专利名称：猪凝血酶的制备方法
技术领域：
本发明是一种用于止血剂---凝血酶的制备方法。
背景技术：
1892年，Schmidt用乙醇从新鲜血浆中制备了凝血酶。国外研究主要致力于人、牛凝血酶的制备；制备方案主要是先制备凝血酶原，再激活，最后获得凝血酶。其原因是凝血酶非常不稳定，而凝血酶原非常稳定。此方案可避免制备过程中凝血酶的大量损失；早期制备方法主要是等电点沉淀和饱和硫酸胺盐析等。例如，Mellanby(1933)将血浆稀释并酸化至pH 5.3制得了凝血酶原，静置自发生成凝血酶。Astrup(1941)用同种方法制备凝血酶原，采用牛肺凝血活酶和Ca2+活化凝血酶原。Seeger(1950)改进了凝血酶的制备工艺，采用氢氧化镁吸附和饱和硫酸胺盐析等方法制备凝血酶原，采用25％柠檬酸钠活化凝血酶原。上述方法制备的优点是操作简单、收率高；缺点是激活效率低、纯度低。
随着生化制备技术的不断发展，凝血酶的制备工艺得到大幅度改进，主要采用吸附、层析、超滤的方法。如Aronson(1966)采用柠檬酸钡吸附、硫酸铵分级沉淀、等电点沉淀、IR-50层析纯化凝血酶原。Lunblad(1971)采用SE-Sephadex C-50和SP-Sephadex C-50离子交换等方法纯化牛凝血酶也获得成功。Whyte(1974)采用QAE-SephdexQ-50和Sephadex G-100层析制备凝血酶活性可达1240±200U/mg。至今国外仍延续这些凝血酶原制备工艺和激活方法。但是采用这些方法制备的凝血酶大都用于科研，很难用于规模化生产。原因是操作步骤多、操作条件复杂，难于控制；损失量大造成的成本高，收率低。凝血酶原的制备方法逐渐成熟的同时，其激活方法也日臻完善。Whyte(1974)采用凝血酶原活酶复合物活化牛凝血酶原获得成功，并分析了此复合物活化牛凝血酶原的产物成分。在体内，凝血酶原活酶复合物是内、外血凝共同通路中活化凝血酶原的物质，可迅速将凝血酶原激活成活性高，稳定性好的α-凝血酶。
相对国外而言，国内凝血酶制备研究起步较晚。在相当长的时期内一直沿用Mellanby(1933)的制备工艺，并将其用于猪凝血酶的制备。但在激活方法上始终没有突破，仍采用高浓度的Ca2+激活。近年来国内也相继采用Aronson(1966)方法制备人、猪凝血酶原，激活剂主要是动物脑组织或肺组织提取液。例如，李征(1998)采用CM-纤维素离子交换层析制备人凝血酶原，采用胰酶激活凝血酶原，酶相对比活为12.3U/mg，未说明收率。欧伶(1997)SephadexG-75层析制备猪凝血酶原，兔脑粉激活凝血酶原，酶相对比活26.6U/mg，收率为41％。肖丽霞(1999)将DEAE-纤维素和SephadexG-100层析结合制备猪凝血酶原，高浓度的Ca2+激活凝血酶原，酶相对比活达到了2000U/mg，收率为56％。但孙文种(2002)单纯采用CM-Sepharose离子交换层析制备人凝血酶原，兔脑提取液激活，酶相对比活就达到1951U/mg，收率可达77.9％。从我国凝血酶制备现状来看，人们只是试图优化凝血酶原的制备方法，而凝血酶原激活方法一直没有突破。因此各种凝血酶制备效果差异非常大，反映出这些工艺的不稳定性，也限制了这些制备工艺实际应用。
发明内容
本发明目的是公开一种猪凝血酶的制备方法；本发明制备方法的工艺过程为材料是猪血与猪脑；试剂牛血清白蛋白(BSA)；纤维蛋白原(Fibrinogen)；DEAE-纤维素(DEAE-cellulose)；凝血酶活性测定试剂盒；和通用的生化试剂或分析纯试剂。试剂、溶液按照生物化学与分子生物学相关说明书配制。
(1)猪血浆的制备向收集新鲜猪血中按1∶9比例加入3.8％的柠檬酸钠抗凝剂和一定浓度的抑制剂。4℃下，4000r/min离心30min沉降红细胞，吸出血浆，置-20℃冻存备用。
(2)猪凝血酶原活酶复合物的制备(2.1)猪凝血因子V(FV)的制备采用聚乙二醇(PEG)沉淀、柠檬酸钡吸附、DEAE-纤维素离子交换层析方法制备。
(2.2)猪激活凝血因子X(Fxa)的制备采用柠檬酸钡吸附、EDTA解吸附、硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、胰蛋白酶激活方法制备。
(2.3)猪脑磷脂的制备取猪脑，除去脑膜和血块，称取10g，匀浆，加入3倍量丙酮于4□浸泡24h，滤渣干燥。再加入3倍量乙醚于4□浸泡24h，合并滤液回收乙醚，浓缩物再以丙酮洗涤2～3次，得猪脑总磷脂。总磷脂中加入少量95％热乙醇，4□浸泡24h，收集沉淀，即为猪脑磷脂。
(3)猪凝血酶的制备(3.1)猪凝血酶原的制备取新鲜血浆100mL，用蒸馏水稀释10倍，用1％醋酸调pH5.0使蛋白质等电沉淀。静置过夜，然后置于离心机中，以3000r/min离心15min。弃上清取沉淀用20mL 0.9％氯化钠溶解，再置于离心机中以3000r/min离心15min，上清液即为凝血酶原粗品。
(3.2)猪凝血酶原的激活采用猪凝血酶原活酶复合物(FV、FXa、猪脑磷脂、Ca2+体系)激活猪凝血酶原，获得猪凝血酶。
本发明的猪FV的收率高于Michael(1978)、Katzmann(1983)和Pryzdial(1991)报道的牛FV的收率；猪FXa的收率高于Joseph(1978)、Kalafatis(1994)、Robert(1996)等人报道的牛FXa的收率，本工艺简单、纯化步骤少；利于大规模化生产。
具体实施例方式猪凝血酶的用途广泛在临床上凝血酶可作为局部止血药，用于手术中不易结扎小血管的止血，外伤止血、骨出血、扁桃体摘除、拔牙等止血；可口服，用于胃和十二指肠出血；用于肝脏实质性出血和骨髓出血止血有显著效果。在治疗重型肝炎、肝炎后肝硬化、上消化道出血，有效率可达96.3％。相对传统止血药剂，凝血酶具有不可比拟的优点1.止血速度快，疗效确切。2.应用范围广，毛细血管、小血管及实质性脏器出血均可应用。3.用药方便、安全，可口服或局部喷洒、涂布、直接作用于出血部位，不干扰体内凝血功能。4.对凝血机能障碍者，如血小板减少性紫癜、高血压及慢性肝炎伴凝血功能低下者，仍有良好止血效果。5.长期、反复及大剂量应用均无明显不良反应，无毒副作用，无刺激性。6.有助于组织修复，加速创面愈合。上述优点已使凝血酶在发达国家畜牧业生产和医疗领域中得到广泛应用。
还可以应用到基因工程研究工作中。目前利用基因工程在原核系统中表达外源短肽时，常常要构建成融合蛋白的形式，以增强表达产物的稳定性，提高表达效率。表达后可采用化学法和蛋白酶法将融合蛋白切开。化学法虽简便易行，效率高，但对目的蛋白中的氨基酸种类有要求，且需使用一些对生物体造成危害的化学试剂(如CNBr)，因而限制了它的应用。目前应用最多的是专一地切割肽链的蛋白酶，由于凝血酶是一种具有高度特异性的丝氨酸蛋白酶，将融合蛋白的接合位点设计成凝血酶的特异性酶切位点，就可以将融合蛋白切开，得到目的蛋白。
同时随着我国畜牧业、珍稀动物繁殖业、宠物养殖业、生物制药业等行业的发展，动物疾病治疗、动物外科手术及动物外伤处理已越来越多，止血药物在临床应用十分紧俏，需求量较大。凝血酶恰好可以弥补传统药物的缺点，如临床领域使用的止血药止血环酸、止血敏、维生素K等，这些药物均是通过刺激毛细血管和微小动脉收缩而达到止血的目的，存在很多难以克服的缺点，如局部止血效果差、对大面积弥漫性出血止血效果差，并且对动物机体有许多不良的作用。本发明可满足目前临床的需要。本发明可规模化生产猪凝血酶，原料广泛易得，适于批量商品化生产。猪凝血酶国内外市场前景相当广阔。
实施例实验材料与仪器实验材料(1)猪血与猪脑新鲜猪血、猪脑。
(2)试剂牛血清白蛋白(BSA)，Sigma公司；纤维蛋白原(Fibrinogen)，Sigma公司；DEAE-纤维素(DEAE-cellulose)，Whatman公司；凝血酶活性测定试剂盒，福建太阳生物技术公司；其余试剂均为市售生化试剂或分析纯试剂。试剂、溶液按照生物化学与分子生物学相关工具书和相关说明书配制。
(3)主要仪器设备水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；离心机，上海安亭公司；恒温摇床，哈尔滨东联仪器公司；752型紫外光栅分光光度仪，山东高密彩虹分析仪器有限公司；AlphaimagerTM2200凝胶成像系统，上海天呈公司；DYY-5型稳压稳流电泳仪，DYCP-24A型电泳槽，北京六一仪器公司；电子天平，PB20型pH计，德国Sartorius公司；-70℃低温冰箱，日本SANYO公司；CDMC-21层析工作站，上海金达生化仪器公司。
制备猪血浆向收集新鲜猪血中按1∶9比例加入3.8％的柠檬酸钠抗凝剂和一定浓度的抑制剂。4℃下，4000r/min离心30min沉降红细胞，吸出血浆，置-20℃冻存备用。
制备猪凝血酶原活酶复合物制备猪FV采用聚乙二醇(PEG)沉淀、柠檬酸钡吸附、DEAE-纤维素离子交换层析等方法制备。
制备猪FXa采用柠檬酸钡吸附、EDTA解吸附、硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、胰蛋白酶激活等方法制备。
制备猪脑磷脂取猪脑，除去脑膜和血块，称取10g，匀浆，加入3倍量丙酮于4□浸泡24h，滤渣干燥。再加入3倍量乙醚于4□浸泡24h，合并滤液回收乙醚，浓缩物再以丙酮洗涤2～3次，得猪脑总磷脂。总磷脂中加入少量95％热乙醇，4□浸泡24h，收集沉淀，即为猪脑磷脂。
制备猪凝血酶制备猪凝血酶原取新鲜血浆100mL，用蒸馏水稀释10倍，用1％醋酸调pH5.0使蛋白质等电沉淀。静置过夜，然后置于离心机中，以3000r/min离心15min。弃上清取沉淀用20mL 0.9％氯化钠溶解，再置于离心机中以3000r/min离心15min，上清液即为凝血酶原粗品。
激活猪凝血酶原采用猪凝血酶原活酶复合物(FV、FXa、猪脑磷脂、Ca2+体系)激活猪凝血酶原，获得猪凝血酶。
本发明工艺制备的优点采用本工艺制备的猪FV的收率高于Michael(1978)、Katzmann(1983)和Pryzdial(1991)报道的牛FV的收率，但纯度均低于他们的报道。分析可能存在两个原因，一是猪、牛FV蛋白自身存在差异；二是本工艺简单、纯化步骤少，因而造成杂蛋白含量相对较高。因此，今后研究应在考虑成本和复杂性的基础上，尽量提高收率和纯度，以提高猪FV在凝血酶原活酶复合物中作用效率。
采用本工艺制备的猪FXa的收率高于Joseph(1978)、Kalafatis(1994)、Robert(1996)等人报道的牛FXa的收率，但纯度均低于他们报道。分析原因，一是猪、牛FXa蛋白自身存在差异；二是本工艺简单、纯化步骤少，因而造成杂蛋白含量相对较高。因此，今后应努力协调成本投入、操作复杂度和收率、纯度的矛盾，进一步完善猪FXa的制备工艺，以提高猪FXa的凝血酶原激活效率。
本研究制备的猪凝血酶的比活力约为40U/mg、纯度为32.5％，皆低于国外相关的牛凝血酶原的报道，如Whyte(1974)、Butenas(1999)和Brummel(2002)等。主要原因是国外采用多重层析结合使用或者利用单克隆抗体纯化牛凝血酶原，经凝血酶原活酶复合物激活后获得牛凝血酶。这些方法虽可制得纯度和比活力高的目的蛋白，但操作复杂、条件控制难、收率低等特点，不利于大规模化生产。
国内研究中，史永昶(1997)采用亲和层析和肖丽霞(1999)采用多重层析技术也获得了与国外报道相近的酶比活力，但同样存在大规模化生产受限的问题。李征(1998)和欧伶(1997)等采用一次层析纯化猪凝血酶原，经兔脑提取液激活后获得猪凝血酶，其比活力均低于本工艺制备的猪凝血酶的比活力。国内这些研究中都没有报道猪凝血酶的制备纯度。
本研究制备的猪凝血酶的收率为每L血浆107mg，每L血浆可获得约4280U的活性猪凝血酶，比国内外关于凝血酶收率的报道都高。因此，采用猪凝血酶原活酶复合物激活猪凝血酶原获得大量高活性凝血酶，将其应用于临床医疗，具有较大的实际应用价值。
综上所述，本工艺可应用于猪凝血酶的规模化制备，并可获得大量高活性猪凝血酶。但今后还应进一步探索猪凝血酶原制备方法和条件，达到可规模生产性、低成本消耗性、制备条件可控性、产品性能稳定性同高酶活性、高收率、高纯度的有机结合。
本工艺有很高的经济价值采用本工艺制备的猪FV总成本投入35.5元，相应市场价格可达385.2元。经济增加10倍我国猪血来源极为丰富，而凝血酶又具有传统止血药物无法比拟的优点，应用将会不断推广，需求量也会不断扩大，市场开发潜力巨大。猪凝血酶制备工艺的建立具有很大的实际生产价值。
权利要求
1.一种猪凝血酶的制备方法；工艺过程为材料是猪血与猪脑；试剂牛血清白蛋白(BSA)；纤维蛋白原(Fibrinogen)；DEAE-纤维素(DEAE-cellulose)；凝血酶活性测定试剂盒；和通用的生化试剂或分析纯试剂；试剂、溶液按照生物化学与分子生物学相关说明书配制；(1)猪血浆的制备向收集新鲜猪血中按1∶9比例加入3.8％的柠檬酸钠抗凝剂和一定浓度的抑制剂；4℃下，4000r/min离心30min沉降红细胞，吸出血浆，置-20℃冻存备用；(2)猪凝血酶原活酶复合物的制备(2.1)猪凝血因子V(F)的制备采用聚乙二醇(PEG)沉淀、柠檬酸钡吸附、DEAE-纤维素离子交换层析方法制备；(2.2)猪激活凝血因子X(Fxa)的制备采用柠檬酸钡吸附、(乙二胺四乙酸二钠盐)EDTA解吸附、硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、胰蛋白酶激活方法制备；(2.3)猪脑磷脂的制备取猪脑，除去脑膜和血块，称取10g，匀浆，加入3倍量丙酮于4□浸泡24h，滤渣干燥；再加入3倍量乙醚于4□浸泡24h，合并滤液回收乙醚，浓缩物再以丙酮洗涤2～3次，得猪脑总磷脂；总磷脂中加入少量95％热乙醇，4□浸泡24h，收集沉淀，即为猪脑磷脂；(3)猪凝血酶的制备(3.1)猪凝血酶原的制备取新鲜血浆100mL，用蒸馏水稀释10倍，用1％醋酸调pH5.0使蛋白质等电沉淀；静置过夜，然后置于离心机中，以3000r/min离心15min；弃上清取沉淀用20mL 0.9％氯化钠溶解，再置于离心机中以3000r/min离心15min，上清液即为凝血酶原粗品；(3.2)猪凝血酶原的激活采用猪凝血酶原活酶复合物(FV、FXa、猪脑磷脂、Ca2+体系)激活猪凝血酶原，获得猪凝血酶。
全文摘要
本发明公开一种猪凝血酶的制备方法；材料是猪血与猪脑；制备包括(1)猪血浆的制备；(2)猪凝血酶原活酶复合物的制备；(3)猪凝血酶的制备。本发明的猪FV的收率高于Michael、Katzmann和Pryzdial报道的牛FV的收率；猪FXa的收率高于Joseph、Kalafatis、Robert等人报道的牛FXa的收率，本工艺简单、纯化步骤少；利于大规模化生产。经济价值可观。
文档编号C12N9/74GK1793350SQ200510010518
公开日2006年6月28日 申请日期2005年11月11日 优先权日2005年11月11日
发明者高学军, 张强, 李庆章, 于艳波 申请人:高学军, 张强, 李庆章, 于艳波