专利名称：一种哺乳动物体细胞核移植方法
技术领域：
本发明涉及转基因动物技术、胚胎工程与发育生物学领域。具体地说，是关于一种哺乳动物体细胞核移植方法。
背景技术：
动物克隆技术是将供体体细胞核经显微手术和/或细胞融合的方法移植到去核卵母细胞胞质中，重新组成胚胎(重构胚)。重构胚经培养发育至囊胚，再将囊胚移植到同步发情的寄母子宫内，待发育成熟后分娩出动物，该动物被称为“克隆动物”，该技术则被称为“体细胞克隆技术”或“体细胞核移植技术”(Nuclear transfer，NT)。
哺乳动物体细胞克隆技术经过几年的发展，业已取得了很大进展，相继诞生了绵羊、山羊、牛、猪、鼠、猫、兔等克隆动物，为家畜良种繁育、濒危动物拯救、生产异种器官移植所需的供体器官以及人类疾病的治疗等开辟了广阔的空间。但是，目前的克隆效率仍很低，而且克隆动物出生前后会出现许多异常，如克隆胚胎发育阻滞、胎盘异常、流产率高、出生个体体重过重及致畸率高等(Han YM，Kang YK，Koo DB.Theriogenology，2003，59(1)33～44)。这些问题极大地限制了克隆技术的应用和发展。
我们知道，在正常受精过程中，卵母细胞接受精子，相互识别，启动胚胎发育；而在核移植技术中移入卵母细胞胞质的则是已分化的体细胞核，其基因组状态与精子有很大差异，卵母细胞对其的“识别”会发生困难，进而导致重编程的失败或不完全，克隆胚胎无法完成发育。因此，作为重构胚受体胞质的卵母细胞对供体核的重编程的能力，是影响核移植效率的重要因素之一。
然而，许多实验室开展的克隆牛工作很大程度上受到了实验材料卵巢来源的制约。由于这些卵巢大都取材于屠宰场，无法评价提供卵巢的牛的性状和生理功能等情况，更无从了解其遗传背景。同时，来自不同遗传背景的受体细胞，它的胞质结构成分也会有所不同。卵母细胞胞质中结构成分的不同主要表现为细胞胞质内DNA类型的多样性和细胞质内环境的差异。不同的DNA组成及内环境的差异会影响核移植的重构胚的分裂及其后续的发育。
以往的一些实验已经证明了杂交F1代的卵母细胞在胚胎发育上的优势。在转基因动物的生产上，用杂交系比用近交系C57BL/6小鼠的效率高8倍；在孤雌激活的实验上，以(B6D2)F1的卵母细胞孤雌激活的胚胎其囊胚孵化率高于以近交系C57BL/6的卵母细胞孤雌激活的胚胎。这可能主要与杂交卵母细胞的杂交优势有关。任何一个杂交个体都有可能比其父母具有更高的生产能力。当两个纯种杂交时，我们将获得具有更高杂交遗传力的杂交体。一个实验从分子水平证实了杂交卵母细胞杂交优势的存在。利用双向蛋白凝胶电泳比较DBA/2和C57BL/6的卵母细胞发现，至少有17种蛋白存在着合成上的区别。而所有的这些蛋白在上两种品系的杂交(B6D2)F1代的卵母细胞上都能合成并且有的合成率还更高，其中在DBA/2也有合成的两种蛋白还被认为极有可能是卵母细胞修饰因子(Latham KE et al.Development，1994；120(12)3419-26)。其机制可能与两品系间等位基因表达水平的不同和印迹基因的不同有关。众所周知，体细胞被移入卵母细胞后必须尽快地被重编程以表达胚胎早期发育所需的基因，而正是卵母细胞胞质中的重编程因子具有去除细胞原有记忆的能力。因此，杂交卵母细胞杂交优势的遗传多样性使其具有较高的重编程能力，在卵子形成期和成熟期杂交卵母细胞将不仅在种类上而且在数量上合成较多的重编程因子来改善重构胚的发育，从而提高体细胞克隆效率。
已有许多研究试图通过选择不同的受体卵母细胞来改善克隆胚的发育(Betthauser J，et al.Nat.Biotechnol.，2000，18(10)1055-9；Bondioli K，et al.Mo1.Reprod.Dev.，2001，60(2)189-95；Miyoshi K，et al.Biol.Reprod.，2002，67(2)540-5)，如MII期卵母细胞和MI期卵母细胞的对比；体外成熟和体内成熟卵母细胞的对比以及来源于青春期前的动物和成体动物的卵母细胞的对比等等。但迄今为止，尚未见有用杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞进行哺乳动物克隆的报道。
发明内容
本发明的目的就在于利用杂交F1代卵母细胞在胚胎发育上的优势，从而提供一种哺乳动物体细胞核移植方法。
本发明的发明人经过研究发现，利用哺乳动物的杂交F1代卵母细胞作为受体细胞可以有效地提高受体胞质卵母细胞的重编程能力，改善重构胚的发育，进而提高动物核移植胚胎的早期发育率。
因此，本发明的哺乳动物体细胞核移植方法的最主要的特点在于以哺乳动物的杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞进行核移植，具体包括以下步骤
A、取哺乳动物体细胞制备供体核细胞；B、取杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞；C、对杂交F1代的卵母细胞进行核去除；D、将供体细胞核注入去核的卵母细胞后融合。
其中，步骤A所述哺乳动物体细胞可以取自牛、羊、猪、狗、猫、兔、猴或小鼠的组织、器官的细胞、体外培养的细胞及遗传修饰过的细胞。优选地，所述供体核细胞为遗传背景清楚的母牛的成纤维细胞或卵丘细胞。
步骤B的杂交F1代卵母细胞的母本与供体核细胞为同一品系，优选地，所述卵母细胞为F1代杂交牛通过活体取卵(ovum pick up，OPU)的方法获得的新鲜卵母细胞；步骤D中，使用胞质内注射法将供体核细胞注入卵母细胞卵周隙，然后通过融合法融入卵母细胞。
本发明的哺乳动物体细胞核移植方法具有下列优点1、利用杂交F1代的杂交优势，以F1代杂交牛的卵母细胞为受体胞质，提高了受体胞质的重编程能力，从而改善了重构胚的发育，提高体细胞克隆效率。将在一定程度上解决目前国际上体细胞克隆效率低下的难题，建立高效的体细胞核移植技术平台；2、利用杂交卵母细胞细胞质核移植技术，不仅在囊胚的数量，而且在囊胚的质量上都有显著的提高。
具体实施例方式
为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的诠释而并非对本发明的任何方式的限制。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料与方法以下实施例中所使用的实验试剂，除另有说明外均为美国Sigma公司产品。
本实施例选取已建立发情周期的青年荷斯坦奶牛、黄牛和F1代杂交牛(荷斯坦母牛×黄种公牛)进行分组，分别为荷斯坦奶牛组、黄牛组和F1代杂交牛组。开始实验时年龄为12-13个月，体重和体况相似。
本实施例中采用荷斯坦奶牛的卵丘细胞作为供体核细胞，而以F1代杂交牛(荷斯坦母牛×黄种公牛)的卵母细胞作为受体卵母细胞，并同时以荷斯坦奶牛和黄牛的卵母细胞作为对照。
实施例1、供体核细胞的制备取荷斯坦奶牛1～5代的卵丘细胞或成纤维细胞用加10％胎牛血清(FBS)的D-MEM/F-12(Gibco，Grand Island，NY)进行培养，细胞生长至瓶底80～90％时，将培养液换成含0.5％FBS的培养液血清饥饿2～3天。然后用0.25％的胰蛋白酶消化约3分钟贴壁细胞，将消化下来的细胞洗涤2遍后，加入适量的TCM199+10％FBS反复吹打成单个细胞的悬液，即得到供体核细胞待用。
实施例2、受体卵母细胞的准备对各实验组的牛进行活体取卵获得卵母细胞，活体取卵的具体方法主要如Petyim等(Petyim SR，et al.J.Vet.Med.A.Physio1.Pathol.Clin.Med.2000，47627-640)所述，具体如下使母牛站立保定，消毒麻醉。全过程在B型超声监视下进行。将带有采卵针的探头轻缓插到阴道穹隆，操作人员通过直肠隔着直肠壁将卵巢牵引至B超探头端部，推进采卵针，同时，用脚踏开关控制真空泵抽吸卵泡液，压力在95mmHg左右，之后，用DPBS(含3％BSA和2u/ml肝素)冲洗采卵针和导管，冲洗液也一同放入收集管。分别记录杂交牛组、荷斯坦奶牛组和黄牛组的OPU操作次数，以及获得的卵母细胞的数量。
将收集到的卵母细胞移入成熟微滴(TCM-199(Gibco，Grand Island，NY)外加10％胎牛血清、10μg/ml促黄体生成激素、1μg/ml雌二醇和1μg/ml促卵泡生成素)。培养条件为5％CO2，38.5℃，饱和湿度培养20h。将成熟20h的卵母细胞放入0.5％的透明质酸酶消化1～2min，同时用吸胚管反复吹吸，脱去附着的卵丘细胞。然后，经TCM199液洗3遍，在体视显微镜下，选择排出第一极体的卵母细胞作为受体卵母细胞，置于TCM199微滴中待用。
实施例3、核移植以及融合将实施例1得到的供体核细胞和实施例2得到的卵母细胞移入操作液(TCM199+10％FBS+5μg/ml细胞松弛素B)中，按照Park等(Park SH，et al.Mol Reprod Dev 2004；6825-34)所述的方法，在显微镜下将卵母细胞的核去除，然后将供体核细胞移入卵周隙。
去核和注核的具体操作如下将卵母细胞移入操作液中20分钟后，将供核细胞与卵母细胞一同置于玻片上，在显微镜下，用持卵针固定卵母细胞，卵母细胞排出的极体处于钟表3点位，去核针正对着或稍偏离极体，去除极体与一部分胞质。去核之后立即将1个供核细胞移入去核卵母细胞的卵周隙内，重复下一枚卵的操作，直至所有卵母细胞操作完成后，将移入供核细胞的卵母细胞置于TCM199液培养30min。
注核后的卵母细胞在38.5℃预热的含甘露醇的电融合液(0.3M甘露醇，0.15mM Ca2+，0.15mM Mg2+)中平衡1～2min，移入电融合槽中，在电极之间通以两个直流脉冲(2.5kV/cm，10μs/次，间隔1s)，诱导融合。30～60min后，在体视显微镜下检查融合情况，融合卵即为重构胚。分别记录杂交牛组、荷斯坦奶牛组以及黄牛组得到的融合重构胚的数量。
实施例4、重构胚的活化和体外培养重构胚用活化液TCM199(含10％FBS、5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml放线菌酮)洗3遍后，移入38.5℃预温好的活化液微滴中作用5h。
将活化后的重构胚放入B2培养液(LABORATOIRE C.C.D，France)和单层Vero细胞的共培养体系(即Vero细胞用B2培养液悬浮成密度1×105个/ml，然后用此悬浮液制作培养滴，约48h后在培养滴底面就会铺上一层Vero细胞，此时可放入胚胎)中，在5％CO2，38.5℃，饱和湿度的培养箱中培养。每隔48h半量更换B2培养液。活化后48h观察重构胚的卵裂情况，计算卵裂率(卵裂胚胎数/培养胚胎数)；培养第8天记录囊胚的数量，计算囊胚率(囊胚数/培养的胚胎数)。
此外，还分别进行囊胚期细胞计数(Petyim SR，et al.J.Vet.Med.A.Physiol.Pathol.Clin.Med.2000，47627-640)，具体如下培养第8天的囊胚用5μg/ml Hoechst33342溶液染色5min，用盖玻片压破胚胎，荧光显微镜下计数，每个囊胚统计三次，计算均值。
以上各步操作的统计数据及计算结果如以下表1所示表1、不同受体卵母细胞对克隆胚胎的融合及发育的影响(Mean±SE)
每行数字有不同上标字母者有显著性差异(P＜0.05)；D囊胚率以卵裂数为基数；EA级囊胚色泽明亮具有致密的内细胞团和分布均匀的滋养层；相比较B级和C级的质量则分别为平均或差；
由表1的结果可见，从囊胚的数量角度看，在融合的重构胚和囊胚率方面杂交牛组都是最高的；从囊胚的质量角度看，囊胚中的细胞数杂交牛组也是最多的，且A级囊胚的比例也是最高的。
因此，本发明的以F1代杂交牛的卵母细胞为受体胞质的体细胞核移植方法，能够显著提高受体胞质的重编程能力，改善重构胚的发育，从而提高体细胞克隆效率。其原因可能与杂交卵母细胞杂交优势的遗传多样性使其具有较高的重编程能力有关。
虽然以上只是以牛为例对本发明的体细胞核移植方法进行了描述，但是本发明的方法同样适用于其它哺乳动物，如牛、羊、猪、狗、猫、兔、猴或小鼠等，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的，完全不需要创造性的劳动，因此，这些应用也同样应当属于本
权利要求
1.一种哺乳动物体细胞核移植方法，其特征在于，所述核移植方法以哺乳动物的杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤A、取哺乳动物体细胞制备供体核细胞；B、取杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞；C、对杂交F1代的卵母细胞进行核去除；D、将供体细胞核注入去核的卵母细胞后融合。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物为牛。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤A中所述哺乳动物体细胞为牛的卵丘细胞或成纤维细胞。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述杂交F1代卵母细胞的母本与供体核细胞为同一品系。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述F1代卵母细胞为通过活体取卵操作获得的牛卵母细胞。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤D中，将供体核细胞注入卵母细胞卵周隙，然后通过融合法融入卵母细胞。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述融合法的具体条件为在预热的含甘露醇的电融合液中平衡1～2分钟，移入电融合槽中，在电极之间通以两个直流脉冲，诱导融合。
全文摘要
本发明提供了一种哺乳动物体细胞核移植方法，其主要特点在于以哺乳动物的杂交F1代的卵母细胞作为受体细胞进行核移植。本发明的方法能够显著地提高哺乳动物核移植受体胞质的重编程能力，改善重构胚的发育，从而提高体细胞克隆效率。
文档编号C12N5/06GK1814750SQ20051002387
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月4日 优先权日2005年2月4日
发明者曾溢滔, 杨晓煜, 黄淑帧 申请人:上海交通大学附属儿童医院, 上海滔滔转基因工程股份有限公司