专利名称：提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物的技术，特别是提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺。
背景技术：
我国作为中草药的发源地，虽然中药资源丰富，但蕴藏量有限。由于生态环境的破坏、无计划的采伐和栽培技术等原因而致使珍稀濒危药用植物种类不断增加。如80年代后期，甘草资源比50年代减少60％，麝香资源此50年代减少70％，其它如厚朴、杜仲、黄柏、麻黄、肉苁蓉、松贝等资源的破坏也十分严重。所以供需矛盾日益加剧。
在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物如生物碱、色素、甾体、萜类等药用成分及香精等，其中有些是微生物和人工不能合成的，有些则是在整株植物含量甚微或本身资源就十分匮乏，而在培养的细胞中含量有时却很高。因此，利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。
西洋参(Panax quinquefolium)是五加科人参属的一种名贵中药材，其所含的西洋参皂甙是主要的药理成份，具有健胃、强心、镇定、降血糖和降血脂的功效，并有一定的防癌和抗衰老的作用。西洋参，最适生长于海拔1000米左右的山地阔叶林地带。喜阴，宜斜射光和散射光，忌强光；怕高温，生长期最适宜温度18℃～24℃；要求栽培土层深厚，土质为疏松、肥沃、腐殖质含量丰富、透水性强的偏酸性的壤土或沙质壤土。无论野生或是栽培的西洋参，由于其自身的生理特性，生长缓慢，一般需四至六年才能收获入药。它们的市场1供需矛盾突出，价格昂贵，约1000元/kg。迄今为止其皂甙成分尚不能人工合成。因此，通过细胞培养方法大量生产西洋参皂甙，成为研究热点。我国的郑光植、方绮民、周立刚、原晓勇、张美萍等分别研究了西洋参细胞悬浮培养的培养条件，并测定了不同培养条件下悬浮培养物中有效成分的含量，为西洋参细胞培养的进一步研究提供了基础。
目前，西洋参细胞悬浮培养技术仍有不完善之处，缺乏适合大规模悬浮培养的高产、稳定的细胞株，细胞悬浮培养工艺不完善，悬浮细胞培养水平及皂甙产量较低，使利用悬浮细胞培养技术大规模工业化生产西洋参皂甙受到限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺，以实现在不降低西洋参悬浮细胞产量的同时，极大的增加有效目的物质含量和降低工业化生产成本的目的。
本发明采用如下技术方案在悬浮细胞培养过程中加入含D-半乳糖的培养液，补充量为培养体积的10％-40％，使D-半乳糖终浓度达到2-40g/L。
本发明具体实施步骤如下(1)配制储备液；
(2)装瓶在已配制好的储备液中加入去离子水稀释18-22倍，再依次加入白糖、水解乳蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸、α-萘乙酸、激动素和吲哚丁酸，，终浓度分别为1.5％-6％、0.3％-1％、0.5-1.5mg/L、0-0.5mg/L、0.2-1.0mg/L和0.2-1.0mg/L，然后调节pH值为5.5-6.5，充分搅拌后装瓶，100ml-500ml三角瓶，装液量为三角瓶容积的1/5-1/2。
(3)灭菌密封瓶口，将温度控制在115-122℃，压力控制在1.0-1.2kg/cm2，灭菌20-30分钟，冷却后备用。
(4)接种、培养制成的培养液中，在无菌条件下接入西洋参对数生长期的悬浮细胞，每升培养液接入15-50克鲜重的悬浮细胞，放入摇床中悬浮暗培养，在培养过程中补充含D-半乳糖的培养液，补充量为培养体积的10％-40％，使D-半乳糖终浓度达到2-40g/L，培养25-35天，收获细胞，提取西洋参人参皂甙。
本发明工艺接种后培养温度控制在22-26℃暗培养。
本发明工艺摇床转速为90-150rpm。
本发明积极效果如下利用本发明工艺开展西洋参悬浮细胞培养，培养结束后，可使细胞生长量比接种量增长近10-20倍。细胞的生长量(鲜重)可达到400-600g/L左右，西洋参人参皂甙产量比对照提高1-2倍，达600-800mg/L。
具体实施例方式
实施例1
配制1000ml悬浮细胞液体培养基，pH6.0，分装33个100ml三角瓶，每瓶30ml；高压灭菌，压力控制在1.0kg/cm2，120℃，20min。取对数生长期的西洋参悬浮细胞接种到100mL三角瓶中，接种量为每升培养液接入15克鲜重的悬浮细胞，培养温度22℃，摇床转速90rpm，暗培养。培养15天，每瓶补充含D-半乳糖的培养液7.8ml，使D-半乳糖浓度达到15g/L，再培养10天，收获细胞。平均每瓶收获鲜细胞26.2g，西洋参人参皂甙含量达610mg/L。
实施例2配制1000ml悬浮细胞液体培养基，pH5.5，分装33个100ml三角瓶，每瓶30ml；高压灭菌，压力控制在1.2kg/cm2，115℃，30min。取对数生长期的西洋参悬浮细胞接种到100mL三角瓶中，接种量为每升培养液接入50克鲜重的悬浮细胞，培养温度26℃，摇床转速150rpm，暗培养。培养25天，每瓶补充含D-半乳糖的培养液12ml，使D-半乳糖浓度达到40g/L，再培养5天，收获细胞。平均每瓶收获鲜细胞18.8g，西洋参总皂甙含量达670mg/L。
实施例3配制1000ml悬浮细胞液体培养基，pH6.5，分装33个100ml三角瓶，每瓶30ml；高压灭菌，压力控制在1.1kg/cm2，122℃，25min。取对数生长期的西洋参悬浮细胞接种到100mL三角瓶中，接种量为每升培养液接入30克鲜重的悬浮细胞，培养温度24℃，摇床转速120rpm，暗培养。培养20天，每瓶补充含D-半乳糖的培养液10ml，使D-半乳糖浓度达到36g/L，再培养7天，收获细胞。平均每瓶收获鲜细胞23.8g，西洋参总皂甙含量达630mg/L。
权利要求
1.一种提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺，其特征在于在悬浮细胞培养过程中加入含D-半乳糖的培养液，补充量为培养体积的10％-40％，使D-半乳糖终浓度达到2-40g/L。
2.根据权利要求1所述的一种提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺，其特征在于经过以下步骤(1)配制储备液；(2)配制培养液在已配制好的储备液中加入去离子水稀释18-22倍，再依次加入白糖、水解乳蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸、α-萘乙酸、激动素和吲哚丁酸，终浓度分别为1.5％-6％、0.3％-1％、0.5-1.5mg/L、0-0.5mg/L、0.2-1.0mg/L和0.2-1.0mg/L，然后调节pH值为5.5-6.5，充分搅拌后装瓶，100ml-500ml三角瓶，装液量为三角瓶容积的1/5-1/2。(3)培养液灭菌密封瓶口，将温度控制在115-122℃，压力控制在1.0-1.2kg/cm2，灭菌20-30分钟，冷却后备用。(4)接种、培养制成的培养液中，在无菌条件下接入西洋参对数生长期的悬浮细胞，每升培养液接入15-50克鲜重的悬浮细胞，放入摇床中悬浮暗培养，在培养过程中补充含D-半乳糖的培养液，补充量为培养体积的10％-40％，使D-半乳糖终浓度达到2-40g/L，培养25-35天，收获细胞，提取西洋参人参皂甙。
3.根据权利要求2所述的一种提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺，其特征在于储备液的成分及含量如下
4.根据权利要求2或3所述的一种提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺，其特征在于接种后培养温度控制在22-26℃暗培养。
5.根据权利要求2或3所述的一种提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺，其特征在于摇床转速为90-150rpm。
全文摘要
本发明涉及一种植物细胞悬浮培养生产次生代谢产物的技术，特别是提高西洋参悬浮细胞皂甙产量的生产工艺，在悬浮细胞培养过程中加入含D－半乳糖的培养液，补充量为培养体积的10％－40％，使D－半乳糖终浓度达到2－40g/L，在西洋参悬浮细胞大量生产的过程中适时加入D－半乳糖，可使西洋参悬浮细胞生长量提高10－20倍，人参皂甙生长量比对照提高1－2倍，达到600－800mg/L。
文档编号C12P33/00GK1804026SQ200510048270
公开日2006年7月19日 申请日期2005年12月31日 优先权日2005年12月31日
发明者闫静辉, 李书生, 张小兵, 李亚璞, 李春生, 吴萌, 陈英珠, 程华, 韩广彦, 籍宝霞, 陈瑞芹, 辛春艳 申请人:河北省生物研究所