专利名称：一种重组的产聚羟基脂肪酸酯菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚羟基脂肪酸酯的生产领域，更具体地本发明公开了一种重组的产聚羟基脂肪酸酯菌及应用。
背景技术：
聚羟基脂肪酸酯尤其是聚羟基丁酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的高分子聚酯，其分子量一般由几万到几百万，广泛存在于自然界的多种微生物体内。它的某些物理性质与传统的由石油合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯类似，可由可再生的能源合成，并且可以完全降解，进入自然界的生态循环，被认为是一种可能替代不可降解的传统塑料的“生物可降解塑料”，引起了世界各国科学界和产业界的广泛关注。
生物可分解塑料的共同特点不仅是在自然界可被微生物完全分解而减轻陆地和海洋的污染，而且在废弃后焚烧处理时所释放的CO2量都明显低于合成塑料，从而能对保护地球大气环境、减少温室效应起到积极作用。
而以3-羟基丁酸为单体组成的聚3-羟基丁酸酯P(3HB)，因其物理性质较脆等而不适合于工业应用。由3-羟基丁酸分别与4-羟基丁酸、3-羟基戊酸或3-羟基己酸共聚合形成的P(3HB-co-4HB)、P(3HB-co-3HV)或P(3HB-co-3HHx)，由于它们具有优良的物理和机械性能(可按不同要求通过共聚比例进行调节，获得具有不同刚性、结晶性、熔点和玻璃化温度适合于不同用途的聚合物材料)，特别是具有生物相容性和可吸收性，能用作生物医学材料，而成为当今世界研究最热门的PHA之一。
1997年，日本理化学研究所的主任研究员土肥仪治等发现在食酸丛毛单孢菌(Comomanas acidovorans IFO 13582，同义代尔夫嗜酸菌Delftia acidovorans)发酵过程中补入不同的脂肪酸或醇以及控制不同的发酵条件，可以得到不同种类的PHA，特别是获得具有优良物理性能从而有着广泛用途的3-羟基丁酸与4-羟基丁酸的共聚物P(3HB-co-4HB)(详见JP08-089264，JP09-098793)。
近年来，基因重组微生物生产PHA最引人瞩目的成就是将真养产碱杆菌的PHA生物合成途径基因和克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的琥珀酰半醛代谢途径基因都重组到大肠杆菌宿主细胞中，在适当的培养条件下进行表达。由于琥珀酰半醛代谢途径以6碳糖或5碳糖为起始物质产生4-羟基丁酰辅酶A中间体，它与PHA生物合成途径的结合意味着可以不依赖前体4-羟基丁酸或1，4-丁二醇或γ-丁内酯产生4HB单体的PHA共聚物。用葡萄糖为碳源对这一重组菌进行培养，可以获得分子量1.8×106Da，4HB含量1.5mol％，细胞内积蓄量占细胞干重46％的(P3HB-co-4HB)。另外，早在1988年土肥仪治等就发现，真养产碱杆菌可以由4-羟基丁酸，γ-丁内酯、1，4-丁二醇和1，6-己二醇合成P(3HB-co-4HB)共聚物。通过调节碳、氮源的组成，这一共聚物中4HB的比例可以在0～100％的范围内改变。P(3HB-co-4HB)的生物降解性和材料性能与P(3HB)和P(3HB-co-3HV)都有所不同，因而具有重要的应用价值。
以γ-丁内酯为碳源，在无氮培养基中用真养产碱杆菌30小时发酵，得到分子量240,000～425,000、占细胞干重29％的共聚物P(3HB-co-4HB)。当发酵培养基中γ-丁内酯用量由10％增加到25％，所得共聚物中4HB的含量可从9％增加到21％。上述培养基里加入果糖，可提高P(3HB-co-4HB)的产率和分子量，细胞中共聚物含量达细胞干重的48％，而共聚物中4HB的含量减少为17％。土肥仪治等还用食酸丛毛单胞菌为生产菌，以丁酸或1，4-丁二醇为碳源，获得的产物分别是P(3HB)和P(3HB-co-4HB)(其中4HB含量为94mol％)。如以丁酸或1，4-丁二醇为混合碳源，则4HB在P(3HB-co-4HB)中的含量随1，4-丁二醇在混合碳源中的比例增加而增加。所得共聚物不是均一的，而是含有4HB不同含量共聚物的混合物(Appl.Envir.Microbiol.1998 643437-3443.)。
Kim等采用甲基杆菌属(Methylobacterium sp.KCTC 0048)细菌发酵，以甲醇及γ-丁内酯为碳源，也可以得到P(3HB-co-4HB)。聚合物积蓄量为细胞干重的2.0％～13.1％，其中4HB的含量为1.9％～5.5％(Biotechnol.Lett.，15，1017-1020(1993) 36)。
尽管目前已经有利用各种不同的微生物、调节底物中炭源、氨源的组成及在发酵过程中补料和控制不同的发酵条件从而提高P(3HB-co-4HB)产量的方法，但不断利用现代生物技术对传统的菌株进行改造而得到新的重组菌从而使P(3HB-co-4HB)方便易得一直是本领域技术人员着力解决的问题。
发明内容
本发明公开了1.一种新的重组产聚羟基脂肪酸酯菌GBR008；2.上述1的重组菌的表达载体pGB_ZV；3.一种获得上述1所述的重组菌的方法，包括(1)克隆代尔夫菌的PHA解聚酶的基因得到质粒pGEMT_phaZ；(2)克隆透明颤菌血红蛋白基因获得质粒pGEMT_VHb；(3)获得表达载体pGEMT_ZV；(4)得到重组产聚羟基脂肪酸酯菌GBR008。
4.一种利用上述1所述的重组菌产生P(3HB-co-4HB)的方法，包括(1)重组菌进行培养；
(2)对重组菌进行发酵；(3)分离发酵液，提取目的物P(3HB-co-4HB)。
5.上述5所述的方法，其中重组菌的培养阶段培养条件为37℃，220rpm培养5小时。
6.上述5所述的方法，其中重组菌的发酵阶段发酵条件为补料分批发酵30℃发酵40小时。
7.上述5所述的方法，其中提取目的物的溶剂为氯仿/无水乙醇。
8.上述8的方法，其中溶剂氯仿/无水乙醇的体积比为1∶4。
本发明将编码代尔夫菌的胞内PHA解聚酶的基因和透明颤菌血红蛋白基因克隆到质粒中，得到了表达载体pGEMT_ZV，进一步将其转化到Delftiasp.中，筛选转化子从而获得重组突变缺失PHA解聚酶的重组整合型的Delftiasp.一种新的重组产聚羟基脂肪酸酯菌GBR008。利用此重组菌经过培养、发酵得到P(3HB-co-4HB)，其含量占细胞干重的30.29％，其中4HB的摩尔百分含量为17.2％，与利用传统的Delftia acidovorans得到的P(3HB-co-4HB)相比即使在氧缺乏的培养、发酵条件下仍然可以增加P(3HB-co-4HB)的产量，从而有利于工业化的大规模生产。
附图1质粒pGEMT_ZV的物理图谱；具体实施方式
以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
本发明中所用的分子克隆技术，包括DNA的分离纯化、DNA合成、聚合酶链式反应(PCR)、DNA的限制性内切酶酶切、DNA的连接、大肠杆菌转化筛选都是本领域中非常熟悉的，在Sambrook等著的MolecularCloning，a laboratory manual一书中有充分地描述。
气相色谱仪的型号及生产厂家安捷伦公司6890型pGEM-T easy载体、T4连接酶、AatII、SalI、EcoRI、NcoI限制性内切酶均购自Promega公司，E.coli DH5α购自北京鼎国生物技术公司，天然代尔夫菌(Delftia sp.)由本实验室从活性污泥中分离，公司菌种保藏号GBSX267。
本发明中如果没有特别说明，所有试剂均为市售。
本发明中如果没有特别说明，胞内含量百分比(胞内蓄积量百分比)均为P(3HB-co-4HB)干重占细胞总干重的重量百分比，4HB含量百分比为P(3HB-co-4HB)中4HB摩尔数占3HB与4HB摩尔数之和的摩尔百分比。
实施例1血红蛋白基因的克隆和质粒构建1.1代尔夫菌(Delftia sp.)的PHA解聚酶的基因克隆为了将编码代尔夫菌的胞内PHA解聚酶的基因克隆到质粒中采用引物1，5’-TTATATGACGTCCGCGCGGCGGCGGCCGC-3’(SEQ NO.1)引物2，5’-ATTAGCGTCGACCGGACTGGCCCGTGAGGTC-3’(SEQ NO.2)通过PCR扩增的方法，以从天然代尔夫菌(Delftia sp.GBSX267)中分离得到的基因作为模板克隆PHA解聚酶。这些引物的制备来自代尔夫嗜酸菌的胞内PHA解聚酶的基因的核苷酸序列(参见Kasuya，K.，GenBankSequence Database，AB003186，1998)。按下列条件进行PCR首先在94℃变性5分钟，然后35次循环94℃变性50秒，50℃退火1分钟以及72℃延伸3分钟后，最后加上72℃延伸10分钟。经过PCR获得的DNA用AatII和SalI限制性内切酶消化后琼脂糖凝胶电泳下分离大约2kb的DNA片段，该片段随后连接到用AatII和SalI限制性内切酶已经消化好的经过改造的pGEM-T easy自连空载体上从而产生重组质粒pGB/phaZ。通过电穿孔技术将重组质粒转化给E.coli DH5α然后在含有氨苄青霉素(50ug/l)的LB琼脂平板上(酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl 10g/l；琼脂粉15g/l)筛选转化子从而获得重组的E.coli DH5α/pGB_phaZ。
1.2透明颤菌血红蛋白基因克隆为了将编码透明颤菌血红蛋白基因克隆到质粒中采用引物1；5’-GGACGCTGGGGTTAAAAGTAT-3’(SEQ NO.3)引物2；5’-GTCCCAAGTTTTGGCAACAGC-3’(SEQ NO.4)以从透明颤菌中分离得到的基因为模板，通过PCR扩增的方法得到血红蛋白基因。这些引物的制备来自透明颤菌的血红蛋白基因的核酸序列(参见Khosla，C.和Bailey等，GenBank Sequence Database，M30794，1993)。按照下列条件进行PCR首先在94℃变性5分钟，然后35次循环的94℃变性50秒，50℃退火1分钟以及72℃延伸2分钟后，最后加上72℃延伸10分钟。经过PCR获得的DNA在琼脂糖凝胶电泳下分离大约650bp的DNA片段，该片段随后连接到pGEM-T easy T载体上从而产生重组质粒pGB_VHb。通过电穿孔技术将重组质粒转化给E.coli DH5α然后在含有氨苄青霉素(50ug/L)，IPTG和X-Gal的LB琼脂平板上(酵母粉5g/L；胰蛋白胨10g/L；NaCl 10g/L；琼脂粉15g/L)筛选转化子从而获得重组的E.coli DH5α/pGB_VHb。
1.3打靶质粒的构建分别用EcoRI和NcoI消化质粒pGB_VHb和用EcoRI和NcoI消化质粒pGB_phaZ，然后用琼脂糖凝胶电泳分离650bp的VHb DNA片段和约5kb的pGB_phaZ线性DNA片段，然后用T4连接酶连接两个线性片段形成质粒pGB_ZV。通过电穿孔技术将重组质粒转化给E.coli DH5α然后在含有氨苄青霉素(50ug/l)的LB琼脂平板上(酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl10g/l；琼脂粉15g/l)挑选单克隆培养抽提质粒并酶切鉴定筛选转化子从而获得重组的E.coli DH5α/pGB_ZV。
实施例2重组代尔夫菌株的获得。
将pGB_ZV质粒用电穿孔技术将重组质粒转化给天然代尔夫菌(Delftia sp.)然后在含有氨苄青霉素(50ug/l)的LB琼脂平板上(酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl 10g/l；琼脂粉15g/l，pH7.0)筛选转化子从而获得重组突变缺失PHA解聚酶的重组整合型的Delftia sp./pGB_ZV。并根据克隆号重新命名为产聚羟基脂肪酸酯重组代尔夫菌R-Delftiasp.GBR008。
实施例3利用天然代尔夫菌(Delffia sp.GBSX267)产生P(3HB-co-4HB)菌体生长培养基(LB)酵母粉5g/l；胰蛋白胨10g/l；NaCl 10g/l，pH7.0。
发酵培养基(g/L)2g/L NH4Cl，0.2g/L MgSO4.7H2O，9g/LNa2HPO4.12H2O，1.5g/L KH2PO4，50ul/L氨苄青霉素和1ml/L微量元素(1mol/L HCl中(g/L)9.7gFeCl3，7.8gCaCl2，0.218gCoCl2.6H2O，0.156g CuSO4.5H2O，0.118g NiCl3.6H2O，0.105g CrCl3.6H2O，0.05g MnCl2.4H2O，0.06g ZnSO4.7H2O)，pH6.8。葡萄糖10g/L。1，4-丁二醇浓度为1％(V/V)。
以各100ul接种量将含有15％甘油的-80℃保藏的天然代尔夫菌(Delftia sp.)接种于100ml(250ml三角瓶)菌体生长培养基(LB)中。以八层纱布覆盖。37℃，220rpm培养5小时。
将在LB中培养好的菌体按照1∶10的比例将10ml菌液接入装在250ml三角瓶中的上述发酵培养基100ml中，以十六层无菌纱布覆盖。30℃，220rpm培养40小时。离心收集菌体用氯仿/乙醇沉淀法(体积比1∶4)提取P(3HB-co-4HB)共聚物干燥称重。
共进行八批次实验，结果见表1。
表1 天然代尔夫菌(Delftia sp.GBSX267)摇瓶发酵实验结果
其中细胞干重为发酵细胞干重；P(34HB)/CDW(％)为P(3HB-co-4HB)重量占细胞干重的百分比；4HB含量(％)为P(3HB-co-4HB)中4HB摩尔数占3HB与4HB摩尔数之和的摩尔百分比。
所得到的发酵细胞干重平均为2.98g/L，产物经分析验证为含4HB16.3mol％的3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚物。检测方法称取8-10mg干细胞，加入2ml氯仿，然后加入1.7ml甲醇，再加入0.3ml浓硫酸，100℃酯化4小时，酯化后的液体加入1ml水，振荡后取下层有机相进行气相色谱检测(Braunegg，G.et al.Eur.J.Microbiol.Biotechnol.1978，6，29-37)，计算得到P(3HB-co-4HB)含量占细胞干重的28.12％，其中4HB的摩尔百分含量为16.3％。
实施例4利用重组代尔夫菌(R-Delftia sp.GBR008)产生P(3HB-co-4HB)改变发酵培养基在250ml三角瓶中的装量增加到150ml，并将覆盖的纱布层数增加到二十四层，以限制培养过程中氧的供给，并将发酵菌种改为实施例2得到的重组菌(R-Delftia sp.GBR008)，其它实验步骤同实施例3。重复实验八批，结果见表2。
表2 重组代尔夫(R-Delftia sp.GBR008)摇瓶发酵实验结果
其中细胞干重、P(34HB)/CDW(％)、4HB含量(％)同表1。
所得到的发酵细胞平均干重为3.27g/L。产物经分析验证(同实施例3)计算平均值得到为含4HB 17.2％的3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚物，P(3HB-co-4HB)含量占细胞干重的30.29％，其中4HB的摩尔百分含量为17.2％。
由上述摇瓶发酵实验结果可知，利用本发明公开的重组代尔夫菌(R-Delftiasp.GBR008)与利用天然代尔夫菌Delftia sp.GBSX267得到的P(3HB-co-4HB)相比在氧缺乏的条件下培养、发酵可以增加P(3HB-co-4HB)的产量，有利于工业化的大规模生产。
SEQUENCE LISTINGSEQ NO.1<110>天津国韵生物科技有限公司<120>一种重组的产聚羟基脂肪酸酯菌及应用<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>1ttatatgacgtccgcgcggcggcggccgc 29SEQ NO.2<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>2attagcgtcgaccggactggcccgtgaggtc 31SEQ NO.3<210>3
<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ggacgctggggttaaaagtat 21SEQ NO.4<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gtcccaagttttggcaacagc 2权利要求
1.一种重组的产聚羟基脂肪酸酯菌GBR008。
2.一种表达载体pGB_ZV；
3.一种获得权利要求1所述的重组菌的方法，包括(1)克隆天然代尔夫菌的PHA解聚酶的基因得到质粒pGEMT_phaZ；(2)克隆透明颤菌血红蛋白基因获得质粒pGEMT_VHb；(3)获得表达载体pGEMT_ZV；(4)得到重组产聚羟基脂肪酸酯菌GBR008。
4.一种利用权利要求1所述的重组菌产生P(3HB-co-4HB)的方法，包括(1)对重组菌进行培养；(2)对重组菌进行发酵；(3)分离发酵液，提取目的物P(3HB-co-4HB)。
5.权利要求4所述的方法，其中重组菌的培养阶段培养条件为37℃，220rpm培养5小时。
6.权利要求4所述的方法，其中重组菌的发酵阶段发酵条件为摇瓶分批发酵30℃发酵40小时。
7.权利要求4所述的方法，其中提取目的物的溶剂为氯仿/无水乙醇。
8.权利要求7的方法，其中溶剂氯仿/无水乙醇的体积比为1∶4。
全文摘要
本发明公开了一种重组的产聚羟基脂肪酸酯菌GBR008及其表达载体pGB_ZV；本发明还公开了一种获得此菌株的方法及其应用，利用本发明公开的重组代尔夫菌(R－Delftia sp.GBR008)得到的P(3HB－co－4HB)与利用天然的代尔夫菌(Delftia sp.GBSX267)相比在氧缺乏的条件下培养、发酵可以增加P(3HB－co－4HB)的产量，有利于工业化的大规模生产。
文档编号C12P7/64GK1807595SQ20051013363
公开日2006年7月26日 申请日期2005年12月26日 优先权日2005年12月26日
发明者吕渭川, 周子振 申请人:天津国韵生物科技有限公司