应过度或不足。相反，受体可获得的神经递质的量可能太多或太少，这是由其产生和分泌，或其从系统的再摄取或排出的水平异常导致的。因此，恢复所述神经递质信号传递的平衡在一些病例中是抑郁的有效治疗。例如，发现有助于调节睡眠、食欲、情绪和抑制疼痛的5-羟色胺在抑郁人群中是低水平的；选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，如floxetine，通过限制摄取而增加可获得的5-羟色胺浓度，并且可以有效作为一些抑郁患者的抗抑郁剂。除了生化改变外，抑郁与患者脑中的物理改变相关，这可以包括病变、失去神经元或某些脑区，如海马和额叶前皮质的萎缩。参见，例如，Sheline、Y.I.等、(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 933908-3913。尽管还不清楚这些细胞损失导致抑郁的发病还是抑郁的结果，但已经表明了抗抑郁剂可以逆转所述神经改变并且有助于症状的改善。典型地，医生通过研究可能的医学原因和得出有助于分析的信息诊断抑郁。第一步可以体检或筛选工具，如自我报告表(要填写的症状清单)、由临床医生完成的表和/或医生或治疗者基于抑郁或双相情感障碍的关键标准进行的临床会见。可以用其它测试证实诊断、获取信息，或将抑郁与其它心理或神经问题进行区别；它们包括心理测试，如明尼苏达多相人格表(″MMPI″)、罗夏测试(″墨迹″)或主题领悟测试，神经心理测试，如修改的Halstead-Reitan battery，神经测试，如脑电图(″EEG″)或MRI，和/或抑郁的生物原因的测试，如甲状腺功能的测试。
注意力缺陷障碍注意力缺陷障碍(ADD)是一种不断发展的障碍，其特征在于不断发展的不适当程度的注意力不集中、多动和冲动。症状是基于神经的，发生在大的儿童中，并且在大多数病例中性质是慢性的。症状不是由于总的神经损失、感觉损失、语言或运动损伤、智力迟钝或情绪扰乱。具有和不具有多动的ADD是分开的和不同的儿童病症。它们不是相同注意力缺陷的亚型。已经注意到，具有ADD/-H的儿童更经常被描述为抑郁的、不能学习或“懒惰的”，而具有ADD/+H的儿童更通常以紊乱的行为或举止为标志。
记忆和认知功能记忆，或活生物储存信息并且此后以功能形式找回这些信息的功能，包括多个过程，并且需要多个不同脑区的功能。人类的记忆提供了说明性的回忆，即，有意识的回忆所能获得的事实和事件，并且提供了非说明性的回忆，即，不是针对时间和地点储存的关于技巧和操作的程序记忆。要添加到记忆中的信息的加工发生在一些阶段。新获得的经历最初容易受到多种形式的破坏。但是，随时间进展，新的经历变得抵抗破坏。这一观察结果解释了易变的、运行中的短期记忆“加固”为更稳定的长期记忆。记忆加固的最初阶段发生在我们暴露于新想法或学习经历之后的最初几分钟内。随后的阶段发生在更长的时间段，如睡眠过程中。如果学习经历对我们有进行中的意义，接下来的大约一周时间作为进一步的记忆加固阶段。实际上，在该阶段，记忆从短期变为长期储存。对于长期记忆的形成提出了多种机理。广泛的观察结果提示了用于形成长期记忆的进化中保守的分子机理。这些观察结果包括增加突触递质的释放和突触受体的数目，以及受体Km的减少、突触前或突触后元件中新记忆因子的合成、新的突触连接，和突触前膜中活性区域的增加。突触的可塑性，即脑中神经元连接的强度改变，被认为进行长期记忆储存。在分子水平上，一系列经典的研究表明，在关键的时间窗中mRNA和蛋白合成的抑制可以破坏长期记忆的形成。以前储存的信息的起始学习和回忆不受蛋白合成的瞬时阻断的破坏。这导致一种假设，即，新基因表达是脑的短期修饰转化或加固为长期记忆所必须的。记忆加固，或长期记忆，也被认为在多种神经和精神障碍，包括智力迟钝、阿尔茨海默病和抑郁中起关键作用。实际上，长期记忆的损失或破坏是所述疾病的显著特征。
痴呆痴呆定义为特征在于以前所获得的智力活动能力的衰退的精神障碍，包括人格改变和记忆、判断和概括性思考的能力受损。其或多或少是持续性的，可以在数月或数年，而不是数日或数周中任意检测到。尽管长期持续，痴呆的一些变化形式可以停滞或逆转。术语“痴呆”并不适用于独立的局灶性功能丧失，如健忘、失语、认知不能或失用中发生的那些。衰退通常涉及记忆、其它认知能力和适应性行为的衰退。通常没有显著的意识改变。患者可能知道或不知道痴呆。在大多数病例中，存在记忆和一种或多种其它智力功能，如语言、空间或时间定向、判断和概括性思考的显著破坏。痴呆的一些标准需要除记忆以外的智力功能的一种或多种成分的缺陷；一些需要总体缺陷，即，涉及智力功能的所有成分。痴呆可以由多种脑病症导致，包括阿尔茨海默病、亨廷顿病、多发性硬化和帕金森病。其它类型的痴呆是血管性痴呆或多梗塞性痴呆、Lewy体痴呆、额叶痴呆，如皮克病、皮层下痴呆(如亨廷顿或进行性核上瘫)、局灶皮质萎缩综合征(如原发性失语症)、代谢毒性痴呆(如慢性甲状腺功能低减或B12缺乏)和感染导致的痴呆(如梅毒、神经系统AIDS或慢性脑膜炎)。
发明概述本发明提供了通过由Hh家族的蛋白修饰中枢神经系统(″CNS″)中的信号传递途径而调节CNS活性的方法。因此，本发明提供了治疗受试者的行为和情绪障碍以及增强或恢复其记忆和/或认知功能的方法。本发明的一方面提供了通过经由Hh信号传递途径刺激神经元干细胞而调节哺乳动物的CNS活性，从而促进神经元干细胞的分化和/或迁移，和/或直接调节基底神经节区的突触传递的方法。可以通过Hh多肽或模拟其活性的任何Hh活性激动剂，或最终增加Gli，特别是Gli-1活性的任何化合物或组合物而激活Hh信号传递途径。例如，可以由途径内的负调节元件或负反馈元件的拮抗剂(如patched受体的拮抗剂)增强Hh信号传递途径。此外，本发明提供了通过经由Hh信号传递途径调节CNS活性而治疗行为和/或情绪障碍的方法。本发明的另一方面是增强患者的认知功能和记忆功能的方法。通过多种试剂激活Hh信号传递途径，从而刺激神经元干细胞的分化和迁移，可以导致认知和记忆改进。本发明的另一方面提供了通过刺激神经元发生、激活神经元干细胞分化和迁移到损伤部位而治疗伴随了神经元细胞损失或病变的病症的方法。可以通过用各种试剂激活Hh信号传递途径而促进所述分化和迁移。增强的神经发生可以增加已经上调的神经元发生，所述上调可能是身体对病理状态的补救反应。本发明的一个方面也提供了由诸如AIDS相关痴呆等疾病导致的受损的记忆和认知的增强，并且减轻这些疾病以及其它与记忆和认知功能退化相关的病症如抑郁的症状。此外，本发明提供了特定受试者中记忆和认知功能的增强，所述受试者不患有记忆和认知受损病症的一般症状，但仍然从记忆和认知功能的改进获益。本发明涉及用Hh激动剂，优选以下文所述的药物组合物治疗或预防抑郁、惊恐性障碍、强迫性障碍、焦虑、疼痛(特别是慢性疼痛)、作用于精神的物质的滥用、偏头痛、社会焦虑/恐惧性障碍和创伤后应激综合征，以及食欲抑制。对于上述任何目的，治疗包括所述状况的一种或多种症状的部分或全部减轻，预防包括所述状况的一种或多种症状起病延迟或严重程度减轻。尽管预期此处描述的方法在任何动物，特别是哺乳动物中都是有效的，在某些实施方案中优选用于治疗人。本发明提供了刺激Hh信号传递途径的药物组合物。药物组合物包含Hh多肽或其功能等同物，或Hh活性的激动剂。药物组合物也可以包含Hh途径的负反馈系统或阻抑元件的拮抗剂。药物组合物可以进一步包含其它治疗剂，如神经元生长因子或神经营养因子。在一种实施方案中，刺激本发明的方法中的途径的试剂是Hh多肽或其功能等同物。优选地，所述试剂是Hh多肽。更优选地，所述试剂是Shh多肽。在一种实施方案中，所述试剂是Hh多肽的片段。更优选地，它是含有结合于Hh多肽的受体的区域的N-末端片段。甚至更优选地，所述片段是人Hh多肽的19kDa N-末端片段。在另一种实施方案中，所述试剂是与描述为SEQ ID NOs10-19的Hh氨基酸序列中任意一种氨基酸序列具有至少60、70、80或90％氨基酸序列同源性的多肽。在某些实施方案中，用亲脂部分在成熟、加工过的细胞外结构域的一个或多个内部位点修饰用于实施本发明的方法的Hh多肽，并且也可以用或不用亲脂部分在成熟多肽的N或C末端残基进行衍生化。在其它实施方案中，用除甾醇之外的疏水部分在C末端修饰多肽。在其它实施方案中，用环状(优选多环)亲脂基团在N末端残基修饰多肽。也考虑以上的多种组合。对于包括Hh多肽的多肽的示例性修饰，参见美国申请No.09/579680，其公开内容在此全文引入作为参考。在本发明的另一实施方案中，实施本发明的方法的试剂是小分子激动剂。优选地，小分子是分子量小于约2500amu，甚至更优选小于约1500amu的化合物。在一种实施方案中，所述试剂是抗独特型抗体，所述抗体抗Hh家族的蛋白的抗体。所述抗独特型抗体模拟Hh多肽的作用。在某些实施方案中，所述方法包括共同施用试剂与神经元生长因子、神经元存活因子或神经元营养因子中的一种或多种。在其它实施方案中，可以通过施用基因激活构建体实施本发明的方法，其中所述基因激活构建体设计用于与患者的基因组hh基因重组，以提供与hh基因的编码序列操作性连接的异源转录调节序列。在其它实施方案中，本发明的Hh激动剂是RNAi构建体，其中所述构建体抑制Hh信号传递途径中负调节元件的表达，导致Hh信号传递阻遏或抑制的释放，并且导致途径的激活。在其它实施方案中，可以通过施用编码Hh多肽或其等同物的基因治疗构建体来实施本发明的方法。例如，可以在选自重组病毒颗粒、脂质体和聚阳离子核酸结合剂的组合物中提供基因治疗构建体。另一方面，本发明提供了通过确定抑郁或另一种行为或情绪障碍的治疗中的Hh激动剂的合适制剂和剂量，并且授予第三方进一步开发和销售所述制剂的权利，从而进行药物商业的方法。另一方面，本发明涉及通过确定抑郁或另一种行为或情绪障碍的治疗中的Hh激动剂的合适制剂和剂量，进行所鉴定的制剂在动物中的效力和毒性的治疗谱分析，并且提供销售具有可接受的治疗谱的制品的分布网络，从而进行药物商业的方法。在某些实施方案中，该方法进一步包括提供将该制品推广到保健提供者的销售团队的额外步骤。
发明详述I.概述本发明基于hedgehog(hh)家族的蛋白的生理功能，已知所述蛋白在动物的胚胎干细胞的发育和分化中起关键作用。最近观察到Hedgehog(Hh)多肽也在成年动物中起作用，指导干细胞分化并且迁移到合适位置中的多种功能细胞。Hh多肽在神经发生、神经元分化和神经元干细胞迁移到动物的中枢神经系统中起作用，并且也在神经元的维持和保护中起作用。参见，例如，Bezard、E.等(2003)FASEB J.express article 10.1096/fj.03-0291fje，在线公布、Pascuala，O.等(2002)J.Physiol.-Paris 96135-166，和Machold、R.等(2003)Neuron 39937-950，在此引入其公开内容作为参考。最近已经观察到多种抗抑郁剂刺激海马中的神经发生，并且神经发生导致抗抑郁剂的效果。抗抑郁剂，如氟西汀或丙咪嗪增加大鼠海马齿状回的神经发生。当通过刺激海马破坏该神经发生时，测试的受试小鼠不再反应于抗抑郁治疗，这是通过新的抑制喂食(NST)实验和通过长期不可预测的应激范例所测量的。此外，缺乏5-HT1A受体的敲除小鼠不反应于5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀，但反应于三环抗抑郁剂丙咪嗪和去甲丙咪嗪，表明存在两种独立的分子途径。参见Santarelli、L.等(2003)Science 301805-809。因此，预计刺激神经发生和分化的Hh多肽或Hh激动剂作为抗抑郁剂。此外，Hh多肽似乎直接参与成年动物的底丘脑核(STN)神经元的电活动。在施用Shh多肽的N末端片段后几分钟内，大鼠脑切片中STN神经元亚组的电活动受抑制，减少突触传递。STN是基底神经节的关键因素，其目前被识别为在情绪和认知活动以及控制自主和不自主运动中起作用。因此，显示Hh多肽直接参与受试者中情绪和认知反应的调节。此外，给脑干切片制品施用脂质修饰形式的sonichedgehog(Shh)，可逆改变了成人nucleus tractus solitarius(NTS)神经元的活动，导致抑制，以及随后动作电位的延迟爆发。NTS是参与调节呼吸、心血管和营养功能的脑干结构。由于Shh是在紧邻NTS的脑区产生，Shh可能在成人NTS中起神经调节功能。参见上文引用的Pascuala的文献。很多神经系统病症与分散的神经元元件群体的退化相关，并且可以用包括Hh激动剂的治疗方案进行治疗。最近已经观察到患有严重抑郁的患者表现出海马的萎缩。患有所述变性状况的患者的治疗可以包括施用Hh多肽或模拟其效果的试剂，以便控制，例如，导致神经元损失的分化和凋亡事件(如增强存在的神经元的存活)并且促进受影响区域的前体细胞的分化和再建群。在有对照的实验室实验中，在攻击CNS前用Hh激动剂处理受试动物，导致较小的病变和神经元体积的保留。在特征在于中枢神经系统的多个部分，特别是脑皮质中神经元死亡的一些退化性疾病中观察到痴呆和记忆丧失。一些形式的痴呆与丘脑或脑皮质下的白质的退化相关。例如，阿尔茨海默病(AD)与突出到神经皮质和存留在皮质中的一些神经递质系统中的缺陷相关。例如，观察到与年龄匹配的对照相比，AD患者中基底核的神经元有明显(75％)损失。最近，已经证明在患有AD的人的海马中，神经发生被上调，如未成熟的神经元标记物蛋白的表达增加所示。Jin、K.等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、Early edition、www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.2634794100。所述神经发生的增加可以是身体对病理性细胞损失的天然防御，也可以适用于其它表现出神经元损失的变性疾病。预计扩大和增强神经发生是有效的治疗选择。尽管到目前为止AD是最常见的痴呆形式，一些其它的病症可以产生痴呆，包括血管或多梗塞痴呆、Lewy体痴呆、皮克病、亨廷顿病、进行性核上瘫、局灶皮质萎缩综合征(如原发性失语症)、代谢毒性痴呆(如慢性甲状腺功能低减或B12缺乏)和感染导致的痴呆(如梅毒、神经系统AIDS或慢性脑膜炎)。在一些疾病中，由传出和传入神经的退化导致皮质区分离，从而导致认知功能障碍。亨廷顿病涉及纹状体内和皮质胆碱能神经元以及GABA能神经元的退化。皮克病是额叶和前颞叶的神经皮质中的严重神经元退化，有时伴随纹状体中神经元的死亡。本发明的方法也适于治疗导致低张力或共济失调的小脑病症，如小脑中产生病变对侧肢体的病症的病变。例如，hh同源物的制品可以用于治疗限定形式的涉及前叶(小脑蚓和腿区)的小脑皮质退化，如醉酒患者中常见的那些。本发明一般涉及用于治疗情绪和行为障碍，如抑郁，和用于增强认知和记忆，以及治疗涉及记忆和认知功能丧失的神经系统病症，如多种痴呆的方法和组合物。我们在此提供基于Hh信号传递途径的刺激治疗所述疾病的方法和组合物。也可以采用Hh多肽或其功能等同物，包括肽片段和突变蛋白实施本发明的方法。也可以用小肽、肽模拟物或有机分子以及抗体实施所述方法。也可以通过进行基因治疗，即，将某些包含例如hedgehog、smoothened或gli-l基因的基因构建体导入受试者，使得从受试者的细胞中产生功能蛋白。
II.定义为方便起见，在此汇集在本说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。此处使用的术语“试剂”和“化合物”包括蛋白和非蛋白部分。试剂可以是小有机分子、多肽、蛋白、肽复合物、肽模拟物、非肽基试剂或多核苷酸。此处使用的“改善”是指减轻、缓解或减少症状或减少疾病表现发作的出现次数。此处使用的“抗体”是指包含两条重链和两条轻链并且识别抗原的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子可以来源于任何公知的类，包括，但不限于IgA，即分泌性IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员公知的，包括，但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。它包括，例如，天然存在和非天然存在的抗体。具体地，“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，及其一价和二价片段。此外，“抗体”包括嵌合抗体、全合成抗体、单链抗体及其片段。任选地，可以用可检测的标记物标记抗体。可检测的标记物包括，例如，放射性或荧光标记物。也可以通过将抗体与其它生物或化学功能部分如交联剂或肽偶联而对抗体进行修饰。术语“抗抑郁剂”和“抗抑郁部分”是指CNS活性部分或其前药形式，其主要作用是预防、治疗或改善急性或慢性抑郁。可以用于制备本发明的辅助药物的示例的抗抑郁剂包括双环抗抑郁剂，如醋胺苯酮、苯双胺咖啡碱、茚达平、盐酸茚氯嗪、诺米芬辛、5-羟色胺(L-5HTP)、帕罗西丁和舍曲林；酰肼类，如苯酰甲苄肼、异丙氯肼、异丙异酰肼、异唑肼、2-肼辛烷和苯乙肼；吡咯烷酮类，如环丙胺(rolicyprine)、环丙胺(rolipram)和sertindole；四环抗抑郁剂，如麦普替林；三环抗抑郁剂，如阿莫沙平、酮肟替林、去甲丙咪嗪、美他帕明、去甲替林、奥匹哌醇、丙吡氮、普罗替林和噻萘普丁；以及其它抗抑郁剂，如阿屈非尼、贝那替嗪、二苯哌啶二烷、duloxetine、胺酯苯巴比妥、苯氯己二醇、氟戊肟胺、血卟啉、金丝桃素、醋苯哌酯、milnacipran、米那普林、摩氯苯胺、吡琥胺酯、roxindole、舒必利、托洛沙酮、反苯环丙胺、1-色氨酸、venlafaxine和维路沙嗪。术语“抗精神病药物”和“抗精神病部分”可以互换使用，并且是指CNS活性部分或其前药形式，其主要作用是预防、治疗或改善急性或慢性精神病。可以用于制备本发明的辅助药物的示例的抗精神病药物包括苯甲酰胺类，如amisulpride、尼莫普利和舒必利；苯并唑类；丁苯酮类，如苯哌唑酮、溴哌利多、氟哌利多、卤吡醇、甲基哌啶醇、酰胺哌啶酮、螺哌隆、替米哌隆和三氟哌啶醇；phothiazines，如乙酰奋乃静、丙酰奋乃静、羟乙氧拉嗪、氟奋乃静、pericyazine、哌甲氧嗪、奋乃静、piperacetazine和哌普嗪；噻吨类，如氯噻吨和氟噻吨；其它三环抗精神病化合物，如卡比米嗪、氯卡比米嗪、mosaprimine、olanzapine、利哌利酮、9-羟基-利哌利酮、奥匹哌醇和seroquel；以及其它的抗精神病药物，如aripiprazole、羟乙苄氨酯、五氟利多、匹莫齐特和ziprasidone。术语“解焦虑剂”、“抗焦虑部分”和“解焦虑部分“是指CNS活性部分或其前药形式，其主要功能是减轻、预防、治疗或改善急性或慢性焦虑症。严重的焦虑症包括普通焦虑症(GAD)、惊恐性障碍、恐怖症、强迫性障碍(OCD)和创伤后应激症(PSTD)。用于制备本发明的辅助药物的示例的解焦虑剂包括芳基哌嗪类，如三甲氧哌醇和flesinoxan；苯并二氮杂衍生物，如利眠宁、氯氮、氟太唑仑、劳拉西泮、甲二氮、地西泮、阿普唑仑、氯硝西泮、氯氮、去甲安定和去甲羟安定；氨基甲酸酯类，如氨甲酸叔己酯、羟基丁氨酯、甲丙氨酯、苯丙醇胺酯和羟戊丁胺酯和其它解焦虑化合物，如，苯环辛胺、谷氨酸、羟嗪、甲氯醛脲、甲苯酮、普奈洛尔、阿替洛尔、丁螺环酮、丙戊酸、加巴喷丁、卡马西平和氧酰胺，以及选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI′s)，如氟西汀、氟戊肟胺、茚达品、盐酸茚氯嗪、milnacipran、氟苯哌苯醚和舍曲林。术语“焦虑症”包括，但不限于强迫性障碍、精神物质焦虑症、创伤后应激症、普通焦虑症、社会焦虑症、恐怖症、社会恐怖症、焦虑症NOS和器质性焦虑症。此处使用的术语“孤独症”是指特征在于DSM-IV-R中第299.xx类中的孤独症，包括299.00、299.80和299.10，优选299.00。此处使用的术语“双相情感障碍”是指特征在于DSM-IV-R中第296.xx类中的双相情感障碍，包括双相情感障碍I和双相情感障碍II。此处使用的术语″dsRNA”是指小干扰RNA(siRNA)分子，或其它包括双链特征并且能够在细胞中加工为siRNA的RNA分子，如发夹RNA部分。术语“ED50”指产生50％最大反应或效果的药物剂量。就主题治疗方法而言，“有效量”如Hh激动剂的有效量指制品内所述激动剂的量，当将所述量作为所需剂量方案的组成部分应用时，根据需要治疗的病症的临床可接受标准或需要的效果，如记忆或认知的增强，产生例如细胞增殖速率的改变和/或细胞分化状态的改变和/或细胞存活率的改变。此处使用的术语“过量侵袭”是指特征在于过量侵袭，以至于其干扰个体的日常功能、关系，并且可以威胁个体的安全的状况，例如在有强烈的自杀欲望的情况。可以用此处要求保护的方法治疗的过量侵袭不依赖于精神状况，并且不直接与药物或其它物质的服用直接相关。在提到由主题RNAi方法抑制的基因时，术语“功能获得”是指与不存在RNAi构建体时的水平相比，增加了基因的表达水平。术语“保健提供者”是指给个人、社区等提供保健服务的个体或组织。“保健提供者”包括医生、医院、持续保健退休社区、有经验的护理设施、亚急性保健设施、诊所、多专业诊所、独立急救中心、家庭健康机构和HMO。“Hh激动剂”是指加强或重新获得Hh的生物活性的试剂，所述生物活性例如激活靶基因，特别是gli-1的转录。此处使用的“Hh激动剂”不仅仅指可以通过直接激活Hh或smoothened多肽的正常功能而起作用的试剂，也指激活Hh信号传递途径的任何试剂，包括缓解所述途径的负调节元件，如Patched蛋白的阻遏或抑制的任何试剂。因此，Hh激动剂可以是Hh信号传递途径的负调节元件的抑制剂。此处使用的术语“Hh激动剂”包括RNA干扰(RNAi)调节剂，其抑制Hh信号传递途径内负控制元件的表达。优选的Hh激动剂可以用于以smoothened依赖性方式模拟或增强Hh多肽的活性或效果。另一种类型的优选Hh激动剂破坏Smoothened和Patched多肽的缔合，缓解Patched的阻遏作用，并且激活Hh途径。术语“Hh多肽”是指由属于hh基因家族的基因表达的任何多肽、其突变体和功能等同的多肽。“基因家族”是指具有共同的功能并且表现出共同的序列同源性的一组基因。术语“hh RNAi激动剂”是指抑制hh信号传递成分(例如gli-3)的生物活性的RNAi试剂，其阻遏正常情况下作为hh信号传递的抑制物或阻遏物的靶hh信号传递成分的表达。例如，某些优选的hhRNAi激动剂可以用于克服ptc功能获得和/或gli-3功能获得。其它优选的RNAi激动剂可以用于缓解hh信号转导中的抑制。RNAi激动剂可以针对编码Hh信号传递途径中的蛋白的基因。在大多数情况下，RNAi激动剂可以通过以下方法抑制靶蛋白的活性降低Hh途径中负调节所述途径的基因编码的蛋白的产量，从而上调Hh信号传递。此处使用的“抑制”是指与对照样品中存在的量相比，所述量减少。在优选实施方案中，抑制表示所述量减少了50％以上，甚至更优选减少了75％以上或甚至100％。此处使用的“说明材料”是指文件或记录介质，其中包括了用于使用药物组合物的书面或声音说明书。说明材料包括瓶子上的标签、盒子的插页、盒子或纸版上的印刷材料、在上述任意位置给出的地址的网页提供的说明。术语“LD50”指使50％测试受试者致死的药物剂量。此处使用的短语“介导RNAi”是指区分哪些RNAs将被RNAi方法，如以序列特异性方式发生的降解(而不是不依赖于序列的dsRNA反应，如PKR反应)而降解的能力。术语“非阿尔茨海默痴呆”是指由脑的器质性疾病或病症导致的特征在于智力活动，如记忆、集中精力和判断破坏的任何形式的痴呆和精神损伤，不伴随阿尔茨海默病的其它标志。其有时伴随情绪紊乱和人格改变。术语“预防”是本领域公知的，当相关于某种状况，如诸如抑郁的疾病、诸如痴呆的综合征或其它医学状况的复发或发病时，该术语是本领域公知的，并且包括施用相对于不接受组合物的受试者而言减少受试者中医学状况的症状的频率或延迟其发作的组合物。因此，抑郁的预防包括，例如，相对于未治疗的对照群体，减少接受预防性治疗的患者群体中抑郁发病的复发，和/或相对于未治疗的群体，延迟受治疗的群体中抑郁的发病。记忆破坏的预防包括，例如，相对于未治疗的对照群体，减少接受预防性治疗的患者群体中不能记忆的发作次数，和/或与未治疗的对照群体相比，延迟记忆缺陷的出现，例如，减少和延迟了统计学和/或临床显著量。认知功能缺陷的预防包括，例如，与未治疗的对照群体相比，减少受治疗群体中认知破坏发作的次数和/或与未治疗的对照群体相比，延迟受治疗群体中认知破坏症状的发作。此处使用的术语“精神病状况”是指精神方面的病理精神状况，或可能与精神病特征相关。所述状况包括，但不限于精神障碍，其在DSM-IV-R、Diagnostic and Statistical Manual of MentalDisorders、Revised、4th Ed.(1994)中表征，包括精神分裂症和急性躁狂。DSM-IV-R是Task Force on Nomenclature and Statistics of theAmerican Association制定的，并且提供了诊断分类的描述。本领域技术人员可以认识到存在病理精神状况的替代命名、疾病分类学和分类体系，并且这些体系是随着医学科学进展而发展的。此处使用的术语“RNAi构建体”是说明书中使用的概括术语，其包括小干扰RNAs(siRNAs)、发夹RNAs和其它可以体内切割以形成siRNA的RNA种类。此处的RNAi构建体也包括能够在细胞中产生形成dsRNAs或发夹RNAs的转录物的表达载体(也称作RNAi表达载体)，和/或能够体内产生siRNAs的转录物。“RNAi表达载体”(在此也称作“dsRNA编码质粒”)是指用于表达(转录)RNA的可复制的核酸构建体，其在表达构建体的细胞中产生siRNA部分。所述载体包含转录单位，其中包含以下成分的组装体(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如，启动子、操纵子或增强子，其任选连接于(2)转录以产生双链RNA的“编码”序列(在细胞中退火以形成siRNA的两个RNA部分，或可以加工为siRNA的单个发夹RNA)，和(3)合适的转录起始和终止序列。启动子和其它调节元件的选择通常根据意欲使用的宿主细胞而改变。概言之，用于重组DNA技术中的表达载体通常是“质粒”形式，其是指环状的双链DNA环，其以载体形式存在时不结合于染色体。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明意欲包括具有等同功能的其它形式的表达载体，并且在本发明后可以被本领域技术人员了解。术语“siRNA”表示小的干扰RNA。术语“小分子”是指分子量小于约2500amu，优选小于约2000amu，甚至更优选小于约1000amu，或最优选小于约750amu的化合物。此处使用的“统计学正常范围”是指在本领域技术人员接受的实验或测定中评分不小于可再现和代表性的检测量的20％。当指定群体内，在相同实验中获得的至少20％的评分低于考虑的评分时，评分被认为在统计学正常范围内。相反，假定正常分布，低于可比较的实验评分平均值的0.84标准差的评分被认为在统计学正常范围外。由主题方法治疗的“受试者”或“患者”可以表示人或非人动物。此处使用的“治疗”表示减缓、停止或逆转病症的进展。在优选的实施方案中，“治疗”表示逆转进展，到达消除病症的点。术语“酰氨基”是本领域内公知的，是指可以用下面通式表示的部分
其中R9如上文定义，R′11代表氢、烷基、链烯基或-(CH2)m-R8，其中m和R8如上文定义。本文中术语“脂族基”指直链、支链或环状脂族烃基，包括饱和和不饱和脂族基，如烷基、链烯基和炔基。术语“链烯基”和“炔基”指长度和可能的取代基与上文所述烷基类似的不饱和脂族基，但分别包含至少一个双键或三键。本文所用术语“烷氧基”指如上文所定义的烷基，其上连接氧基团。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔-丁氧基等。“醚”是通过一个氧原子共价连接的两个烃。因此，使烷基成为一种醚的烷基的取代基是烷氧基或类似烷氧基，例如可以用-O-烷基、-O-链烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R8其中之一表示，其中m和R8如上文定义。术语“烷基”指饱和脂族基，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环基)、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选实施方案中，直链烷基或支链烷基在其主链上具有30个或更少碳原子(如直链是C1-C30，支链是C3-C30)，更优选20个或更少碳原子。同样，优选的环烷基在它们的环结构上具有3个到10个碳原子，更优选在环结构上有5、6或7个碳原子。此外，在本说明书、实施例和权利要求全文中使用的术语“烷基”(或“低级烷基”)包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者指具有取代烃主链上一个或多个碳原子上的氢的取代基的烷基部分。所述取代基可以包括例如卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫代酸酯、硫代乙酸酯、硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域内技术人员理解，如果合适，烃链上的取代部分本身可以被取代。例如，取代的烷基的取代基可以包括取代和未取代形式的氨基、叠氮基、亚氨基、酰氨基、磷酰基(包括膦酸酯和次膦酸酯)、磺酰基(包括硫酸酯、亚磺酰氨基、氨磺酰和磺酸酯)和甲硅烷基以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸酯和酯)、-CF3、-CN等。取代的烷基的例子如下文所述。环烷基可以进一步用烷基、链烯基、烷氧基、烷硫基、氨烷基、羰基取代的烷基、-CF3、CN等取代。除特别指出碳原子数目外，本文使用的“低级烷基”指如上文定义的烷基，但在其主链上具有一到十个碳原子，更优选一到六个碳原子。同样，“低级链烯基”和“低级炔基”有相似的链长度。在本申请全文中，优选烷基是低级烷基。在优选实施方案中，本文命名为烷基的取代基是低级烷基。术语“烷硫基”指如上文定义的烷基，其上连接一个硫基团。在优选实施方案中，所述“烷硫基”部分用-S-烷基、-S-链烯基、-S-炔基和-S-(CH2)m-R8之一代表，其中m和R8如上文定义。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等。术语“胺”和“氨基”是本领域内公知的术语，指取代和未取代的胺，如可以用下面通式代表的部分 其中R9、R10和R′10各自独立地代表氢、烷基、链烯基、-(CH2)m-R8，或者R9和R10与它们连接的N原子一起构成环状结构内有4到8个原子的杂环；R8代表芳基、环烷基、环烯基、杂环或多环；m是零或1到8的整数。在优选实施方案中，仅R9或R10其中之一可以是羰基，如R9、R10和氮一起不形成二酰亚胺。在更优选的实施方案中，术语“胺”不包括酰胺，其中R9和R10之一代表羰基。在甚至更优选的实施方案中，R9和R10(任选R′10)各自独立地代表氢、烷基、链烯基或-(CH2)m-R8。因此，本文使用的术语“烷基胺”指如上文定义的胺基，其上连接有取代或未取代烷基，即至少R9和R10之一是烷基。术语“酰氨基”是本领域公知的术语，指氨基取代的羰基，包括可以用下面通式表示的部分
其中R9、R10如上文定义。所述酰胺的优选实施方案将不包括可能不稳定的二酰亚胺。本文使用的术语“芳烷基”指被芳基(如芳基或杂芳基)取代的烷基。本文使用的术语“芳基”包括由5-、6-和7-元、可以包括零到四个杂原子的单环芳基，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。这些在环结构上具有杂原子的芳基也可以称为“芳基杂环”或“杂芳基”。所述芳环可以用上文定义的取代基在一个或多个位置上进行取代，所述取代基例如卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、亚磺酰氨基、酮、醛、酯、杂环基、芳族部分或杂芳族部分、-CF3、-CN等。术语“芳基”也包括具有两个或多个环的多环系统，其中两个或多个碳为两个邻接的环所共用(所述环是“稠合环”)，其中至少其中一个环是芳环，如其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基。本文使用的术语“碳环”指所述环中每一个原子都是碳的芳环或非芳环。术语“羰基”是本领域内公知的术语，包括可以用下面通式代表的部分 其中X是一个键或代表氧或硫，R11代表氢、烷基、链烯基、-(CH2)m-R8或药学上可接受的盐，R′11代表氢、烷基、链烯基或-(CH2)m-R8，其中m和R8如上文定义。当X是氧并且R11或R′11不是氢时，该式代表“酯”。当X是氧，并且R11如上文定义时，所述部分在本文中指羧基，尤其是当R11是氢时，该式代表“羧酸酯”。当X是氧，并且R′11是氢时，该式代表“甲酸酯”。一般地说，当上式的氧原子被硫取代时，上式代表“硫代羰基”基团。当X是硫并且R11或R′11不是氢时，该式代表“硫代酸酯”。当X是硫并且R11是氢时，该式代表“硫代羧酸”。当X是硫并且R′11是氢时，该式代表“硫代甲酸酯”。另一方面，当X是一个键并且R11不是氢时，上式代表“酮”基团。当X是一个键并且R11是氢时，上式代表“醛”基团。本文使用的术语“杂原子”指除碳或氢以外任何元素的原子。优选的杂原子是硼、氮、氧、磷、硫和硒。术语“杂环基”或“杂环基团”指3-到10-元环结构，更优选3-到7-元环，所述环结构包括一到四个杂原子。杂环也可以是多环。杂环基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、苯并吡喃、色烯、呫吨、phenoxathiin、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、中氮茚、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、2，3-二氮杂萘、1，5-二氮杂萘、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩吡嗪、吩噻嗪、呋咱、吩嗪、吡咯烷、oxolane、硫茂烷、唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺如β-丙内酰胺和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺内酯等。所述杂环可以在一个或多个位置被上文所述取代基的取代，所述取代基例如卤素、烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳族部分或杂芳族部分、-CF3、-CN等。本文所用术语“硝基”指-NO2；术语“卤素”是指-F、-Cl、-Br或-I；术语“巯基”指-SH；术语“羟基”指-OH；术语“磺酰基”指-SO2-。“亚膦酰胺”可以用下面通式代表 其中R9和R10如上文定义，Q2代表O、S或N，R48代表低级烷基或芳基，Q2代表O、S或N。“亚磷酰胺”可以用下面通式代表
其中R9和R10如上文定义，Q2代表O、S或N。“磷酰基”一般可以用下面通式代表 其中Q1代表S或O，R46代表氢、低级烷基或芳基。当用于取代例如烷基时，磷酰基烷基的磷酰基可以用下面通式代表 其中Q1代表S或O，每个R46独立地代表氢、低级烷基或芳基，Q2代表O、S或N。当Q1是S时，所述磷酰基部分是“硫代磷酸酯”。术语“多环基”或“多环基团”指两个或多个环，其中两个或多个碳为两个邻接的环所共用(如环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基)，如所述环是“稠合环”。通过非邻接的原子连接的环称为“桥”环。所述多环的每一个环可以用上文所述的取代基取代，所述取代基例如卤素、烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰氨基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳族部分或杂芳族部分、-CF3、-CN等。本文使用的短语“保护基”指保护潜在反应性官能团不发生不希望的化学转化的临时取代基。所述保护基的例子分别包括羧酸的酯、醇的甲硅烷醚、醛和酮的缩醛和缩酮。已经综述保护基化学的领域(Greene、T.W.；Wuts、P.G.M.Protective Groups in OrganicSynthesis、第二版；WileyNew York、1991)。“硒代烷基”指其上连接有取代硒基的烷基。在烷基上可被取代的“硒代醚”的例子选自-Se-烷基、-Se-链烯基、-Se-炔基和-Se-(CH2)m-R8，其中m和R8在上文定义。本文使用的术语“取代的”包括有机化合物的所有允许的取代基。在广义方面，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状取代基、分支和不分支取代基、碳环和杂环取代基、芳族和非芳族取代基。示例的取代基包括例如那些上文描述的取代基。允许的取代基对于合适的有机化合物可以是一个或多个，可以相同或不同。为本发明的目的，杂原子例如氮可以有氢取代基和/或满足所述杂原子化合价的任何允许的本文所述有机化合物取代基。本发明不在任何形式上受限制于所述允许的有机化合物取代基。可以理解“取代”或“被取代”包括隐含的限定条件，即所述取代符合所述被取代原子和所述取代基的允许化合价，并且所述取代产生稳定的化合物，如并不通过例如重排、环化、消除等而自发发生转化。术语“氨磺酰”是本领域内已知的，包括可以用下面通式代表的部分 其中R9和R10如上文定义。术语“硫酸酯”是本领域公知的，包括可以用下面通式代表的部分 其中R41如上文定义。术语“亚磺酰氨基”是本领域内已知的，包括可以用下面通式表示的部分 其中R9和R′11如上文定义。术语“磺酸酯”是本领域内已知的术语，包括可以用下面通式表示的部分
其中R41是电子对、氢、烷基、环烷基或芳基。本文使用的术语“亚砜基”或“亚磺酰基”指可以用下面通式代表的部分 其中R44选自下组的基团氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳烷基或芳基。对链烯基和炔基可以进行类似取代，产生例如氨基链烯基、氨基炔基、酰氨基链烯基、酰氨基炔基、亚氨基链烯基、亚氨基炔基、硫代链烯基、硫代炔基、羰基取代的链烯基或炔基。本文中每种表达的定义，如烷基、m、n等，当在任何结构中出现一次以上时，应当独立于其在同一结构中其它地方的定义。术语三氟甲磺酰基、甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁磺酰基是本领域内公知的术语，分别指三氟甲磺酰基、对甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁磺酰基。术语三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和九氟丁磺酸酯是本领域内公知的术语，分别指三氟甲磺酸酯、对甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁磺酸酯官能团以及包含所述基团的分子。缩写Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts、Ms分别代表甲基、乙基、苯基、三氟甲磺酰基、九氟丁磺酰基、对甲苯磺酰基和甲磺酰基。本领域内一般有机化学技术人员使用的缩写的更详细列表见Journal ofOrganic Chemistry每一卷的第一期；该列表通常出现在名为StandardList of Abbreviations-的表内。所述列表中包含的缩写以及本领域内有机化学技术人员使用的所有缩写在此引入作为参考。
III.示例的方法和组合物治疗方法
激活Hh信号传递途径刺激神经元干细胞的神经发生、分化和迁移。Hh多肽也直接调节突触电神经传递。因此，根据本发明，在方法中用Hh激动剂治疗从增加的神经元生长和分化获益，并且从受调节的突触活性受益的多种病症和状况。本发明的一方面提供了通过经由Hh信号传递途径刺激神经元干细胞而调节哺乳动物的CNS活性，从而促进神经元干细胞的分化和迁移的方法。本发明的方法包括给经历某些CNS神经元功能缺陷的受试者或从某些CNS功能的增强获益的受试者施用Hh激动剂。更具体地，本发明提供了通过经由Hh信号传递途径调节中枢神经系统活性而治疗行为和/或情绪障碍的方法。本发明涉及用Hh激动剂，优选以下文所述的药物组合物治疗或预防情绪障碍，如抑郁、惊恐性障碍、强迫性障碍、焦虑和社会焦虑/恐惧性障碍。对于上述任何目的，治疗包括所述状况的一种或多种症状的部分或全部减轻，预防包括所述状况的一种或多种症状起病延迟或严重程度减轻。本发明的一个具体方面是治疗抑郁。已经证明了抗抑郁的小分子刺激海马中的神经发生，并且所述神经发生导致抗抑郁剂的效果。Hh激动剂刺激海马中的神经发生，并且预期与已知的抗抑郁剂表现出相似的效果。本发明的另一方面提供了增强受试者的认知功能和/或记忆功能的方法。本发明的另一方面也提供了认知功能的增强，所述方法还考虑用于治疗表现出相关痴呆的疾病，和减轻这些疾病和诸如抑郁的表现出记忆和认知功能退化的和其它病症的症状。本发明的另一方面涉及用Hh激动剂预防性防止受试者中学习和/或记忆缺陷的发生，因此，改变受试者的学习能力和/或记忆能力。在某些实施方案中，主题方法可以用于治疗诊断为患有特定病症或具有发生特定病症的风险的患者，所述病症中的一个症状是语言性记忆减退，例如，不是程序性记忆减退。因此，本发明的方法可以用于预防记忆受损。考虑的记忆受损的原因包括有毒物质的暴露、脑损伤、年龄相关的记忆受损、轻度认知功能受损、癫痫、儿童智力迟钝、和疾病导致的痴呆，例如在帕金森病、AIDS、头部创伤、亨廷顿病、皮克病、克-雅病、心脏术后、唐氏综合征、前交通动脉综合征和中风的其它症状的某些病例中的痴呆。本发明的另一方面提供了通过刺激神经元干细胞分化和迁移到损伤位点，治疗伴随神经元损失或病变的病症的方法。可以通过由多种试剂激活Hh信号传递途径而促进所述分化和迁移。此外，本发明也可以用于增强正常个体中的记忆。老年人中最常见的痴呆原因是阿尔茨海默病(AD)。AD是一种病因未知的、非传染性的神经系统病症，其表现出进行性痴呆。大约3-5％的65岁以上的人患有AD。尽管AD的确定特征是尸检在患者脑中发现淀粉样斑和神经纤维缠结(神经细胞内的畸形)，已经建立了在活体中诊断AD的指南。国家神经系统和交流障碍及中风-阿尔茨海默病和相关病症联系研究所(NINCDS-ADRDA)设计了一系列诊断AD的指示性症状。存在受试者患AD的可能性的一些标准。大概的AD的临床诊断标准
1.由以下标准确定痴呆a1.临床检查，和a2.MMSE、BDS或其它相似检查的记录，和a3.神经心理测试证实b.两个或多个认知区中的缺陷c.记忆和其它认知功能的进行性恶化d.不存在意识紊乱e.在40-90岁发病，最通常在65岁后f.缺乏可以解释记忆和认知的进行性缺陷的有症状的病症和其它脑疾病
2.大概的AD的诊断由以下标准支持a.特定认知功能，如语言(失语症)、运动技巧(失用症)和感知(失认症)的进行性恶化；b.日常生活的活动受损和行为方式改变c.相似病症的家族史，特别是如果神经病理证实d.以下实验室结果d1.通过标准技术评估腰椎穿刺结果正常d2.正常EEG模式或非特异性EEG改变，如慢波活动增加；c.CT发现脑萎缩的迹象，系列观察记录到进展
3.排除其它痴呆原因后与大概的AD一致的其它临床特征a.疾病进展过程中的平台b.抑郁、失眠、失禁、错觉、幻想、幻觉、灾难性语言、情绪或身体爆发、性功能障碍和体重减轻的相关症状c.某些患者，特别是具有更晚期疾病的患者中的其它神经病学异常，包括运动体征，如肌张力增加、肌阵挛、或步态紊乱d.晚期疾病中的癫痫发作e.老年人CT正常
4.诊断大概的AD为不确定或不太可能的特征a.突然的中风发作b.局灶的神经病学发现，如轻度偏瘫、感觉丧失、视野缺损和疾病早期的不协调c.在症状发生或疾病非常早期时的癫痫发作或步态紊乱
可能的AD的诊断
1.可以在痴呆症状的基础上进行a.不存在足以导致痴呆的其它神经、精神或全身病症；和b.存在起病、表现或临床病程的变化
2.可以在足以产生痴呆但认为是痴呆的原因的第二种全身或脑病症的存在下进行
3.当不存在另一种可鉴别的原因的条件下鉴别了单个逐渐进展的严重认知缺陷时，应该用于研究中
C.诊断确定的AD的标准1.大概的AD的临床标准2.由活检或尸检获得的组织病理证据3.用于研究目的的亚型分离4.家族性存在5.在65岁前发病6.存在21三体7.其它相关状况，如PD的共同存在
AD的DSM-IV标准如下
A.表现为以下几点的多种认知缺陷的发展1.记忆受损(学习新信息或回忆以前学习的信息的能力受损)。
2.以下一种(或多种)认知障碍a.失语症(语言障碍)b.失用症(进行运动活动的能力受损，但运动功能完整)c.失认症(不能识别或鉴别物体，但感觉功能完整)d.执行功能(即，计划、组织、排序、概括)障碍B.A1和A2中的认知缺陷均导致社会或职业功能显著受损，并且代表从以前的功能水平显著下降。C.病程的特征在于认知衰退的逐渐发生和持续。A1和A2中的认知缺陷不是由于以下任意缺陷1.导致记忆和认知的进行性缺陷的其它中枢神经系统状况(如心血管疾病、帕金森病、亨廷顿病、硬膜下血肿、正常压力的脑水肿、脑肿瘤)2.已知导致痴呆的全身状况(如甲状腺功能低减、甲状腺功能亢进、维生素B12或叶酸缺乏、烟酸缺乏、高钙血症、神经系统梅毒、HIV感染)3.物质诱导的状况
E.所述缺陷不仅仅在谵妄过程中发生
F.不能用另一种Axis I病症(如重性抑郁症或精神分裂症)更好地解释所述障碍
阿尔茨海默病的标志包括痴呆的进展性质、特征性正电子发射体层摄影，其表现出顶叶和颞页联合和后扣带皮层中2FDG代谢的减少。所述减少通常是双侧的，但是通常在严重性或代谢减退的程度上是不对称的。具有晚期临床症状的患者通常表现在额叶前联合皮层中的代谢减少。代谢在主要的感觉和运动皮层区，包括躯体运动、听觉和视觉皮层中是相对少的。皮层下结构，包括基底神经节、丘脑、脑干和小脑也在典型的AD中保留。AD中的总体代谢分布部分反映了神经元和突触的已知区域性丧失，但很可能也包括皮质断开的效果，导致到联合区的传入输入减少。此外，脑脊液中的生物标志物，如总tau和磷酸化tau的增加辅助了阿尔茨海默病的诊断。增加阿尔茨海默病的风险遗传因素，如对于ApoE蛋白的等位基因4是纯合的，支持所述诊断。AD的生物标志物的最近的综述参见Frank、R.A.等(2003)Neurobiol.Aging 24521-536，在此全文引入其公开内容作为参考。在多种实施方案中，本发明涉及利用一种或多种Hh激动剂的治疗和预防方式。这些激动剂可以用于减少生物体中学习和/或记忆缺陷的发生，因此维持生物体的学习能力和/或记忆功能。在其它实施方案中，本发明的制品可以简单地用于增强正常记忆功能。本发明的方法和组合物可以用于治疗运动障碍。Hh激动剂可以用于治疗患有共济失调、皮质基底神经节变性(CBGD)、运动障碍、肌张力异常、震颤、遗传性痉挛性截瘫、亨廷顿病、多发性硬化、多系统萎缩、肌阵挛、帕金森病、进行性核上瘫、下肢不宁综合征、雷特综合征、痉挛状态、小舞蹈病、其它舞蹈病、手足徐动症、颤搐、刻板症、迟发性运动障碍/张力失常、抽搐、图特雷综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)、弥漫性Lewy体病、偏侧投掷症、偏侧面肌痉挛、下肢不宁综合征、成尔逊病、僵体综合征、无动性缄默、精神运动性阻抑、疼痛性下肢运动脚趾综合征、步态障碍、药物诱导的运动障碍和其它运动障碍的患者。本发明的方法和组合物可以用于治疗以下疾病或减轻所述疾病的严重程度行为障碍，如注意力缺陷障碍(ADD)、注意力缺陷的多动症(ADHD)和认知障碍，如痴呆(包括年龄相关的痴呆、HIV相关的痴呆、AIDS痴呆综合征(ADC)、HIV脑病和老年性痴呆)。某些辅助药物提供改进正常(包括正常老年人)或记忆受损的患者中的长期和/或工作记忆的一种或多种CNS活性部分。已经证明，大多数个体中的ADHD特征在儿童早期出现。该障碍的特征在于持续至少6个月的长期行为，通常在7岁前发病。目前，定义了以下四种ADHD亚型
1.注意力不集中型
2.多动/冲动型
3.复合型
4.除非特别指出，定义为表现某些特征但症状的数目不足以达到完全诊断的个体。但是，这些症状破坏日常生活。根据美国精神病协会诊断和统计手册(DSM-IV)，诊断ADHD的标准包括
以下的(1)或(2)
(1)以下六种(或更多)注意力不集中症状持续6个月，到达与发育水平不适应或不一致的程度
注意力不集中
(a)经常不能密切注意细节，或者在作业、工作或其它活动中出错(b)经常难以在任务或活性中保持注意力
(c)在直接对话时看起来经常不听
(d)经常不听从指令，并且不能完成作业、家务事或工作中的职责(不是由于反对行为或不能理解指令)
(e)经常难以组织任务和活动
(f)经常避免、不喜欢或不愿意参与需要持续的智力努力的任务(如课堂作业或家庭作业)
(g)经常丢失任务或活动必须的东西(如玩具、学校分发的物品、铅笔、书或工具)
(h)经常受到外界刺激的干扰
(i)在日常活动中健忘
(2)以下六种(或更多)多动-冲动症状持续6个月，到达与发育水平不适应或不一致的程度
多动
(a)手或脚经常坐立不安，或在座位上扭动
(b)在教室或其它需要保持坐着的场合下经常离开座位
(c)在不适当的场合下经常跑来跑去或爬(在青年或成人中，可能限于主观感觉不安宁)
(d)经常难以在安静地进行或沉迷于休闲活动
(e)经常“忙碌”或经常表现为似乎“有发动机驱动”
(f)经常谈话过多
冲动
(g)经常在问题没有结束时爆发出答案
(h)经常难以等候
(i)经常打断或加入其他人(如闯入谈话或游戏)
B.一些导致损害的多动-冲动或注意力不集中症状在7岁前存在
C.在两种或多种场合(如在学校[或工作]和在家)存在由症状导致的损害
D.必须在社会、学术或职业功能中存在明确的临床显著损害的证据
E.这些症状不是仅仅在普遍的发育障碍、精神分裂症或其它精神障碍中出现，并且不能由另一种精神障碍(如情绪障碍、焦虑性障碍、分离性障碍或人格障碍)更好地解释
本发明的方法和组合物可以用作治疗患有孤独症的患者的治疗的一部分。本发明的方法和组合物可以用作患有睡眠障碍、深眠状态、与医学或精神状况相关的睡眠障碍或其它睡眠障碍的患者的治疗的一部分。在某些优选实施方案中，睡眠障碍选自内在睡眠障碍、外在睡眠障碍和昼夜节律睡眠障碍。内在睡眠障碍的实例包括心理生理性失眠、睡眠状态感知错误、特发性失眠、发作性睡病、复发性睡眠过度、特发性睡眠过度、创伤后睡眠过度、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、中枢性睡眠呼吸暂停综合征、中央肺泡通气不足、周期性肢体运动障碍、下肢不宁综合征(RLS)等。外在睡眠障碍的实例包括睡眠卫生不良、环境性睡眠障碍、海拔性失眠、调整性睡眠障碍、睡眠不足综合征、限度设置睡眠障碍、睡眠开始相关综合征、食物过敏性失眠、夜间饮食/喝水综合征、催眠依赖性睡眠障碍、刺激物依赖性睡眠障碍、酒精依赖性睡眠障碍、毒素诱导的睡眠障碍等。昼夜节律睡眠障碍的实例包括时区改变(时差)综合征、工作改变睡眠综合征、不规律的睡眠/觉醒模式、延迟的睡眠阶段综合征、晚期睡眠阶段综合征、非24小时睡眠/觉醒障碍等。在某些实施方案中，本发明涉及健忘症的治疗。记忆问题的主诉是常见的。不能集中精神、不能觉醒和不能集中注意力都可能一定程度破坏记忆过程。因此，记忆问题的主诉必须与真正的健忘症区别。通常在床旁的更总体的评估中和通过特异性的神经心理测试而进行。通过所述测试可以区分视觉和语言记忆。在健忘症中，保留了其它智力活动能力，如逻辑。根据记忆的神经生物理论可以预测，健忘症应该具有相对少的病理生物改变。临床上，健忘症的问题通常是由于原本健康的人的突发疾病而出现的。健忘症被描述为陈述性记忆的特定缺陷。记忆的忠实编码需要信息的注册、编排和保留。前两个要素似乎涉及海马和中颞叶结构。保留或储存似乎涉及异模联合区。健忘症可以体验为失去储存的记忆或不能形成新的记忆。失去储存的记忆被称作逆行性健忘症。不能形成记忆被称作顺行性健忘症。可以由主题方法治疗的健忘症的示例形式包括短期健忘症、酒精中毒、Wernicke-Korsakoff’s(早期)、部分的复合性癫痫、瞬时总体健忘症、与药物，如三唑仑(Halcion)相关的健忘症和基底动脉性偏头痛。主题方法也可以用于治疗更长时间的健忘症，如脑震荡后的健忘症或单纯疱疹脑炎引起的健忘症。本发明的方法和组合物可以用于治疗任何其它的CNS相关状况，或减轻其严重程度。所述状况可以包括，例如，不能学习、记忆丧失状况、进食障碍或药物成瘾(如尼古丁成瘾)。在某些实施方案中，CNS相关状况不是神经退化性疾病和/或运动障碍。主题方法可以用于治疗需要改进陈述性记忆的正常个体。本发明的某些实施方案涉及治疗上文描述的任何障碍，更具体是抑郁和ADHD(成人或儿童)的方法，包括给受试者共同施用(例如，同时或不同时)足以治疗ADHD的注意力成分的量的Hh激动剂，并且任选施用足以治疗运动障碍成分的量的多巴胺再摄取抑制剂。预期Hh途径的激活上调合适的神经发生，并且增强突触传递，减轻由于神经元信号传递缺陷导致的ADHD的症状。在某些实施方案中，Hh激动剂和多巴胺再摄取抑制剂是同时施用的。在某些实施方案中，Hh激动剂和多巴胺再摄取抑制剂是作为单一组合物的一部分施用的。在某些实施方案中，该组合物由于口服施用或用于经皮施用。此外，本发明的一方面涉及使用Hh激动剂和多巴胺再摄取抑制剂的联合的方法和组合物。多种结构的多种多巴胺转运蛋白抑制剂(也称作多巴胺摄取抑制剂；此处称作活性化合物)是公知开的。参见，例如，S.Berger，美国专利No.5,217、987；J.Boja等(1995)Molec.Pharmacol.47779-786；C.Xu等(1995)Biochem.Pharmacol.49339-50；B.Madras等(1994)Eur.J.Pharmacol.267167-73；F.Carroll等(1994)J.Med.Chem.372865-73；A.Eshleman等(1994)Molec.Pharmacol.45312-16；R.Heikkila和L.Manzino(1984)Eur.J.Pharmacol.103241-8。概言之，多巴胺转运蛋白抑制剂是以立体特异性方式结合于多巴胺转运蛋白的配体。所述化合物的实例是
(1)三环抗抑郁剂，如buprion、诺米芬辛和安扑定；
(2)1，4-二取代的哌嗪或哌嗪类似物，如1-[2-[二(4-氟苯基)甲氧基]乙基]-4-(3-苯基丙基)哌嗪二盐酸盐(或GBR 12909)、1-[2-[二(苯基)甲氧基]乙基]-4-(3-苯基丙基)哌嗪二盐酸盐(或GBR12934)和GBR13069；
(3)托烷类似物，或(二取代的苯基)托烷-2β-羧酸甲基酯，如3[β]-(4-氟苯基)托烷-2[β]-羧酸甲基酯(或WIN 35,428)和3[β]-(4-碘苯基)托烷-2[β]-羧酸异丙基酯(RTI-121)；
(4)取代的哌啶或哌啶类似物，如N-[1-(2-苯并[β]苯硫基)环己基]哌啶、茚垂宁和4-[2-[二(4-氟苯基)甲氧基]乙基]-1-(3-苯基丙基)哌啶(或O-526)；
(5)喹喔啉衍生物或喹喔啉类似物，如7-三氟甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)吡咯并[1，2-[α]]-喹喔啉(或CGS 12066b)；和
(6)其它作为多巴胺再摄取抑制剂的化合物，如吗吲哚、苯托品、丁氨苯丙酮、苯环己哌啶、哌甲酯等。可以用多种刺激Hb信号传递途径的试剂实施本发明的方法。所述试剂包括Hh多肽及其功能等同物、小的生物活性分子、抗体等。Hh激动剂可以是Hh信号传递途径的抑制剂或阻抑剂。所述抑制剂的实例是RNAi构建体。这些试剂和包含其的组合物在下文详细描述。在某些优选实施方案中，用于实施本发明的方法的Hh激动剂以1mM或更小，更优选1μM或更小，甚至更优选1nM或更小的ED50激活Hh介导的信号转导。在某些实施方案中，可以通过施用Hh信号传递途径的阻抑物的RNAi调节剂而实施主题方法。Hh信号传递途径包含多个调节元件，其中的一些，如patched，被鉴定为负调节剂。这些负调节剂的抑制或拮抗将导致Hh信号传递途径的激活。在某些优选实施方案中，主题Hh激动剂可以在它们对Hh信号传递途径的选择性的基础上选择。该选择性是相对于其它途径，针对Hh信号传递途径，如与Hh途径共有某些成分的wingless途径，或者可以是使用一些同源物针对特定Hh信号传递途径之间的选择性，如ptc-1v.ptc-2，等。在其它实施方案中，可以通过施用基因激活构建体实施主题方法，其中基因激活构建体设计为与患者的基因组hh基因重组，以提供与hh基因的编码序列操作性连接的异源转录调节序列。在其它实施方案中，可以通过施用编码Hh多肽或其等同物的基因治疗构建体实施主题方法。例如，可以在选自重组病毒颗粒、脂质体和聚阳离子核酸结合剂的组合物中提供基因治疗构建体。这些治疗剂描述于下文。在此处描述的方法的一种实施方案中，受试者是能够受病症影响的任何动物或人工修饰的动物。受试者包括，但不限于，人、灵长类动物、马、羊、鸟类、牛、猪、犬科动物、猫科动物或鼠科动物受试者。在优选实施方案中，受试者是人。在此处描述的方法的一种实施方案中，通过以下任一途径施用试剂病变内、腹膜内、皮下、肌内或静脉内注射；输注；脂质体介导的送递；局部、鞘内、齿龈袋、直肠、支气管内、鼻、经粘膜、肠道、口服、眼、或耳送递。本发明的化合物和/或试剂可以经过胶囊送递，所述胶囊使得试剂或肽在一个时间段持续释放。受控或持续释放组合物包括亲脂储存物(如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明也包括聚合物(如poloxamers或poloxamines)包被的颗粒状组合物。本发明的组合物的其它生活方案包括用于多种施用途径，包括肠胃外、肺、鼻和口服途径的颗粒状形式的保护性包衣、蛋白酶抑制剂或通透增强剂。在某些实施方案中，在退化区域内或附近立体定位提供Hh激动剂。在此处描述的方法的一种实施方案中，试剂的有效量是约1mg-约50mg/kg受试者体重。在一种实施方案中，试剂的有效量是约2mg-约40mg/kg受试者体重。在一种实施方案中，试剂的有效量是约3mg-约20mg/kg受试者体重。但是，本领域技术人员可以理解，本发明的组合物的剂量将根据受试者和采用的特定施用途径而改变。调整剂量以适合各个受试者是本领域的常规技术。此外，有效量可以基于化合物的大小、化合物的生物可降解性、化合物的生物活性和化合物的生物利用度等。如果化合物不很快降解，是生物可利用的，并且具有高度活性，则有效量较小。可以每小时、每日、每周、每月、每年(如，以时间释放形式)或单次送递化合物。送递可以是在一段时间连续送递，如静脉内送递。在此处描述的方法的一个实施方案中，至少每日一次施用所述试剂。在一种实施方案中，每日施用所述试剂。在一种实施方案中，每隔一日施用所述试剂。在一种实施方案中，每6-8天施用所述试剂。在一种实施方案中，每周施用所述试剂。在某些实施方案中，该方法包括与刺激Hh信号传递途径的试剂共同施用一种或多种神经元生长因子、神经元存活因子或神经元营养因子。实例包括神经生长因子、睫状神经营养生长因子、施旺细胞瘤衍生的生长因子、胶质细胞生长因子、纹状体(striatal)衍生的神经营养因子、血小板衍生的生长因子和分散(scatter)因子(HGF-SF)。
多肽和突变体
在一种实施方案中，刺激所述途径的试剂是Hh多肽或其功能等同物。术语“功能等同物”包括多肽的片段、突变体和突变蛋白，其表现出与进行比较的蛋白相似的生物和生理功能。在某些实施方案中，通过化学部分修饰Hh多肽，以便增强它们的稳定性或改变它们对某些环境的溶解度或亲和力。所述修饰可以是在成熟的、加工过的细胞外结构域的一个或多个内部位点加入亲脂部分，并且也可以在成熟多肽的N-或C-末端残基用亲脂部分衍生化，或不衍生化。在其它实施方案中，在C-末端残基用除甾醇外的疏水部分修饰多肽。在其它实施方案中，在N-末端残基用环状(优选多环)亲脂基团修饰多肽。也考虑上述多种组合。如上文所讨论的，在脊椎动物中发现了hh家族的一些独特基因。示例的脊椎动物Hh多肽的氨基酸序列在此处描述为SEQ ID Nos1-8。也描述了单个果蝇Hh多肽。也描述了相应的核酸序列。根据所附序列表(也参见表1)，鸡Shh多肽由SEQ ID No1编码；小鼠Dhh多肽由SEQ ID No2编码；小鼠Ihh多肽由SEQ ID No3编码；小鼠Shh多肽由SEQ ID No4编码；斑马鱼Shh多肽由SEQ ID No5编码；人Shh多肽由SEQ ID No6编码；人Ihh多肽由SEQ ID No7编码；人Dhh多肽由SEQ ID No8编码；斑马鱼Thh多肽由SEQ ID No9编码。
表1.序列表中hedgehog序列的说明 优选地，用于本发明的方法和组合物的试剂是Hh多肽。更优选地，所述试剂是sonic Hh多肽。在一种实施方案中，所述试剂是Hh多肽的片段。更优选地，其是含有Hh多肽的受体的结合位点的N-末端片段。甚至更优选地，所述片段是人Hh多肽的19kDa N-末端片段。在另一种实施方案中，所述试剂是与描述为SEQ ID NOs10-18的任一Hh氨基酸序列具有至少60、70、80、90％氨基酸序列同源性的多肽。可以通过任何常规的分析算法评估同源性，如Pileup序列分析软件(Wisconsin软件包的程序手册、1996)。本发明的方法和组合物的试剂可以是Hh多肽的突变体。蛋白的“突变体”包括改变的氨基酸序列，例如，一个或多个氨基酸缺失、取代或添加，使得突变体保留结合未改变的蛋白的靶的能力。保守取代更容易产生与最初的蛋白功能等同的突变体。所述保守取代可以是以下各组内的取代(1)甘氨酸和丙氨酸；(2)缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；(3)天冬氨酸和谷氨酸；(4)天冬酰胺和谷氨酰胺；(5)丝氨酸和苏氨酸；(6)赖氨酸和精氨酸；(7)苯丙氨酸和酪氨酸。所述取代也可以是诸如以下各组内的取代的同源取代(a)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(b)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(c)赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(d)天冬氨酸和谷氨酸；(e)天冬酰胺和谷氨酰胺；(f)丝氨酸和苏氨酸；(g)半胱氨酸和甲硫氨酸。在另一优选实施方案中，本发明涉及调节，如模拟或拮抗Hh多肽的生物活性的多肽的用途，所述多肽由包含与SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8或SEQ ID No9之一指定的核苷酸序列相同或同源的基因的全部或部分编码区核苷酸序列编码。优选地，所述核酸包含在严格条件下与SEQ ID Nos1-9指定的一种或多种核酸的编码部分杂交的Hh编码部分。术语“等同”理解为包含编码功能等同的Hh多肽的核苷酸序列或具有诸如此处描述的脊椎动物Hh多肽的活性的功能等同的肽。等同的核苷酸序列包括通过一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，如等位基因变体；并且因此包括由于遗传密码简并性而与SEQ ID Nos1-9所示脊椎动物hh cDNAs的核苷酸序列不同的序列。等同物也包括在严格条件下(即，相当于比在约1M盐中形成的DNA双链体的解链温度(Tm)低约20-27℃)与SEQ ID Nos1-9中的一个或多个所代表的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在一种实施方案中，等同物将进一步包含衍生自、并且在进化上相关于SEQ ID Nos1-9的任意一个所示核苷酸序列的核酸序列。在更优选的实施方案中，用于本发明的编码Hh多肽的核酸在严格条件下与核酸探针杂交，所述探针相当于SEQ ID Nos1-9中一个或多个序列的有义或反义序列的至少12个连续核苷酸；优选SEQID Nos1-9中一个或多个序列的有义或反义序列的至少20个连续核苷酸；更优选至少40、50或75个连续核苷酸。
融合蛋白
在一种实施方案中，实施本发明的方法的试剂是包含Hh多肽和任意其它多肽部分，如标记物或另一种生物活性蛋白的全部或一部分的融合蛋白。可以在本发明的融合蛋白中包括其它结构域。广泛理解，融合蛋白也可以促进蛋白的表达，因此，可以用于表达本发明的Hh多肽。例如，融合蛋白可以包括促进其纯化的结构域，如“组氨酸标志”或谷胱甘肽-S-转移酶结构域。它们可以包括编码已知单克隆抗体所识别的多肽的“表位标志”，用于检测细胞内的蛋白或通过抗体体外捕获蛋白。在优选实施方案中，重组Hh多肽是含有促进其纯化的结构域的融合蛋白，如Hh/GST融合蛋白。在某些情况下，可能必须将非结构化的多肽接头区导入类似物肽和嵌合蛋白的其它部分之间。接头可以促进融合蛋白的增强的柔性。接头也可以减少融合蛋白的任意两个片段之间的空间位阻。接头也可以促进每个片段发生合适的折叠。接头可以是天然来源，如确定在蛋白的两个结构域之间的随机卷曲中存在的序列。示例的接头序列是RNA聚合酶亚基的C-末端和N-末端结构域之间的接头。天然存在的接头的其它实例包括1cI和LexA蛋白中的接头。或者，接头可以是合成来源。例如，序列(Gly4Ser)3可以用作合成的非结构化接头。该类型的接头描述于Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 854879；和美国专利No.5,091、513。在某些实施方案中，接头的设计优选包括需要接头跨相对短的距离，优选少于大约10的结构域的排列。但是，在某些实施方案中，根据例如选定的结构域和构型，接头可以跨最多至大约50的距离。在接头内，氨基酸序列可以根据接头的优选特征而改变，这是通过经验确定或通过建模而揭示的。例如，除了需要的长度，建模研究可以显示，某些氨基酸的侧基可能干扰融合蛋白的生物活性。选择接头的考虑包括接头的柔性、接头的电荷、以及接头的某些氨基酸在天然亚基中的存在。也可以设计接头，使得接头中的残基接触DNA，从而影响结合亲和力或特异性，或者与其它蛋白相互作用。例如，接头可以含有由蛋白酶识别的氨基酸序列，使得嵌合蛋白的活性可以受到切割的调节。在某些情况下，特别是当必须跨亚基间的较长距离时，或当结构域必须保持为特定构型时，接头可以任选包含额外的折叠的结构域。
蛋白的制备
可以通过本领域技术人员公知的任何方法制备此处描述的试剂。例如，可以通过从核酸重组表达而制备蛋白，所述核酸如包含编码核酸的质粒或载体，其中所述质粒或载体位于合适的宿主细胞中，即，用于产生目的多肽的宿主-载体系统。多种原核和真核表达系统是本领域技术人员公知可以用于蛋白和肽生产的，并且是可以商购的。可以用本领域技术人员公知的方法化学合成少于50个氨基酸的小多肽。可以用于本发明的单链构建体的哺乳动物细胞表达的多种细胞、细胞系和DNA序列在本领域中已经充分表征，并且很容易得到。重组蛋白的转染、表达和纯化的具体细节在本领域中有充分记录，并且是本领域普通技术人员能够理解的。用于哺乳动物细胞表达系统中外源基因的重组生产中每一步的多个技术方面的其它细节可以参见本领域的许多文字和实验室手册，如Ausubel等ed.、Current Protocolsin Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、(1989)。如本领域公知，可以通过标准生物技术生产Hh多肽。例如，可以在合适的条件下培养用指定编码主题多肽的核苷酸序列表达的核酸载体转染的宿主细胞，以便发生肽的表达。可以分泌Hh多肽，并且从细胞和含有重组Hh多肽的培养基的混合物中分离。或者，通过从重组hh基因除去信号肽，可以在细胞质中保留肽，收获细胞，裂解，并且分离蛋白。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其它副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域公知的。可以通过将编码Hh多肽的核酸或其部分连接到适于在原核细胞、真核细胞或这两者中表达的载体中，生产重组hh基因。用于生产重组形式的主题多肽的表达载体包括质粒和其它载体。例如，用于表达Hh多肽的合适载体包括以下类型的质粒用于在原核细胞，如大肠杆菌中表达的pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒。存在许多用于在酵母中表达重组蛋白的载体。例如，YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2和YRP17是用于将遗传构建体导入啤酒糖酵母的克隆和表达载体(参见，例如，Broach等(1983)in Experimental Manipulation of Gene Expression、ed.M.InouyeAcademic Press、p.83、在此引入作为参考)。由于pBR322 ori的存在，这些载体可以在大肠杆菌中复制，由于酵母2微米质粒的复制决定簇，能够在啤酒糖酵母中复制。此外，可以使用药物抗性标记物，如氨苄青霉素。在示例的实施方案中，利用通过亚克隆SEQ ID Nos1-9或19表示的hh基因之一的编码序列产生的表达载体重组产生Hh多肽。优选的哺乳动物表达载体包含两种原核序列，以促进载体在细菌中的增殖，以及在真核细胞中表达的一种或多种真核转录单位的增殖。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。这些载体中的一些用来自细菌质粒的序列如pBR322修饰，以促进原核和真核细胞中的复制和药物抗性选择。或者，诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或EB病毒(pHEBo、pREP-衍生的和p205)的病毒的衍生物可以用于蛋白在真核细胞中的瞬时表达。在宿主生物的质粒制备和转化中使用的多种方法是本领域公知的。对于原核和真核细胞的其它合适的表达系统，以及常用的重组程序，参见Sambrook、Fritsch和Maniatis编的MolecularCloningA Laboratory Manual第二版，第16和17章。在某些情况下，可能需要通过使用杆状病毒表达系统表达重组Hh多肽。所述杆状病毒表达系统的实例包括昆虫宿主细胞，如Sf9细胞和杆状病毒衍生的载体，如pVL-衍生的载体(如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW-衍生的载体(如pAcUWl)和pBlueBac-衍生的载体(如含β-gal的pBlueBac III)。当需要仅仅表达Hh多肽的一部分，如缺乏N-末端的一部分的形式，即缺乏信号肽的截短突变体时，可能需要添加起始密码子(ATG)到含有需要表达的序列的寡核苷酸片段。本领域公知，位于N-末端位置的甲硫氨酸可以用甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)酶促切割。已经从大肠杆菌(Ben-Bassat等(1987)J.Bacteriol.169751-757)和伤寒沙门氏菌克隆了MAP，并且在重组蛋白上证明了其体外活性(Miller等(1987)PNAS 842718-1722)。因此，如果需要，可以通过在产生MAP的宿主中表达Hh-衍生的多肽体内实现N-末端甲硫氨酸的去除，或通过使用纯化的MAP体外实现(如上文引用的Miller等的文献中的程序)。此外，为了修饰蛋白或其功能等同物的特性，本领域技术人员理解，可以在核酸水平，对已知的蛋白序列进行改变，例如，通过添加、取代或插入一个或多个核苷酸。定点诱变是可以用于制备突变蛋白的优选方法。本领域存在许多本领域技术人员公知的诱变方法，包括，但不限于采用PCR进行的定向于寡核苷酸的诱变，如Sambrook中描述的方法，或采用可商购的试剂盒。在确定哪些氨基酸残基构成受体结合域后，本领域技术人员可以设计具有限定预选的受体结合基序的氨基酸序列的合成肽。用于设计潜在具有生物活性的肽模拟物的计算机程序描述于美国专利No.5,331,573，在此引入其公开内容作为参考。除了选择需要的氨基酸序列，本领域技术人员可以采用标准的分子建模软件包设计特定肽，其具有例如位于预选位置的额外半胱氨酸，用于促进目的肽的环化。额外半胱氨酸残基的氧化导致肽的环化，从而在构象上将肽限制为模拟天然蛋白中的相应氨基酸序列的构象。认为通常用于环化合成肽的任何标准共价键，如二硫键，可以用于实施本发明。替代的环化化学讨论于国际申请PCT/WO95/01800，其公开内容在此引入作为参考。或者，可以采用标准固相肽合成程序，例如，类似Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.、852149中描述的程序合成作为小肽的类似物，通常长度最多50个氨基酸。例如，在合成过程中，具有受保护侧链的N-α-保护的氨基酸被逐步添加到生长中的肽链，所述肽链通过其C-末端与不溶的聚合物支持物，如聚苯乙烯珠连接。通过将N-α-保护的氨基酸的氨基连接于N-α-保护的氨基酸的被活化的α-羧基而合成肽，所述活化是通过将其与诸如二环己基碳二亚胺的试剂反应而实现的。游离氨基与活化的羧基的连接导致肽键形成。常用的N-α-保护的基团包括在酸中不稳定的Boc和在碱中不稳定的Fomc。合适的化学方法、树脂、保护基、受保护的氨基酸和试剂是本领域公知的，因此不在此详细讨论。参见，例如Atherton等(1963)Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach(IRL Press、)和Bodanszky(1993)Peptide Chemistry、A Practical Textbook、2nd Ed.、Springer-Verlag，和Fields等(1990)Int.J.Peptide Protein Res.35161-214，其公开内容在此引入作为参考。
蛋白回收和纯化
可以用本领域公知的用于纯化蛋白的技术，包括制备HPLC，如凝胶电泳、分配层析和/或离子交换层析、超滤、电泳和用所述肽的特异性抗体进行的免疫亲和纯化从细胞培养基、宿主细胞、或这两者分离重组Hh多肽。合适基质和缓冲液的选择是本领域公知的，因此在此不详细描述。通过将纯化标志，如对需要的蛋白或多肽添加的聚组氨酸工程化到表达载体中，可以容易地促进和实施表达的蛋白的纯化。通过采用Ni2+金属树脂的亲和层析，可以容易纯化聚(His)-Hh多肽。然后通过用肠激酶处理，可以除去聚(His)前导序列(参见，例如Hochuli等(1987)J.Chromatography 411177；和Janknecht等PNAS 888972)。例如，通过使用谷胱甘肽-衍生的基质，GST-融合蛋白能够实现Hh多肽的简便纯化(参见，例如Current Protocols inMolecular Biology、eds.Ausubel等(N.Y.John Wiley & Sons、1991))。
蛋白修饰
存在许多可以用来衍生Hh多肽的亲脂部分。在与Hh多肽连接的范畴中，术语“亲脂基团”是指具有高烃含量，从而产生对脂相的基团高亲和力的基团。亲脂基团可以是，例如，具有大约7-30个碳的相对长链的烷基或环烷基(优选n-烷基)。烷基可以终止于羟基或伯胺“尾”。为了进一步说明，亲脂分子包括天然存在和合成的芳族或非芳族部分，如脂肪酸、酯和醇、其它脂质分子、笼结构，如金刚烷和buckminsterfullerenes、以及芳烃，如苯、苝、菲、蒽、萘、芘、和并四苯。关于Hh多肽修饰的其它细节，参见美国申请No.09/579680，其公开内容在此全文引入作为参考。特别可以用作亲脂分子的是脂环烃、饱和和不饱和脂肪酸以及其它脂质和磷脂部分、蜡、胆固醇、类异戊二烯、萜、和多脂环烃，包括金刚烷和buckminsterfullerenes、维生素、聚乙二醇或低聚乙二醇、(C1-C18)-烷基磷酸二酯、-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-烷基，特别是与芘衍生物形成的缀合物。亲脂部分可以是适用于本发明的亲脂染料，包括，但不限于，二苯基己三烯、Nile Red、N-苯基-1-萘胺、Prodan、Laurodan、芘、苝、罗丹明、罗丹明B、四甲基罗丹明、TexasRed、磺基罗丹明、1，1′-双十二烷基-3，3，3′，3′四甲基靛青高氯酸盐、十八烷基罗丹明B和可购自Molecular Probes IDc的BODIPY染料。其它示例的亲脂部分包括脂族羰基，包括1-或2-金刚烷基乙酰基、3-甲基金刚烷-1-基乙酰基、3-甲基-3-溴-1-金刚烷基乙酰基、1-萘烷乙酰基、樟脑乙酰基、莰烷乙酰基、正金刚烷基乙酰基、正莰烷乙酰基、二环[2.2.2.]-八-5-烯乙酰基、1-甲氧基二环[2.2.2.]-八-5-烯-2-羰基、顺式-5-正莰烯-内-2，3-二羰基、5-正莰烯-2-基乙酰基、(1R)-(-)-myrtentaneacetyl、2-正莰烷乙酰基、反-3-氧-三环[2.2.1.0<2，6>]-庚烷-7-羰基、癸醇、十二烷醇、十二烯醇、十四碳二烯醇、癸炔醇或十二缺醇。
衍生Hh多肽
Hh多肽可以通过多种途径与疏水部分连接，包括通过化学偶联方式或通过基因工程。存在许多本领域公知的化学交联剂。对于本发明，优选的交联剂是异双官能交联剂，其可以用于以逐步方式连接Hh多肽和疏水部分。异双官能交联剂提供了设计用于缀合蛋白的更特异的偶联方法，从而减少不需要的副反应，如，同蛋白聚合物的存在。多种异双官能交联剂是本领域公知的。这些交联剂包括琥珀酰4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、m-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；N-琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SLAB)、琥珀酰亚氨基4-(p-马来酰亚氨基苯基)丁酸酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)；4-琥珀酰亚氨基氧羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基6-[3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯]己酸酯(LC-SPDP)。具有N-羟基琥珀酰亚胺部分的交联剂可以作为N-羟基琥珀酰亚胺类似物获得，其通常具有更高的水溶性。此外，具有交联链内的二硫桥的交联剂可以作为烷基衍生物合成，以便减少体内接头裂解的量。除了异双官能交联剂，存在许多其它交联剂，包括同双官能和光反应交联剂。二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)、二马来酰亚氨基己烷(BMH)和二甲基pimelimidate.2HCl(DMP)是有用的同双官能交联剂的例子，二-[β-(4-叠氮基水杨酰氨基)乙基]二硫化物(BASED)和N-琥珀酰亚氨基-6(4′-叠氮基-2′-硝基苯基-氨基)己酸酯(SANPAH)是用于本发明的光反应交联剂的例子。关于蛋白偶联技术的最近的综述，参见Means等(1990)Bioconjugate Chemistry 12-12，在此引入作为参考。包括前面所述的交联剂的一类特别有用的异双官能交联剂包含伯胺反应基团、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或其水溶性类似物N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)。在碱性pH条件下的伯胺(赖氨酸ε基团)是未质子化的，并且通过亲核攻击在NHS或磺基-NHS酯上反应。该反应导致酰胺键的形成以及NHS或磺基-NHS作为副产物释放。另一种用作异双官能交联剂的一部分的反应基团是硫醇反应基团。常用的硫醇反应基团包括马来酰亚胺、卤素和吡啶基二硫化物。马来酰亚胺在弱酸性到中性(pH 6.5-7.5)条件下数分钟内与游离巯基(半胱氨酸残基)特异性反应。卤素(碘乙酰基官能)在生理pH下与-SH基反应。这些反应基团都导致稳定硫醚键的形成。异双官能交联剂的第三个部分是间隔臂或桥。桥是连接两个反应末端的结构。桥的最明显的贡献是其对空间位阻的作用。在某些情况下，较长的桥可以更容易跨连接两个复杂生物分子必须的距离。例如，SMPB的跨度是14.5埃。用异双官能试剂制备蛋白-蛋白缀合物包括胺反应和巯基反应。对于第一步，即胺反应，选择的蛋白应包含伯胺。其可以是赖氨酸ε胺或大多数蛋白N-末端的α伯胺。蛋白不应该含有游离巯基。在偶联的两种蛋白都含有游离巯基的情况下，可以修饰一种蛋白，以便用例如N-乙基马来酰亚胺封闭所有巯基(参见，Partis et al.(1983)J.Pro.Chem.2263，在此引入作为参考)。也可以用Ellman试剂计算特定蛋白中的巯基量(例如，参见，Ellman等(1958)Arch.Biochem.Biophys.74443和Riddles等(1979)Anal.Biochem.9475，在此引入作为参考)。反应缓冲液应该不含外来的胺和巯基。反应缓冲液的pH应该是7.0-7.5。该pH范围防止马来酰亚胺基团与胺反应，保留马来酰亚胺基团，用于与巯基进行第二次反应。含有交联剂的NHS-酯具有有限的水溶性。它们应该在将交联剂导入反应混合物之前溶解在最小量的有机溶剂(DMF或DMSO)中。交联剂/溶剂形成允许反应发生的乳状液。磺基-NHS酯类似物在水中的溶解度更高，并且可以直接加入反应缓冲液中。应该避免高离子强度的缓冲液，因为它们具有从磺基-NHS酯中“盐析”的倾向。为了避免由于水解而失去反应性，在溶解蛋白溶液后立即将交联剂加入反应混合物。反应在浓缩的蛋白溶液中可以更有效。反应混合物的pH越碱性，反应速度越快。NHS和磺基-NHS酯的水解速度也随着pH的增加而增加。更高的温度将增加水解和酰化的反应速度。一旦反应完成，就用巯基反应部分活化第一种蛋白。可以通过简单的凝胶过滤或渗析，从反应混合物分离活化的蛋白。为了进行第二步的交联，即巯基反应，选择用于与马来酰亚胺、活化的卤素或吡啶基二硫化物反应的亲脂基团必须含有游离巯基。或者，可以修饰伯胺以添加巯基。在所有情况下，应该对缓冲液脱气，以防止巯基的氧化。可以加入EDTA，以螯合缓冲液中可能存在的任何氧化性金属。缓冲液应该不含任何含有巯基的化合物。马来酰亚胺与-SH基团在弱酸性到中性pH范围(6.5-7.5)特异性反应。中性pH对于包括卤素和吡啶基二硫化物的反应来说是足够的。在这些条件下，马来酰亚胺通常在数分钟内与-SH基团反应。对于卤素和吡啶基二硫化物，需要更长的反应时间。在合适的缓冲液条件下，将胺反应步骤中制备的第一种巯基反应性蛋白与含有巯基的亲脂基团混合。通过诸如凝胶过滤或渗析的方法，可以从反应混合物分离缀合物。用于偶联的示例的活化的亲脂部分包括N-(1-芘)马来酰亚胺；2，5-二甲氧基茋-4′-马来酰亚胺，曙红-5-马来酰亚胺；荧光素-5-马来酰亚胺；N-(4-(6-二甲基氨基-2-苯并呋喃基)苯基)马来酰亚胺；二苯酮-4-马来酰亚胺；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4′-马来酰亚胺(DABMI)，四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺，四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺，罗丹明RedTMC2马来酰亚胺，N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺，三氟乙酸盐，N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺、三氟乙酸盐，Oregon GreenTM488马来酰亚胺，N-(2-((2-(((4-叠氮基-2，3，5，6-四氟)苯甲酰基)氨基)乙基)二硫)乙基)马来酰亚胺(TFPAM-SS1)、2-(1-(3-二甲基氨基丙基)-吲哚-3-基)-3-(吲哚-3-基)马来酰亚胺(二吲哚基马来酰亚胺；GF109203X)，BODIPYFL N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺，N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACM)，AlexaTM488C5马来酰亚胺，AlexaTM594C5马来酰亚胺，钠盐N-(1-芘)马来酰亚胺，2，5-二甲氧基茋-4′-马来酰亚胺，曙红-5-马来酰亚胺，荧光素-5-马来酰亚胺，N-(4-(6-二甲基氨基-2-苯并呋喃基)苯基)马来酰亚胺，二苯酮-4-马来酰亚胺，4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4′-马来酰亚胺、1-(2-马来酰亚氨基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)唑-2-基)吡啶甲磺酸酯、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺，四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺、罗丹明RedTMC2马来酰亚胺、N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺，N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺，N-(2-((2-(((4-叠氮基-2，3，5，6-四氟)苯甲酰基)氨基)乙基)二硫)乙基)马来酰亚胺，2-(1-(3-二甲基氨基丙基)-吲哚-3-基)-3-(吲哚-3-基)马来酰亚胺，N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)马来酰亚胺(DACM)，11H-苯并[α]芘，苯并[α]芘。在一种实施方案中，可以用芘马来酰亚胺衍生Hh多肽，所述芘马来酰亚胺可以购自Molecular Probes(Eugene、OR)，如N-(1-芘)马来酰亚胺或1-芘甲基碘乙酸酯(PMIA酯)。如

图1所示，芘衍生的Hh多肽具有的活性谱表明其比修饰形式的蛋白的活性几乎高两个数量级。对于疏水部分是多肽的实施方案，本发明的修饰的Hh多肽可以构建为融合蛋白，其包含Hh多肽和作为一个连续肽链的疏水部分。在某些实施方案中，亲脂部分是两亲性多肽，如爪蟾抗菌肽、杀菌肽、attacin、蜂毒肽、短杆菌肽S、金黄色葡萄球菌的α毒素、丙甲甘肽或合成的两亲性多肽。病毒颗粒的融合包膜蛋白也可以是用于Hh多肽的两亲性序列的方便来源。
小分子
在某些实施方案中，刺激Hh信号传递途径的试剂是小分子激动剂。用于所述方法和组合物的化合物包括通式(I)代表的那些 式I其中，当化合价和稳定性允许时，Ar和Ar′独立地代表取代或未取代的芳环或杂芳环；
独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；Cy和Cy′独立地代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；并且独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，Ar和Ar′代表苯环，如未取代的或由一个或多个包括杂原子，如O、N和S的基团取代的苯环。在某些实施方案中，Ar和Ar′的至少一个代表苯环。在某些实施方案中，Ar和Ar′的至少一个代表杂芳环，如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶基等。在某些实施方案中，Y和Ar′以间位和/或1，3-关系连接于Ar。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在存在Y的实施方案中，i优选在邻接的Mi中代表1-2的整数，如果i＝0，则将导致出现的两个Y直接连接，或一个Y直接连接于N。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的芳基或杂芳基。在某些实施方案中，Cy′直接连接于X。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的双环或杂芳环，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中、X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，R代表H或低级烷基，如H或Me。在某些实施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳环或杂环，即，包括至少一个sp3杂化原子，并且优选包括多个sp3杂化原子。在某些实施方案中，Cy包括环的原子内的胺或环的取代基上的胺，如，Cy是吡啶基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等，和/或带有氨基取代基。在某些实施方案中，Cy是5-7元环。在某些实施方案中，Cy与N直接连接。在Cy是与N直接连接的6元环，并且带有位于环的相对于N的第4位上的氨基取代基的实施方案中，N和胺取代基可以在环上是反式的。在某些实施方案中，Ar和Ar′上的取代基选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式，其中独立地对于每一次出现，p和n代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，在本发明中有用的化合物可以由通式(II)代表 式II
其中，当化合价和稳定性允许时，Ar和Ar′独立地代表取代或未取代的芳环或杂芳环；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔，其中Mj中存在的M中的一些或全部形成环结构的全部或部分；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；Cy′代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；独立地对于每一次出现，j代表0-10，优选2-7的整数；并且独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，Ar和Ar′代表苯环，如未取代的或由一个或多个包括杂原子，如O、N和S的基团取代的苯环。在某些实施方案中，Ar和Ar′的至少一个代表苯环。在某些实施方案中，Ar和Ar′的至少一个代表杂芳环，如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶基等。在某些实施方案中，Y和Ar′以间位和/或1，3-关系连接于Ar。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在存在Y的实施方案中，i优选在邻接的Mi中代表1-2的整数，如果i＝0，则将导致出现的两个Y直接连接，或一个Y直接连接于N或NR2。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的芳基或杂芳基。在某些实施方案中，Cy′直接连接于X。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的双环或杂芳环，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中、X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，R代表H或低级烷基，如H或Me。在某些实施方案中，NR2代表分别由一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，优选伯胺或仲胺。在某些实施方案中，Ar和Ar′上的取代基选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR-、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式，其中独立地对于每一次出现，p和n代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，在本发明中有用的化合物可以由通式(III)代表 式III其中，当化合价和稳定性允许时，
Ar和Ar′独立地代表取代或未取代的芳环或杂芳环；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；Cy和Cy′独立地代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；并且独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，Ar和Ar′代表苯环，如未取代的或由一个或多个包括杂原子，如O、N和S的基团取代的苯环。在某些实施方案中，Ar和Ar′的至少一个代表苯环。在某些实施方案中，Ar和Ar′的至少一个代表杂芳环，如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶基等。在某些实施方案中，Y和Ar′以间位和/或1，3-关系连接于Ar。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在存在Y的实施方案中，i优选在邻接的Mi中代表1-2的整数，如果i＝0，则将导致出现的两个Y直接连接，或一个Y直接连接于N或NR2。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的芳基或杂芳基。在某些实施方案中，Cy′直接连接于X。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的双环或杂芳环，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中、X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，R代表H或低级烷基，如H或Me。在某些实施方案中，NR2代表分别由一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，优选伯胺或仲胺。在某些实施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳环或杂环，即，包括至少一个sp3杂化原子，并且优选包括多个sp3杂化原子。在某些实施方案中，Cy与N和/或NR2直接连接。在某些实施方案中，Cy是5-7元环。在Cy是与N直接连接的6元环，并且带有位于环的相对于N的第4位上的氨基取代基的实施方案中，N和胺取代基可以在环上是反式的。在某些实施方案中，Ar和Ar′上的取代基选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式，其中独立地对于每一次出现，p和n代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，在本发明中有用的化合物可以由通式(IV)代表 式IV
其中，当化合价和稳定性允许时，Cy′代表取代或未取代的芳环或杂芳环，包括多环；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；独立地，并且当化合价允许时，R1和R2代表与其连接的环上的0-5个取代基，选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式；Cy代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数；并且独立地对于每一次出现，p和n代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，Cy′代表取代或未取代的双环或杂环体系，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′与X直接连接。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在存在Y的实施方案中，i优选在邻接的Mi中代表1-2的整数，如果i＝0，则将导致出现的两个Y直接连接，或一个Y直接连接于N。在某些实施方案中、X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，R代表H或低级烷基，如H或Me。在某些实施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳环或杂环，即，包括至少一个sp3杂化原子，并且优选包括多个sp3杂化原子。在某些实施方案中，Cy包括环的原子内的胺或环的取代基上的胺，如，Cy是吡啶基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等，和/或带有氨基取代基。在某些实施方案中，Cy与N直接连接。在某些实施方案中，Cy是5-7元环。在Cy是与N直接连接的6元环，并且带有位于环的相对于N的第4位上的氨基取代基的实施方案中，N和胺取代基可以在环上是反式的。在某些实施方案中，独立地，并且当化合价允许时，R1和R2代表与其连接的环上的0-5个取代基，选自卤素、低级烷基、低级链烯基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式。在某些实施方案中，在本发明中有用的化合物可以由通式(V)代表
式V其中，当化合价和稳定性允许时，Cy′代表取代或未取代的芳环或杂芳环，包括多环；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；独立地，并且当化合价允许时，R1和R2代表与其连接的环上的0-5个取代基，选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式；Cy′代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；独立地对于每一次出现，j代表0-10，优选2-7的整数；独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数；并且独立地对于每一次出现，p和n代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，Cy′代表取代或未取代的双环或杂环体系，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′与X直接连接。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在存在Y的实施方案中，i优选在邻接的Mi中代表1-2的整数，如果i＝0，则将导致出现的两个Y直接连接，或一个Y直接连接于N或NR2。在某些实施方案中、X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，NR2代表分别由一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，优选伯胺或仲胺。在某些实施方案中，R代表H或低级烷基，如H或Me。在某些实施方案中，独立地，并且当化合价允许时，R1和R2代表与其连接的环上的0-5个取代基，选自卤素、低级烷基、低级链烯基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式。在某些实施方案中，在本发明中有用的化合物可以由通式(VI)代表 式VI
其中，当化合价和稳定性允许时，Cy′代表取代或未取代的芳环或杂芳环，包括多环；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；Cy代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；独立地，并且当化合价允许时，R1和R2代表与其连接的环上的0-5个取代基，选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式；独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数；并且独立地对于每一次出现，p和n代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，Cy′代表取代或未取代的双环或杂环体系，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′与X直接连接。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在存在Y的实施方案中，i优选在邻接的Mi中代表1-2的整数，如果i＝0，则将导致出现的两个Y直接连接，或一个Y直接连接于N或NR2。在某些实施方案中、X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，NR2代表分别由一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，优选伯胺或仲胺。在某些实施方案中，R代表H或低级烷基，如H或Me。在某些实施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳环或杂环，即，包括至少一个sp3杂化原子，并且优选包括多个sp3杂化原子。在某些实施方案中，Cy与N和/或NR2直接连接。在某些实施方案中，Cy是5-7元环。在Cy是与N直接连接的6元环，并且带有位于环的相对于N的第4位上的氨基取代基的实施方案中，N和胺取代基可以在环上是反式的。在某些实施方案中，独立地，并且当化合价允许时，R1和R2代表与其连接的环上的0-5个取代基，选自卤素、低级烷基、低级链烯基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式。在某些实施方案中，主题化合物具有式VII的结构 式VII其中，当化合价和稳定性允许时，Cy代表取代或未取代的杂环基或环烷基；Cy′是取代或未取代的芳环或杂芳环，包括多环；W是O或S；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；独立地，并且当化合价允许时，R1和R2代表与其连接的环上的0-5个取代基，选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、酰胺基、脒基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式；独立地对于每一次出现，p和n代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，Cy′代表取代或未取代的双环或杂环体系，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些其它实施方案中，Cy′代表至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，NR2代表分别由一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，优选伯胺或仲胺。在某些实施方案中，Cy代表取代或未取代的饱和碳环或杂环，即，包括多个sp3杂化原子。在某些实施方案中，Cy是5-7元环。在Cy是与N直接连接的6元环，并且带有位于环的相对于N的第4位上的氨基取代基的实施方案中，N和胺取代基可以在环上是反式的。在某些实施方案中，独立地，并且当化合价允许时，R1和R2代表与其连接的环上的0-5个取代基，选自卤素、低级烷基、低级链烯基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式。在某些实施方案中，主题化合物具有式VIII的结构
式VIII其中，当化合价和稳定性允许时，U代表取代或未取代的、与含氮的环稠合的芳环或杂芳环；V代表低级亚烷基，如亚甲基、1，2-亚乙基、1，1-亚乙基、1，1-亚丙基、1，2-亚丙基、1，3-亚丙基等；W代表S或O，优选O；X代表C＝O、C＝S或SO2；R3代表取代或未取代的芳基、杂芳基、低级烷基、低级链烯基、低级炔基、碳环基、碳环基烷基、杂环基、杂环基烷基、芳烷基或杂芳烷基；R4代表取代或未取代的芳烷基或低级烷基，如苯乙基、苄基或氨基烷基等；R5代表取代或未取代的芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，包括多环芳基或杂芳基。在某些实施方案中，U代表与含氮的环稠合的苯环。在某些实施方案中，R3选自取代或未取代的芳基、杂芳基、低级烷基、低级链烯基、芳烷基和杂芳烷基。在某些实施方案中，R4是未取代低级烷基，或由仲胺或叔胺取代的低级烷基。在某些实施方案中，R5选自取代或未取代的苯基或萘基，或是二芳基烷基，如2，2-二苯基乙基、二苯基甲基等。在某些实施方案中，主题化合物包括通式(IX)代表的化合物 通式IX
其中，当化合价和稳定性允许时，Ar代表取代或未取代的芳环或杂芳环；Z不存在或代表取代或未取代的芳基、碳环基、杂环基或杂芳环，或低级烷基、硝基、氰基或卤素取代基；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-，前提是如果Z不是环，则连接于Z的Y不存在；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；Cy和Cy′独立地代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数；并且k代表0-3，优选0-2的整数。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，对于除序列N-Mi-Y-Ar中之外的每一次出现，i代表0，在序列N-Mi-Y-Ar中，i代表1。在某些实施方案中，Ar和X独立地代表取代或未取代的芳环或杂芳环，如未取代或由一个或多个任选包括杂原子，如O、N和S的基团取代。在某些实施方案中，Ar代表苯环。在某些实施方案中，Ar的至少一个代表杂芳环，如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶基、呋喃基等。在某些实施方案中，Y以间位和/或1，3-关系连接于Ar。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在某些实施方案中，仅有的Y连接于Mk。在存在Y的实施方案中，i或k优选在邻接的Mi/k中代表2，如果i/k＝0，则将导致出现的两个Y直接彼此连接，或一个Y直接连接于N。在某些实施方案中，当出现的两个Y连接于M时，至少一个所述Y不存在。在某些实施方案中，存在不超过两个Y。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的芳基或杂芳基。在某些实施方案中，Cy′与X直接连接。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的双环或杂环，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中、Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，优选3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，如其中苯环由1-4个选自卤素、硝基、氰基、甲基(如包括卤代甲基，如CHCl2和CF3)和乙基(如包括卤代乙基，如CH2CCl3、C2F5等)，优选选自卤素和甲基(如包括卤代甲基，如CHCl2和CF3)的取代基取代。在某些所述实施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中苯环由第4位的氟(与噻吩环上的3-取代基是邻位)和任选第7位的氟(与噻吩环的S是邻位)取代。在某些实施方案中，X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳环或杂环，即，包括至少一个sp3杂化原子，并且优选包括多个sp3杂化原子。在某些实施方案中，Cy包括环的原子内的胺或环的取代基上的胺，如，Cy是吡啶基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等，和/或带有氨基取代基。在某些实施方案中，Cy是5-7元环。在某些实施方案中，Cy与N直接连接。在Cy是与N直接连接的6元环，并且带有位于环的相对于N的第4位上的氨基取代基的实施方案中，N和胺取代基可以在环上是反式的。在某些实施方案中，当Z是芳环或杂芳环时，Ar或Z上的取代基选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式，其中独立地对于每一次出现，n和p代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，Z直接连接于Ar，或通过一个或两个原子的链连接于Ar。在某些实施方案中，Z-Y-M一起不存在。
在某些实施方案中，在本发明中有用的化合物可以由通式(X)代表 式X其中，当化合价和稳定性允许时，Ar代表取代或未取代的芳环或杂芳环；Z不存在或代表取代或未取代的芳基、碳环基、杂环基或杂芳环，或低级烷基、硝基、氰基或卤素取代基；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-，前提是如果Z不是环，则连接于Z的Y不存在；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；
Cy′代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔，其中Mj中存在的M中的一些或全部形成环结构的全部或部分；独立地对于每一次出现，j代表0-10，优选2-7的整数；独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数；并且k代表0-3，优选0-2的整数。
在某些实施方案中，NR2代表分别由一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，优选伯胺或仲胺。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，对于除序列N-Mi-Y-Ar中之外的每一次出现，i代表0，在序列N-Mi-Y-Ar中，i代表1。在某些实施方案中，Ar和X独立地代表取代或未取代的芳环或杂芳环，如未取代或由一个或多个任选包括杂原子，如O、N和S的基团取代。在某些实施方案中，Ar代表苯环。在某些实施方案中，Ar代表杂芳环，如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶基、呋喃基等。在某些实施方案中，Y以间位和/或1，3-关系连接于Ar。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在某些实施方案中，仅有的Y连接于Mk。在存在Y的实施方案中，i或k优选在邻接的Mi/k中代表2，如果i/k＝0，则将导致出现的两个Y直接彼此连接，或一个Y直接连接于N。在某些实施方案中，当出现的两个Y连接于M时，至少一个所述Y不存在。在某些实施方案中，存在不超过两个Y。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的芳基或杂芳基。在某些实施方案中，Cy′与X直接连接。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的双环或杂环，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中、Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，优选3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，如其中苯环由1-4个选自卤素、硝基、氰基、甲基(如包括卤代甲基，如CHCl2和CF3)和乙基(如包括卤代乙基，如CH2CCl3、C2F5等)，优选选自卤素和甲基(如包括卤代甲基，如CHCl2和CF3)的取代基取代。在某些所述实施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中苯环由第4位的氟(与噻吩环上的3-取代基是邻位)和任选第7位的氟(与噻吩环的S是邻位)取代。在某些实施方案中，X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，当Z是芳环或杂芳环时，Ar或Z上的取代基选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式，其中独立地对于每一次出现，n和p代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，Z直接连接于Ar，或通过一个或两个原子的链连接于Ar。在某些实施方案中，Z-Y-M一起不存在。
在某些实施方案中，在本发明中有用的化合物可以由通式(XI)代表
式XI其中，当化合价和稳定性允许时，Ar代表取代或未取代的芳环或杂芳环；Z不存在或代表取代或未取代的芳基、碳环基、杂环基或杂芳环，或低级烷基、硝基、氰基或卤素取代基；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-，前提是如果Z不是环，则连接于Z的Y不存在；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；Cy和Cy′独立地代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；独立地对于每一次出现，i代表0-5，优选0-2的整数；并且k代表0-3，优选0-2的整数。在某些实施方案中，NR2代表分别由一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，优选伯胺或仲胺。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，Ar和Z独立地代表取代或未取代的芳环或杂芳环，如未取代或由一个或多个任选包括杂原子，如O、N和S的基团取代。在某些实施方案中，Ar和Z的至少一个代表苯环。在某些实施方案中，Ar和Z的至少一个代表杂芳环，如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶基、呋喃基等。在某些实施方案中，Y以间位和/或1，3-关系连接于Ar。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在某些实施方案中，仅有的Y连接于Mk。在存在Y的实施方案中，i或k优选在邻接的Mi/k中代表2，如果i/k＝0，则将导致出现的两个Y直接彼此连接，或一个Y直接连接于N。在某些实施方案中，当出现的两个Y连接于M时，至少一个所述Y不存在。在某些实施方案中，存在不超过两个Y。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的芳基或杂芳基。在某些实施方案中，Cy′与X直接连接。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的双环或杂环，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中、Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，优选3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，如其中苯环由1-4个选自卤素、硝基、氰基、甲基(如包括卤代甲基，如CHCl2和CF3)和乙基(如包括卤代乙基，如CH2CCl3、C2F5等)，优选选自卤素和甲基(如包括卤代甲基，如CHCl2和CF3)的取代基取代。在某些所述实施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中苯环由第4位的氟(与噻吩环上的3-取代基是邻位)和任选第7位的氟(与噻吩环的S是邻位)取代。在某些实施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳环或杂环，即，包括至少一个sp3杂化原子，并且优选包括多个sp3杂化原子。在某些实施方案中，Cy是5-7元环。在某些实施方案中，Cy与N和/或NR2直接连接。在Cy是与N直接连接的6元环，并且带有位于环的相对于N的第4位上的氨基取代基的实施方案中，N和胺取代基可以在环上是反式的。在某些实施方案中，X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，当Z是芳环或杂芳环时，Ar或Z上的取代基选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式，其中独立地对于每一次出现，n和p代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，Z直接连接于Ar，或通过一个或两个原子的链连接于Ar。在某些实施方案中，Z-Y-M一起不存在。
在某些实施方案中，在本发明中有用的化合物可以由通式(XII)代表 式XII其中，当化合价和稳定性允许时，Ar代表取代或未取代的芳环或杂芳环；
Z不存在或代表取代或未取代的芳基、碳环基、杂环基或杂芳环，或低级烷基、硝基、氰基或卤素取代基；独立地对于每一次出现，Y不存在或代表-N(R)-、-O-、-S-或-Se-，前提是如果Z不是环，则连接于Z的Y不存在；X选自任选由1-2个诸如低级烷基、链烯基或炔基的基团取代的-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(O2)-、-S(O)-、-C(＝NCN)-、-P(＝O)(OR)-和亚甲基；独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等，或两个M一起代表取代或未取代的乙烯或乙炔；独立地对于每一次出现，R代表H或取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、炔基、链烯基或烷基，或两个R一起可以形成4-8元环，如与N形成4-8元环；Cy和Cy′独立地代表取代或未取代的芳基、杂环基、杂芳基或环烷基，包括多环基团；并且k代表0-3，优选0-2的整数。在某些实施方案中，NR2代表分别由一个或两个低级烷基、芳基或芳烷基取代的伯胺或仲胺或叔胺，优选伯胺或仲胺。在某些实施方案中，独立地对于每一次出现，M代表取代或未取代的亚甲基，如-CH2-、-CHF-、-CHOH-、-CH(Me)-、-C(＝O)-，等。在某些实施方案中，所有位置都不存在Y。在某些实施方案中，当Y邻接于Mk时，Y不存在或k＝0。在某些实施方案中，对于至少一个出现的连接于Cy的Mk，k＝0，任选对于两次出现都是如此。在某些实施方案中，对于连接于Ar和N的Mk，k＝1。在某些实施方案中，Ar和Z独立地代表取代或未取代的芳环或杂芳环，如未取代或由一个或多个任选包括杂原子，如O、N和S的基团取代。在某些实施方案中，Ar和Z的至少一个代表苯环。在某些实施方案中，Ar和Z的至少一个代表杂芳环，如吡啶基、噻唑基、噻吩基、嘧啶基、呋喃基等。在某些实施方案中，Y以间位和/或1，3-关系连接于Ar。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的芳基或杂芳基。在某些实施方案中，Cy′与X直接连接。在某些实施方案中，Cy′是取代或未取代的双环或杂环，优选既是双环又是杂芳环，如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并吡咯、苯并嘧啶等。在某些实施方案中，Cy′是至少由取代或未取代的芳环或杂芳环取代的单环芳环或杂芳环，即，形成双芳环体系。在某些实施方案中，Cy′包括两个取代或未取代的芳环或杂芳环，其例如是相同或不同的，通过一个或多个键直接连接，例如，形成双芳环或双环体系。在某些实施方案中、Cy′代表苯并(b)噻吩-2-基，优选3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，如其中苯环由1-4个选自卤素、硝基、氰基、甲基(如包括卤代甲基，如CHCl2和CF3)和乙基(如包括卤代乙基，如CH2CCl3、C2F5等)，优选选自卤素和甲基(如包括卤代甲基，如CHCl2和CF3)的取代基取代。在某些所述实施方案中，Cy′代表3-氯-苯并(b)噻吩-2-基、3-氟-苯并(b)噻吩-2-基或3-甲基-苯并(b)噻吩-2-基，其中苯环由第4位的氟(与噻吩环上的3-取代基是邻位)和任选第7位的氟(与噻吩环的S是邻位)取代。在某些实施方案中，Cy代表取代或未取代的非芳族碳环或杂环，即，包括至少一个sp3杂化原子，并且优选包括多个sp3杂化原子。在某些实施方案中，Cy是5-7元环。在某些实施方案中，Cy与N和/或NR2直接连接。在Cy是与N直接连接的6元环，并且带有位于环的相对于N的第4位上的氨基取代基的实施方案中，N和胺取代基可以在环上是反式的。在某些实施方案中，X选自-C(＝O)-、-C(＝S)-和-S(O2)-。在某些实施方案中，当Z是芳环或杂芳环时，Ar或Z上的取代基选自卤素、低级烷基、低级链烯基、芳基、杂芳基、羰基、硫代羰基、酮、醛、氨基、酰氨基、氰基、硝基、羟基、叠氮基、磺酰基、亚砜基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、亚磺酰氨基、磷酰基、膦酸酯、次膦酸酯、-(CH2)p烷基、-(CH2)p链烯基、-(CH2)p炔基、-(CH2)p芳基、-(CH2)p芳烷基、-(CH2)pOH、-(CH2)pO低级烷基、-(CH2)pO低级链烯基、-O(CH2)nR、-(CH2)pSH、-(CH2)pS-低级烷基、-(CH2)pS-低级链烯基、-S(CH2)nR、-(CH2)pN(R)2、-(CH2)pNR-低级烷基、-(CH2)pNR-低级链烯基、-NR(CH2)nR，及上述基团的受保护形式，其中独立地对于每一次出现，n和p代表0-10，优选0-5的整数。在某些实施方案中，Z直接连接于Ar，或通过一个或两个原子的链连接于Ar。在某些实施方案中，Z-Y-M一起不存在。
抗体
在此处描述的本发明的一个实施方案中，刺激Hh信号传递途径的试剂是抗体或其片段。本发明的一个实施方案是抗Hh多肽的抑制剂的抗体，所述抑制剂与Patched蛋白，即一种认为的Hh多肽受体竞争性结合Hh多肽。某些抗所述抑制剂的抗体模拟与抑制剂结合的Hh多肽的区域，所述区域可以是与Hh受体结合的区域。因此，所述抗体与Patched蛋白结合，并且与Hh多肽类似，在细胞中引发相似类型的反应。本发明的另一个实施方案是抗独特型抗体。抗独特型抗体是抗第一抗体的。某些抗独特型抗体模拟第一抗体的表位的内部图像，从而也模拟第一抗体所针对的抗原的活性。参见，例如，Ma、J.等，(2002)Japan.J.Cancer Res.93(1)78-84；Depraetere、H.等、(2000)Eur.J.Biochem.267(8)2260-7；Rajeshwari、K.and Karande、A.A.、(1999)Immunol.Invest.28(2-3)103-14。抗特异于Hh多肽的参与与受体功能性结合的位点的抗体的抗独特型抗体与Hh多肽上的所述位点呈镜像结构。因此，所述抗独特型抗体也结合于Hh多肽的受体，并且引发生物学相关的反应。以与产生任何抗体相似的方式产生抗独特型抗体。用于本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。此处使用的“单克隆抗体”也表示为mAb，其用于描述一级序列基本相同并且表现出相同抗原特异性的抗体分子。可以通过杂交瘤、重组、转基因或其它本领域公知的技术产生单克隆抗体。此外，存在在转基因动物或植物中产生单克隆抗体的方法(Pollock等，J.Immunol.Methods、231147、1999；Russell、Curr.Top.Microbiol.Immunol.240119，1999)。在一种实施方案中，抗体的部分包括抗体的轻链。如此处使用的，“轻链”表示包含一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)或其片段的抗体分子的较小多肽。在一种实施方案中，抗体的部分包括抗体重链。如此处使用的，“重链”表示包含一个可变区(VH)和三个或四个恒定区(CH1、CH2、CH3和CH4)或其片段的抗体分子的较大多肽。在一种实施方案中，抗体的部分包括抗体的Fab部分。如此处使用的，“Fab”表示由一个轻链和重链的一部分组成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。在一种实施方案中，抗体的部分包括抗体的Fab(ab′)2部分。如此处使用的，“Fab(ab′)2片段”表示由两条轻链和两条重链的一部分组成的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。可以通过简单的胃蛋白酶消化或重组方法获得Fab和Fab(ab′)2。在一种实施方案中，抗体的部分包括抗体的一个或多个CDR区。如此处使用的，“CDR”或“互补决定区”表示抗体可变区中的高度可变的氨基酸序列，其直接与抗体的表位相互作用。抗体的可变区也含有构架区(FRs)，其维持抗原互补位的三级结构(总体上参见Clark、1986；Roitt、1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中，存在四个构架区(FR1-FR4)，其分别由三个互补决定区(CDR1-CDR3)隔开。CDRs，特别是CDR3区，更特别是重链CDR3，很大程度上负责抗体特异性。本领域已经确定，哺乳动物的非CDR区可以由同特异性或异特异性抗体的相似区域替代，而同时保留原始抗体的表位特异性。这在“人源化”抗体的开发和使用中最明确展示，所述人源化抗体中非人CDRs与人FR和/或Fc/pFc′区共价结合，以产生功能性抗体。抗体可以是人或非人抗体。可以通过重组方法对非人抗体“人源化”，以减少其在人类中的免疫原性。用于使抗体人源化的方法是本领域技术人员公知的。如此处使用的，“人源化”描述了这样的抗体，其中CDR区外的一些、大多数或所有氨基酸被来源于人免疫球蛋白分子的相应氨基酸替代。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR区外的一些、大多数或所有抗体被来自于人免疫球蛋白分子的氨基酸替代，但其中一个或多个CDR区内的一些、大多数或所有氨基酸没有改变。氨基酸的小的添加、缺失、插入、取代或修饰是可以允许的，只要它们不消除抗体结合指定抗原的能力。合适的人免疫球蛋白分子包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM分子。“人源化”抗体将保留与原始抗体相似的抗原特异性。人源化的方法包括，但不限于美国专利4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,761、5,693,762和5,859,205中描述的那些，所述专利在此引入作为参考。本领域技术人员熟悉用于抗体人源化的其它方法。采用某些人源化方法，可以用Wu等，J.Mol.Biol.294151、1999中描述的“定向进化”方法增加抗体结合的亲和力和/或特异性，在此引入所述文献作为参考。也可以通过免疫对人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大部分是转基因的小鼠，制备全人抗体。参见，例如美国专利5,591,669、5,598,369、5,545,806、5,545,807、6,150,584和其中的参考文献，其内容在此引入作为参考。这些动物进行了遗传修饰，使得内源(如鼠)抗体的产生存在功能性缺陷。对动物进行进一步修饰，以包含人种系免疫球蛋白基因座的全部或部分，使得这些动物的免疫将导致感兴趣抗原的全人抗体的产生。在这些小鼠(如XenoMouse(Abgenix)、HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))的免疫后，可以根据标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体将具有人免疫球蛋白序列，并且因此当施用于人时，将不引起人抗-小鼠抗体(HAMA)应答。也存在用于产生人抗体的体外方法。这些方法包括噬菌体展示技术(美国专利5,565,332和5,573,905)和人B细胞的体外刺激(美国专利5,229,275和5,567,610)。这些专利的内容在此引入作为参考。
RNA干扰在一种实施方案中，Hh激动剂是RNA干扰(RNAi)分子。RNAi构建体包含可以特异性阻断靶基因表达的双链RNA。因此，特异性阻断负调节Rh信号传递途径的基因表达的RNAi构建体可以作为Hh信号传递途径的激动剂。“RNA干扰”或“RNAi”是最初用于在植物和蠕虫中观察到的一种现象的术语，其中双链RNA(dsRNA)以特异性和转录后方式阻断基因表达。不受理论的限制，RNAi似乎参与mRNA降解；但是，生化机理目前是活跃的研究领域。尽管关于作用机理存在某些不确定性，RNAi提供了体外或体内抑制基因表达的有用方法。在优选实施方案中，本发明的hhRNAi激动剂是siRNA，其是从编码短发夹(茎-环)siRNA，即一种合成siRNA的DNA载体转录，或者是可以加工成较短siRNA(如21-23个核苷酸)的较长dsRNA，编码干扰Hh信号传递途径的负控制元件，如Patched或Gli-3的表达的序列。RNAi构建体包含在细胞的生理条件下与要抑制的基因(即靶基因)的mRNA转录物的至少一部分的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。双链RNA仅需要与天然RNA足够相似，使得它具有介导RNAi的能力。因此，本发明具有能耐受序列变异的优点，所述变异由于基因突变、株多态性或进化趋异性而可能是能够预期的。靶基因和RNAi构建体序列间的耐受的核苷酸错配数不超过5个碱基对中有1个，或10个碱基对中有1个，或20个碱基对中有一个，或50个碱基对中有一个。siRNA双链体中心的错配是最关键的，可能基本上消除靶RNA的切割。相反，位于与靶RNA互补的siRNA链3’末端的核苷酸不显著导致靶识别的特异性。通过本领域公知的序列比较和比对算法(参见Gribskov andDevereux、Sequence Analysis Primer、Stockton Press、1991及其中引用的参考文献)，并且通过例如采用缺省参数的BESTFIT软件程序(例如University of Wisconsin Genetic Computing Group)中的Smith-Waterman算法计算核苷酸序列之间的百分比差异，可以优化序列同一性。抑制性RNA和靶基因的部分之间优选具有超过90％的序列同一性，或甚至100％序列同一性。或者，RNA的双链区可以功能上确定为能与靶基因转录物的一部分杂交的核苷酸序列(如400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时，然后洗涤)。
RNAi的示例的靶
下面列出的基因是Hh信号传递途径的负调节剂。抑制负调节剂的hh RNAi激动剂能够用于上调Hh信号传递途径，例如，在涉及Hh信号传递活性过低的条件下，或在需要上调Hh途径信号传递时进行上调。
表2.Hedgehog信号传递的负调节剂
*来自公共数据库的核苷酸序列编号列于“()”中。Patched在不存在Hh多肽的情况下抑制另一种膜结合的蛋白，即Smoothened。Patched和Smoothened的缔合使得能够产生一种细胞内高分子量蛋白复合物，其包含驱动蛋白相关的分子Costal2(Cos2)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶Fused(Fu)和Fused的蛋白阻抑物[Su(fu)]，以促进全长Cubitus interruptus(Cil55)的蛋白水解加工，从而产生转录阻遏物Ci75。尽管还没有证明与这种高分子量复合物直接相互作用，蛋白激酶A(PKA)、糖原合酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶1α(CK1α)也修饰Ci，以调节其切割。该过程也依赖于Slimb。Hh与Ptc的结合缓解了Smo的抑制，并且通过未知的机理，Smo抑制细胞质复合物的Ci加工活性。然后未加工的Cil55易位到细胞核，在此激活特定靶基因的表达。人类中的散发肿瘤证明了patched的两个功能性等位基因都丧失。在用单链构象多态性筛选测定鉴定出patched突变的12种肿瘤中，9种具有第二等位基因的染色体缺失，而其它三种在两个等位基因中都具有的灭活突变(Gailani、supra)。大多数鉴别的突变导致提前出现的终止密码子或移码(Lench、N.J.等(1997)Hum.Genet.100(5-6)497-502)。此外，存在一些鉴定的突变，它们是导致细胞外或细胞质结构域中的氨基酸取代的点突变。所述改变不存在于相应的种系DNA中。果蝇patched基因的一个例子表示在SEQ ID No23中。patched参与基因表达的抑制，以及patched的频繁等位基因缺失在BCC途径中的出现，支持了该基因的肿瘤阻遇物功能。已知其在基因家族调节中的作用是参与细胞信号传递和细胞内联系，这提供了肿瘤阻抑的可能机理。最近，Lum等(Science(2003)2992039-2045)鉴定了Hh信号传递途径的一些其它成员。采用体外和体内测定，这些作者鉴定了四种基因，其产物以前不被认为在Hh信号传递中有特异性作用在这四种基因中，CK1α是负调节剂，而其它三种是正调节剂。CK1α是Ci切割的正调节剂，Ci切割是产生其阻遏物形式的过程Price andKalderon(2002)Cell 108823-835，图1)。因此，CK1α是Hh信号传递的负调节剂。可以常规地从公共和私有数据库，如GenBank、EMBL、FlyBase等获得多个物种的所有Hh信号传递途径基因。在某些生物，如人和果蝇中，对全基因组进行测序，并且可以用序列比较程序，如NCBI网站上在线提供的BLAST程序系列检索任何已知Hh信号传递途径基因的最近更新的序列。下文的表列出了多个物种中已知Hh信号传递途径基因的一些代表性成员。其不是无遗漏的，因此不应认为是限制性的。相反，它作为无遗漏检索的有用的起点，本领域技术人员能够用常规的生物技术进行这些检索。一些基因可以具有一些不同的数据库条目，其具有不同编号，但序列仍然是相同或几乎相同的。尽管如此，上文表中提供了每种基因的仅仅一个条目。
示例的RNAi构建体
在某些实施方案中，主题RNAi构建体是“小干扰RNAs”或“siRNAs”。这些核酸的长度是大约19-30个核苷酸，甚至更优选21-23个核苷酸，例如，相当于由更长双链RNAs的核酸酶“切割”产生的片段的长度。siRNA是双链的，并且可以在每个末端包含短的突出端。优选地，突出端在3’末端的长度是1-6个核苷酸。本领域公知，siRNAs可以化学合成，或者衍生自更长的双链RNA或发夹RNA。siRNAs与靶RNA具有显著的序列相似性，因此siRNAs可以与靶RNA配对，导致通过RNA干扰机制进行的靶RNA的序列特异性降解。可以理解，siRNAs募集核酸酶复合物，并且通过与特异性序列配对，指导复合物到靶mRNA。因此，靶mRNA被蛋白复合物中的核酸酶降解。在特定实施方案中，21-23个核苷酸的siRNA分子包含3’羟基。在某些优选实施方案中，siRNA分子的至少一条链具有长度为约1-约6个核苷酸的3’突出端，但长度也可以是2-4个核苷酸。更优选地，3’突出端的长度是1-3个核苷酸。在某些实施方案中，一条链具有3’突出端，而另一条链是平端的，或也具有突出端。每一条链的突出端的长度可以是相同或不同的。为了进一步增强siRNA的稳定性，可以使3’突出端稳定化而抗降解。在一种实施方案中，通过包含嘌呤核苷酸，如腺苷或鸟苷核苷酸而稳定RNA。或者，由修饰的类似物进行的嘧啶核苷酸的取代，如由2’-脱氧胸苷对尿苷核苷酸3’突出端进行的取代是耐受的，并且不影响RNAi的有效性。2’羟基的缺乏显著增强了组织培养基中突出端的核酸酶抗性，并且在体内可能是有益的。RNAi构建体可以包含双链RNA的长段，其与靶核酸序列相同或基本相同，或者可以包含双链RNA的短段，其与靶核酸序列的仅仅一个区域相同或基本相同。制备和送递长或短RNAi构建体的示例的方法可以参见，例如WO01/68836和WOO1175164。在某些实施方案中，RNAi构建体是长双链RNA的形式。在某些实施方案中，RNAi构建体是至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实施方案中，RNAi构建体的长度是400-800个碱基。双链RNAs是细胞内消化的，如，在细胞中产生siRNA序列。但是，体内使用长双链RNAs不总是实际的，推测是由于序列非依赖性dsRNA反应可能导致的有害作用。在这样的实施方案中，使用局部送递系统和/或减少干扰素或PKR的作用的试剂是优选的。在某些实施方案中，RNAi构建体是发夹结构的形式(即，发夹RNA)。可以外源合成发夹RNAs，或可以通过体外由RNA聚合酶III启动子转录而形成。制备和使用所述发夹RNAs，以便在哺乳动物细胞中进行基因沉默的实例描述于，例如，Paddison等(2002)GenesDev.、16948-58；McCaffrey等(2002)Nature、41838-9；McManus等、(2002)RNA、8842-50；Yu等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、996047-52)。优选地，所述发夹RNAs在细胞或动物中工程化，以确保需要的基因的连续和稳定阻抑。本领域公知，可以通过在细胞中加工发夹RNA而制备siRNAs。
RNAi构建体的制备
可以采用本领域技术人员公知的多种技术获得本发明的siRNA分子。例如，可以化学合成或用本领域公知的方法重组制备siRNA分子。例如，可以合成短的有义和反义RNA寡聚物，并且退火形成每个末端具有2个核苷酸组成的突出端的双链RNA结构(Caplen、等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、989742-9747；Elbashir，等(2001)EMBO J、206877-88)。然后可以通过被动摄取或选择的送递系统，如下文所述的那些，将这些双链siRNA结构直接导入细胞。在某些实施方案中，可以通过加工较长的双链RNAs，例如，在切割酶的存在下，产生siRNA构建体。在一种实施方案中，使用果蝇体外系统。在该实施方案中，dsRNA与来源于果蝇胚胎的可溶性提取物组合，从而产生一种组合。在将dsRNA加工成大约21-大约23个核苷酸的RNA分子的条件下维持组合。可以由单链自互补RNA链或两个互补RNA链形成双链结构。可以在细胞内或细胞外起始RNA双链体形成。可以用本领域技术人员公知的许多技术纯化siRNA分子。例如，可以用凝胶电泳纯化siRNAs。或者，可以用非变性方法，如非变性柱层析纯化siRNA。此外，可以用层析(如大小排阻层析)、甘油梯度离心、用抗体进行的亲和纯化对siRNA进行纯化。可以通过化学合成方法或通过重组核酸技术进行RNAi构建体的制备。受处理的细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内转录，或者，克隆的RNA聚合酶可以用于体外转录。RNAi构建体可以包括对磷酸-糖主链或核苷的修饰，例如，降低对细胞核酸酶的易感性、改进生物利用度、改进制剂特征，和/或改变其它药代动力学特性。例如，可以修饰天然RNA的磷酸二酯键，以包括氮或硫杂原子中的至少一个。可以调整RNA结构的修饰，以允许特异性基因抑制，同时避免对dsRNA的普遍反应。同样，可以对碱基进行修饰，以阻断腺苷脱氨酶的活性。RNAi构建体可以酶促产生或通过部分/总有机合成产生，可以通过体外酶促或有机合成导入修饰的核糖核苷酸。可以调整化学修饰RNA分子的方法，用于修饰RNAi构建体(参见，例如，Heidenreich等(1997)Nucleic Acids Res.、25776-780；Wilson等(1994)J.Mol.Recog.、789-98；Chen等(1995)Nucleic Acids Res.、232661-2668；Hirschbein等(1997)AntisenseNucleic Acid Drug Dev.755-61)。仅仅为了说明，RNAi构建体的主链可以用含有寡聚物或糖修饰的硫代磷酸酯、磷酰胺、二硫代磷酸酯、嵌合的膦酸甲酯-磷酸二酯、肽核酸、5-丙炔基-嘧啶取代(如2′-取代的核糖核苷酸，α构型)。
RNAi构建体的送递
可以以允许送递每个细胞至少一个拷贝的量导入RNA。双链材料的更高剂量(如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可以产生更有效的抑制，而较低的剂量也可以用于特定应用。抑制是序列特异性的，因为靶定了相应于RNA双链区的核苷酸序列以进行基因抑制。在其它实施方案中，用质粒送递双链RNA，如，作为转录产物。在这样的实施方案中，设计质粒以包括RNAi构建体的每条有义和反义链的“编码序列”。编码序列可以是相同的序列，如侧翼是倒置的启动子，或可以是两个分开的序列，每个序列受分开的启动子的转录控制。在转录编码序列后，互补的RNA转录物进行碱基配对，以形成双链RNA。PCT申请WO01/77350描述了用于双向(或趋同)转录转基因以在真核细胞中产生相同转基因的有义和反义RNA转录物的示例的载体。因此，在某些实施方案中，本发明提供了具有以下独特特征的重组载体其包含具有以相反方向排列，并且侧翼是感兴趣的RNAi构建体的转基因的两个重叠的转录单位的病毒复制子，其中这两个重叠的转录单位从宿主细胞中的相同转基因片段产生有义和反义RNA转录物。也参见Tran等、(2003)BMC Biotechnology 321(在此引入作为参考)。
组合物
本发明的一个方面提供了包含Hh信号传递途径的激动剂的药物组合物。该药物组合物包含Hh多肽或其功能等同物，或Hh活性的激动剂。该药物组合物也可以包含负反馈系统的拮抗剂或Hh信号传递途径的阻遇元件的拮抗剂。该药物组合物也可以进一步包含其它的治疗剂，如神经元生长因子或神经营养因子。另一方面，本发明涉及制备药物组合物的方法，包括在组合物中组合Hh激动剂，任选额外的药学活性成分和药学可接受的载体，用于同时施用药物。本发明提供了此处描述的所述试剂，并且所述药物组合物可以额外包含药学可接受的载体。药学可接受的载体是本领域技术人员公知的。所述药学可接受的载体可以包括，但不限于，稀释剂、气溶胶、表面载体、水溶液、非水溶液或固体载体。非水溶液的实例是乙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油、和可注射的有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳状液或悬浮液、盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、Ringer′s右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的Ringer′s或固定的油。静脉内载体包括液体和营养补充物、电解质补充物，如基于Ringer′s右旋糖的那些，等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。对于试剂是多肽和抗体的实施方案，可以将药物组合物制剂化，用于与生物可接受的介质一起施用，所述介质如水、缓冲盐水、多元醇(如甘油、乙二醇、液态聚乙二醇等)或其合适的混合物。在优选实施方案中，多肽分散在液体制剂，如胶束中，所述胶束非常类似蛋白要送递到的天然细胞膜的液体组成。此处用到的“生物可接受的介质”包括任何和所有溶剂、分散介质等，其适用于施用药物制剂的需要的途径。所述用于药学活性物质的介质的使用是本领域公知的。除了任何与Hh信号传递途径激动剂的活性不相容的任何常规介质或试剂，考虑了将其用于本发明的药物制剂中。合适的载体及包含多种蛋白的其制剂描述于，例如Remington′s PharmaceuticalSciences(Remington′s Pharmaceutical Sciences.Mack PublishingCompany、Easton、Pa.、USA 1985)。对于这样的施用，将适于要通透的屏障的渗透剂用于多肽制剂中。所述渗透剂是本领域公知的，包括，例如，用于经粘膜施用的胆盐和梭链孢酸衍生物。此外，可以将去污剂用于促进通透。可以通过鼻喷雾或采用栓剂进行经粘膜施用。对于表面施用，将本发明的蛋白制剂化为本领域公知的油膏、软膏、凝胶或乳膏。根据主题方法，主题多肽(以及适当的内皮化多肽)的表达构建体可以在任何生物学有效的载体中施用，例如在能够用重组融合基因有效体内转染细胞的任何制剂或组合物中施用。方法包括在包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒-1的病毒载体，或重组细菌或真核质粒中插入主题融合基因。病毒载体可以用于直接转染细胞；可以在例如阳离子脂质体(lipofectin)或衍生化的(例如抗体缀合的)、聚赖氨酸聚合物、短杆菌肽S、人工病毒包膜或其它所述细胞内载体的辅助下送递质粒DNA，以及直接注射基因构建体或体内进行CaPO4沉淀。可以理解，由于合适的靶细胞的转导代表了基因治疗中关键的第一步，特定基因送递系统的选择将依赖于诸如靶的表型等因素和施用途径，如局部施用或系统施用。可以根据药物化学家公知的程序，根据经验确定选择的培养基中试剂的最优浓度。
基因治疗
本发明的一方面提供了用基因治疗对多种行为和情绪障碍进行治疗的方法。此处使用的“基因治疗”是指将核酸治疗性导入受试细胞，使得可以表达核酸，导致疾病的减轻。在另一优选实施方案中，本发明描述了编码调节，如模拟或拮抗Hh多肽的生物活性的多肽的核酸，所述核酸包含与SEQ IDNo1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8或SEQ ID No9之一所示的核苷酸序列相同或同源的基因的编码区的全部或部分核苷酸序列。优选地，该核酸包含在严格条件下与SEQ ID No1-9所示的一个或多个核酸的编码部分杂交的Hh编码部分。术语“等同物”理解为包含编码功能等同的Hh多肽的核苷酸序列或具有诸如此处描述的脊椎动物Hh多肽的活性的功能等同的肽。等同的核苷酸序列包括通过一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，如等位基因变体；并且因此包括由于遗传密码简并性而与SEQ ID Nos1-9所示脊椎动物hhcDNAs的核苷酸序列不同的序列。等同物也包括在严格条件下(即，相当于比在约1M盐中形成的DNA双链体的解链温度(Tm)低约20-27℃)与SEQ ID Nos1-9中的一个或多个所代表的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在一种实施方案中，等同物将进一步包含衍生自、并且在进化上相关于SEQ IDNos1-9的任意一个所示核苷酸序列的核酸序列。在更优选的实施方案中，核酸在严格条件下与核酸探针杂交，所述探针相当于SEQ ID Nos1-9中一个或多个序列的有义或反义序列的至少12个连续核苷酸；优选SEQ ID Nos1-9中一个或多个序列的有义或反义序列的至少20个连续核苷酸；更优选至少40、50或75个连续核苷酸。术语“等同物”理解为包含编码功能等同的Hh多肽的核苷酸序列或具有诸如此处描述的脊椎动物Hh多肽的活性的功能等同的肽。等同的核苷酸序列包括通过一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列，如等位基因变体；并且因此包括由于遗传密码简并性而与SEQ ID Nos1-9所示脊椎动物hh cDNAs的核苷酸序列不同的序列。等同物也包括在严格条件下(即，相当于比在约1M盐中形成的DNA双链体的解链温度(Tm)低约20-27℃)与SEQ ID Nos1-9中的一个或多个所代表的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。在一种实施方案中，等同物将进一步包含衍生自、并且在进化上相关于SEQ IDNos1-9的任意一个所示核苷酸序列的核酸序列。用于本发明的基因治疗的优选核酸编码包含与选自SEQID Nos10-18的氨基酸序列具有至少60％同源性，更优选70％同源性，最优选80％同源性的氨基酸序列的脊椎动物Hh多肽。编码与SEQID Nos10-18之一所示的氨基酸序列具有至少约90％，更优选至少约95％，最优选至少约98-99％同源性的多肽的核酸也在本发明的范围内。在一种实施方案中，核酸是编码具有主题脊椎动物Shh多肽的至少一种活性的多肽的cDNA。优选地，核酸包括相应于SEQ ID Nos1-9的编码区的核苷酸序列的全部或部分。对于sonic克隆的功能等同的片段，优选的核酸编码包括分子量为大约19kDa，并且可以调节，例如模拟或拮抗Hh生物活性的Hh部分的多肽。优选地，由所述核酸编码的多肽包含与SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No13、SEQ ID No14、SEQ ID No15、SEQ ID No16、SEQ ID No17或SEQ ID No18之一所示的氨基酸序列相同或同源的氨基酸序列。更优选地，该多肽包含SEQ ID No21所示的氨基酸序列。优选的核酸编码包含式A-B所表示的氨基酸序列的Hh多肽，其中，A代表SEQ ID No21的残基1-168所示的氨基酸序列的全部或部分；B代表SEQ ID No21的残基169-221所示氨基酸序列的至少一个氨基酸残基；其中A和B一起代表SEQ ID No21所示的连续多肽序列。优选地，B可以代表SEQ ID No21的残基169-221所示的氨基酸序列的至少5、10或20个氨基酸残基。为了进一步说明，另一种优选的核酸编码包含式A-B所表示的氨基酸序列的多肽，其中，A代表SEQ ID No15的残基24-193所示的氨基酸序列的全部或部分；B代表SEQ ID No15的残基194-250所示氨基酸序列的至少一个氨基酸残基；其中A和B一起代表SEQID No15所示的连续多肽序列，并且所述多肽调节，例如模拟或拮抗Hh多肽的生物活性。另一种优选的核酸编码包含式A-B所表示的氨基酸序列的多肽，其中，A代表与SEQ ID No13相同或同源的脊椎动物Hh多肽的残基25-193或其类似残基所示氨基酸序列的全部或部分，如25、50、75或100个残基；B代表与SEQ ID No13相同或同源的脊椎动物Hh多肽的残基194-250或其类似残基所示氨基酸序列的至少一个氨基酸残基；其中A和B一起代表SEQ ID No13所示的连续多肽序列。另一种优选的核酸编码包含式A-B所表示的氨基酸序列的多肽，其中，A代表SEQ ID No11的残基23-193所示氨基酸序列的全部或部分，如25、50、75或100个残基；B代表SEQ ID No11的残基194-250所示氨基酸序列的至少一个氨基酸残基，并且所述多肽调节，例如模拟或拮抗Hh多肽的生物活性。另一种优选的核酸编码包含式A-B所表示的氨基酸序列的多肽，其中，A代表SEQ ID No12的残基28-197所示氨基酸序列的全部或部分，如25、50、75或100个残基；B代表SEQ ID No12的残基198-250所示氨基酸序列的至少一个氨基酸残基，并且所述多肽调节，例如模拟或拮抗Hh多肽的生物活性。另一种优选的核酸编码包含式A-B所表示的氨基酸序列的多肽，其中，A代表与SEQ ID No18相同或同源的脊椎动物Hh多肽的残基1-98或其类似残基所示氨基酸序列的全部或部分，如25、50或75个残基；B代表与SEQ ID No18相同或同源的脊椎动物Hh多肽的残基99-150或其类似残基所示氨基酸序列的至少一个氨基酸残基；其中A和B一起代表SEQ ID No18所示的连续多肽序列。本发明的另一方面提供了在高或低严格条件下与SEQ IDNos1-9之一所示的核酸杂交的核酸。促进DNA杂交的合适的严格性条件，例如，大约45℃下6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在50℃下用2.0x SSC洗涤，是本领域技术人员公知的，或者可以参见CurrentProtocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y.(1989)、6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤的盐浓度可以选自50℃下约2.0x SSC的低严格性至50℃下约0.2xSSC的高严格性。此外，洗涤步骤中的温度可以从室温，即约22℃下的低严格性条件至约65℃下的高严格性条件。由于遗传密码的简并性而具有与SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQID No7、SEQ ID No8或SEQ ID No9之一所示的核苷酸序列不同的序列的核酸也包括在本发明的范围内。所述核酸编码功能等同，但由于遗传密码的简并性而与序列表中所示序列在序列上不同的功能等同的肽(即，具有脊椎动物hh多肽的生物活性的肽)。例如，许多氨基酸是由一种以上的三联密码子确定的。指定相同氨基酸的密码子，或同义密码子(例如，CAU和CAC均编码组氨酸)可能导致“沉默”突变，其不影响脊椎动物hh多肽的氨基酸序列。但是，预期在脊椎动物中存在确实导致主题hh多肽的氨基酸序列改变的DNA序列多态性。本领域技术人员可以理解，具有脊椎动物hh多肽活性的多肽的编码核酸中的一个或多个核苷酸(最多大约3-5％的核苷酸)的这些变异可以由于天然等位基因变异而存在于特定物种的个体中。此处的hh基因片段是指这样的核酸，其比编码脊椎动物Hh多肽的完整成熟形式的核苷酸序列具有更少的核苷酸，但其(优选)编码保留全长蛋白的一些生物活性的多肽。在一种用于说明的实施方案中，对每一Shh克隆的外显子1、2和外显子3的一部分编码的序列(如成熟蛋白的N末端大约221个残基)进行的比对产生了由以下通式表示的一组简并的Shh多肽
C-G-P-G-R-G-X(1)-G-X(2)-R-R-H-P-K-K-L-T-P-L-A-Y-K-Q-F-I-P-N-V-A-E-K-T-L-G-A-S-G-R-Y-E-G-K-I-X(3)-R-N-S-E-R-F-K-E-L-T-P-N-Y-N-P-D-I-I-F-K-D-E-E-N-T-G-A-D-R-L-M-T-Q-R-C-K-D-K-L-N-X(4)-L-A-I-S-V-M-N-X(5)-W-P-G-V-X(6)-L-R-V-T-E-G-W-D-E-D-G-H-H-X(7)-E-E-S-L-H-Y-E-G-R-A-V-D-I-T-T-S-D-R-D-X(8)-S-K-Y-G-X(9)-L-X(10)-R-L-A-V-E-A-G-F-D-W-V-Y-Y-E-S-K-A-H-I-H-C-S-V-K-A-E-N-S-V-A-A-K-S-G-G-C-F-P-G-S-A-X(11)-V-X(12)-L-X(13)-X(14)-G-G-X(15)-K-X-(16)-V-K-D-L-X(17)-P-G-D-X(18)-V-L-A-A-D-X(19)-X(20)-G-X(21)-L-X(22)-X(23)-S-D-F-X(24)-X(25)-F-X(26)-D-R(SEQ ID No21)，
其中每个简并位置“X”可以是存在于人、小鼠、鸡或斑马鱼Shh克隆之一的该位置上的氨基酸，或者，为了扩展文库，每个X也可以选自每个所述位置中天然存在的氨基酸的保守取代氨基酸残基。例如，Xaa(1)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr或Trp；Xaa(2)代表Arg、His或Lys；Xaa(3)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；Xaa(4)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；Xaa(5)代表Lys、Arg、His、Asn或Gln；Xaa(6)代表Lys、Arg或His；Xaa(7)代表Ser、Thr、Tyr、Trp或Phe；Xaa(8)代表Lys、Arg或His；Xaa(9)代表Met、Cys、Ser或Thr；Xaa(10)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；Xaa(11)代表Leu、Val、Met、Thr或Ser；Xaa(12)代表His、Phe、Tyr、Ser、Thr、Met或Cys；Xaa(13)代表Gln、Asn、Glu或Asp；Xaa(14)代表His、Phe、Tyr、Thr、Gln、Asn、Glu或Asp；Xaa(15)代表Gln、Asn、Glu、Asp、Thr、Ser、Met或Cys；Xaa(16)代表Ala、Gly、Cys、Leu、Val或Met；Xaa(17)代表Arg、Lys、Met、Ile、Asn、Asp、Glu、Gln、Ser、Thr或Cys；Xaa(18)代表Arg、Lys、Met或Ile；Xaa(19)代表Ala、Gly、Cys、Asp、Glu、Gln、Asn、Ser、Thr或Met；Xaa(20)代表Ala、Gly、Cys、Asp、Asn、Glu或Gln；Xaa(21)代表Arg、Lys、Met、Ile、Asn、Asp、Glu或Gln；Xaa(22)代表Leu、Val、Met或Ile；Xaa(23)代表Phe、Tyr、Thr、His或Trp；Xaa(24)代表Ile、Val、Leu或Met；Xaa(25)代表Met、Cys、Ile、Leu、Val、Thr或Ser；Xaa(26)代表Leu、Val、Met、Thr或Ser。在甚至更广泛的文库中，每个X可以选自任何氨基酸。以相似的方式，人、小鼠、鸡和斑马鱼hh克隆中每一个的比对(图5B)，可以提供由以下通式代表的简并多肽序列
C-G-P-G-R-G-X(1)-X(2)-X(3)-R-R-X(4)-X(5)-X(6)-P-K-X(7)-L-X(8)-P-L-X(9)-Y-K-Q-F-X(10)-P-X(11)-X(12)-X(13)-E-X(14)-T-L-G-A-S-G-X(15)-X(16)-E-G-X(17)-X(18)-X(19)-R-X(20)-S-E-R-F-X(21)-X(22)-L-T-P-N-Y-N-P-D-I-I-F-K-D-E-E-N-X(23)-G-A-D-R-L-M-T-X(24)-R-C-K-X(25)-X(26)-X(27)-N-X(28)-L-A-I-S-V-M-N-X(29)-W-P-G-V-X(30)-L-R-V-T-E-G-X(31)-D-E-D-G-H-H-X(32)-X(33)-X(34)-S-L-H-Y-E-G-R-A-X(35)-D-I-T-T-S-D-R-D-X(36)-X(37)-K-Y-G-X(38)-L-X(39)-R-L-A-V-E-A-G-F-D-W-V-Y-Y-E-S-X(40)-X(41)-H-X(42)-H-X(43)-S-V-K-X(44)-X(45)(SEQ ID No22)，
其中，如上文所述，每一个简并位置“X”可以是野生型克隆之一的相应位置中存在的氨基酸，也可以包括保守取代的氨基酸残基，或每一个X可以是任何氨基酸残基。在一种示例的实施方案中，Xaa(1)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Tyr；Xaa(2)代表Gly、Ala、Val、Leu或Ile；Xaa(3)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Lys、His或Arg；Xaa(4)代表Lys、Arg或His；Xaa(5)代表Phe、Trp、Tyr或氨基酸空位；Xaa(6)代表Gly、Ala、Val、Leu，Ile或氨基酸空位；Xaa(7)代表Asn、Gln、His、Arg或Lys；Xaa(8)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；Xaa(9)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；Xaa(10)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；Xaa(11)代表Ser、Thr，Gln或Asn；Xaa(12)代表Met、Cys、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；Xaa(13)代表Gly、Ala、Val、Leu，Ile或Pro；Xaa(14)代表Arg、His或Lys；Xaa(15)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Arg、His或Lys；Xaa(16)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe或Tyr；Xaa(17)代表Arg、His或Lys；Xaa(18)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser或Thr；Xaa(19)代表Thr或Ser；Xaa(20)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Asn或Gln；Xaa(21)代表Arg、His或Lys；Xaa(22)代表Asp或Glu；Xaa(23)代表Ser或Thr；Xaa(24)代表Glu、Asp、Gln或Asn；Xaa(25)代表Glu或Asp；Xaa(26)代表Arg、His或Lys；Xaa(27)代表Gly、Ala、Val、Leu或Ile；Xaa(28)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Thr或Ser；Xaa(29)代表Met、Cys、Gln、Asn、Arg、Lys或His；Xaa(30)代表Arg、His或Lys；Xaa(31)代表Trp、Phe、Tyr、Arg、His或Lys；Xaa(32)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Tyr或Phe；Xaa(33)代表Gln、Asn、Asp或Glu；Xaa(34)代表Asp或Glu；Xaa(35)代表Gly、Ala、Val、Leu、or Ile；Xaa(36)代表Arg、His或Lys；Xaa(37)代表Asn、Gln、Thr或Ser；Xaa(38)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Met或Cys；Xaa(39)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Thr或Ser；Xaa(40)代表Arg、His或Lys；Xaa(41)代表Asn、Gln、Gly、Ala、Val、Leu或Ile；Xaa(42)代表Gly、Ala、Val、Leu或Ile；Xaa(43)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr或Cys；Xaa(44)代表Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Thr或Ser；并且Xaa(45)代表Asp或Glu。可以用本领域公知的方案从这些序列中选择功能等同的多肽，从而筛选组合表达文库。体内导入编码主题多肽之一的核酸的优选方法是通过使用包含核酸，如编码基因产物的cDNA的病毒载体。用病毒载体感染细胞有以下优点，即大比例的靶细胞可以接受核酸。此外，在病毒载体内编码的分子，如，由包含在病毒载体内的cDNA编码的分子在摄取了病毒载体核酸的细胞中有效表达。通常认为逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体是选择用于体内转移外源基因，特别是转移到人的重组基因送递系统。这些载体使基因有效送递到细胞，并且转移的核酸稳定整合到宿主的染色体DNA中。使用逆转录病毒的主要前提是确保它们的使用安全性，特别是在野生型病毒在细胞群中传播的可能性方面。仅仅产生复制缺陷的逆转录病毒的特化细胞系(称作“包装细胞”)的开发增加了逆转录病毒在基因治疗中的应用，并且，缺陷的逆转录病毒是充分表征的，用于基因治疗目的的基因转移(综述参见Miller，A.D.(1990)Blood76271)。因此，可以构建重组逆转录病毒，其中逆转录病毒编码序列(gag、pol、env)的一部分被编码CKI多肽的核酸取代，使得逆转录病毒缺陷。然后将复制缺陷的逆转录病毒包装到毒粒中，可以通过标准技术，使用辅助病毒将所述毒粒用于感染靶细胞。制备重组逆转录病毒和用所述病毒体外或体内感染细胞的方案可以参见CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等(eds.)GreenePublishing Associates，(1989)，Sections 9.10-9.14，和其它标准实验室手册。合适的逆转录病毒的实例包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它们是本领域技术人员公知的。用于制备亲嗜性和兼嗜性逆转录病毒系统的合适的包装病毒系的实例包括ψCrip、ψCre、ψ2和ψAm。已经用逆转录病毒将多种基因体外和/或体内导入许多不同的细胞类型，包括神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(参见，例如，Eglitis，等(1985)Science 2301395-1398；Danos andMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876141-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888039-8043；Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA888377-8381；Chowdhury等(1991)Science 2541802-1805；vanBeusechem等(1992)Proe.Natl.Acad.Sci.USA 897640-7644；Kay等(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.1504104-4115；美国专利No.4,868,116；美国专利No.4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；和PCT申请WO92/07573)。在选择作为主题蛋白的基因送递系统的逆转录病毒载体时，重要的是注意由大多数逆转录病毒成功感染靶细胞，并且因此稳定导入重组基因的前提，是靶细胞必须分裂。当围绕靶细胞的组织不进行广泛的细胞分裂并因此抗逆转录病毒载体感染时，所述对感染的限制可以是有益的。此外，已经证明了通过修饰病毒颗粒表面上的病毒包装蛋白，可以限制逆转录病毒的感染谱，因此能够限制基于逆转录病毒的载体的感染谱(参见，例如，PCT公开W093/25234，W094/06920和W094/11524)。例如，用于修饰逆转录病毒载体的感染谱的策略包括将细胞表面抗原的特异性抗体偶联到病毒env蛋白(Roux等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 869079-9083；Julan等(1992)J.Gen.Virol.733251-3255；和Goud等(1983)Virology 163251-254)；或将细胞表面配体偶联到病毒env蛋白(Neda等(1991)J Biol.Chem.26614143-14146)。偶联可以是与蛋白或其它物质进行的化学交联形式(如与乳糖交联，将env蛋白转化为脱唾液酸糖蛋白)，也可以是通过产生融合蛋白(如单链抗体/env融合蛋白)。该技术可以用于限制或指导对某些组织类型的感染，同时可以用于将亲嗜性载体转化为兼嗜性载体。此外，通过使用控制逆转录病毒载体的融合基因表达的组织或细胞特异性转录调节序列，可以进一步增强逆转录病毒基因送递的用途。用于送递主题多肽的另一种病毒载体系统是腺伴随病毒(AAV)。腺伴随病毒是一种需要另一种病毒，如腺病毒或疱疹病毒作为有效复制和生命周期循环的辅助病毒的天然存在的缺陷性病毒(综述参见Muzyczka等(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.15897-129)。它也是可以将其DNA整合到非分裂细胞，因此表现出高频率的稳定整合的少数病毒之一(参见，例如Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski等(1989)J.Virol.633822-3828；和McLaughlin等(1989)J.Virol.621963-1973)。含有少至AAV的300个碱基对的载体可以被包装并且可以整合。外源DNA的空间限于大约4.5kb。诸如Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.53251-3260中描述的AAV载体可以用于将DNA导入细胞。已经用AAV载体将多种核酸导入了不同的细胞类型(参见，例如，Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51611-619；和Flotte等(1993)J.Biol.Chef.2683781-3790)。在本发明中有用的另一种病毒基因送递系统利用了腺病毒衍生的载体。可以操作腺病毒的基因组，使得其编码感兴趣的基因产物，但对其在正常的裂解性病毒生命周期中的复制能力进行了灭活(参见，例如，Berkner等(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld等(1991)Science 252431-434；和Rosenfeld等(1992)Cell 68143-155)。衍生自腺病毒株Ad5 dl324型或腺病毒的其它株(如Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员公知的。重组腺病毒在某些情况下是有利的，因为它们不能感染非分裂细胞，并且可以用于感染多种细胞类型，包括内皮细胞(Lemarchand等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA896482-6486)和平滑肌细胞(Quantin等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892581-2584)。此外，病毒颗粒相对稳定，容易纯化和浓缩，并且，如上文所述，可以进行修饰以影响感染谱。此外，导入的腺病毒DNA(和其中包含的外来DNA)不整合到宿主细胞的基因组中，而是保持游离型，从而避免由于导入的DNA整合到宿主基因组的情况下(如逆转录病毒DNA)的插入诱变可能导致的潜在问题。此外，相对于其它基因送递载体，外来DNA的腺病毒基因组的携带能力是大的(最多8千碱基)(Berkner等supra；Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57267)。目前正在使用，并且因此从本发明获益的大多数复制缺陷腺病毒缺失了病毒E1和E3基因的全部或部分，但保留了80％的腺病毒遗传物质(参见，例如，Jones等(1979)Cell 16683；Berkner等，supra；和Graham等，Methods in Molecular Biology，E.J.Murray，Ed.(Humana，Clifton，NJ，1991)vol.7.pp.109-127)。插入的融合基因的表达可以受例如E1A启动子、主要晚期启动子(MLP)和相关前导序列、E3启动子或外源添加的启动子序列的控制。可能用于基因治疗的其它病毒载体系统衍生自疱疹病毒、痘苗病毒和一些RNA病毒。具体地，疱疹病毒载体可以提供主题融合蛋白在中枢神经系统和眼组织的细胞中持续表达的独特策略(Pepose等(1994)Invest.Ophthalrnol.Vis.Sci.352662-2666)。除了病毒转移方法，如上文列举的那些，也可以用非病毒方法导致主题蛋白在动物组织中的表达。基因转移的大多数非病毒方法依赖哺乳动物采用的正常机制进行大分子的摄取和细胞内转运。在优选实施方案中，本发明的非病毒基因送递系统依赖内吞途径，由靶细胞摄取基因。这种类型的示例的基因送递系统包括脂质体衍生的系统、聚赖氨酸缀合物和人工病毒包膜。在代表性实施方案中，编码主题蛋白之一的基因可以捕获在表面带有正电荷(如lipofectins)，并且(任选)用抗靶组织的细胞表面抗原的抗体标记的脂质体中(Mizuno等(1992)No Shinkei Geka 20547-551；PCT公开W091/06309；日本专利申请1047381；和欧洲专利公开EP-A-43075)。例如，可以用标记了抗神经胶质瘤相关抗原的单克隆抗体的脂质体进行神经胶质瘤细胞的脂转染(Mizuno等(1992)Neurol.Med.Clair.32873-876)。在另一示例的实施方案中，基因送递系统包含与诸如聚赖氨酸的基因结合剂交联的抗体或细胞表面配体(参见，例如，PCT公开W093/04701，W092/22635，W092/20316，W092/19749和W092/06180)。例如，采用包含与聚阳离子，如聚赖氨酸缀合的脱唾液酸糖蛋白的可溶的多核苷酸载体，可以将主题基因构建体用于体内转染肝细胞(参见，美国专利5,166,320)。也可以理解，可以用增强基因从内体结构逃离的试剂改进通过受体介导的内吞作用进行的主题核酸构建体的有效送递。例如，流感HA基因产物的完整腺病毒或致融合肽可以用作送递系统的一部分，以诱导含DNA的内体的有效破坏(Mulligan等(1993)Science 260-926；Wagner等(1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 897934；和Christiano等(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 902122)。在临床设置中，可以通过本领域熟悉的多种方法中的任意一种方法将基因送递载体导入患者。例如，可以通过如静脉内注射将基因送递系统的药物制剂系统地导入，靶细胞的特异性转导主要发生自由于控制基因表达的转录调节序列导致的基因送递载体、细胞类型或组织类型表达，或其组合提供的转染特异性。在其它实施方案中，重组基因的起始送递更有限，向动物中的导入非常局限。例如，可以通过导管(参见美国专利5,328,470)或通过立体定位注射(如Chen等(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 913054-3057)导入基因送递载体。此外，药物制剂可以基本由可接受的稀释剂中的基因送递系统组成，或可以包含包埋了基因送递载体的缓释基质。或者，当完整的基因送递系统可以从重组细胞如逆转录病毒包装细胞以完整形式产生时，药物制剂可以包含一个或多个产生基因送递系统的细胞。在后一种情况下，可以通过例如可补或生物可降解的装置提供导入病毒包装细胞的方法。近年来已经开发和体内检验了多种缓释聚合物装置，用于药物的受控送递，包括蛋白性生物药物，并且可以适用于通过聚合物组成和形式的操作释放病毒颗粒。多种生物相容的聚合物(包括水凝胶)，包括生物可降解和非生物可降解的聚合物，可以用于形成植入物，用于通过植入到特定靶位点的细胞进行病毒颗粒的持续释放。本发明的所述实施方案可以用于送递外源性纯化的病毒，所述病毒掺入聚合物装置，或用于送递由包裹在聚合物装置中的细胞产生的病毒颗粒。
进行药物商业的方法
另一方面，本发明涉及通过制造Hh激动剂和任选额外的药物活性成分的制品或包含每种成分的分开的制剂的试剂盒，并且将在行为和/或情绪/认知障碍的治疗中采用所述制品或试剂盒的益处推广给保健提供者而进行药物商业的方法。另一方面，本发明提供了通过给销售组合制品和试剂盒提供分布网络，并且给在行为和/或情绪/认知障碍的治疗中采用所述制品或试剂盒的患者或医生提供说明材料而进行药物商业的方法。另一方面，本发明提供了通过确定行为和/或情绪/认知障碍的治疗中共同施用的Hh激动剂，任选额外药物活性成分的合适制剂和剂量，进行鉴定的制剂在动物中的效力和毒性的治疗谱分析，以及提供销售具有可接受的治疗谱的制剂的分布网络而进行药物商业的方法。在某些实施方案中，该方法进一步包括提供销售团队，用于将该制剂推广给保健提供者的额外步骤。另一方面，本发明提供了通过确定行为和/或情绪/认知障碍的治疗中共同施用的Hh激动剂，任选额外药物活性成分的合适制剂和剂量，以及将进一步开发和销售该制剂的权利许可给第三方而进行药物商业的方法。在某些实施方案中，要治疗的障碍是运动障碍，包括共济失调、皮质基底神经节变性(CBGD)、运动障碍、肌张力异常、震颤、遗传性痉挛性截瘫、亨廷顿病、多发性硬化、多系统萎缩、肌阵挛、帕金森病、进行性核上瘫、下肢不宁综合征、雷特综合征、痉挛状态、小舞蹈病、其它舞蹈病、手足徐动症、颤搐、刻板症、迟发性运动障碍/张力失常、抽搐、图特雷综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)、弥漫性Lewy体病、偏侧投掷症、偏侧面肌痉挛、下肢不宁综合征、威尔逊病、僵体综合征、无动性缄默、精神运动性阻抑、疼痛性下肢运动脚趾综合征、步态障碍、药物诱导的运动障碍和其它运动障碍。在其它实施方案中，情绪或认知障碍是注意力缺陷障碍(ADD)、注意力缺陷的多动症(ADHD)、认知障碍，如痴呆(包括年龄相关的痴呆或老年性痴呆、HIV相关的痴呆、AIDS痴呆综合征(ADC)、由HIV脑病导致的痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、头部创伤、亨廷顿病、皮克病、克一雅病、心脏术后、前交通动脉综合征、缺氧、唐氏综合征和中风)以及由于例如有毒物质的暴露或脑损伤导致的记忆受损、年龄相关的记忆受损、轻度认知功能受损、癫痫或儿童智力迟钝。在某些实施方案中，所述病症是孤独症。在其它实施方案中，行为障碍是睡眠障碍、深眠状态、与医学或精神状况相关的睡眠障碍或其它睡眠障碍。在某些优选实施方案中，睡眠障碍选自内在睡眠障碍、外在睡眠障碍和昼夜节律睡眠障碍。内在睡眠障碍的实例包括心理生理性失眠、睡眠状态感知错误、特发性失眠、发作性睡病、复发性睡眠过度、特发性睡眠过度、创伤后睡眠过度、阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、中枢性睡眠呼吸暂停综合征、中央肺泡通气不足、周期性肢体运动障碍、下肢不宁综合征(RLS)等。外在睡眠障碍的实例包括睡眠卫生不良、环境性睡眠障碍、海拔性失眠、调整性睡眠障碍、睡眠不足综合征、限度设置睡眠障碍、睡眠开始相关综合征、食物过敏性失眠、夜间饮食/喝水综合征、催眠依赖性睡眠障碍、刺激物依赖性睡眠障碍、酒精依赖性睡眠障碍、毒素诱导的睡眠障碍等。昼夜节律睡眠障碍的实例包括时区改变(时差)综合征、工作改变睡眠综合征、不规律的睡眠/觉醒模式、延迟的睡眠阶段综合征、晚期睡眠阶段综合征、非24小时睡眠/觉醒障碍等。在某些实施方案中，要治疗的病症是ADHD，额外药物活性成分是多巴胺再摄取抑制剂。在其它实施方案中，额外药物活性成分选自。在某些实施方案中，所述治疗是预防性治疗，要施用给诊断为具有上述示例的病症或有发生上述示例的病症的危险性的患者。可以对进行药物商业的方法的任何实施方案进行修改，代替记忆和认知障碍的治疗，用于增强表现出正常范围的记忆和认知功能的受试者中的记忆和认知。在此全文引入在此引用的全部公开文献和专利作为参考。
等同方案本领域内技术人员将认识到或者仅使常规实验就能够确定本文所述的本发明特定实施方案的许多等同实施方案。所述等同实施方案将包括在下面权利要求中。
序列表序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1277个碱基对(B)类型核酸(C)链未端两个(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..1275(xi)序列说明SEQ ID NO1ATG GTC GAA ATG CTG CTG TTG ACA AGA ATT CTC TTG GTG GGC TTC ATC48Met Val Glu Met Leu Leu Leu Thr Arg Ile Leu Leu Val Gly Phe Ile1 5 10 15TGC GCT CTT TTA GTC TCC TCT GGG CTG ACT TGT GGA CCA GGC AGG GGC96Cys Ala Leu Leu Val Ser Ser Gly Leu Thr Cys Gly Pro Gly Arg Gly20 25 30ATT GGA AAA AGG AGG CAC CCC AAA AAG CTG ACC CCG TTA GCC TAT AAG144Ile Gly Lys Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys35 40 45CAG TTT ATT CCC AAT GTG GCA GAG AAG ACC CTA GGG GCC AGT GGA AGA192Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg50 55 60TAT GAA GGG AAG ATC ACA AGA AAC TCC GAG AGA TTT AAA GAA CTA ACC240Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr65 70 75 80CCA AAT TAC AAC CCT GAC ATT ATT TTT AAG GAT GAA GAG AAC ACG GGA288Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly85 90 95GCT GAC AGA CTG ATG ACT CAG CGC TGC AAG GAC AAG CTG AAT GCC CTG336Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu100 105 110
GCG ATC TCG GTG ATG AAC CAG TGG CCC GGG GTG AAG CTG CGG GTG ACC384Ala Ile Ser Val Met Asn Gln Trp Pro Gly Val Lys Leu Arg Val Thr115 120 125GAG GGC TGG GAC GAG GAT GGC CAT CAC TCC GAG GAA TCG CTG CAC TAC432Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr130 135 140GAG GGT CGC GCC GTG GAC ATC ACC ACG TCG GAT CGG GAC CGC AGC AAG480Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys145 150 155 160TAC GGA ATG CTG GCC CGC CTC GCC GTC GAG GCC GGC TTC GAC TGG GTC528Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val165 170 175TAC TAC GAG TCC AAG GCG CAC ATC CAC TGC TCC GTC AAA GCA GAA AAC576Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn180 185 190TCA GTG GCA GCG AAA TCA GGA GGC TGC TTC CCT GGC TCA GCC ACA GTG624Ser Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Thr Val195 200 205CAC CTG GAG CAT GGA GGC ACC AAG CTG GTG AAG GAC CTG AGC CCT GGG672His Leu Glu His Gly Gly Thr Lys Leu Val Lys Asp Leu Ser Pro Gly210 215 220GAC CGC GTG CTG GCT GCT GAC GCG GAC GGC CGG CTG CTC TAC AGT GAC720Asp Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Asp Gly Arg Leu Leu Tyr Ser Asp225 230 235 240TTC CTC ACC TTC CTC GAC CGG ATG GAC AGC TCC CGA AAG CTC TTC TAC768Phe Leu Thr Phe Leu Asp Arg Met Asp Ser Ser Arg Lys Leu Phe Tyr245 250 255GTC ATC GAG ACG CGG CAG CCC CGG GCC CGG CTG CTA CTG ACG GCG GCC816Val Ile Glu Thr Arg Gln Pro Arg Ala Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ala260 265 270CAC CTG CTC TTT GTG GCC CCC CAG CAC AAC CAG TCG GAG GCC ACA GGG864His Leu Leu Phe Val Ala Pro Gln His Asn Gln Ser Glu Ala Thr Gly275 280 285TCC ACC AGT GGC CAG GCG CTC TTC GCC AGC AAC GTG AAG CCT GGC CAA912Ser Thr Ser Gly Gln Ala Leu Phe Ala Ser Asn Val Lys Pro Gly Gln290 295 300
CGT GTC TAT GTG CTG GGC GAG GGC GGG CAG CAG CTG CTG CCG GCG TCT960Arg Val Tyr Val Leu Gly Glu Gly Gly Gln Gln Leu Leu Pro Ala Ser305 310 315 320GTC CAC AGC GTC TCA TTG CGG GAG GAG GCG TCC GGA GCC TAC GCC CCA1008Val His Ser Val Ser Leu Arg Glu Glu Ala Ser Gly Ala Tyr Ala Pro325 330 335CTC ACC GCC CAG GGC ACC ATC CTC ATC AAC CGG GTG TTG GCC TCC TGC1056Leu Thr Ala Gln Gly Thr Ile Leu Ile Asn Arg Val Leu Ala Ser Cys340 345 350TAC GCC GTC ATC GAG GAG CAC AGT TGG GCC CAT TGG GCC TTC GCA CCA1104Tyr Ala Val Ile Glu Glu His Ser Trp Ala His Trp Ala Phe Ala Pro355 360 365TTC CGC TTG GCT CAG GGG CTG CTG GCC GCC CTC TGC CCA GAT GGG GCC1152Phe Arg Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Asp Gly Ala370 375 380ATC CCT ACT GCC GCC ACC ACC ACC ACT GGC ATC CAT TGG TAC TCA CGG1200Ile Pro Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ile His Trp Tyr Ser Arg385 390 395 400CTC CTC TAC CGC ATC GGC AGC TGG GTG CTG GAT GGT GAC GCG CTG CAT1248Leu Leu Tyr Arg Ile Gly Ser Trp Val Leu Asp Gly Asp Ala Leu His405 410 415CCG CTG GGC ATG GTG GCA CCG GCC AGC TG1277Pro Leu Gly Met Val Ala Pro Ala Ser420 425(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度1190个碱基对(B)类型核酸(C)链未端两个(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..1191(xi)序列说明SEQ ID NO2
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180 185 190GCG GTC CGA GCC GGA GGC TGC TTT CCG GGA AAT GCC ACG GTG CGC TTG624Ala Val Arg Ala Gly Gly Cys Phe Pro Gly Asn Ala Thr Val Arg Leu195 200 205CGG AGC GGC GAA CGG AAG GGG CTG AGG GAA CTA CAT CGT GGT GAC TGG672Arg Ser Gly Glu Arg Lys Gly Leu Arg Glu Leu His Arg Gly Asp Trp210 215 220GTA CTG GCC GCT GAT GCA GCG GGC CGA GTG GTA CCC ACG CCA GTG CTG720Val Leu Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg Val Val Pro Thr Pro Val Leu225 230 235 240CTC TTC CTG GAC CGG GAT CTG CAG CGC CGC GCC TCG TTC GTG GCT GTG768Leu Phe Leu Asp Arg Asp Leu Gln Arg Arg Ala Ser Phe Val Ala Val245 250 255GAG ACC GAG CGG CCT CCG CGC AAA CTG TTG CTC ACA CCC TGG CAT CTG816Glu Thr Glu Arg Pro Pro Arg Lys Leu Leu Leu Thr Pro Trp His Leu260 265 270GTG TTC GCT GCT CGC GGG CCA GCG CCT GCT CCA GGT GAC TTT GCA CCG864Val Phe Ala Ala Arg Gly Pro Ala Pro Ala Pro Gly Asp Phe Ala Pro275 280 285GTG TTC GCG CGC CGC TTA CGT GCT GGC GAC TCG GTG CTG GCT CCC GGC912Val Phe Ala Arg Arg Leu Arg Ala Gly Asp Ser Val Leu Ala Pro Gly290 295 300GGG GAC GCG CTC CAG CCG GCG CGC GTA GCC CGC GTG GCG CGC GAG GAA960Gly Asp Ala Leu Gln Pro Ala Arg Val Ala Arg Val Ala Arg Glu Glu305 310 315 320GCC GTG GGC GTG TTC GCA CCG CTC ACT GCG CAC GGG ACG CTG CTG GTC1008Ala Val Gly Val Phe Ala Pro Leu Thr Ala His Gly Thr Leu Leu Val325 330 335AAC GAC GTC CTC GCC TCC TGC TAC GCG GTT CTA GAG AGT CAC CAG TGG1056Asn Asp Val Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val Leu Glu Ser His Gln Trp340 345 350GCC CAC CGC GCC TTC GCC CCT TTG CGG CTG CTG CAC GCG CTC GGG GCT1104Ala His Arg Ala Phe Ala Pro Leu Arg Leu Leu His Ala Leu Gly Ala355 360 365CTG CTC CCT GGG GGT GCA GTC CAG CCG ACT GGC ATG CAT TGG TAC TCT1152
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(xi)序列说明SEQ ID NO4ATG CTG CTG CTG CTG GCC AGA TGT TTT CTG GTG ATC CTT GCT TCC TCG48Met Leu Leu Leu Leu Ala Arg Cys Phe Leu Val Ile Leu Ala Ser Ser1 5 10 15CTG CTG GTG TGC CCC GGG CTG GCC TGT GGG CCC GGC AGG GGG TTT GGA96Leu Leu Val Cys Pro Gly Leu Ala Cys Gly Pro Gly Arg Gly Phe Gly20 25 30AAG AGG CGG CAC CCC AAA AAG CTG ACC CCT TTA GCC TAC AAG CAG TTT144Lys Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gln Phe35 40 45ATT CCC AAC GTA GCC GAG AAG ACC CTA GGG GCC AGC GGC AGA TAT GAA192Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu50 55 60GGG AAG ATC ACA AGA AAC TCC GAA CGA TTT AAG GAA CTC ACC CCC AAT240Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn65 70 75 80TAC AAC CCC GAC ATC ATA TTT AAG GAT GAG GAA AAC ACG GGA GCA GAC288Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp85 90 95CGG CTG ATG ACT CAG AGG TGC AAA GAC AAG TTA AAT GCC TTG GCC ATC336Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu Ala Ile100 105 110TCT GTG ATG AAC CAG TGG CCT GGA GTG AGG CTG CGA GTG ACC GAG GGC384Ser Val Met Asn Gln Trp Pro Gly Val Arg Leu Arg Val Thr Glu Gly115 120 125TGG GAT GAG GAC GGC CAT CAT TCA GAG GAG TCT CTA CAC TAT GAG GGT432Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly130 135 140CGA GCA GTG GAC ATC ACC ACG TCC GAC CGG GAC CGC AGC AAG TAC GGC480Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys Tyr Gly145 150 155 160ATG CTG GCT CGC CTG GCT GTG GAA GCA GGT TTC GAC TGG GTC TAC TAT528Met Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr165 170 175
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Ser Ser(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度1425个碱基对(B)类型核酸(C)链未端单个(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..1425(xi)序列说明SEQID NO6ATG CTG CTG CTG GCG AGA TGT CTG CTG CTA GTC CTC GTC TCC TCG CTG48Met Leu Leu Leu Ala Arg Cys Leu Leu Leu Val Leu Val Ser Ser Leu1 5 10 15CTG GTA TGC TCG GGA CTG GCG TGC GGA CCG GGC AGG GGG TTC GGG AAG96Leu Val Cys Ser Gly Leu Ala Cys Gly Pro Gly Arg Gly Phe Gly Lys20 25 30AGG AGG CAC CCC AAA AAG CTG ACC CCT TTA GCC TAC AAG CAG TTT ATC144Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gln Phe Ile35 40 45CCC AAT GTG GCC GAG AAG ACC CTA GGC GCC AGC GGA AGG TAT GAA GGG192Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly50 55 60AAG ATC TCC AGA AAC TCC GAG CGA TTT AAG GAA CTC ACC CCC AAT TAC240Lys Ile Ser Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn Tyr65 70 75 80AAC CCC GAC ATC ATA TTT AAG GAT GAA GAA AAC ACC GGA GCG GAC AGG288Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp Arg85 90 95CTG ATG ACT CAG AGG TGT AAG GAC AAG TTG AAC GCT TTG GCC ATC TCG336Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu Ala Ile Ser100 105 110GTG ATG AAC CAG TGG CCA GGA GTG AAA CTG CGG GTG ACC GAG GGC TGG384
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TTC GCC AGC CGC GTG CGC CCG GGC CAG CGC GTG TAC GTG GTG GCC GAG960Phe Ala Ser Arg Val Arg Pro Gly Gln Arg Val Tyr Val Val Ala Glu305 310 315 320CGT GAC GGG GAC CGC CGG CTC CTG CCC GCC GCT GTG CAC AGC GTG ACC1008Arg Asp Gly Asp Arg Arg Leu Leu Pro Ala Ala Val His Ser Val Thr325 330 335CTA AGC GAG GAG GCC GCG GGC GCC TAC GCG CCG CTC ACG GCC CAG GGC1056Leu Ser Glu Glu Ala Ala Gly Ala Tyr Ala Pro Leu Thr Ala Gln Gly340 345 350ACC ATT CTC ATC AAC CGG GTG CTG GCC TCG TGC TAC GCG GTC ATC GAG1104Thr Ile Leu Ile Asn Arg Val Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val Ile Glu355 360 365GAG CAC AGC TGG GCG CAC CGG GCC TTC GCG CCC TTC CGC CTG GCG CAC1152Glu His Ser Trp Ala His Arg Ala Phe Ala Pro Phe Arg Leu Ala His370 375 380GCG CTC CTG GCT GCA CTG GCG CCC GCG CGC ACG GAC CGC GGC GGG GAC1200Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ala Pro Ala Arg Thr Asp Arg Gly Gly Asp385 390 395 400AGC GGC GGC GGG GAC CGC GGG GGC GGC GGC GGC AGA GTA GCC CTA ACC1248Ser Gly Gly Gly Asp Arg Gly Gly Gly Gly Gly Arg Val Ala Leu Thr405 410 415GCT CCA GGT GCT GCC GAC GCT CCG GGT GCG GGG GCC ACC GCG GGC ATC1296Ala Pro Gly Ala Ala Asp Ala Pro Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Ile420 425 430CAC TGG TAC TCG CAG CTG CTC TAC CAA ATA GGC ACC TGG CTC CTG GAC1344His Trp Tyr Ser Gln Leu Leu Tyr Gln Ile Gly Thr Trp Leu Leu Asp435 440 445AGC GAG GCC CTG CAC CCG CTG GGC ATG GCG GTC AAG TCC AGC NNN AGC1392Ser Glu Ala Leu His Pro Leu Gly Met Ala Val Lys Ser Ser Xaa Ser450 455 460CGG GGG GCC GGG GGA GGG GCG CGG GAG GGG GCC1425Arg Gly Ala Gly Gly Gly Ala Arg Glu Gly Ala465 470 475(2)SEQ ID NO7的信息
(i)序列特征(A)长度1622个碱基对(B)类型核酸(C)链未端两个(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置51..1283(xi)序列说明SEQ ID NO7CATCAGCCCA CCAGGAGACC TCGCCCGCCG CTCCCCCGGG CTCCCCGGCC ATG TCT56Met Ser1CCC GCC CGG CTC CGG CCC CGA CTG CAC TTC TGC CTG GTC CTG TTG CTG104Pro Ala Arg Leu Arg Pro Arg Leu His Phe Cys Leu Val Leu Leu Leu5 10 15CTG CTG GTG GTG CCC GCG GCA TGG GGC TGC GGG CCG GGT CGG GTG GTG152Leu Leu Val Val Pro Ala Ala Trp Gly Cys Gly Pro Gly Arg Val Val20 25 30GGC AGC CGC CGG CGA CCG CCA CGC AAA CTC GTG CCG CTC GCC TAC AAG200Gly Ser Arg Arg Arg Pro Pro Arg Lys Leu Val Pro Leu Ala Tyr Lys35 40 45 50CAG TTC AGC CCC AAT GTG CCC GAG AAG ACC CTG GGC GCC AGC GGA CGC248Gln Phe Ser Pro Asn Val Pro Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg55 60 65TAT GAA GGC AAG ATC GCT CGC AGC TCC GAG CGC TTC AAG GAG CTC ACC296Tyr Glu Gly Lys Ile Ala Arg Ser Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr70 75 80CCC AAT TAC AAT CCA GAC ATC ATC TTC AAG GAC GAG GAG AAC ACA GGC344Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly85 90 95GCC GAC CGC CTC ATG ACC CAG CGC TGC AAG GAC CGC CTG AAC TCG CTG392Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys Asp Arg Leu Asn Ser Leu100 105 110GCT ATC TCG GTG ATG AAC CAG TGG CCC GGT GTG AAG CTG CGG GTG ACC440Ala Ile Ser Val Met Asn Gln Trp Pro Gly Val Lys Leu Arg Val Thr
115 120 125 130GAG GGC TGG GAC GAG GAC GGC CAC CAC TCA GAG GAG TCC CTG CAT TAT488Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr135 140 145GAG GGC CGC GCG GTG GAC ATC ACC ACA TCA GAC CGC GAC CGC AAT AAG536Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg Asn Lys150 155 160TAT GGA CTG CTG GCG CGC TTG GCA GTG GAG GCC GGC TTT GAC TGG GTG584Tyr Gly Leu Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val165 170 175TAT TAC GAG TCA AAG GCC CAC GTG CAT TGC TCC GTC AAG TCC GAG CAC632Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Val His Cys Ser Val Lys Ser Glu His180 185 190TCG GCC GCA GCC AAG ACG GGC GGC TGC TTC CCT GCC GGA GCC CAG GTA680Ser Ala Ala Ala Lys Thr Gly Gly Cys Phe Pro Ala Gly Ala Gln Val195 200 205 210CGC CTG GAG AGT GGG GCG CGT GTG GCC TTG TCA GCC GTG AGG CCG GGA728Arg Leu Glu Ser Gly Ala Arg Val Ala Leu Ser Ala Val Arg Pro Gly215 220 225GAC CGT GTG CTG GCC ATG GGG GAG GAT GGG AGC CCC ACC TTC AGC GAT776Asp Arg Val Leu Ala Met Gly Glu Asp Gly Ser Pro Thr Phe Ser Asp230 235 240GTG CTC ATT TTC CTG GAC CGC GAG CCC CAC AGG CTG AGA GCC TTC CAG824Val Leu Ile Phe Leu Asp Arg Glu Pro His Arg Leu Arg Ala Phe Gln245 250 255GTC ATC GAG ACT CAG GAC CCC CCA CGC CGC CTG GCA CTC ACA CCC GCT872Val Ile Glu Thr Gln Asp Pro Pro Arg Arg Leu Ala Leu Thr Pro Ala260 265 270CAC CTG CTC TTT ACG GCT GAC AAT CAC ACG GAG CCG GCA GCC CGC TTC920His Leu Leu Phe Thr Ala Asp Asn His Thr Glu Pro Ala Ala Arg Phe275 280 285 290CGG GCC ACA TTT GCC AGC CAC GTG CAG CCT GGC CAG TAC GTG CTG GTG968Arg Ala Thr Phe Ala Ser His Val Gln Pro Gly Gln Tyr Val Leu Val295 300 305GCT GGG GTG CCA GGC CTG CAG CCT GCC CGC GTG GCA GCT GTC TCT ACA1016
Ala Gly Val Pro Gly Leu Gln Pro Ala Arg Val Ala Ala Val Ser Thr310 315 320CAC GTG GCC CTC GGG GCC TAC GCC CCG CTC ACA AAG CAT GGG ACA CTG1064His Val Ala Leu Gly Ala Tyr Ala Pro Leu Thr Lys His Gly Thr Leu325 330 335GTG GTG GAG GAT GTG GTG GCA TCC TGC TTC GCG GCC GTG GCT GAC CAC1112Val Val Glu Asp Val Val Ala Ser Cys Phe Ala Ala Val Ala Asp His340 345 350CAC CTG GCT CAG TTG GCC TTC TGG CCC CTG AGA CTC TTT CAC AGC TTG1160His Leu Ala Gln Leu Ala Phe Trp Pro Leu Arg Leu Phe His Ser Leu355 360 365 370GCA TGG GGC AGC TGG ACC CCG GGG GAG GGT GTG CAT TGG TAC CCC CAG1208Ala Trp Gly Ser Trp Thr Pro Gly Glu Gly Val His Trp Tyr Pro Gln375 380 385CTG CTC TAC CGC CTG GGG CGT CTC CTG CTA GAA GAG GGC AGC TTC CAC1256Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Arg Leu Leu Leu Glu Glu Gly Ser Phe His390 395 400CCA CTG GGC ATG TCC GGG GCA GGG AGC TGAAAGGACT CCACCGCTGC1303Pro Leu Gly Met Ser Gly Ala Gly Ser405 410CCTCCTGGAA CTGCTGTACT GGGTCCAGAA GCCTCTCAGC CAGGAGGGAG CTGGCCCTGG1363AAGGGACCTG AGCTGGGGGA CACTGGCTCC TGCCATCTCC TCTGCCATGA AGATACACCA1423TTGAGACTTG ACTGGGCAAC ACCAGCGTCC CCCACCCGCG TCGTGGTGTA GTCATAGAGC1483TGCAAGCTGA GCTGGCGAGG GGATGGTTGT TGACCCCTCT CTCCTAGAGA CCTTGAGGCT1543GGCACGGCGA CTCCCAACTC AGCCTGCTCT CACTACGAGT TTTCATACTC TGCCTCCCCC1603ATTGGGAGGG CCCATTCCC1622(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度1191个碱基对(B)类型核酸(C)链未端两个(D)拓扑学线性
(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..1191(xi)序列说明SEG ID NO8ATG GCT CTC CTG ACC AAT CTA CTG CCC TTG TGC TGC TTG GCA CTT CTG48Met Ala Leu Leu Thr Asn Leu Leu Pro Leu Cys Cys Leu Ala Leu Leu1 5 10 15GCG CTG CCA GCC CAG AGC TGC GGG CCG GGC CGG GGG CCG GTT GGC CGG96Ala Leu Pro Ala Gln Ser Cys Gly Pro Gly Arg Gly Pro Val Gly Arg20 25 30CGC CGC TAT GCG CGC AAG CAG CTC GTG CCG CTA CTC TAC AAG CAA TTT144Arg Arg Tyr Ala Arg Lys Gln Leu Val Pro Leu Leu Tyr Lys Gln Phe35 40 45GTG CCC GGC GTG CCA GAG CGG ACC CTG GGC GCC AGT GGG CCA GCG GAG192Val Pro Gly Val Pro Glu Arg Thr Leu Gly Ala Ser Gly Pro Ala Glu50 55 60GGG AGG GTG GCA AGG GGC TCC GAG CGC TTC CGG GAC CTC GTG CCC AAC240Gly Arg Val Ala Arg Gly Ser Glu Arg Phe Arg Asp Leu Val Pro Asn65 70 75 80TAC AAC CCC GAC ATC ATC TTC AAG GAT GAG GAG AAC AGT GGA GCC GAC288Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Ser Gly Ala Asp85 90 95CGC CTG ATG ACC GAG CGT TGC AAG GAG AGG GTG AAC GCT TTG GCC ATT336Arg Leu Met Thr Glu Arg Cys Lys Glu Arg Val Asn Ala Leu Ala Ile100 105 110GCC GTG ATG AAC ATG TGG CCC GGA GTG CGC CTA CGA GTG ACT GAG GGC384Ala Val Met Asn Met Trp Pro Gly Val Arg Leu Arg Val Thr Glu Gly115 120 125TGG GAC GAG GAC GGC CAC CAC GCT CAG GAT TCA CTC CAC TAC GAA GGC432Trp Asp Glu Asp Gly His His Ala Gln Asp Ser Leu His Tyr Glu Gly130 135 140CGT GCT TTG GAC ATC ACT ACG TCT GAC CGC GAC CGC AAC AAG TAT GGG480Arg Ala Leu Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg Asn Lys Tyr Gly145 150 155 160
TTG CTG GCG CGC CTC GCA GTG GAA GCC GGC TTC GAC TGG GTC TAC TAC528Leu Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr165 170 175GAG TCC CGC AAC CAC GTC CAC GTG TCG GTC AAA GCT GAT AAC TCA CTG576Glu Ser Arg Asn His Val His Val Ser Val Lys Ala Asp Asn Ser Leu180 185 190GCG GTC CGG GCG GGC GGC TGC TTT CCG GGA AAT GCA ACT GTG CGC CTG624Ala Val Arg Ala Gly Gly Cys Phe Pro Gly Asn Ala Thr Val Arg Leu195 200 205TGG AGC GGC GAG CGG AAA GGG CTG CGG GAA CTG CAC CGC GGA GAC TGG672Trp Ser Gly Glu Arg Lys Gly Leu Arg Glu Leu His Arg Gly Asp Trp210 215 220GTT TTG GCG GCC GAT GCG TCA GGC CGG GTG GTG CCC ACG CCG GTG CTG720Val Leu Ala Ala Asp Ala Ser Gly Arg Val Val Pro Thr Pro Val Leu225 230 235 240CTC TTC CTG GAC CGG GAC TTG CAG CGC CGG GCT TCA TTT GTG GCT GTG768Leu Phe Leu Asp Arg Asp Leu Gln Arg Arg Ala Ser Phe Val Ala Val245 250 255GAG ACC GAG TGG CCT CCA CGC AAA CTG TTG CTC ACG CCC TGG CAC CTG816Glu Thr Glu Trp Pro Pro Arg Lys Leu Leu Leu Thr Pro Trp His Leu260 265 270GTG TTT GCC GCT CGA GGG CCG GCG CCC GCG CCA GGC GAC TTT GCA CCG864Val Phe Ala Ala Arg Gly Pro Ala Pro Ala Pro Gly Asp Phe Ala Pro275 280 285GTG TTC GCG CGC CGG CTA CGC GCT GGG GAC TCG GTG CTG GCG CCC GGC912Val Phe Ala Arg Arg Leu Arg Ala Gly Asp Ser Val Leu Ala Pro Gly290 295 300GGG GAT GCG CTT CGG CCA GCG CGC GTG GCC CGT GTG GCG CGG GAG GAA960Gly Asp Ala Leu Arg Pro Ala Arg Val Ala Arg Val Ala Arg Glu Glu305 310 315 320GCC GTG GGC GTG TTC GCG CCG CTC ACC GCG CAC GGG ACG CTG CTG GTG1008Ala Val Gly Val Phe Ala Pro Leu Thr Ala His Gly Thr Leu Leu Val325 330 335AAC GAT GTC CTG GCC TCT TGC TAC GCG GTT CTG GAG AGT CAC CAG TGG1056Asn Asp Val Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val Leu Glu Ser His Gln Trp
340 345 350GCG CAC CGC GCT TTT GCC CCC TTG AGA CTG CTG CAC GCG CTA GGG GCG1104Ala His Arg Ala Phe Ala Pro Leu Arg Leu Leu His Ala Leu Gly Ala355 360 365CTG CTC CCC GGC GGG GCC GTC CAG CCG ACT GGC ATG CAT TGG TAC TCT1152Leu Leu Pro Gly Gly Ala Val Gln Pro Thr Gly Met His Trp Tyr Ser370 375 380CGG CTC CTC TAC CGC TTA GCG GAG GAG CTA CTG GGC TG1191Arg Leu Leu Tyr Arg Leu Ala Glu Glu Leu Leu Gly385 390 395(2)SEQ ID No9的信息(i)序列特征(A)长度1251个碱基对(B)类型核酸(C)链未端两个(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..1248(xi)序列说明SEQ ID No9ATG GAC GTA AGG CTG CAT CTG AAG CAA TTT GCT TTA CTG TGT TTT ATC48Met Asp Val Arg Leu His Leu Lys Gln Phe Ala Leu Leu Cys Phe Ile1 5 10 15AGC TTG CTT CTG ACG CCT TGT GGA TTA GCC TGT GGT CCT GGT AGA GGT96Ser Leu Leu Leu Thr Pro Cys Gly Leu Ala Cys Gly Pro Gly Arg Gly20 25 30TAT GGA AAA CGA AGA CAC CCA AAG AAA TTA ACC CCG TTG GCT TAC AAG144Tyr Gly Lys Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys35 40 45CAA TTC ATC CCC AAC GTT GCT GAG AAA ACG CTT GGA GCC AGC GGC AAA192Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Lys50 55 60TAC GAA GGC AAA ATC ACA AGG AAT TCA GAG AGA TTT AAA GAG CTG ATT240
Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ile65 70 75 80CCG AAT TAT AAT CCC GAT ATC ATC TTT AAG GAC GAG GAA AAC ACA AAC288Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Asn85 90 95GCT GAC AGG CTG ATG ACC AAG CGC TGT AAG GAC AAG TTA AAT TCG TTG336Ala Asp Arg Leu Met Thr Lys Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ser Leu100 105 110GCC ATA TCC GTC ATG AAC CAC TGG CCC GGC GTG AAA CTG CGC GTC ACT384Ala Ile Ser Val Met Asn His Trp Pro Gly Val Lys Leu Arg Val Thr115 120 125GAA GGC TGG GAT GAG GAT GGT CAC CAT TTA GAA GAA TCT TTG CAC TAT432Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Leu Glu Glu Ser Leu His Tyr130 135 140GAG GGA CGG GCA GTG GAC ATC ACT ACC TCA GAC AGG GAT AAA AGC AAG480Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Lys Ser Lys145 150 155 160TAT GGG ATG CTA TCC AGG CTT GCA GTG GAG GCA GGA TTC GAC TGG GTC528Tyr Gly Met Leu Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val165 170 175TAT TAT GAA TCT AAA GCC CAC ATA CAC TGC TCT GTC AAA GCA GAA AAT576Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn180 185 190TCA GTG GCT GCT AAA TCA GGA GGA TGT TTT CCT GGG TCT GGG ACG GTG624Ser Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Gly Thr Val195 200 205ACA CTT GGT GAT GGG ACG AGG AAA CCC ATC AAA GAT CTT AAA GTG GGC672Thr Leu Gly Asp Gly Thr Arg Lys Pro Ile Lys Asp Leu Lys Val Gly210 215 220GAC CGG GTT TTG GCT GCA GAC GAG AAG GGA AAT GTC TTA ATA AGC GAC720Asp Arg Val Leu Ala Ala Asp Glu Lys Gly Asn Val Leu Ile Ser Asp225 230 235 240TTT ATT ATG TTT ATA GAC CAC GAT CCG ACA ACG AGA AGG CAA TTC ATC768Phe Ile Met Phe Ile Asp His Asp Pro Thr Thr Arg Arg Gln Phe Ile245 250 255
GTC ATC GAG ACG TCA GAA CCT TTC ACC AAG CTC ACC CTC ACT GCC GCG816Val Ile Glu Thr Ser Glu Pro Phe Thr Lys Leu Thr Leu Thr Ala Ala260 265 270CAC CTA GTT TTC GTT GGA AAC TCT TCA GCA GCT TCG GGT ATA ACA GCA864His Leu Val Phe Val Gly Asn Ser Ser Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala275 280 285ACA TTT GCC AGC AAC GTG AAG CCT GGA GAT ACA GTT TTA GTG TGG GAA912Thr Phe Ala Ser Asn Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Leu Val Trp Glu290 295 300GAC ACA TGC GAG AGC CTC AAG AGC GTT ACA GTG AAA AGG ATT TAC ACT960Asp Thr Cys Glu Ser Leu Lys Ser Val Thr Val Lys Arg Ile Tyr Thr305 310 315 320GAG GAG CAC GAG GGC TCT TTT GCG CCA GTC ACC GCG CAC GGA ACC ATA1008Glu Glu His Glu Gly Ser Phe Ala Pro Val Thr Ala His Gly Thr Ile325 330 335ATA GTG GAT CAG GTG TTG GCA TCG TGC TAC GCG GTC ATT GAG AAC CAC1056Ile Val Asp Gln Val Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val Ile Glu Asn His340 345 350AAA TGG GCA CAT TGG GCT TTT GCG CCG GTC AGG TTG TGT CAC AAG CTG1104Lys Trp Ala His Trp Ala Phe Ala Pro Val Arg Leu Cys His Lys Leu355 360 365ATG ACG TGG CTT TTT CCG GCT CGT GAA TCA AAC GTC AAT TTT CAG GAG1152Met Thr Trp Leu Phe Pro Ala Arg Glu Ser Asn Val Asn Phe Gln Glu370 375 380GAT GGT ATC CAC TGG TAC TCA AAT ATG CTG TTT CAC ATC GGC TCT TGG1200Asp Gly Ile His Trp Tyr Ser Asn Met Leu Phe His Ile Gly Ser Trp385 390 395 400CTG CTG GAC AGA GAC TCT TTC CAT CCA CTC GGG ATT TTA CAC TTA AGT1248Leu Leu Asp Arg Asp Ser Phe His Pro Leu Gly Ile Leu His Leu Ser405 410 415TGA1251(2)SEQ ID No10的信息(i)序列特征(A)长度425个氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列说明SEQ ID N010Met Val Glu Met Leu Leu Leu Thr Arg Ile Leu Leu Val Gly Phe Ile1 5 10 15Cys Ala Leu Leu Val Ser Ser Gly Leu Thr Cys Gly Pro Gly Arg Gly20 25 30Ile Gly Lys Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys35 40 45Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg50 55 60Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr65 70 75 80Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly85 90 95Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu100 105 110Ala Ile Ser Val Met Asn Gln Trp Pro Gly Val Lys Leu Arg Val Thr115 120 125Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr130 135 140Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys145 150 155 160Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val165 170 175Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn180 185 190Ser Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Ala Thr Val195 200 205His Leu Glu His Gly Gly Thr Lys Leu Val Lys Asp Leu Ser Pro Gly210 215 220Asp Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Asp Gly Arg Leu Leu Tyr Ser Asp225 230 235 240Phe Leu Thr Phe Leu Asp Arg Met Asp Ser Ser Arg Lys Leu Phe Tyr245 250 255Val Ile Glu Thr Arg Gln Pro Arg Ala Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ala260 265 270His Leu Leu Phe Val Ala Pro Gln His Asn Gln Ser Glu Ala Thr Gly
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Ala Asn Gly Gln Ala Val Tyr Ser Glu Val Ile Leu Phe Met Asp Arg290 295 300AAC CTC GAG CAG ATG CAA AAC TTT GTG CAG CTG CAC ACG GAC GGT GGA960Asn Leu Glu Gln Met Gln Asn Phe Val Gln Leu His Thr Asp Gly Gly305 310 315 320GCA GTG CTC ACG GTG ACG CCG GCT CAC CTG GTT AGC GTT TGG CAG CCG1008Ala Val Leu Thr Val Thr Pro Ala His Leu Val Ser Val Trp Gln Pro325 330 335GAG AGC CAG AAG CTC ACG TTT GTG TTT GCG CAT CGC ATC GAG GAG AAG1056Glu Ser Gln Lys Leu Thr Phe Val Phe Ala His Arg Ile Glu Glu Lys340 345 350AAC CAG GTG CTC GTA CGG GAT GTG GAG ACG GGC GAG CTG AGG CCC CAG1104Asn Gln Val Leu Val Arg Asp Val Glu Thr Gly Glu Leu Arg Pro Gln355 360 365CGA GTG GTC AAG TTG GGC AGT GTG CGC AGT AAG GGC GTG GTC GCG CCG1152Arg Val Val Lys Leu Gly Ser Val Arg Ser Lys Gly Val Val Ala Pro370 375 380CTG ACC CGC GAG GGC ACC ATT GTG GTC AAC TCG GTG GCC GCC AGT TGC1200Leu Thr Arg Glu Gly Thr Ile Val Val Asn Ser Val Ala Ala Ser Cys385 390 395 400TAT GCG GTG ATC AAC AGT CAG TCG CTG GCC CAC TGG GGA CTG GCT CCC1248Tyr Ala Val Ile Asn Ser Gln Ser Leu Ala His Trp Gly Leu Ala Pro405 410 415ATG CGC CTG CTG TCC ACG CTG GAG GCG TGG CTG CCC GCC AAG GAG CAG1296Met Arg Leu Leu Ser Thr Leu Glu Ala Trp Leu Pro Ala Lys Glu Gln420 425 430TTG CAC AGT TCG CCG AAG GTG GTG AGC TCG GCG CAG CAG CAG AAT GGC1344Leu His Ser Ser Pro Lys Val Val Ser Ser Ala Gln Gln Gln Asn Gly435 440 445ATC CAT TGG TAT GCC AAT GCG CTC TAC AAG GTC AAG GAC TAC GTG CTG1392Ile His Trp Tyr Ala Asn Ala Leu Tyr Lys Val Lys Asp Tyr Val Leu450 455 460CCG CAG AGC TGG CGC CAC GAT TGA1416Pro Gln Ser Trp Arg His Asp465 470
(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度471个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白(xi)序列说明SEQ ID NO20Met Asp Asn His Ser Ser Val Pro Trp Ala Ser Ala Ala Ser Val Thr1 5 10 15Cys Leu Ser Leu Gly Cys Gln Met Pro Gln Phe Gln Phe Gln Phe Gln20 25 30Leu Gln Ile Arg Ser Glu Leu His Leu Arg Lys Pro Ala Arg Arg Thr35 40 45Gln Thr Met Arg His Ile Ala His Thr Gln Arg Cys Leu Ser Arg Leu50 55 60Thr Ser Leu Val Ala Leu Leu Leu Ile Val Leu Pro Met Val Phe Ser65 70 75 80Pro Ala His Ser Cys Gly Pro Gly Arg Gly Leu Gly Arg His Arg Ala85 90 95Arg Asn Leu Tyr Pro Leu Val Leu Lys Gln Thr Ile Pro Asn Leu Ser100 105 110Glu Tyr Thr Asn Ser Ala Ser Gly Pro Leu Glu Gly Val Ile Arg Arg115 120 125Asp Ser Pro Lys Phe Lys Asp Leu Val Pro Asn Tyr Asn Arg Asp Ile130 135 140Leu Phe Arg Asp Glu Glu Gly Thr Gly Ala Asp Gly Leu Met Ser Lys145 150 155 160Arg Cys Lys Glu Lys Leu Asn Val Leu Ala Tyr Ser Val Met Asn Glu165 170 175Trp Pro Gly Ile Arg Leu Leu Val Thr Glu Ser Trp Asp Glu Asp Tyr180 185 190His His Gly Gln Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Thr Ile195 200 205Ala Thr Ser Asp Arg Asp Gln Ser Lys Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu210 215 220Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Ser Tyr Val Ser Arg Arg His225 230 235 240Ile Tyr Cys Ser Val Lys Ser Asp Ser Ser Ile Ser Ser s Val His245 250 255
Gly Cys Phe Thr Pro Glu Ser Thr Ala Leu Leu Glu Ser Gly Val Arg260 265 270Lys Pro Leu Gly Glu Leu Ser Ile Gly Asp Arg Val Leu Ser Met Thr275 280 285Ala Asn Gly Gln Ala Val Tyr Ser Glu Val Ile Leu Phe Met Asp Arg290 295 300Asn Leu Glu Gln Met Gln Asn Phe Val Gln Leu His Thr Asp Gly Gly305 310 315 320Ala Val Leu Thr Val Thr Pro Ala His Leu Val Ser Val Trp Gln Pro325 330 335Glu Ser Gln Lys Leu Thr Phe Val Phe Ala His Arg Ile Glu Glu Lys340 345 350Asn Gln Val Leu Val Arg Asp Val Glu Thr Gly Glu Leu Arg Pro Gln355 360 365Arg Val Val Lys Leu Gly Ser Val Arg Ser Lys Gly Val Val Ala Pro370 375 380Leu Thr Arg Glu Gly Thr Ile Val Val Asn Ser Val Ala Ala Ser Cys385 390 395 400Tyr Ala Val Ile Asn Ser Gln Ser Leu Ala His Trp Gly Leu Ala Pro405 410 415Met Arg Leu Leu Ser Thr Leu Glu Ala Trp Leu Pro Ala Lys Glu Gln420 425 430Leu His Ser Ser Pro Lys Val Val Ser Ser Ala Gln Gln Gln Asn Gly435 440 445Ile His Trp Tyr Ala Asn Ala Leu Tyr Lys Val Lys Asp Tyr Val Leu450 455 460Pro Gln Ser Trp Arg His Asp465 470(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度221个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(v)片段类型内部(xi)序列说明SEQ ID NO21Cys Gly Pro Gly Arg Gly Xaa Gly Xaa Arg Arg His Pro Lys Lys Leu1 5 10 15
Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr20 25 30Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Xaa Arg Asn Ser Glu35 40 45Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys50 55 60Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys65 70 75 80Asp Lys Leu Asn Xaa Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Xaa Trp Pro Gly85 90 95Val Xaa Leu Arg Val Thr Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Xaa100 105 110Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser115 120 125Asp Arg Asp Xaa Ser Lys Tyr Gly Xaa Leu Xaa Arg Leu Ala Val Glu130 135 140Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His Cys145 150 155 160Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe165 170 175Pro Gly Ser Ala Xaa Val Xaa Leu Xaa Xaa Gly Gly Xaa Lys Xaa Val180 185 190Lys Asp Leu Xaa Pro Gly Asp Xaa Val Leu Ala Ala Asp Xaa Xaa Gly195 200 205Xaa Leu Xaa Xaa Ser Asp Phe Xaa Xaa Phe Xaa Asp Arg210 215 220(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度167个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(v)片段类型内部(xi)序列说明SEQ ID NO22
Cys Gly Pro Gly Arg Gly Xaa Xaa Xaa Arg Arg Xaa Xaa Xaa Pro Lys1 5 10 15Xaa Leu Xaa Pro Leu Xaa Tyr Lys Gln Phe Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Glu20 25 30Xaa Thr Leu Gly Ala Ser Gly Xaa Xaa Glu Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa35 40 45Ser Glu Arg Phe Xaa Xaa Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile50 55 60Phe Lys Asp Glu Glu Asn Xaa Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Xaa Arg65 70 75 80Cys Lys Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Xaa Trp85 90 95Pro Gly Val Xaa Leu Arg Val Thr Glu Gly Xaa Asp Glu Asp Gly His100 105 110His Xaa Xaa Xaa Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Xaa Asp Ile Thr115 120 125Thr Ser Asp Arg Asp Xaa Xaa Lys Tyr Gly Xaa Leu Xaa Arg Leu Ala130 135 140Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr Glu Ser Xaa Xaa His Xaa145 150 155 160His Xaa Ser Val Lys Xaa Xaa165(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度3900个碱基对(B)类型核酸(C)链未端两个(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1..3897(xi)序列说明SEQ ID NO23ATG GAC CGC GAC AGC CTC CCA CGC GTT CCG GAC ACA CAC GGC GAT GTG48Met Asp Arg Asp Ser Leu Pro Arg Val Pro Asp Thr His Gly Asp Val1 5 10 15
GTC GAT GAG AAA TTA TTC TCG GAT CTT TAC ATA CGC ACC AGC TGG GTG96Val Asp Glu Lys Leu Phe Ser Asp Leu Tyr Ile Arg Thr Ser Trp Val20 25 30GAC GCC CAA GTG GCG CTC GAT CAG ATA GAT AAG GGC AAA GCG CGT GGC144Asp Ala Gln Val Ala Leu Asp Gln Ile Asp Lys Gly Lys Ala Arg Gly35 40 45AGC CGC ACG GCG ATC TAT CTG CGA TCA GTA TTC CAG TCC CAC CTC GAA192Ser Arg Thr Ala Ile Tyr Leu Arg Ser Val Phe Gln Ser His Leu Glu50 55 60ACC CTC GGC AGC TCC GTG CAA AAG CAC GCG GGC AAG GTG CTA TTC GTG240Thr Leu Gly Ser Ser Val Gln Lys His Ala Gly Lys Val Leu Phe Val65 70 75 80GCT ATC CTG GTG CTG AGC ACC TTC TGC GTC GGC CTG AAG AGC GCC CAG288Ala Ile Leu Val Leu Ser Thr Phe Cys Val Gly Leu Lys Ser Ala Gln85 90 95ATC CAC TCC AAG GTG CAC CAG CTG TGG ATC CAG GAG GGC GGC GGG CTG336Ile His Ser Lys Val His Gln Leu Trp Ile Gln Glu Gly Gly Gly Leu100 105 110GAG GCG GAA CTG GCC TAC ACA CAG AAG ACG ATC GGC GAG GAC GAG TCG384Glu Ala Glu Leu Ala Tyr Thr Gln Lys Thr Ile Gly Glu Asp Glu Ser115 120 125GCC ACG CAT CAG CTG CTC ATT CAG ACG ACC CAC GAC CCG AAC GCC TCC432Ala Thr His Gln Leu Leu Ile Gln Thr Thr His Asp Pro Asn Ala Ser130 135 140GTC CTG CAT CCG CAG GCG CTG CTT GCC CAC CTG GAG GTC CTG GTC AAG480Val Leu His Pro Gln Ala Leu Leu Ala His Leu Glu Val Leu Val Lys145 150 155 160GCC ACC GCC GTC AAG GTG CAC CTC TAC GAC ACC GAA TGG GGG CTG CGC528Ala Thr Ala Val Lys Val His Leu Tyr Asp Thr Glu Trp Gly Leu Arg165 170 175GAC ATG TGC AAC ATG CCG AGC ACG CCC TCC TTC GAG GGC ATC TAC TAC576Asp Met Cys Asn Met Pro Ser Thr Pro Ser Phe Glu Gly Ile Tyr Tyr180 185 190ATC GAG CAG ATC CTG CGC CAC CTC ATT CCG TGC TCG ATC ATC ACG CCG624Ile Glu Gln Ile Leu Arg His Leu Ile Pro Cys Ser Ile Ile Thr Pro
195 200 205CTG GAC TGT TTC TGG GAG GGA AGC CAG CTG TTG GGT CCG GAA TCA GCG672Leu Asp Cys Phe Trp Glu Gly Ser Gln Leu Leu Gly Pro Glu Ser Ala210 215 220GTC GTT ATA CCA GGC CTC AAC CAA CGA CTC CTG TGG ACC ACA CTG AAT720Val Val Ile Pro Gly Leu Asn Gln Arg Leu Leu Trp Thr Thr Leu Asn225 230 235 240CCC GCC TCT GTG ATG CAG TAT ATG AAG CAG AAG ATG TCC GAG GAA AAG768Pro Ala Ser Val Met Gln Tyr Met Lys Gln Lys Met Ser Glu Glu Lys245 250 255ATC AGC TTC GAC TTC GAG ACC GTG GAG CAG TAC ATG AAG CGT GCG GCC816Ile Ser Phe Asp Phe Glu Thr Val Glu Gln Tyr Met Lys Arg Ala Ala260 265 270ATT GCG AGT GGC TAC ATG GAG AAG CCC TGC CTG AAC CCA CTG AAT CCC864Ile Ala Ser Gly Tyr Met Glu Lys Pro Cys Leu Asn Pro Leu Asn Pro275 280 285AAT TGC CCG GAC ACG GCA CCG AAC AAG AAC AGC ACC CAG CCG CCG GAT912Asn Cys Pro Asp Thr Ala Pro Asn Lys Asn Ser Thr Gln Pro Pro Asp290 295 300GTG GGA GCC ATC CTG TCC GGA GGC TGC TAC GGT TAT GCC GCG AAG CAC960Val Gly Ala Ile Leu Ser Gly Gly Cys Tyr Gly Tyr Ala Ala Lys His305 310 315 320ATG CAC TGG CCG GAG GAG CTG ATT GTG GGC GGA GCG AAG AGG AAC CGC1008Met His Trp Pro Glu Glu Leu Ile Val Gly Gly Ala Lys Arg Asn Arg325 330 335AGC GGA CAC TTG AGG AAG GCC CAG GCC CTG CAG TCG GTG GTG CAG CTG1056Ser Gly His Leu Arg Lys Ala Gln Ala Leu Gln Ser Val Val Gln Leu340 345 350ATG ACC GAG AAG GAA ATG TAC GAC CAG TGG CAG GAC AAC TAC AAG GTG1104Met Thr Glu Lys Glu Met Tyr Asp Gln Trp Gln Asp Asn Tyr Lys Val355 360 365CAC CAT CTT GGA TGG ACG CAG GAG AAG GCA GCG GAG GTT TTG AAC GCC1152His His Leu Gly Trp Thr Gln Glu Lys Ala Ala Glu Val Leu Asn Ala370 375 380
TGG CAG CGC AAC TTT TCG CGG GAG GTG GAA CAG CTG CLA CGT AAA CAG1200Trp Gln Arg Asn Phe Ser Arg Glu Val Glu Gln Leu Leu Arg Lys Gln385 390 395 400TCG AGA ATT GCC ACC AAC TAC GAT ATC TAC GTG TTC AGC TCG GCT GCA1248Ser Arg Ile Ala Thr Asn Tyr Asp Ile Tyr Val Phe Ser Ser Ala Ala405 410 415CTG GAT GAC ATC CTG GCC AAG TTC TCC CAT CCC AGC GCC TTG TCC ATT1296Leu Asp Asp Ile Leu Ala Lys Phe Ser His Pro Ser Ala Leu Ser Ile420 425 430GTC ATC GGC GTG GCC GTC ACC GTT TTG TAT GCC TTC TGC ACG CTC CTC1344Val Ile Gly Val Ala Val Thr Val Leu Tyr Ala Phe Cys Thr Leu Leu435 440 445CGC TGG AGG GAC CCC GTC CGT GGA CAG AGC AGT GTC GGC GTG GCC GGA1392Arg Trp Arg Asp Pro Val Arg Gly Gln Ser Ser Val Gly Val Ala Gly450 455 460GTT CTG CTC ATG TGC TTT AGT ACC GCC GCC GGA TTG GGA TTG TCA GCC1440Val Leu Leu Met Cys Phe Ser Thr Ala Ala Gly Leu Gly Leu Ser Ala465 470 475 480CTG CTC GGT ATC GTT TTC AAT GCC GCC AGC ACC CAG GTG GTT CCG TTT1488Leu Leu Gly Ile Val Phe Asn Ala Ala Ser Thr Gln Val Val Pro Phe485 490 495TTG GCC CTT GGT CTG GGC GTC GAT CAC ATC TTC ATG CTG ACC GCT GCC1536Leu Ala Leu Gly Leu Gly Val Asp His Ile Phe Met Leu Thr Ala Ala500 505 510TAT GCG GAG AGC AAT CGG CGG GAG CAG ACC AAG CTG ATT CTC AAG AAA1584Tyr Ala Glu Ser Asn Arg Arg Glu Gln Thr Lys Leu Ile Leu Lys Lys515 520 525GTG GGA CCG AGC ATC CTG TTC AGT GCC TGC AGC ACC GCA GGA TCC TTC1632Val Gly Pro Ser Ile Leu Phe Ser Ala Cys Ser Thr Ala Gly Ser Phe530 535 540TTT GCG GCC GCC TTT ATT CCG GTG CCG GCT TTG AAG GTA TTC TGT CTG1680Phe Ala Ala Ala Phe Ile Pro Val Pro Ala Leu Lys Val Phe Cys Leu545 550 555 560CAG GCT GCC ATC GTA ATG TGC TCC AAT TTG GCA GCG GCT CTA TTG GTT1728Gln Ala Ala Ile Val Met Cys Ser Asn Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val
565 570 575TTT CCG GCC ATG ATT TCG TTG GAT CTA CGG AGA CGT ACC GCC GGC AGG1776Phe Pro Ala Met Ile Ser Leu Asp Leu Arg Arg Arg Thr Ala Gly Arg580 585 590GCG GAC ATC TTC TGC TGC TGT TTT CCG GTG TGG AAG GAA CAG CCG AAG1824Ala Asp Ile Phe Cys Cys Cys Phe Pro Val Trp Lys Glu Gln Pro Lys595 600 605GTG GCA CCA CCG GTG CTG CCG CTG AAC AAC AAC AAC GGG CGC GGG GCC1872Val Ala Pro Pro Val Leu Pro Leu Asn Asn Asn Asn Gly Arg Gly Ala610 615 620CGG CAT CCG AAG AGC TGC AAC AAC AAC AGG GTG GCG CTG CCC GCC CAG1920Arg His Pro Lys Ser Cys Asn Asn Asn Arg Val Ala Leu Pro Ala Gln625 630 635 640AAT CCT CTG CTG GAA CAG AGG GCA GAC ATC CCT GGG AGC AGT CAC TCA1968Asn Pro Leu Leu Glu Gln Arg Ala Asp Ile Pro Gly Ser Ser His Ser645 650 655CTG GCG TCC TTC TCT CTG GCA ACA TTC GCC TTT CAG CAC TAC ACT CCC2016Leu Ala Ser Phe Ser Leu Ala Thr Phe Ala Phe Gln His Tyr Thr Pro660 665 670TTC CTC ATG CGC AGC TGG GTG AAG TTC CTG ACC GTT ATG GGT TTC CTG2064Phe Leu Met Arg Ser Trp Val Lys Phe Leu Thr Val Met Gly Phe Leu675 680 685GCG GCC CTC ATA TCC AGC TTG TAT GCC TCC ACG CGC CTT CAG GAT GGC2112Ala Ala Leu Ile Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Thr Arg Leu Gln Asp Gly690 695 700CTG GAC ATT ATT GAT CTG GTG CCC AAG GAC AGC AAC GAG CAC AAG TTC2160Leu Asp Ile Ile Asp Leu Val Pro Lys Asp Ser Asn Glu His Lys Phe705 710 715 720CTG GAT GCT CAA ACT CGG CTC TTT GGC TTC TAC AGC ATG TAT GCG GTT2208Leu Asp Ala Gln Thr Arg Leu Phe Gly Phe Tyr Ser Met Tyr Ala Val725 730 735ACC CAG GGC AAC TTT GAA TAT CCC ACC CAG CAG CAG TTG CTC AGG GAC2256Thr Gln Gly Asn Phe Glu Tyr Pro Thr Gln Gln Gln Leu Leu Arg Asp740 745 750
TAC CAT GAT TCC TTT GTG CGG GTG CCA CAT GTG ATC AAG AAT GAT AAT2304Tyr His Asp Ser Phe Val Arg Val Pro His Val Ile Lys Asn Asp Asn755 760 765GGT GGA CTG CCG GAC TTC TGG CTG CTG CTC TTC AGC GAG TGG CTG GGT2352Gly Gly Leu Pro Asp Phe Trp Leu Leu Leu Phe Ser Glu Trp Leu Gly770 775 780AAT CTG CAA AAG ATA TTC GAC GAG GAA TAC CGC GAC GGA CGG CTG ACC2400Asn Leu Gln Lys Ile Phe Asp Glu Glu Tyr Arg Asp Gly Arg Leu Thr785 790 795 800AAG GAG TGC TGG TTC CCA AAC GCC AGC AGC GAT GCC ATC CTG GCC TAC2448Lys Glu Cys Trp Phe Pro Asn Ala Ser Ser Asp Ala Ile Leu Ala Tyr805 810 815AAG CTA ATC GTG CAA ACC GGC CAT GTG GAC AAC CCC GTG GAC AAG GAA2496Lys Leu Ile Val Gln Thr Gly His Val Asp Asn Pro Val Asp Lys Glu820 825 830CTG GTG CTC ACC AAT CGC CTG GTC AAC AGC GAT GGC ATC ATC AAC CAA2544Leu Val Leu Thr Asn Arg Leu Val Asn Ser Asp Gly Ile Ile Asn Gln835 840 845CGC GCC TTC TAC AAC TAT CTG TCG GCA TGG GCC ACC AAC GCG TCT TCG2592Arg Ala Phe Tyr Asn Tyr Leu Ser Ala Trp Ala Thr Asn Ala Ser Ser850 855 860CCTACG GAG CTT CTC AGG GCA AAT TGT ATC CGG AAC CGC GCC AAC GGA2640Pro Thr Glu Leu Leu Arg Ala Asn Cys Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly865 870 875 880GCT TCT CAG GGC AAA TTG TAT CCG GAA CCG CGC CAG TAT TTT CAC CAA2688Ala Ser Gln Gly Lys Leu Tyr Pro Glu Pro Arg Gln Tyr Phe His Gln885 890 895CCC AAC GAG TAC GAT CTT AAG ATA CCC AAG AGT CTG CCA TTG GTC TAC2736Pro Asn Glu Tyr Asp Leu Lys Ile Pro Lys Ser Leu Pro Leu Val Tyr900 905 910GCT CAG ATG CCC TTT TAC CTC CAC GGA CTA ACA GAT ACC TCG CAG ATC2784Ala Gln Met Pro Phe Tyr Leu His Gly Leu Thr Asp Thr Ser Gln Ile915 920 925AAG ACC CTG ATA GGT CAT ATT CGC GAC CTG AGC GTC AAG TAC GAG GGC2832Lys Thr Leu Ile Gly His Ile Arg Asp Leu Ser Val Lys Tyr Glu Gly
930 935 940TTC GGC CTG CCC AAC TAT CCA TCG GGC ATT CCC TTC ATC TTC TGG GAG2880Phe Gly Leu Pro Asn Tyr Pro Ser Gly Ile Pro Phe Ile Phe Trp Glu945 950 955 960CAG TAC ATG ACC CTG CGC TCC TCA CTG GCC ATG ATC CTG GCC TGC GTG2928Gln Tyr Met Thr Leu Arg Ser Ser Leu Ala Met Ile Leu Ala Cys Val965 970 975CTA CTC GCC GCC CTG GTG CTG GTC TCC CTG CTC CTG CTC TCC GTT TGG2976Leu Leu Ala Ala Leu Val Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Ser Val Trp980 985 990GCC GCC GTT CTC GTG ATC CTC AGC GTT CTG GCC TCG CTG GCC CAG ATC3024Ala Ala Val Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Ala Ser Leu Ala Gln Ile995 10001005TTT GGG GCC ATG ACT CTG CTG GGC ATC AAA CTC TCG GCC ATT CCG GCA3072Phe Gly Ala Met Thr Leu Leu Gly Ile Lys Leu Ser Ala Ile Pro Ala101010151020GTC ATA CTC ATC CTC AGC GTG GGC ATG ATG CTG TGC TTC AAT GTG CTG3120Val Ile Leu Ile Leu Ser Val Gly Met Met Leu Cys Phe Asn Val Leu1025103010351040ATA TCA CTG GGC TTC ATG ACA TCC GTT GGC AAC CGA CAG CGC CGC GTC3168Ile Ser Leu Gly Phe Met Thr Ser Val Gly Asn Arg Gln Arg Arg Val104510501055CAG CTG AGC ATG CAG ATG TCC CTG GGA CCA CTT GGC ATG CTG3216Gln Leu Ser Met Gln Met Ser Leu Gly Pro Leu Gly Met Leu106010651070ACC TCC GGA GTG GCC GTG TTC ATG CTC TCC ACG TCG CCC TTT GAG TTT3264Thr Ser Gly Val Ala Val Phe Met Leu Ser Thr Ser Pro Phe Glu Phe107510801085GTG ATC CGG CAC TTC TGC TGG CTT CTG CTG GTG GTC TTA TGC GTT GGC3312Val Ile Arg His Phe Cys Trp Leu Leu Leu Val Val Leu Cys Val Gly109010951100GCC TGC AAC AGC CTT TTG GTG TTC CCC ATC CTA CTG AGC ATG GTG GGA3360Ala Cys Asn Ser Leu Leu Val Phe Pro Ile Leu Leu Ser Met Val Gly1105111011151120
CCG GAG GCG GAG CTG GTG CCG CTG GAG CAT CCA GAC CGC ATA TCC ACG3408Pro Glu Ala Glu Leu Val Pro Leu Glu His Pro Asp Arg Ile Ser Thr112511301135CCC TCT CCG CTG CCC GTG CGC AGC AGC AAG AGA TCG GGC AAA TCC TAT3456Pro Ser Pro Leu Pro Val Arg Ser Ser Lys Arg Ser Gly Lys Ser Tyr114011451150GTG GTG CAG GGA TCG CGA TCC TCG CGA GGC AGC TGC CAG AAG TCG CAT3504Val Val Gln Gly Ser Arg Ser Ser Arg Gly Ser Cys Gln Lys Ser His115511601165CAC CAC CAC CAC AAA GAC CTT AAT GAT CCA TCG CTG ACG ACG ATC ACC3552His His His His Lys Asp Leu Asn Asp Pro Ser Leu Thr Thr Ile Thr117011751180GAG GAG CCG CAG TCG TGG AAG TCC AGC AAC TCG TCC ATC CAG ATG CCC3600Glu Glu Pro Gln Ser Trp Lys Ser Ser Asn Ser Ser Ile Gln Met Pro1185119011951200AAT GAT TGG ACC TAC CAG CCG CGG GAA CAG CGA CCC GCC TCC TAC GCG3648Asn Asp Trp Thr Tyr Gln Pro Arg Glu Gln Arg Pro Ala Ser Tyr Ala120512101215GCC CCG CCC CCC GCC TAT CAC AAG GCC GCC GCC CAG CAG CAC CAC CAG3696Ala Pro Pro Pro Ala Tyr His Lys Ala Ala Ala Gln Gln His His Gln122012251230CAT CAG GGC CCG CCC ACA ACG CCC CCG CCG CCC TTC CCG ACG GCC TAT3744His Gln Gly Pro Pro Thr Thr Pro Pro Pro Pro Phe Pro Thr Ala Tyr123512401245CCG CCG GAG CTG CAG AGC ATC GTG GTG CAG CCG GAG GTG ACG GTG GAG3792Pro Pro Glu Leu Gln Ser Ile Val Val Gln Pro Glu Val Thr Val Glu125012551260ACG ACG CAC TCG GAC AGC AAC ACC ACC AAG GTG ACG GCC ACG GCC AAC3840Thr Thr His Ser Asp Ser Asn Thr Thr Lys Val Thr Ala Thr Ala Asn1265127012751280ATC AAG GTG GAG CTG GCC ATG CCC GGC AGG GCG GTG CGC AGC TAT AAC3888Ile Lys Val Glu Leu Ala Met Pro Gly Arg Ala Val Arg Ser Tyr Asn128512901295TTT ACG AGT TAG3900Phe Thr Ser
权利要求
1.治疗抑郁的方法，包括给表现出抑郁症状的患者施用Hh信号传递的激动剂，从而改善一些或全部症状。
2.权利要求1的方法，其中所述方法改善与抑郁相关的记忆受损或认知受损。
3.预防性治疗具有发生抑郁的危险性的患者的方法，包括给所述患者施用Hh信号传递的激动剂，从而预防抑郁。
4.增强哺乳动物的认知功能的方法，包括给哺乳动物施用Hh信号传递途径的激动剂，从而增强哺乳动物的认知功能。
5.权利要求4的方法，其中所述哺乳动物在施用所述激动剂之前表现出统计学正常范围内的认知功能。
6.权利要求4的方法，其中所述哺乳动物在施用所述激动剂之前由于除阿尔茨海默病以外的原因具有认知功能缺陷。
7.权利要求4的方法，其中所述哺乳动物除认知功能缺陷外，不表现阿尔茨海默病的标志。
8.预防性治疗具有发生认知缺陷的危险性的患者的方法，包括给所述哺乳动物施用Hh信号传递途径的激动剂，从而预防认知功能缺陷。
9.增强哺乳动物的记忆的方法，包括给所述哺乳动物施用Hh信号传递途径的激动剂，从而增强哺乳动物的记忆。
10.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物在施用所述激动剂之前表现出统计学正常范围内的记忆功能。
11.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物在施用所述激动剂之前由于除阿尔茨海默病以外的原因具有记忆功能缺陷。
12.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物除记忆缺陷外，不表现阿尔茨海默病的标志。
13.预防性治疗具有发生记忆缺陷的危险性的患者的方法，包括给所述哺乳动物施用Hh信号传递途径的激动剂，从而预防记忆缺陷。
14.治疗情绪障碍的方法，所述情绪障碍的特征在于哺乳动物的中枢神经系统的异常活性，所述方法包括给哺乳动物施用Hh信号传递途径的激动剂，从而治疗情绪障碍。
15.权利要求14的方法，其中所述障碍是抑郁、焦虑症、惊恐性障碍、强迫性障碍、社会焦虑/恐惧性障碍或创伤后应激综合征。
16.预防性治疗情绪障碍的方法，所述情绪障碍的特征在于治疗哺乳动物的中枢神经系统的异常活性，所述方法包括给哺乳动物施用Hh信号传递途径的激动剂，从而预防情绪障碍。
17.权利要求16的方法，其中所述障碍是抑郁、焦虑症、惊恐性障碍、强迫性障碍、社会焦虑/恐惧性障碍或创伤后应激综合征。
18.治疗非阿尔茨海默病痴呆或ADHD的方法，包括给哺乳动物施用Hh信号传递途径的激动剂，从而治疗行为障碍。
19.预防性治疗非阿尔茨海默病痴呆或ADHD的方法，包括给哺乳动物施用Hh信号传递途径的激动剂，从而预防行为障碍。
20.权利要求1-19的任意一项的方法，其中所述激动剂功能性结合包含Hh多肽的Patched受体的受体复合物。
21.权利要求20的方法，其中所述激动剂功能性结合Smoothened蛋白。
22.权利要求1-19的任意一项的方法，其中所述激动剂抑制Hh信号传递途径内的负反馈或阻遏因子。
23.权利要求22的方法，其中所述激动剂干扰Patched蛋白的阻遏物功能，从而激活Hh信号传递途径。
24.权利要求23的方法，其中所述激动剂破坏Patched蛋白和Smoothened蛋白之间的功能性相互作用。
25.权利要求20的方法，其中所述试剂是小有机分子。
26.权利要求20的方法，其中所述激动剂是包含SEQ ID NOs10-18中任意一个序列的全部或部分序列的多肽的功能等同物。
27.权利要求20的方法，其中所述激动剂是包含与SEQ ID NOs10-18中任意一个序列具有至少80％同一性的氨基酸序列或其片段的多肽，其中所述氨基酸序列或其片段结合patched受体。
28.权利要求27的方法，其中所述激动剂是SEQ ID NOs10-18中任意一个序列的19kDa N-末端片段。
29.权利要求27的方法，其中所述激动剂是与SEQ ID NOs10-18中任意一个序列具有至少70％同一性的多肽。
30.权利要求20的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO15或其结合于patched的片段。
31.权利要求20的方法，其中所述激动剂是激活Hh信号传递途径的抗独特型抗体。
32.权利要求1-19的任意一项的方法，其中所述激动剂是包含核酸的载体，当所述核酸表达时，激活Hh信号传递。
33.权利要求32的方法，其中所述载体包含的核酸序列编码包含与SEQ ID NOs10-18中任意一个序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。
34.权利要求33的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO15的氨基酸序列。
35.权利要求32的方法，其中所述载体包含的多核苷酸在包括6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，在约45℃洗涤，然后50℃下用2.0×SSC洗涤的条件下与包含SEQ ID NOs1-9中任意一个序列的第二种多核苷酸杂交。
36.权利要求22的方法，其中所述激动剂是RNAi构建体。
37.权利要求36的方法，其中所述载体包含RNAi构建体和与所述RNAi构建体操作性连接的启动子，其中所述RNAi构建体抑制Hh信号传递途径内的负反馈或阻遏因子。
38.权利要求36的方法，其中所述RNAi构建体是siRNA。
39.权利要求36的方法，其中所述RNAi构建体抑制表2中列出的基因。
40.权利要求36的方法，其中所述RNAi构建体抑制Gli-3。
41.权利要求39的方法，其中所述RNAi构建体抑制patched。
42.权利要求22的方法，其中所述激动剂是小有机分子。
43.权利要求25或42的方法，其中包含所述激动剂的药物组合物是口服施用的。
44.权利要求1-19的任意一项的方法，其中包含所述激动剂的药物组合物是肠胃外施用的。
45.权利要求1-19的任意一项的方法，其中包含所述激动剂的药物组合物是通过注射到靶位点而施用的。
46.权利要求1-19的任意一项的方法，进一步包括施用额外的药物活性成分。
47.权利要求46的方法，其中所述额外的药物活性成分是多巴胺再摄取抑制剂。
48.包含下列成分的试剂盒a.药物可接受的赋形剂中的Hh激动剂；和b.用于在以哺乳动物的中枢神经系统的异常活性为特征的情绪或行为障碍的治疗中施用Hh激动剂的说明书。
49.包含下列成分的试剂盒a.药物可接受的赋形剂中的Hh激动剂和一种或多种额外的药物活性成分；和b.用于在以哺乳动物的中枢神经系统的异常活性为特征的情绪或行为障碍的治疗中施用Hh激动剂的说明书。
50.权利要求49的试剂盒，其中所述额外的药物成分是多巴胺再摄取抑制剂。
51.权利要求49的试剂盒，其中所述额外的药物成分是另一种Hh激动剂。
52.Hh激动剂在制备用于治疗以哺乳动物的中枢神经系统的异常活性为特征的情绪或行为障碍的药物中的用途。
53.进行药物商业的方法，包括a.制造包含Hh激动剂的组合物或权利要求48-51的任意一项的试剂盒；和b.将在以哺乳动物的中枢神经系统的异常活性为特征的情绪或行为障碍的治疗中采用所述制剂或试剂盒的益处推广给保健提供者。
54.进行药物商业的方法，包括a.提供销售包含Hh激动剂的组合物或权利要求48-51的任意一项的试剂盒的分布网络；和b.给患者或医生提供用该制剂治疗抑郁的说明材料。
55.进行药物商业的方法，包括a.提供销售包含Hh激动剂的组合物或权利要求48-51的任意一项的试剂盒的分布网络；和b.给患者或医生提供用该制剂治疗抑郁的说明材料。
56.进行药物商业的方法，包括a.确定要在抑郁治疗中施用的Hh激动剂的合适制剂和剂量；b.进行步骤(a)中鉴定的制剂在动物中的效力和毒性的治疗谱分析；和c.提供销售在步骤(b)中鉴定的具有可接受的治疗谱的制品的分布网络。
57.权利要求54的方法，进一步包括提供销售团队，用于将该制品推广给保健提供者。
58.进行药物商业的方法，包括a.确定要在抑郁治疗中施用的Hh激动剂的合适制剂和剂量；和b.将进一步开发和销售该制剂的权利许可给第三方。
59.进行药物商业的方法，包括a.制造包含Hh激动剂的组合物或权利要求48-51的任意一项的试剂盒；和b.将采用所述制剂或试剂盒在受试者中增强记忆或认知功能的益处推广给保健提供者。
60.进行药物商业的方法，包括a.提供销售包含Hh激动剂的组合物或权利要求48-51的任意一项的试剂盒的分布网络；和b.给患者或医生提供用该制剂在受试者中增强记忆或认知功能的说明材料。
61.进行药物商业的方法，包括a.提供销售包含Hh激动剂的组合物或权利要求48-51的任意一项的试剂盒的分布网络；和b.给患者或医生提供用该制剂在受试者中增强记忆或认知功能的说明材料。
62.进行药物商业的方法，包括a.确定为了在受试者中增强记忆或认知功能而要施用的Hh激动剂的合适制剂和剂量；b.进行步骤(a)中鉴定的制剂在动物中的效力和毒性的治疗谱分析；和c.提供销售在步骤(b)中鉴定的具有可接受的治疗谱的制品的分布网络。
63.权利要求60的方法，进一步包括提供销售团队，用于将该制品推广给保健提供者。
64.进行药物商业的方法，包括a.确定为增强记忆或认知功能而要施用的Hh激动剂的合适制剂和剂量；和b.将进一步开发和销售该制剂的权利许可给第三方。
65.权利要求1-19的任意一项的方法，其中所述Hh激动剂是具有式I-XII中任意一个的结构的化合物。
全文摘要
本发明涉及通过施用hedgehog信号传递的激动剂而治疗抑郁和中枢神经系统的其它行为和/或情绪障碍的方法和组合物。可以通过本方法治疗的其它障碍包括注意力缺陷的多动症、非阿尔茨海默痴呆和记忆丧失的多种症状。本发明还涉及在患有影响这些功能的疾病的患者中和在没有诊断记忆或认知功能缺陷的受试者中增强记忆和/或认知功能的方法和组合物。本发明的方法和组合物刺激神经发生和分化，并且增强神经元的突触传递。
文档编号C12Q1/68GK1917897SQ200480041838
公开日2007年2月21日 申请日期2004年12月15日 优先权日2003年12月19日
发明者L·L·鲁宾 申请人:柯里斯公司