真核细胞转染的培养装置和方法

专利名称：真核细胞转染的培养装置和方法
技术领域：
在一个实施方案中，本发明涉及真核细胞转染装置。在另一个实施方案中，本发明涉及用于转染装置的细胞转染试剂盒和制剂。还描述了使用转染装置进行细胞转染的方法。
背景技术：
基因转染方法可用于将核酸导入细胞中，还可用于研究基因调节和基因功能。高通量分析尤其有用，它可用于筛选多组DNA，以鉴定编码具有所关注性质的产物的DNA。基因转染是将在生物学上具有功能的核酸以核酸在细胞中保持其功能的方式送递和导入细胞中，如真核细胞中。基因转染广泛应用于涉及基因调节、基因功能、分子治疗、信号传导、药物筛选和基因治疗的研究。随着对高等生物基因的克隆和分类的进行，研究人员设法揭示基因功能并鉴定具有所需要的性质的基因产物。对基因序列日渐增长的收集需要开发表征基因产物和分析基因功能的系统的和高通量的方法，细胞和分子生物学研究的其它领域也是如此。
病毒基因载体和非病毒基因载体可用于基因送递。病毒载体表现出较非病毒载体更高的转染率，但是病毒载体的安全性妨碍了其可用性(Verma I.M and Somia N.Nature 389(1997)，pp.239-242；Marhsall E.Science 286(2000)，pp.2244-2245)。尽管非病毒转染系统未表现出病毒载体的有效性，但由于非病毒载体与病毒载体相比其理论安全性较高，所以它们还是受到高度的关注。另外，病毒载体的制备是一个复杂而昂贵的过程，这限制了病毒载体的体外应用。与病毒载体的制备相比，非病毒载体的制备更为简单并且费用效益更高，这使得合成基因载体成为体外研究中的理想转染试剂。
大部分非病毒载体会模仿病毒进入细胞的重要特征以越过细胞障碍，该细胞障碍意味着防止外源基因物质的渗入。以基因载体骨架为基础的非病毒基因载体可被分为a)脂质体/DNA复合物(lipoplex)、b)聚合物/DNA复合物(polyplex)和c)脂质体/聚合物/DNA复合物(lipopolyplex)。脂质体/DNA复合物是核酸和脂质组分的集合，通常为阳离子性的。采用脂质体/DNA复合物的基因转染被称为脂质转染。聚合物/DNA复合物是核酸和阳离子性聚合物的复合物。脂质体/聚合物/DNA复合物包含脂质和聚合物组分。通常上述这些DNA复合物被进一步修饰，包含细胞靶向部分或细胞内靶向部分和/或膜不稳定组分，例如病毒蛋白、肽或破膜性合成肽。近来，细菌和噬菌体也被描述作为穿梭载体用于将核酸转化到细胞中。
大部分非病毒转染试剂为合成的阳离子性分子，并被报道通过阳离子上的阳离子位点和核酸上的阴离子位点的相互作用“包被”核酸。带正电的DNA-阳离子性分子复合物与带负电的细胞膜相互作用，有助于DNA通过非特异性胞吞作用穿过细胞膜(Schofield，Brit.Microencapsulated.Bull，51(1)56-71(1995))。在大部分常规基因转染方法中，细胞在转染前16到24h先接种到细胞培养装置上。通常在单独的试管中制备转染试剂(如阳离子性聚合物载体)和DNA，并将每种溶液分别在培养基(不含胎牛血清和抗生素)中稀释。然后在连续振荡混合物的条件下小心缓慢地将一种溶液加入另外一种溶液中以混合溶液。然后将混合物在室温下培养15-45分钟，使得形成转染试剂-DNA复合物。转染前，除去细胞培养基，然后用缓冲液洗涤细胞以除去残留的血清和抗生素。将含DNA-转染试剂复合物的溶液加至细胞并将细胞培养约3-4小时。然后用新鲜培养基换掉含转染试剂的培养基。最后在一个或多个具体时间点分析细胞。这显然是一个耗费时间的方法，特别是当有待转染的样本数非常大时。
在常规转染方法中存在几个主要问题。第一，常规方法耗费时间，特别是当在转染实验中要用到很多细胞或基因样本时。还有，由于所必需的步骤数，常规转染方法所得到的结果难以重复。例如，在生产DNA转染试剂中，复合物的形成受到如下因素的影响核酸和试剂的浓度和体积、pH、温度、所使用的缓冲液类型、涡旋时间和速度、培养时间以及其它因素。尽管可采用相同试剂和方法，但是还是可能获得不同的结果。多步法所获得的结果通常受到在每一步的人为的或机械的错误或者其它偏差的影响。另外，转染后更换细胞培养液打扰了细胞，可能会使它们脱离培养它们的表面，由此导致最终结果的偏差以及不可预见性。由于所提及的全部因素，常规转染方法要求高度熟练的人员来进行转染实验或分析。
Sabatini(U.S.2002/0006664A1)描述了含混合物并放置在载玻片上的DNA。然而，该系统只能转染事先放置的DNA。
美国专利申请No.10/341,059(通过援引纳入本文)描述了一种细胞培养/转染装置，在其上的转染由脂质体聚合物介导。申请号10/341,059的某些方法可用于本文所描述的转染制剂。
本发明的一方面公开了一种减少转染分析的费用的细胞培养/转染装置。以简单的方法完成了使用目的分子进行的转染。
如上所述，常规转染是一个耗时并且技术复杂的方法。一般而言，需要三个步骤1)将细胞接种到细胞培养板或培养皿并培养，一直到获得充分的汇合度；2)制备转染试剂/核酸复合物；3)加入目的核酸和转染试剂并再进行培养。需要两次培养过程，并且一般需要两天以上的时间完成所有步骤。相反地，本发明的实施方案提供了只需要一次培养的简单方法。事先包被有转染试剂的细胞培养装置可通过连续加入目的核酸和细胞培养物进行转染。然后将所转染的细胞在该装置中培养。因此，可在细胞培养装置上转染和培养细胞，无须在转染之后立即对细胞进行进一步操作。转染率与常规转染相当。因此，本发明提供了一种简易转染方法，并且减少转染方法所需时间1天多。可以高效率地转染大量细胞。

发明内容
某些实施方案涉及用于转染真核细胞的多孔板，其中在至少一些孔的底部至少部分包被有含金属盐的组合物。在优选的实施方案中，金属盐为钙盐。在更为优选的实施方案中，钙盐为氯化钙或乙酸钙。
在一些优选的实施方案中，多孔板包括基质复合物。优选地，含金属盐的组合物保留在多孔板上。更为优选地，组合物保留在具有基质复合物的多孔板上。在更为优选的实施方案中，基质复合物选自蛋白、糖蛋白、肽、多糖和聚合物及其组合。在一些优选的实施方案中，蛋白为明胶、胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白或牛血清白蛋白或其组合。在优选的实施方案中，聚合物选自水凝胶、可生物降解的聚合物以及生物相容性物质。
本发明的某些实施方案涉及一种转染真核细胞、包括固体表面的细胞培养/转染装置，其中所述固体表面为凝胶基质中的氯化钙所包被。在优选的实施方案中，该表面可为连续表面、培养瓶、培养皿、试管、多孔板、载玻片或植入装置。在优选的实施方案中，该固体表面是玻璃、聚苯乙烯或环氧树脂。在最优选的实施方案中，该固体表面为载玻片或多孔板。
本发明的某些实施方案涉及一种试剂盒，该试剂盒包括含有固体表面用于转染真核细胞的上述细胞转染装置(其中，固体表面为凝胶基质中的氯化钙所包被)、有待转染的真核细胞以及用于转染的核酸。在优选的实施方案中，真核细胞为哺乳动物细胞。优选地，真核细胞可为分裂细胞或非分裂细胞。优选地，真核细胞为转化细胞或原代细胞。优选地，真核细胞为体细胞或干细胞。在一些优选的实施方案中，真核细胞为植物细胞。在另一些优选的实施方案中，真核细胞为昆虫细胞。
在优选的实施方案中，试剂盒包括至少一种核酸，它选自DNA、RNA、DNA/RNA杂合体(hybrid)或经化学修饰的核酸。更为优选地，经化学修饰的核酸包括肽核酸。更为优选地，DNA为环状、线性或单链寡核苷酸。更优选地，RNA为单链的或双链的。更为优选地，该单链RNA为核酶。更优选地，该双链RNA为siRNA。
本发明的某些实施方案涉及转染真核细胞的方法，包括如下步骤提供至少部分为含金属盐的组合物所包被的固体表面，加入需要被导入固体表面上的真核细胞中的至少一种核酸或至少一种多肽，并且以充分的细胞密度以及在将核酸或多肽导入真核细胞的合适条件下将真核细胞接种到固体表面。优选地，该表面选自培养瓶、培养皿、试管、连续表面、多孔板、载玻片以及植入装置。优选地，该固体表面为玻璃、聚苯乙烯或环氧树脂。
在优选的实施方案中，金属盐为钙盐。更优选地，该钙盐为氯化钙或乙酸钙。
在优选的实施方案中，含金属盐的组合物还包括基质复合物。优选地，该组合物保留在固体表面上。更优选地，该组合物保留在具有基质复合物的固体表面上。在更为优选的实施方案中，该基质复合物选自蛋白、糖蛋白、肽、多糖和聚合物或其组合。更优选地，蛋白选自明胶、胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和牛血清白蛋白或其组合。最优选地，聚合物选自水凝胶、可生物降解聚合物和生物相容性物质。
在更为优选的实施方案中，该固体表面为载玻片或多孔板。
在优选的实施方案中，真核细胞为哺乳动物细胞。在优选的实施方案中，真核细胞为分裂细胞或非分裂细胞。在优选的实施方案中，真核细胞为转化细胞或原代细胞。在优选的实施方案中，真核细胞为体细胞或干细胞。更优选地，真核细胞为植物细胞。在另一更优选的实施方案中，真核细胞为昆虫细胞。
在所述方法的优选的实施方案中，加入至少一种核酸，它选自DNA、RNA、DNA/RNA杂合体和经化学修饰的核酸。更优选地，经化学修饰的核酸包括肽核酸。更优选地，DNA为环状、线性或单链寡核苷酸。更优选地，RNA为单链的或双链的。在一个最优选的实施方案中，单链RNA为核酶。在另一最为优选的实施方案中，双链RNA为siRNA。
本发明的某些实施方案涉及检测生物分子能否进入细胞的方法，它包括如下步骤(a)提供为聚合物或脂质所包被的固体表面，所述生物分子可与之相互作用；(b)将生物分子加到固体表面，使生物分子与所述聚合物或脂质相互作用；(c)以充分密度以及在将生物分子导入细胞的合适条件下将细胞接种到表面；并(d)检测生物分子是否送递到细胞。
在优选的实施方案中，加到固体表面的生物分子为核酸、蛋白、肽、糖、多糖或有机化合物。更优选地，核酸为DNA、RNA、DNA/RNA杂合体或经化学修饰的核酸。最优选地，经化学修饰的核酸包括肽核酸。最优选地，DNA为环状、线性或单链寡核苷酸。优选地，RNA为单链的或双链的。最优选地，单链RNA为核酶。最优选地，双链RNA为siRNA。
在优选的实施方案中，接种到表面的细胞为哺乳动物细胞。优选地，细胞为分裂细胞或非分裂细胞。优选地，细胞为转化细胞或原代细胞。优选地，细胞为体细胞或干细胞。更优选地，细胞为植物细胞。在另一更优选的实施方案中，细胞为昆虫细胞。
本发明的其他方面、特征和优点通过下列优选的实施方案的详述将会变得显而易见。


现在，参照旨在说明而非限定本发明的优选的实施方案的附图，对本发明的各方面特征进行描述。
图1示出在0-0.5mg明胶/孔和0.25-1.0μmol CaCl2/孔时所分析的293细胞的转染率，使用GFP作为报道分子。
图2示出在0-0.5mg明胶/孔和0.25-1.0μmol CaCl2/孔时所分析的COS-7细胞的转染率，使用GFP作为报道分子。
图3示出在0-0.5mg明胶/孔和0.25-1.0μmol CaCl2/孔时所分析的HeLa细胞的转染率，使用GFP作为报道分子。
图4示出CaCl2浓度为0.25μmol、0.5μmol和0.75μmol和siRNA浓度为0.12μM时siRNA送递对荧光素酶活性的抑制。
图5示出使用GFP质粒在三种不同类型的细胞293、COS-7和HeLa细胞中分析得到的共转染率。
图6示出使用荧光素酶质粒在三种不同类型的细胞293、COS-7和HeLa细胞中分析得到的共转染率。
图7示出小规模(96孔板和24孔板)和大规模(6孔板和10cm培养皿)应用的转染细胞的落射荧光显微照片。左图示出发射光，右图示出来自GFP的荧光。
具体实施例方式
本发明描述了一种新型转染装置和方法，与常规转染方法相比，它简单、便捷和有效。根据本发明所描述的方法，通过将转染试剂附着在细胞培养装置的固体表面制备转染装置。通过使用本装置，研究人员仅需将一种核酸或其它生物分子载体系统加到细胞培养装置的表面。无须事先将DNA或生物分子与转染试剂相混合。这除去了常规转染方法所要求的最主要的耗时步骤。与现有方法所要求的2到5小时或更长时间相比，科学家仅需要大约40分钟就可对10个样本完成全部转染过程。这对于需同时检测几百个样本的高通量转染分析而言尤为有利。
同常规转染方法相比，本发明所描述的新方法具有几个优点。它提供了易于保存的转染装置，并提供了生物分子送递或基因转染的简单方法，无需混合生物物质/转染试剂的步骤。本文所描述的转染方法可在短时间内完成，例如在约40分钟完成，并提供了转染或药物送递的高通量的方法，其中大量样本可同时转染。
本发明所描述的基因送递的方法和装置的实施方案克服了上文所述的在常规转染方法中所遇到的普遍问题。转染试剂被简单地包被到细胞培养装置表面上，这易于商业化和大规模生产。例如，消费者、研究人员仅需在转染前将例如目的核酸的生物分子直接加入细胞培养装置表面，以制备该装置。然后将细胞接种到细胞培养装置的表面并培养，无须更换培养基，然后分析细胞。无须在转染过程中更换培养基。本发明所描述的方法通过降低所包含的步骤数大大降低了出错风险，由此提高本系统的一致性和精确性。
根据本发明所描述的方法，将转染试剂附着到载玻片、多孔板的表面或其它表面以形成转染装置。通过使用该装置，人们只需加入DNA或其它生物分子到该表面，使得转染试剂和DNA或生物分子形成复合物。该反应在约30分钟时发生，然后将细胞接种到表面上并在将生物分子导入细胞的合适条件下培养。
可使用任何可用于将含混合物的核酸/生物分子附着到其表面的合适表面。例如，该表面可为玻璃、塑料(如聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯)、硅、金属(如金)、膜(如硝酸纤维素、甲基纤维素、PTFE或纤维素)、纸、生物物质(如蛋白、明胶、琼脂)、组织(如皮肤、上皮组织、骨、软骨)、矿物质(如羟磷灰石、石墨)。根据优选的实施方案，该表面可为载玻片(玻璃或聚-L-赖氨酸包被的载玻片)或多孔板的孔。
就载玻片而言，如聚-L-赖氨酸(如Sigma公司)包被的玻璃载玻片，将转染试剂固定在表面并干燥，然后导入目的核酸或有待导入细胞的核酸、蛋白、肽或小分子药物。将载玻片在室温下培养30分钟以在转染装置的表面形成生物分子/转染试剂复合物。该生物分子/转染试剂复合物形成用于高通量微阵列的培养基，该微阵列可用于同时研究成百上千核酸、蛋白、肽和其它小分子药物。在另一个实施方案中，转染试剂或药物送递试剂可附着在转染装置表面离散的、确定的区域，以形成转染试剂或药物送递试剂的微阵列。在该实施方案中，欲被导入细胞的分子，如核酸，可与转染或送递试剂一起散布在转染装置表面。本方法可用于从几千种化合物中筛选转染试剂或其它送递试剂。该筛选方法的结果可通过计算机分析检测。
在本发明的另一实施方案中，可将多孔板的一个或多个孔用转染或药物送递试剂包被。常用于转染和药物筛选的板为96孔板和384孔板。可将转染试剂或生物分子送递试剂均匀涂布于板的底部。然后通过例如多孔加样器或自动加样器将几百种核酸、蛋白、肽或其它生物分子加入孔中。然后使用微量培养板读数器检测转染结果。这是分析转染细胞的非常便利的方法，因为大部分生物医学实验室通常使用微量培养板读数器。包被有转染或生物分子送递试剂的多孔板可广泛应用于大部分实验室以研究基因调节、基因功能、分子治疗和信号传导以及药物筛选。同样，若将不同类转染试剂包被到多孔板不同孔中，该板可用于相当有效地筛选多种转染或送递试剂。最近，开发了1536和3456孔板，它们也可以用于本发明所述的方法。
转染试剂或送递试剂优选金属盐，它们可将生物分子如核酸、蛋白、肽、糖、多糖、有机化合物和其它生物分子导入细胞中。优选的实施方案使用钙金属盐，特别是氯化钙或乙酸钙。
根据一个实施方案，转染试剂或送递试剂可与基质如蛋白、肽、多糖或其它聚合物混合。蛋白可为明胶、胶原、牛血清白蛋白或任何其它可用于将蛋白附着到表面上的蛋白。聚合物可为水凝胶、共聚物、不可降解的或可生物降解的聚合物和生物相容性物质。多糖可为任何可形成膜和包被送递剂如脱乙酰壳多糖的化合物。其它试剂如细胞毒性还原剂、细胞结合试剂、细胞生长试剂、细胞刺激试剂或细胞抑制试剂以及用于培养特定细胞的化合物也可与转染或送递试剂一起附着在转染装置上。
根据另一实施方案，明胶-转染试剂混合物包括转染试剂(如诸如氯化钙的金属盐)和溶于恰当溶剂(如水或双去离子水)的明胶，它可被附着到转染装置上。在另一实施方案中，明胶-转染试剂混合物还可含有细胞培养试剂。该混合物被均匀涂布在诸如载玻片和多孔板的表面上，由此生成携带明胶-转染试剂混合物的转染表面。在另一实施方案中，不同的转染试剂-明胶混合物也可散布在转染装置表面的离散区域。所得到的产物可在合适的条件下完全干燥，以使明胶-转染试剂混合物附着到混合物所应用的位点上。例如，所得到的产物可在特定温度或湿度下或在真空干燥器中干燥。
混合物中转染试剂的浓度取决于试剂的转染率以及细胞毒性。一般而言，在转染率和细胞毒性之间存在平衡。在转染试剂浓度使得转染率最高，同时细胞毒性保持在可接受的水平时，转染试剂的浓度就是最佳水平。转染试剂的浓度一般在约1到10mM，优选约2-7mM的范围内。同样，明胶或其它基质的浓度取决于有待进行的实验和分析，但是其浓度一般为转染试剂的0.1％到0.5％，优选0.5％到2％，最优选约1％-2％的范围内。根据在实施例中所示出的实施方案，明胶浓度约为转染试剂的2％。当然，在明胶基质中的转染试剂的浓度在全部反应体积中较高，约为5mM到0.1M，优选10-40mM。在一个优选的实施方案中，基质中的转染试剂涂布于转染装置并在无菌空气中干燥。优选地，基质中的转染试剂在无菌通风橱中干燥2小时至过夜。
导入细胞的分子可为核酸、蛋白、肽、肽核酸(PNA)和其它生物分子。核酸可为DNA、RNA和DNA/杂合体等。若所用DNA存在于载体中，载体可为任何类型，如质粒(例如pCMV-GFP、pCMV-luc)或以病毒为基础的载体(例如pLXSN)。DNA还可为具有在cDNA 5’端表达的启动子序列(如CMV启动子)和3’端的聚腺苷酸位点的线性片段。这些基因表达元件可使目的cDNA在哺乳动物细胞中瞬时表达。若DNA为单链寡脱氧核苷酸(ODN)，例如反义ODN，它可被导入细胞中调节靶基因表达。在实施方案中所使用的RNA核酸可为单链的(反义RNA和核酶)或双链的(RNA干扰，siRNA)。大部分情况下，RNA被修饰以增强RNA的稳定性并增强其在下调基因表达中的功能。在肽核酸(PNA)中，核酸骨架被替换成肽，这使分子更稳定。在具体实施例中，本发明所描述的方法可就各种目的用于将蛋白、肽和其它分子导入细胞，例如分子治疗、蛋白功能研究或分子机制研究。
在恰当条件下，生物分子被加入包被有转染或送递试剂的转染装置上形成生物分子/送递试剂复合物。生物分子优选地溶于不含胎牛血清和抗生素的细胞培养基，例如Dulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)或opti-MEM。若转染或送递试剂被均匀附着到载玻片上，那么生物分子就可散布到载玻片上的离散位置上。或者，转染或送递试剂可散布到载玻片上的离散位置，而将生物分子简单加入以覆盖转染装置的全部表面。若转染试剂或送递试剂附着到多孔板的底部，那么生物分子可通过多通道加样器、自动进样器或其它方法简单加入到不同孔中。培养所得到的产物(包被有转染或送递试剂和生物分子的转染装置)以形成生物分子/转染试剂(或送递试剂)复合物。在某些实施方案中，培养在室温下进行约25分钟。在一些情况下，例如，不同种类的生物分子散布在载玻片上的离散位置，并在培养之后除去DNA溶液，以产生携带复合物中的生物分子和转染试剂的表面。在其它实施方案中，生物分子溶液可保留在表面。
加入生物分子后，将在适当培养基中的适当密度的细胞接种到表面上。所得到的产物(携带生物分子和接种细胞的表面)维持在可使生物分子进入接种细胞的条件下。
根据本发明所描述的方法，所使用的合适的细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞，包括植物和动物细胞，特别是哺乳动物细胞。真核细胞，如哺乳动物细胞(如人、猴、犬、猫、牛或鼠类的细胞)、细菌、昆虫或植物细胞，以充足密度和在将生物分子导入/进入真核细胞和表达DNA或生物分子与细胞组分相互作用的适当条件下被接种到包被有转染或送递试剂和生物分子的转染装置上。在具体实施方案中，细胞可选自造血细胞、神经细胞、胰腺细胞、肝细胞、软骨细胞、骨细胞或肌细胞。细胞可为完全分化的细胞或祖细胞/干细胞。
在优选的实施方案中，真核细胞在含10％热灭活的胎牛血清(FBS)、L谷氨酰胺和青霉素/链霉素(pen/strep)的Dulbecco’s ModifiedEagles Medium(DMEM)中培养。本领域的技术人员认为某种细胞应该在特定培养基中培养，因为某些细胞需要特定营养，如生长因子和氨基酸。细胞的最适密度取决于细胞类型和实验目的。例如，70％-80％汇合的细胞群优选用于基因转染，但是用于寡核苷酸送递的最佳条件为30-50％汇合的细胞。在一个实施例中，若5×104293细胞/孔被接种到96孔板上，细胞在接种后18-24h可达到90％汇合率。就HeLa 705细胞而言，在96孔板中只需要1×104细胞/孔就可达到相似的汇合率。
细胞接种到含生物分子/送递试剂的表面上后，细胞在就其细胞类型而言最佳条件(如37℃、5-10％CO2)下培养。培养时间取决于试验目的。一般地，就基因转染实验而言，将细胞培养24到48小时以使细胞表达靶基因。在分析细胞内生物分子的胞内运输时，需要培养几分钟到几个小时并在确定的时间点观察细胞。
生物分子送递的结果可通过不同方法分析。就基因转染和反义核酸送递而言，靶基因表达水平可由例如绿色荧光蛋白(GFP)基因、荧光素酶基因或β-半乳糖苷酶基因的报道基因的表达检测。GFP信号可在荧光显微镜下直接观察，荧光素酶活性可由光度计检测，由β-半乳糖苷酶催化的蓝色产物可在显微镜下观察或由微量培养板读数器检测。本领域的技术人员熟知这些报道分子如何起作用以及它们如何被导入基因送递系统。根据本发明所描述的方法被送递的核酸及其产物、蛋白、肽或其它生物分子以及由这些生物分子调节的靶物质可由多种方法检测，如检测免疫荧光或酶免疫细胞化学、自显影或原位杂交。若使用免疫荧光来检测编码蛋白的表达，则要使用结合靶蛋白的荧光标记的抗体(如在抗体和蛋白结合的合适条件下加到载玻片上)。然后将含有蛋白的细胞通过检测荧光信号而鉴定。若所送递的分子可调节基因表达，靶基因表达水平还可通过诸如自显影、原位杂交和原位PCR等方法测定。但是，鉴定方法取决于所送递分子的性质、它们的表达产物，它们所调节的靶物质和/或由于生物分子的送递而得到的终产物。
实施例实施例1制备细胞培养/转染装置使用氯化钙和线性聚乙烯亚胺(L-PEI)在体外将质粒DNA转染到哺乳动物细胞中，以评估转染率。转染试剂与明胶(B型；SIGMA-ALDRICH，Cat.No.G-9391)被附着到96孔细胞培养板(CorningCostar，Cat.No.3997)的孔底部。就氯化钙而言，附着0.5μmol/孔氯化钙与0.5mg/孔明胶。就PEI而言，附着3.5μmol/孔PEI与0.05mg/孔明胶。这些试剂和明胶溶于25μl去离子水中(每孔)并分装到孔中。然后将这些孔空气干燥。
实施例2用细胞培养/转染装置转染293细胞将溶于25μl opti-MEM I(Invitrogen，Cat.No.31985-070)的50ng pCMV-GFP质粒加入各孔中并在室温下放置25分钟。然后，加入在100μl含有10％牛血清(Invitrogen)的Dulbecco’s ModifiedEagle Medium(DMEM)(Invitrogen，Cat.No.11965-084)中的5×104293细胞并在37℃、7.5％CO2培养。培养24h后，通过使用落射荧光显微镜(IX70，Olympus)观察GFP荧光估算转染率。
表1示出转染率。两种转染试剂均适用于本发明的转染系统并表现出非常高的转染率。
表1使用可转染细胞培养装置的转染率

实施例3常规方法转染293细胞100μl 293细胞培养物(5×105细胞/ml DMEM)接种到96孔板中并在37℃、7.5％CO2培养24h。培养后，制备溶于opti-MEM的pCMV-GFP质粒-转染试剂混合物(终浓度质粒；10ng/μl，转染试剂，如表2中所示)并在室温下培养15分钟，使得形成质粒-转染试剂复合物。然后将15μl质粒-转染试剂复合物加入各孔中并在37℃、7.5％CO2培养24h。如实施例2中所描述的那样估算转染率。结果发现，L-PEI在常规方法中是有效的，但是氯化钙不适用。在常规方法中，需要两次培养以及一次复杂的制备过程。
如表2所示，在常规方法中CaCl2不是有效的转染试剂。尽管转染率较实施例2中的试验所观察到的(表1)低，但是L-PEI还是有效的试剂。
表2
常规方法的转染率

实施例4多种细胞系分析检测了对哺乳动物细胞(293细胞、COS-7细胞和HeLa细胞)的转染率。通过在各种条件下将氯化钙和明胶附着到96孔板的底部制备细胞培养/转染装置。通过遵照实施例2中描述的方法对pCMV-GFP进行转染。但是，COS-7和HeLa细胞的接种数为在100μl含10％牛血清的DMEM中的2×104细胞，293细胞的接种数为在100μl含10％牛血清的DMEM中的5×104细胞。
图1、2和3示出使用本发明的96孔转染板的转染率。通过使用该预处理的板，pCMV-GFP质粒被转染到每一种细胞系中，结果表明该细胞培养/转染板可用于多种常规培养的哺乳动物细胞类型。
实施例5通过使用细胞培养/转染装置的siRNA送递siRNA是生命科学研究领域中研究特定基因的作用的重要工具。将上述用于细胞培养/转染装置的方法学用于siRNA送递。
具有荧光素酶基因GL2的GT2-293-LUC细胞购自BD BiosciencesClonetech，Palo Alto，CA USA，siRNA购自Dharmacon Inc.，Lafayuette，CO USA。靶向GL2的siRNA序列如下所示正义序列CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT(SEQ ID NO1)
反义序列UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT(SEQ ID NO2)将这两个片段退火形成双链。
按下述方法制备细胞培养/转染装置将25μl的2％B型明胶加上10、20或30mM CaCl2溶液加入96孔板并过夜干燥。因此，各孔底部涂布了0.5mg明胶和0.25、0.50或0.75μmol的CaCl2。然后，将25μl的siRNA溶液(在opti-MEM中为36nM或0.12μM)加入各孔并培养25分钟。加入100μl的GP2-293-LUC细胞(5×105细胞/ml含10％牛血清的DMEM)并在37℃、7.5％CO2培养48h。通过使用DynexMLX Microtiter板光度计和荧光素酶分析系统(Promega Corp.Madison，WI USA)测定细胞的荧光素酶活性。通过比较转染细胞和未处理细胞的荧光素酶活性评估siRNA的效果(图4)。siRNA对GP2-293-LUC细胞的荧光素酶活性的干扰最高达70％。因此，本发明的装置也可用于siRNA送递。
实施例6使用细胞培养/转染装置共转染在典型的病毒载体生产中，两个或多个质粒被转染到细胞中。共转染可模拟细胞培养/转染装置用于病毒载体生产的效率。
将携带荧光素酶基因的pCMV-luc质粒以及pCMV-GFP共转染到哺乳动物细胞中。细胞培养/转染装置按照如下方法制备将25μl的2％B型明胶和20mM CaCl2溶液加入96孔板的孔中并过夜干燥。因此，各个孔的底部涂布了0.5mg明胶和0.50μmol的CaCl2。然后将25μl质粒溶液(溶于opti-MEM)加入各个孔中并培养25分钟。每25μl溶液中的质粒量为(1)500ng的pCMV-GFP和500ng的pCMV-luc；(2)250ng的pCMV-GFP和250ng的pCMV-GFP；(3)500ng的pCMV-GFP；(4)250ng的pCMV-GFP；(5)500ng的pCMV-luc；(6)250ng的pCMV-luc。然后加入100μl细胞培养物(293细胞5×105细胞/ml，COS-7细胞2×105细胞/ml，HeLa细胞2×105细胞/ml，在含10％牛血清的DMEM中)。培养24h后，通过观察GFP荧光以及测量荧光素酶活性估算转染率。
图5和6示出转染率。对于GFP荧光，在所有细胞系中的常规转染(一个质粒)和共转染之间没有明显差异。共转染的293细胞和COS-7细胞的荧光素酶活性较常规转染细胞低10倍，但是，共转染细胞的活性依然很高。这些结果表明所描述的细胞培养/转染装置可用于共转染。而且该装置在病毒载体生产上前景广阔。
实施例7细胞培养/转染装置大规模应用还准备了适用于大规模应用的细胞培养/转染装置的实施方案。通常使用24孔板和6孔板，并且病毒载体生产非常重要，特别是对于体内研究。就此目的，转染可在大的细胞培养皿中，例如在直径为10cm或者25cm的细胞培养皿中进行。
按照如下所述制备装置将含2％B型明胶和20mM的CaCl2、溶于去离子水中的包被溶液加入各孔或培养皿中。所加的包被溶液的量为1)96孔板中25μl，2)24孔板中100μl，3)6孔板中500μl，和4)10cm培养皿中2ml。将这些培养板和培养皿在无菌通风橱中干燥。
干燥后，将20μg/ml溶于opti-MEM的pCMV-GFP加入培养板和培养皿中。溶液的量为1)96孔板中25μl，2)24孔板中100μl，3)6孔板中500μl，和4)10cm培养皿中3ml。然后将培养板和培养皿在室温下放置25分钟。接下来，将293细胞培养物加入培养板和培养皿中并在37℃、7.5％CO2培养24h。最后，通过观察GFP荧光估算转染率。
图7示出转染细胞的GFP荧光。在每个培养板或培养皿中转染率均相当高，并且细胞状况也很好。这些数据表明本发明所描述的方法适用于各种尺寸的细胞培养装置。
本领域的技术人员可以理解的是在不背离本发明的宗旨的前提下，可对本发明作多种改变。因此，应清楚地理解的是本发明的形式仅仅为示例性的，无意于限制本发明的范围。
序列表<110>日东电工株式会社田中安信俞磊季守平<120>真核细胞转染培养装置和方法<130>NDTCO.029VPC<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>打靶GL2的siRNA的正义序列<221>misc_RNA<222>(1)...(21)<223>前19个残基为RNA；最后2个残基为DNA<400>1cguacgcgga auacuucgat t 21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>打靶GL2的siRNA的反义序列<221>misc_signal<222>(1)...(21)<223>前19个残基为RNA；最后2个残基为DNA<400>2ucgaaguauu ccgcguacgt t 2权利要求
1.一种用于转染真核细胞的多孔板，其中在至少一些孔的底部至少部分涂布了含金属盐的组合物。
2.根据权利要求1的多孔板，其中所述金属盐为钙盐。
3.根据权利要求2的多孔板，其中所述钙盐选自氯化钙和乙酸钙。
4.根据权利要求1的多孔板，其中所述组合物还包括基质复合物。
5.根据权利要求1的多孔板，其中所述组合物保留在多孔板上。
6.根据权利要求5的多孔板，其中所述组合物保留在具有基质复合物的多孔板上。
7.根据权利要求6的多孔板，其中所述基质复合物选自蛋白、糖蛋白、肽、多糖和聚合物或其组合。
8.根据权利要求7的多孔板，其中所述蛋白选自明胶、胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和牛血清白蛋白或其组合。
9.根据权利要求7的多孔板，其中所述聚合物选自水凝胶、可生物降解的聚合物以及生物相容性物质。
10.一种用于转染真核细胞的细胞培养/转染装置，该装置包括固体表面，其中所述固体表面包被有在凝胶基质中的氯化钙。
11.根据权利要求10的细胞培养/转染装置，其中所述表面选自连续表面、培养瓶、培养皿、试管、多孔板、载玻片以及植入装置。
12.根据权利要求10的细胞培养/转染装置，其中所述固体表面为玻璃、聚苯乙烯或环氧树脂。
13.根据权利要求10的细胞培养/转染装置，其中所述固体表面选自载玻片和多孔板。
14.一种试剂盒，包含权利要求10的细胞转染装置；待转染的真核细胞；以及至少一种用于转染的核酸。
15.根据权利要求14的试剂盒，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。
16.根据权利要求14的试剂盒，其中所述真核细胞为分裂细胞或非分裂细胞。
17.根据权利要求14的试剂盒，其中所述真核细胞为转化细胞或原代细胞。
18.根据权利要求14的试剂盒，其中所述真核细胞为体细胞或干细胞。
19.根据权利要求14的试剂盒，其中所述真核细胞为植物细胞。
20.根据权利要求14的试剂盒，其中所述真核细胞为昆虫细胞。
21.根据权利要求14的试剂盒，其中所述至少一种核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA杂合体和经化学修饰的核酸。
22.根据权利要求21的试剂盒，其中所述经化学修饰的核酸包括肽核酸。
23.根据权利要求21的试剂盒，其中所述DNA为环状、线性或单链寡核苷酸。
24.根据权利要求21的试剂盒，其中所述RNA为单链的或双链的。
25.根据权利要求24的试剂盒，其中所述单链RNA为核酶。
26.根据权利要求24的试剂盒，其中所述双链RNA为siRNA。
27.一种转染真核细胞的方法，包括提供至少部分涂布有含金属盐的组合物的固体表面；将待导入真核细胞的至少一种核酸或至少一种多肽加到固体表面上；并且以充分密度在将核酸或多肽导入真核细胞中的合适条件下将真核细胞接种到固体表面。
28.根据权利要求27的方法，其中所述表面选自培养瓶、培养皿、试管、连续表面、多孔板、载玻片和植入装置。
29.根据权利要求27的方法，其中所述固体表面为玻璃、聚苯乙烯或环氧树脂。
30.根据权利要求27的方法，其中所述金属盐为钙盐。
31.根据权利要求30的方法，其中所述钙盐选自氯化钙和乙酸钙。
32.根据权利要求27的方法，其中组合物还包括基质复合物。
33.根据权利要求27的方法，其中所述组合物保留在固体表面上。
34.根据权利要求33的方法，其中所述组合物保留在具有基质复合物的固体表面上。
35.根据权利要求34的方法，其中所述基质复合物选自蛋白、糖蛋白、肽、多糖和聚合物或其组合。
36.根据权利要求35的方法，其中所述蛋白选自明胶、胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和牛血清白蛋白或其组合。
37.根据权利要求35的方法，其中所述聚合物选自水凝胶、可生物降解的聚合物和生物相容性物质。
38.根据权利要求27的方法，其中所述固体表面选自载玻片和多孔板。
39.根据权利要求27的方法，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。
40.根据权利要求27的方法，其中所述真核细胞为分裂细胞或非分裂细胞。
41.根据权利要求27的方法，其中所述真核细胞为转化细胞或原代细胞。
42.根据权利要求27的方法，其中所述真核细胞为体细胞或干细胞。
43.根据权利要求27的方法，其中所述真核细胞为植物细胞。
44.根据权利要求27的方法，其中所述真核细胞为昆虫细胞。
45.根据权利要求27的方法，其中所述至少一种核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA杂合体和经化学修饰的核酸。
46.根据权利要求45的方法，其中经化学修饰的核酸包括肽核酸。
47.根据权利要求45的方法，其中所述DNA为环状、线性或单链寡核苷酸。
48.根据权利要求45的方法，其中所述RNA为单链的或双链的。
49.根据权利要求48的方法，其中所述单链RNA为核酶。
50.根据权利要求48的方法，其中所述双链RNA为siRNA。
51.一种检测生物分子能否进入细胞的方法，包括(a)提供包被有聚合物或脂质的固体表面，所述生物分子能与之相互作用；(b)将该生物分子加到该固体表面，使得该生物分子与所述聚合物或脂质相互作用；(c)以充足密度在将生物分子导入细胞的合适条件下将细胞接种到表面上；并(d)检测生物分子是否被送递到细胞。
52.根据权利要求51的方法，其中所述生物分子选自核酸、蛋白、肽、糖、多糖和有机化合物。
53.根据权利要求52的方法，其中所述核酸选自DNA、RNA、DNA/RNA杂合体和经化学修饰的核酸。
54.根据权利要求53的方法，其中所述经化学修饰的核酸包括肽核酸。
55.根据权利要求53的方法，其中所述DNA为环状、线性或单链寡核苷酸。
56.根据权利要求53的方法，其中所述RNA为单链的或双链的。
57.根据权利要求56的方法，其中所述单链RNA为核酶。
58.根据权利要求56的方法，其中所述双链RNA为siRNA。
59.根据权利要求51的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
60.根据权利要求51的方法，其中所述细胞为分裂细胞或非分裂细胞。
61.根据权利要求51的方法，其中所述细胞为转化细胞或原代细胞。
62.根据权利要求51的方法，其中所述细胞为体细胞或干细胞。
63.根据权利要求51的方法，其中所述细胞为植物细胞。
64.根据权利要求51的方法，其中所述细胞为昆虫细胞。
全文摘要
公开了一种用于转染真核细胞的细胞培养装置。该细胞培养/转染装置可为包被有如CaCl
文档编号C12N15/64GK1918300SQ200480041809
公开日2007年2月21日 申请日期2004年2月18日 优先权日2004年2月18日
发明者田中安信, 俞磊, 季守平 申请人:日东电工株式会社