专利名称：一种生物合成γ－氨基丁酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物合成γ-氨基丁酸的方法。
背景技术：
γ-氨基丁酸(简称GABA)是一种具有重要生理活性的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统重要的神经递质。大量文献报道，GABA具有降血压和胆固醇、降低神经元活性，防止神经细胞过热，不仅具有安神和抗除抑郁作用，而且还能增强脑功能和长期记忆、增加生长激素分泌、防止肥胖、健肝利肾、改善更年期综合症等功能。随着对GABA生理活性的不断深入研究，最新研究发现的γ-氨基丁酸的生理功能越来越多。GABA也越来越多地受到了更多的关注，GABA在生物体内虽然广泛存在，但无论动、植物中，含量却都很低，分离很困难，需要对其进行合成制备。对于它的合成制备方法主要有化学合成法和生物合成方法。与化学合成方法相比，生物法合成GABA是利用生物体内的谷氨酸脱羧酶作为催化剂，以L-谷氨酸钠(L-MSG)为底物，将L-谷氨酸钠(L-MSG)α-脱羧，产生γ-氨基丁酸和CO2，主要优点在于合成条件温和，不需要昂贵的原材料，环境污染小，能耗小。采用生物法合成GABA的关键之一就是筛选出具有高谷氨酸脱羧酶活力的优良菌株。有文献报道，GABA的生物合成通常采用大肠杆菌作为生产菌株，但是用大肠杆菌作为生产菌株存在食品安全卫生方面的隐患，本实验室筛选到一株具有高效生物合成GABA能力的乳酸菌株。本文报道了一种生物合成GABA的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物合成γ-氨基丁酸的方法。
保藏编号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10～30小时后，以0.5％～5％的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中，在25℃～35℃下静置培养48h～120h，即得含菌体的发酵液，菌体离心分离收集；离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.25～2g湿菌体，悬浮于15～50mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为5mM～60mM，反应1～10小时，反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
保藏编号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，在发酵时产乳酸，显微镜观察成对或成链状出现，不运动，无孢子，菌落小，表面光滑；属于革兰氏阳性菌株，兼性厌氧。
本发明采用短乳杆菌作为菌种，菌体生长达到稳定期，收集菌体，采用全细胞催化，以L-谷氨酸钠(L-MSG)为底物，以柠檬酸—磷酸氢二钠为缓冲体系，无其它碳氮源等其它培养基成分，利用乳酸菌体内含有高活性谷氨酸脱羧酶，将L-谷氨酸钠(L-MSG)α-脱羧，产生γ-氨基丁酸，GABA产量达到1～6g/L。本方法的优点在于生产成本低、反应条件温和、环境污染小、方法简单、易于操作，周期短、生产效率高，并且产品纯度较高，减轻了后续分离纯化工艺。
具体实施例方式
A.菌株本实验室筛选。
B.培养基1000mL琼脂斜面保藏培养基葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，乙酸钠2g，MgSO4·7H2O 20mg，MnSO4·4H2O 1mg，NaCl 1mg，FeSO4·7H2O 1mg，琼脂15g，pH6.8。
1000mL GYP种子培养基葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，乙酸钠2g，MgSO4·7H2O 20mg，MnSO4·4H2O 1mg，NaCl 1mg，FeSO4·7H2O 1mg，pH6.6-7.0。
1000mL GYP发酵培养基葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，乙酸钠2g，MgSO4·7H2O 20mg，MnSO4·4H2O 1mg，NaCl 1mg，FeSO4·7H2O 1mg，一水合L-谷氨酸钠10g，pH6.6-7.0。
1000mL MRS种子培养基牛肉膏10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，K2HPO42g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，醋酸钠5g，无机盐溶液5mL(MgSO4·7H2O，11.5％；MnSO4·2H2O，2.4％)，pH6.6。
1000mL MRS发酵培养基牛肉膏10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，K2HPO42g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，醋酸钠5g，无机盐溶液5mL(MgSO4·7H2O，11.5％；MnSO4·2H2O，2.4％)，一水合L-谷氨酸钠10g，pH6.6。
C.制备工艺此菌株经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10～30小时后，以0.5％～5％的接种量接种GYP或MRS发酵培养基，在30℃下静置培养48h～120h，即得含菌体的发酵液，菌体通过离心(8000r/min，5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.25～2g湿菌体，悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为5mM-100mM，反应1～10小时，反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
该菌株经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10～30小时后，以0.5％～5％的接种量接种GYP或MRS发酵培养基，在30℃下静置培养48h～120h，即得含菌体的发酵液，菌体通过离心(8000r/min，5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.25～2g湿菌体，悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为5mM-100mM，反应1～10小时，反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
实施例1此菌株经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基，培养时间为24小时，将种子培养液以1％的接种量接种于GYP发酵培养基中，发酵培养基内加1％的一水合L-谷氨酸钠，发酵培养基的装液量为200mL/500mL，静置培养60小时，即得含菌体的发酵液，菌体通过离心(8000r/min，5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.5g湿菌体，悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为10mM，反应1小时，反应液离心经高效液相色谱分析得，γ-氨基丁酸含量约1g/L。
实施例2此菌株经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基，培养时间为24小时，将种子培养液以1％的接种量接种于GYP发酵培养基中，发酵培养基内加1％的一水合L-谷氨酸钠，发酵培养基的装液量为200mL/500mL，静置培养60小时，即得含菌体的发酵液，菌体通过离心(8000r/min，5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.5g湿菌体，悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为20mM，反应2小时，反应液离心经高效液相色谱分析得，γ-氨基丁酸含量约2g/L。
实施例3此菌株经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基，培养时间为24小时，将种子培养液以1％的接种量接种于GYP发酵培养基中，发酵培养基内加1％的一水合L-谷氨酸钠，发酵培养基的装液量为200mL/500mL，静置培养60小时，即得含菌体的发酵液，菌体通过离心(8000r/min，5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.5g湿菌体，悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为40mM，反应3小时，反应液离心经高效液相色谱分析得，γ-氨基丁酸含量约4g/L。
实施例4此菌株经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基，培养时间为24小时，将种子培养液以1％的接种量接种于GYP发酵培养基中，发酵培养基内加1％的一水合L-谷氨酸钠，发酵培养基的装液量为200mL/500mL，静置培养60小时，即得含菌体的发酵液，菌体通过离心(8000r/min，5min)收集。离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.5g湿菌体，悬浮于25mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为60mM，反应5小时，反应液离心经高效液相色谱分析得，γ-氨基丁酸含量约6g/L。
权利要求
1.一种生物合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，保藏编号为CGMCCNO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10～30小时后，以0.5％～5％的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中，在25℃～35℃下静置培养48h～120h，即得含菌体的发酵液，菌体离心分离收集；离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.25～2g湿菌体，悬浮于15～50mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠含量为5mM～60mM，反应1～10小时，反应液离心即得含γ-氨基丁酸的溶液。
2.根据权利要求1所述的一种生物合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述保藏编号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，在发酵时产乳酸，显微镜观察成对或成链状出现，不运动，无孢子，菌落小，表面光滑；属于革兰氏阳性菌株，兼性厌氧。
全文摘要
本发明公开了一种生物合成γ－氨基丁酸的方法，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10～30小时后，以0.5％～5％的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中，在25℃～35℃下静置培养48h～120h，即得含菌体的发酵液，菌体离心分离收集；离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.25～2g湿菌体，悬浮于15～50mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L－谷氨酸钠含量为5mM～60mM，反应1～10小时，反应液离心即得含γ－氨基丁酸的溶液。本发明生产成本低、反应条件温和、环境污染小、方法简单、易于操作，生产效率高，并且产品纯度较高，减轻了后续分离纯化工艺。
文档编号C12P13/00GK1683544SQ20051004918
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月7日 优先权日2005年3月7日
发明者梅乐和, 黄 俊, 武鸿 申请人:浙江大学