专利名称：动物精子中dna片段测定的方法
技术领域：
本发明涉及医疗卫生部门的应用领域，主要涉及生物繁殖，特别是针对动物精液质量的测定步骤和方法。
背景技术：
目前西方国家6％的育龄男性患有一些妨碍正常生育的疾病。为此，世界卫生组织(WHO)将一系列的实验方法汇集成一个协议，这个协议在国际范围内规范化了精液质量的分析。这些研究集中在精液的浓度、形态和运动性的测定，辅以特定功能测试的评估，以及精液生化和酶参数的测定(WHO，1999)。这组测试可以估计每毫升精液中精子的总量和精子的浓度，可以诊断出男性是否由于射出精液中精子数量缺乏(无精子症)或明显减少(精子数量过少症)而导致不孕。同时，它能确定可能存在运动性问题(精子活动异常症)，这使得这些细胞无法穿越子宫腔并成功到达输卵管的外三分之一处。也可分析组成部分(头、颈、尾)是否有严重的形态问题(精子形态异常症)，因为这些变化会影响女性卵子有效授精的能力。此外，也研究了腺体诸如前列腺和精囊(感染，发育不全)的参与过程。最后，通过如HOS测试(细胞膜的离子渗透性)或体外精子的发育能力等的功能性测试，他们给出了关于精液至育能力的概念。最后，这些实验室研究有时不得不辅以激素曲线，睾丸活组织检查和/或染色体组型的测定(确定男性或女性个体的遗传条件的染色体研究)和/或分子遗传测试。
尽管使用临床和实验室研究，但是约30％-50％的不育男性的不育原因无法确定，这被称为先天性不育症。最近，人们意识到精子DNA受损能对这些病例中的很大一部分进行解释(Evenson et la，.1999；Larson et al，.2000)，这样精子DNA片段的研究是连续发表在专业杂志上的活跃研究对象(Evenson et al.，2002)。精子核DNA染色质异常或甚至受损，可能会发生，或甚至是精子产生过程中发生的DNA包装异常的结果(Saileret al.，1995)。甚至还有可能这是由导致氧化应激的自由基造成破坏的结果(Aitken etal.，1998)，这是一个可能细胞凋亡过程的结果(Gorczyca et al.，1993)。
有不同的方法用来评估人类精子染色质/DNA的完整性。其中突出的方法是DNA原位断裂法，使用酶如末端转移酶(TUNEL)或DNA聚合酶(原位缺口翻译ISNT)(Gorczyca et al.，1993)将标记的核苷酸导入断裂DNA。这些方法基于在固定载玻片上精子使用酶。正因为这个原因，效率不是很高，只有那些标记的断裂能够接触酶，这会导致结果的再现性相对低。试剂也很贵，所以这项技术只是用在研究方面，不可能用在精液临床评估上。另外一个技术是彗星分析法(comet assay)(Hughes et al.，1996)。载玻片上的琼脂糖微凝胶含有精子，用裂解溶液抽提膜和蛋白质。这样，就得到了类核，也就是去蛋白的核，其中DNA由于伸展而解链。类核在充满缓冲液的容器中电泳，这样DNA链移向正极，形成了彗星的样子，头和尾按电泳移动方向取向。在荧光显微镜下观察发现，这些彗星被荧光染色剂染色。如果核有DNA片段，那将有大量的核已移动并集中在彗星的尾部。这是相当敏感的测试，但对常规临床实验来说也是相对昂贵和复杂的。事实上，这特别需要复杂设备电泳电源和电泳槽，荧光显微镜，及图像捕捉系统和分析系统。基于以上这些原因，也不能用于精液临床研究，只能用于研究目的。
当前精子DNA片段研究方面的参考技术是Evenson的染色质结构分析(SCSA精子染色质结构分析；Evenson et al.，1980；2000；Evenson和Jost，1994)。在这种技术中，悬浮的精子加到酸性变性溶液(denaturing solution)中。其中DNA未破损的精子能抵抗酸性变性溶液，仍然保持为双链DNA。但是，含有片段化的DNA的精子使它们的DNA变性了，转变成了单链DNA。然后用吖啶橙对它们进行染色。当和双链DNA结合时，这种染色剂发出绿荧光。但是，在具有单链变性DNA的精子里，这种荧光染料发红荧光。用流动细胞计对有变性DNA的精子进行定量，以区别两种类型的荧光。SCSA是一种广泛临床应用的技术，已评估了大量的病人。利用这一系统已经确定，当个体有30％或以上的精子存在片段化的DNA，其受孕的概率将不到1％，这已应用在自然受精和人工协助授精中(Evenson et al.，1999；Larson et al.，2000)。
含有片段化的DNA精子的百分比在一个个体的不同的精子产生周期差不多是恒定的，也会随外界因素而变化，或，比如高烧发作，如流行性感冒之后(Evensonet al.，2000)。这样，可以进行一系列的研究，选择那些片段水平低的样本，继而用在人工协助授精技术上。考虑到将精液样本冰冻在液态氮中不会改变DNA片段水平这一点是很重要的，所以，能用冰冻的样本来试验，在后来用于授精，IVF(体外授精)或ICSI(胞质内精子注射)。这对病人和实验室有很大的操作优势。
SCSA技术虽然稳固并具有高再现性，但是这系统昂贵，实施困难，不是很容易进入常规实验室(De Jonge，2002)。基于这原因，尽管在临床不孕研究中确实具有临床价值，但是还是无法用作精子DNA质量的常规评估。
最近，我们研究小组曾经描述了一项能使得人类精子的染色质在原处分散的技术，表明无法分散染色质的那些精子含有片段化的DNA(Fernandez，J.L.et al.，《男性学杂志》，2003，vol.24，No.1，59-66页；“精子染色质分散试验测定精子DNA片段的一种简单方法”)。使用这方法，精液样本相继用含有酸性变性溶液的琼脂糖微凝胶、双裂解溶液和洗涤液处理，以便可以干燥和随后的染色。这项叫做精子染色质分散(SCD)试验的技术，使用过于腐蚀性的试剂和条件。所述的方法没有给出一致的结果，这使得重复评估变得困难。另一方面，得到图像的质量和对照以及结果的可重复性不足以商业地使用。同时，精子的结构受到了影响，样本中的尾巴消失了。这个问题很重要，因为精子不容易与样本中其他细胞区分，这就会在随后计算具有受损的染色质/DNA的精子的数量上出错。
所以，仍然需要一个能常规地使用和容易地研究动物精液质量的可靠方法，尤其是评估染色质/DNA的完整性。这个方法必须是稳固的，容易实施的，廉价的和可在基础实验室使用。它必须解决上述的问题。同时它必须在实验室间给出一致的结果并适于自动化。
发明目的本发明的目的是一套快速而准确评估动物精子细胞染色质/DNA完整性的方法，它能和并到对兽医或专用于人类生育的任何分析实验室进行的常规活动中。
所以，本发明的一个目的是评估动物精子染色质/DNA完整性的方法，它包括a)用DNA变性溶液处理含精子样本的步骤，b)用裂解溶液抽提核蛋白的单一处理步骤，c)评估精子染色质/DNA完整性的步骤，特征在于裂解溶液不含蛋白变性去污剂并且本质上不破坏精子尾部。
通常，优选步骤a)先于步骤b)。
为了达到发明目标，正如所指出的裂解溶液的选择是严格的。在蛋白变性去污剂中，一定不能使用的是阴离子和阳离子的去污剂，比如SDS，十二(烷)基硫酸钠，烷基苯磺酸盐，乙醇酸氢氧化盐等等。这些是严重破坏膜的去污剂，具有裂解作用并同时在蛋白质变性方面有活性。它们使用在确保完全变性(丧失三维结构)使蛋白质移动的变性电泳上。它们在酸性pH，尤其是革兰氏阳性培养基中特别有活性。它们在去污剂中的活性高。
在本发明方法中，优选使用了一种非离子无蛋白变性去污剂，也就是说一种溶解蛋白质但不使蛋白质变性的去污剂。其中优选的是toctylphenoxypolyethoxyethanol(TritonX-100)，N，N-双(3-D-Gluconamidopropyl)cholamide(bigCHAP)，Brij(r)35P，N-癸酰基-N-甲基葡糖胺，洋地黄皂苷，十二酰基-N-甲基葡萄糖酰胺，七酰基-N-葡萄糖酰胺，支链辛基苯氧基多(乙烯氧基)乙醇(lgepal CA-630)，N-壬酰基-N-甲基葡糖胺，诺乃洗涤剂(Nonidet)P40，N-辛酰基-N-甲基葡糖胺，Span 20溶液，聚山梨醇酯20(Polysorbate 20)(Tween 20)。Triton X-100由于它能提供好的结果和它容易得到是特别优选的。
优选的裂解溶液含有足够离子强度以使在没有变性的情况下促进裂解过程。我们已经确定的一种有效溶液是含1M-3M的氯化钠，0.001M-2M二硫苏糖醇(DTT)，0.001M-2M的2-氨基-2(羟甲基)-1，3-丙二醇(Tris)和0.1％-3％的TritonX-100。含约2.5M的氯化钠，约0.2M的DTT，约0.2M的Tris，约1％Triton X-100，且pH约7.5的溶液尤其合适。
DNA变性溶液优选酸，例如选自盐酸，醋酸，硝酸的组或其混合物的酸。优选是盐酸溶液。
本发明的方法在步骤a)和b)之后含有评估精子染色质/DNA完整性的步骤。虽然可有几个选择方法来评估，优选是用目视。基于这目的，本方法优选在步骤a)和b)之后包括一个样本染色步骤。染色用的是类似于Wright的溶液，它能得到很好的结果，并可以看见精子尾部，以及形成特征晕圈。
在一个优选的改变中，精子存于与悬浮液一样的介质中，优选微凝胶，特别是琼脂糖微凝胶。
本发明还有针对评估动物精子质量的试剂盒，包括a)DNA变性溶液，b)抽提核蛋白的裂解溶液，特征在于裂解溶液不含蛋白变性去污剂并本质上不破坏精子尾部。该试剂盒能够实施上述的本发明方法。
图1.根据本发明的方法，用于定义人类精子晕圈大小的参数。1a类核，相当于完全去除蛋白的精子细胞核，其包括两部分精子细胞核的轮廓，称为核心，在中心位置，和染色质/DNA扩散的外围晕圈。精子的尾部是可见的。1b为了更好的观察和建立晕圈和核心之间的界限而免去滤光。1c核心(a)的较小直径和晕圈(b)的厚度，作为用于建立晕圈不同大小的测量样本，如本发明的方法所阐述。
图2.根据应用本发明方法后得到的晕圈大小定义精子的不同类型。2a大晕圈的精子。2b中等晕圈的精子。2c小晕圈的精子。2d无晕圈的精子。2e无晕圈并退化的精子。2f观察到的上述不同类型精子全域。
图3用DAPI(a-e，荧光蓝)染色后观察到的不同晕圈大小和使用全长人类基因组DNA探针的原位(in situ)杂交信号之间的关系，根据DBD-FISH方法(a’-e’，荧光红)观察DNA片段水平。3a有晕圈和低杂交信号(3a’)的精子。3b有中等晕圈和低杂交信号的精子，尽管该信号稍高于前种情形(3b’)。3c有小晕圈和杂交水平(3c’)显著提高的精子。3d无晕圈和高杂交水平(3d’)的精子。3e退化精子和显示的不规则杂交分布(3e’)。
图4本发明的方法应用于以下种属的精子样本鼠(Mus musculus)，公牛(Bostaurus)，大菱鲆(Scophthalmus maximus)和蚯蚓(Lombricus terrestris)。4a，对应公牛；4b，c，d对应鼠；4e对应蚯蚓；4f对应大菱鲆。
图5取自存在高水平白细胞吞噬精子(leucocytospermia)病人的样本。注意到白细胞中尾部缺失，这使得它们区别于其他的细胞类型。
发明详述正如将要详细描述的，本发明的方法和试剂盒是用片段化的DNA测定精子频率的简单可靠的体系。男性学实验室和协助生育诊所及动物繁殖实验室可应用本方法。它也是非常通用的体系因为可以冷冻样本并在需要的时候进行分析而不导致分析结果的变化。
本发明的方法能评估动物精子和染色质/DNA的完整性，其包括a)用DNA变性溶液处理含精子样本的步骤；b)用裂解溶液抽提核蛋白的单一处理步骤，裂解溶液不含蛋白变性去污剂和本质上不破坏精子尾部；
c)评估精子染色质/DNA完整性的步骤。
除了其他，与现有技术和特别是Fernandez，J.L.et al.Journal ofAndrology，2003，vol.24，No.1，第59-66页比较，本发明方法的主要差别基本在于裂解和染色方面。因而，使用了单一裂解溶液取代了两个连续的裂解溶液。因为它不含SDS(阴离子蛋白变性去污剂)和EDTA(螯合试剂)，所以组分不同。它能与相对温和，中性，非变性去污剂，例如Triton X-100混合。
技术上的这些差别使精子尾部得到了保留。这是至关重要的改进，因为它们的检测是区别类核图像事实上是来自精子还是可能存在的其他细胞类型，例如泌尿生殖系统脱落的细胞，炎症细胞，血液等的数据中不可缺少的一块。使用更小腐蚀性的裂解以及排除SDS的使用使这种保留得以实现。
而且，更温和的裂解获得了不折叠染色质链，更好地保存头部或核心的形态，并获得更高密度染色质物质的扩散晕圈，导致它们被更强烈地染色。结果，不同大小晕圈的差异和视觉效果提高了许多，特别是使用Wright’s染色剂。
另一显著进步是例如SDS蛋白变性去污剂的缺失允许本文所描述的技术和其他能观察到其他细胞成分的技术连续使用。因而，在所获类核上，根据所述方法，可以使用蛋白，膜层(laminin)蛋白类型和其他核蛋白的免疫检测的方法，也能检测核基质相关的RNA，当DNA被延伸时，能尽可能多的保留核结构的量。这在某些精子核结构的研究课题上是重要的。
另一显著进步是低剂量试剂的使用，因此，节约了经济成本。例如，DTT特别昂贵，并且实施例(文章中的四分之一篇幅所描述的)中所述的降低浓度在成本上也是有意义的。
与现有技术相比，对于所表现的所有现象的推断是本专利方法得到了更改善和更可重复的精子类核图像。它可以区别类核是否来自成熟精子或来自其他细胞类型，并且晕圈大小的分类更加精确和可靠。因此，用本专利的方法，鉴定样本DNA片段的水平更加可靠，其意味着它能以低成本常规方便使用。它的应用与不同的实验室相关，与临床定位和在人类样本上，也与研究动物样本的兽医实验室相关。这是非常重要的，因为这是可能用于病人的临床应用的试验。
样本处理的步骤顺序可以以任何顺序，首先用DNA变性溶液，随后用裂解溶液的处理步骤或反之亦然。但是优选在用DNA变性溶液前处理样本然后用裂解溶液，因为这带来更好的结果。在另一变体(裂解后DNA变性)中，带有片段化的DNA的精子行为方式不同。这种情况下，它们分散了染色质/DNA的片段，使晕圈的尺寸变大。甚至用裂解溶液的单一处理足以观察到这种行为，虽然晕圈尺寸辨别不十分精确。
在下面详细描述本发明的方法，以及几种变化和可选步骤。依据本发明描述的基本发明点，本领域技术专家将能理解的其他方法和其他可能性都受本发明的保护。
第一步是制备样本。用本领域常规方法获得样本，并测定样本中精子浓度。适合分析的浓度在0.1×106-20×106个细胞/毫升。如果样本浓度高，用培养基或磷酸盐/盐缓冲溶液(PBS)或类似物稀释调至合适浓度。
根据本发明的方法，精液样本置于一载体上以待处理和便于评估。优选覆盖一层标准琼脂糖的载玻片。这里，在科普林缸或类似物中用蒸馏水制备0.2％-1％的标准琼脂糖溶液。将其覆上一层塑料薄膜，置于微波炉中。微波炉设置功率在300W-1000W之间，例如500W，摇动容器增加琼脂糖的溶解，直至煮沸。本方法用恒温槽操作。当琼脂糖溶液变成完全透明时，将其置于10ml-250ml垂直容器中而制得。这些容器应预先在60℃-100℃下加热，例如70℃，水浴，保持琼脂糖溶液在液体状态。
在载片涂上琼脂糖溶液之前，将其用布擦拭干净消除可能的杂质。载片垂直浸没，用镊子夹在粗糙的地方，保持1-60秒，将其撤出再重新浸没1-10次，直至在载片上形成均匀的涂层。将其水平放置在光滑的表面，例如玻璃或金属，冷却至1℃-15℃，优选4℃。装有载片的盘子在冰箱4℃下放30分钟，直到证实琼脂糖在载片表面凝胶。从冰箱取出盘子，接触盘子的载片表面用吸水纸清洁。接着，载片水平放在干燥器中，温度范围37℃-100℃，直到琼脂糖完全干燥并形成粘附在玻璃上的薄层。这样处理的载片能立即使用或在周围温度(室温)下在密封完好的箱子中贮藏几个月。
为了更便于处理含精子的样本，可以用类似悬浮液这样特征的培养基，例如琼脂糖微凝胶。这种情况下，用蒸馏水制备浓度0.5-2％的低熔/低胶凝琼脂糖溶液。这种琼脂凝胶化在微波炉或恒温槽中进行，再将其保存在置于恒温槽或干燥器的试管中温度在30℃-37℃之间。精液和琼脂糖溶液在Eppendorf管或类似物中小心混合，以这样的一种方式后者浓度在0.3％-1％之间。例如，70微升琼脂糖溶液+30微升样本。重要的是琼脂糖溶液不能高于37℃，以免破坏细胞。
最后，为将样本放在到载体上，涂层载片置于玻璃或金属的光滑冷却表面，温度在1℃-15℃之间，避免形成气泡。建议应用微量加液器取一滴5-200微升的混合物，在液滴上盖上盖玻片。提醒应每个样本做两份，每次使用一个对照样本应用在本技术中。装有载片的盘子在冰箱4℃下放2-30分钟直至产生合适的琼脂糖凝胶。一旦凝胶形成，非常平稳地从同一冰箱中取出载片，并确保微凝胶未损坏。
一旦准备好合适样本进行简单重复操作，将根据本发明的方法用DNA变性溶液处理步骤和裂解步骤对其进行处理以提取核蛋白。
优选的一种变化，有样本的载片首先在水平位置上放入装有变性溶液的容器。DNA变性溶液可以是酸性，例如低浓度的醋酸溶液，硝酸溶液，硫酸溶液，或碱性例如低浓度的氢氧化钠溶液，氢氧化钡溶液，氢氧化钾溶液。优选的一种变化，使用浓度0.01N-0.5N的盐酸溶液，优选0.1N-0.3N，特别优选浓度约0.2N。应在制备此溶液的当天，进行试验和将载片在1℃-37℃温度下在DNA变性溶液孵育1-15分钟，优选18℃-25℃，优选20℃-22℃。
一旦完成这部分操作，再用足够温和不破坏精子尾部的单一裂解溶液裂解样本。为此，每个载片在水平位置上浸入装有裂解溶液的另一容器。
如前所述，以获得不折叠的染色质链，更好保留链头部形态，从而以更高密度染色质物质形成特征晕圈的方式选择裂解溶液。裂解溶液液也必须足够温和以保护精子尾部。这通过保证避免腐蚀性去污剂和蛋白变性剂完成。另外，离子浓度的控制也能调整这种影响。
优选的一种变化，此溶液包括1M-3M的氯化钠，优选2M-3M；0.001M-2M二硫苏糖醇(DTT)，优选0.01M-0.8M；0.001M-2M的2-氨基-2(羟甲基)-1，3-丙二醇(Tris)，优选0.01M-0.4M；0.1％-3％Triton X-100，优选0.5％-1.5％。溶液调至pH6.5-8.5，优选7-7.5。
有其他可选的裂解溶液，或者能改变浓度、时间和溶液孵育温度来保留其功能特征。也有像β-巯基乙醇和其他还原剂的化合物作为DTT的替换。能用其他缓冲溶液替换Tris，例如Hepes，Mops和Pipes。如上所述，能用其他中性去污剂替换Triton X-100。
根据所用溶液和样本类型，制品于裂解溶液中孵育1-60分钟，优选15-35分钟，特别优选时间约25分钟；温度1℃-37℃，优选18℃-25℃，特别优选温度20℃-22℃。
作为前面所述方法的全部替换，变性溶液和裂解溶液的孵育顺序能颠倒。对于精子染色质的影响，有损伤染色质/DNA的精子也与除精子之外的余下细胞区别开。实施例6详细描述了区别。
用DNA变性溶液和裂解溶液处理之后，可以清洗制品以免这些溶液残留。为此，使用尽可能温和的洗液，避免鳌合试剂或去污剂。例如，将它们在水平位置上浸没于装满蒸馏水或缓冲溶液或生理盐水的容器中1-60分钟。
再将样本脱水。为此可以使用高浓度的醇。例如，取出载片，在水平位置上，将其浸入一连串装浓度升高的乙醇的容器中，浓度5％-100％，每个30秒至60分钟，再将制品置于空气中干燥。作为在一连串乙醇中孵育的替换，可以在不同的醇例如甲醇孵育使制品脱水，或者甚至将其在空气中或干燥器中干燥。
一旦干燥，已处理的含精液样本的载片能在储藏箱中周围温度(室温)下保存几个月。这有助于将本发明的处理过程和下一步评估精子染色质/DNA完整性的步骤分开。储藏能使来自同一个体的几个样本在不同时间间隔重复评估。
一旦样本根据本发明被处理，它们将进入评估步骤。如前面所述，有几种可能的方法评估精子染色质/DNA完整性。优点是根据本发明处理的样本有视觉更清楚的晕圈和精子结构被保留下来，特别是尾部的完整性，这能使它们明显区别于其他类型细胞。
优选的一种变化，用于样本的染色剂易于视觉评估。选择合适的染色条件能获得高质量的图像和高度一致的评估结果。有一些染色的策略，依赖于是使用常规清晰视野显微镜还是荧光显微镜。
在清晰视野显微镜下观察染色这种情况下，可用的染色剂是Wright试剂，Giemsa试剂，Orcein试剂，Schiff试剂，Acetic Carmine，噻嗪类和Romanowsky类混合物或上述物质的衍生物(参见Chromosome banding，AT Sumner著，90-91页)。
像Wright那样的染色剂因为样本染色更强烈，特别是晕圈，所以优选。用了这些染色剂，不同大小晕圈的对比和视觉差显著加强。它们也有低成本和任何类型实验室易于获得的优点。它们的使用能让尾部被看到，因为使用荧光显微镜所采用的荧光物染色在DNA中一般看不见这些。重要的是该染色剂非常便于操作以达到适当的染色水平，Diff-Quik或类似物就不行。
其他染色剂，例如Fernandez，J.L.et al.Journal of Andrology，2003，vol.24，No.1，第59-66页所述的Diff-Quik，相当微弱，不能达到晕圈与背景足够的对比。同时，当晕圈很分散时，一般很难观察到它的外围轮廓，有时误认为小晕圈，因此将含完整DNA的精子指定片段分类。这就是说，公开的方法趋向过度评估片断水平，特别是清晰视野染色时。这对于可能应用于个体的试验是相当不便的。所以，显而易见这种进步与技术的可靠性有巨大关系。
样本染色的一种变化，Wright’s溶液(Merck 1.01383.0500)与磷酸盐缓冲溶液例如pH6.88(Merck 1.07924.1000)以1∶30-30∶1(v/v)的比率混合。水平放上一层染色剂，应覆上干燥的微凝胶。达到最适宜对比的染色时间在30秒至60分钟之间。应偶尔吹吹染色层。多余的染色剂轻轻倒出，用流水轻轻洗涤载片并放置干燥。如果染色过多，可在水中以同样强度洗涤。另一可能是用乙醇去染色，干燥，再染色。如果染色微弱，特别在染色质分散晕圈区域，可直接用Wright’s溶液再次染色。
作为替换，可用其他染色剂例如Hemacolor 2(Merck 1.11956)，Hemacolor 3(Merck1.11957)，Giemsa，同族的其他染色溶液也可。
在荧光显微镜下观察染色依赖于荧光滤光板的应用，可在抗衰减的介质(例如，Vector H-1000)中用针对DNA特定的荧光物，DAPI类，Hoechst 33258，溴化乙啶，碘化丙啶等给样本染色。
如果希望得到持久的制品，处理和染色的载片可放在包埋介质中(例如，Entellan；Merck 1.07961)。
最后，评估精子染色质/DNA完整性后区分细胞类型。如前面所述，本发明的方法与现有技术相比，使得评估更容易。
所获的图像可直接视觉分析研究，或者用连接于显微镜平台上的数码相机或类似物得到图像应用数码图像分析软件研究。
最初，应研究每个样本最少500个精子，采用以下基本标准(见图1和图2)1.无染色质分散晕圈的精子(图1)。
2.无染色质分散晕圈的退化精子不显示晕圈，头部碎成颗粒或显示非常微弱的染色(图1)。
3.有小分散晕圈的精子晕圈的厚度小于或等于核心较小直径的1/3(图1)。
4.有中等分散晕圈的精子晕圈的厚度大于核心较小直径的1/3，并小于核心直径(图1)。
5.有大分散晕圈的精子精子的晕圈大于或等于核心较小直径(图1)。
6.其他不属于精子的细胞核。区别于它们的形态特征之一是缺少尾部。
具有片段化的DNA的精子可看作无染色质分散晕圈的精子1，无染色质分散晕圈的退化精子2和有小分散晕圈的精子3。有中等或大染色质分散晕圈和DNA片段的精子得自用DBD-FISH技术的结果(原位杂交DNA断裂荧光检测；Fernandez等，1998；2000；2002；Fernandez and Gonsálvez，2002)。本方法能检验和量化去蛋白的和DNA变性受控的DNA破损细胞核。这种变性从破损末端产生DNA单链，这用荧光物标记的总基因组DNA探针原位杂交检验，用荧光显微镜观察。细胞DNA破损水平越高，杂交探针数量越高和观察到的荧光越高。根据本发明所述方法处理的样本，包含通过变性溶液从存在DNA破损的可能末端产生的DNA单链。因此，使用总基因组DNA探针的杂交强度与精子细胞核中存在的破损数量有关。这样，我们确定无晕圈或晕圈非常小的类核，用DBD-FISH显现强烈标记，这证明了其DNA强烈破碎(图2)。用此探针，类核余下部分显示非常低水平的标记，这通过染色质本身处理与杂交深度相应。
本发明也设计了评估动物精子染色质/DNA完整性的试剂盒。该试剂盒包括DNA变性溶液和抽提核蛋白的裂解溶液，其特征在于裂解溶液不含蛋白变性去污剂并本质上不破坏精子尾部。优选DNA变性溶液和优选裂解溶液如前面所述。
任选的，试剂盒也可包含预处理过的载体，例如用琼脂糖，以及用来制备培养基溶液，其具有与包含样本的悬浮液的相似特征，。例如，能形成微凝胶的低凝胶温度温度(gelling point)琼脂糖溶液。
根据本发明的一种变化，试剂盒使用的内容和说明详述如下试剂盒内容的描述预处理过的载片*含有低凝胶温度的琼脂糖的Eppendorf管，试管(A)装37％HCl的试管，试管(B)装裂解溶液的试管，试管(C)*。组分2.5M NaCl，0.2M DTT，0.2M Tris，1％TritonX-100，pH7.5变性溶液和裂解溶液的处理容器柳叶刀Eppendorf管的浮子*制备如前面所述。
所需材料和仪器清晰视野或荧光显微镜(推荐油浸物镜)4℃冰箱37℃恒温槽塑胶手套玻璃载玻片(18×18mm，22×22mm或24×60mm)
微量加液器4个用于孵育的水平容器蒸馏水70％，90％，100％乙醇使用说明为载片准备样本1)在周围温度(22℃)将裂解溶液置于烧瓶C中2)在培养基或PBS中稀释精液样本至浓度5×106-10×106/毫升。可用新鲜或在液氮中直接冷冻的样本。
琼脂糖微凝胶的制备3)为让琼脂糖沉积在试管底部，在垂直位置轻敲含低凝胶稳定的琼脂糖的Eppendorf管(试管A)。
4)加140微升蒸馏水，避免形成气泡，再次悬浮。
5)给试管A加浮子，让其与盖子水平，使其在90-100℃水中漂浮5分钟，直至琼脂糖溶解。可选择在微波炉中进行融化琼脂糖。
6)将带浮子的试管A移至37℃恒温槽，放置5分钟达到温度。
7)加60微升精液样本到试管A内，再次悬浮。
8)4℃下，将预处理过的载片置于冷却表面(例如，金属或玻璃板)。
9)一旦载片冷却，滴上管试A的细胞悬浮液并盖上玻璃盖玻片，避免形成气泡。应滴11微升，17微升，50微升的液滴，分别用18×18mm，22×22mm或24×60mm盖玻片。
10)将盛有载片的冷却的板放入冰箱，让样本凝胶5分钟。
处理样本11)制备变性溶液。为此，在10微升蒸馏水中加80微升试管B的内容物，混合并放进绿盒子。
12)移开盖玻片，轻轻滑动它们，并立即将载片水平放入变性溶液，周围温度(22℃)下孵育7分钟。
13)用手套，借助柳叶刀提起载片。水平握住它们，将它们水平放入装有10ml裂解溶液(达到室温的试管C)的白色容器中。孵育25分钟。
14)提起载片并将它们水平放入盛有大量蒸馏水的容器中洗去裂解溶液。放置5分钟。
15)将载片水平放入盛有70％乙醇的容器中(2分钟)，再放入90％乙醇中(2分钟)，并最后放入100％乙醇中(2分钟)。
16)在空气中干燥。一旦处理的载片干了，可将它们在周围温度(室温)贮藏于整理柜几个月。
样本染色在清晰视野显微镜下观察染色-将Wright’s溶液与磷酸盐缓冲液(1∶1)混合，滴一层染色剂水平覆盖在干燥的微凝胶上。染色5-10分钟，偶尔吹吹。轻轻倒掉，用流水轻轻洗涤并放置干燥。如果染色过多，可用乙醇退色，干燥，再染色。如果染色微弱，特别是晕圈，可用更多的Wright’s溶液再染色。
-另一种可能是在装有Hemacolor 2溶液(Merck 1.11956)的科普林缸中垂直孵育5分钟，垂直排水10秒，再在另一装有Hemacolor 3溶液(Merck 1.11957)的科普林缸中垂直孵育5分钟。最后，用蒸馏水轻轻洗涤，放置干燥。如果希望得到持久的产品，可用Entallan包埋。
在荧光显微镜下观察染色依赖于荧光滤光板的不同，可在抗衰减的介质(例如，Vectashield Vector H-1000)中用针对DNA特定的荧光物，DAPI类，Hoechst 33258，溴化乙啶，碘化丙啶等给样本染色。
安全和环境避免吸入和接触所用溶液溶液B和溶液C含有盐酸，二硫苏糖醇和Triton X-100。
参考厂家提供的说明书不要将用过的产品丢弃到环境中。遵循中心的指导方针贮藏和处理有毒产品生物样本必须控制潜在的传染。
贮藏和稳定性在周围温度(室温)下贮藏，除了溶液C必须在4℃贮藏。有效期试剂和材料至少6个月内稳定。溶液B和溶液C应垂直位置保存且密封完好。
本发明的应用与不同领域相关。在人类应用上运用是显而易见的。例如，应用于seminogram参数正常的不育个体样本，重复流产的夫妇，协助生育所用样本，由于睾丸根除的协助生育技术中为未来使用而冷冻(低温保藏)的样本。也应用于因肿瘤疾病而接受化疗和/或放射疗法的病人，并在进行输精管切除术前。
用本方法进行的研究和本发明的试剂盒能提高精子捐赠候选人的选择标准，也能帮助精子银行中捐赠样本的定期评估。也能分析年龄增长对精液和生育的质量的影响。它的应用对评估患有可能影响精子完整性疾病的病人是有意义的发热，感染，精索静脉曲张，应激，工作或其他方面暴露于遗传毒物下(杀虫剂，辐射，环境雌激素，等)，激素治疗，或重复暴露于高温下(与热锅炉，陶器，玻璃有关的职业，或交通工具的司机)。也能定期评估这些个体。最后，本发明在基础和临床研究上是有用的。
同样，本发明也用于兽医实验室。可以在不同动物品种例如生殖雄性上，在贮藏样本上，在疾病处理上，在濒临灭绝品种的雄性上和毒剂引起的损伤评估上研究DNA片段水平。
实施例本发明以一些实施例为基础进行描述，实施例更详细地阐述一些前面所述的特征。
实施例1所述方法应用于新鲜精液样本以产生染色质分散晕圈。为此，在PBS中，稀释至浓度10×106/毫升的样本与1％低凝胶温度琼脂糖液体混合，以获得最终浓度为0.7％的后者。微凝胶在载片上凝胶之后，样本22℃下在含0.08MHCl的变性溶液中孵育8分钟，在22℃下在含2.5M NaCl，0.2M DTT，0.2M Tris，1％Triton X-100，pH7.5的裂解溶液中孵育25分钟。用蒸馏水清洗载片5分钟，泡在乙醇中脱水，并在空气中干燥。继而，用总基因组DNA探针在同一细胞上按顺序进行DBD-FISH(原位杂交DNA断裂荧光探测；Fernandez et al.，1998；2000；2002；Fernandez and Gonsálvez，2002)。该方法能能检验和量化去蛋白的和DNA变性受控的浸在琼脂糖微凝胶中的细胞核的DNA破损。这种变性从破损末端产生DNA单链部分，其用发出红荧光的荧光物(Cy3)标记的总基因组DNA探针原位(in situ)杂交检验。细胞DNA破损数目越高，变性溶液产生的DNA单链质量越高，杂交探针数量越高和所获红色荧光越高。根据本发明的方法处理的样本含有通过变性溶液从DNA破损的可能末端产生的DNA单链。因此，使用总基因组DNA探针的杂交强度与精子细胞核中存在的破损数量有关。
统计250个随机取的细胞。用使用两个滤光板的冷冻CCD相机捕捉染色质分散晕圈的DAPI染色图像，观察到蓝色的分散晕圈，同时看到红色的杂交信号。最终目标是建立染色质分散晕圈大小和DNA破损标记水平之间的相互关系。结果显示染色质分散晕圈的相关面积和用DBD-FISH的DNA破损标记的强度成相反关系(表1)。
表1注意到当晕圈相关面积变小时，杂交的总平均密度(MD)增加。
结果，使用我们的方法简单测定染色质分散晕圈的大小，得到对人类精子染色质/DNA完整性的简单直接评估。
实施例2评估协助生育技术所用精子捐赠的辅助方法在协助生育临床上，取10个精液捐赠样本。作为常规精子克(spermogram)的补充，测定这些样本的DNA片段水平。计量500个细胞/人。这样，应用本发明的染色质分散晕圈测试得到结果。包含在琼脂糖微凝胶中的样本，如实施例1所述，于酸性裂解溶液中孵育，清洗，脱水并干燥。这样，不用DAPI染色而用Wright染色剂，用于清晰视野显微方法。为此，将Wright’s溶液与磷酸盐缓冲液(1∶1)混合，滴一层染色剂水平覆盖在干燥的微凝胶上。染色5-10分钟，偶尔吹吹。流水清洗后，放置干燥，观察到类核。结果如表2所示。本组的平均片段水平全部小于20％(15.4±3.1)。
表2晕圈大小各类的百分比分布来自10个精液捐赠者。有片段化的DNA精子的百分比包括小晕圈精子，无晕圈精子和无晕圈退化精子几类的总和。
实施例3不育病人的临床评估在协助生育临床上，取17个精液捐赠样本。作为常规精子克(spermogram)的补充，测定这些样本的DNA片段水平。计量500个细胞/人。如前个实施例，应用本发明的染色质分散晕圈测试得到结果。结果如表3所示。本组的平均片段水平全部大于20％(49.9±20.7)。
表3晕圈大小各类的百分比分布来自17个患者。有片段化的DNA精子的百分比包括小晕圈精子，无晕圈精子和无晕圈退化精子几类的总和。
实施例4用本发明评估影响人类精子的毒物学损伤。用外源和内源试剂损伤。
作为例证性的实施例，进行了一项由一氧化氮(NO)供体化学试剂诱导的DNA损伤的分析研究。为此，正常个体的完全新鲜精液样本的50微升等分在周围温度(室温)下用不同剂量硝普钠(SNP)孵育1小时。处理过的样本再轻轻离心，弃去上清，洗去SNP。在PBS再次悬浮之后，根据本发明所述方法处理样本。
结果如表4所示。观察到NO供体浓度提高时，有损伤染色质/DNA的精子百分比提高。
表4晕圈大小各类的百分比分布来自用不同浓度的能损伤DNA的一氧化氮(NO)供体试剂处理过的精液样本。有片段化的DNA精子的百分比包括小晕圈精子，无晕圈精子和无晕圈退化精子几类的总和。
实施例5使用冷冻精液样本的可重复性分析用分析染色质晕圈分散程度的方法研究两个可能影响样本质量的因素，例如冷冻和稀释。为此，分析来自不同捐赠人的4个新鲜样本和液氮冷冻的等分。每个样本和实验点在两个不同的载片上至少两次直接观察统计不同类型的类核(500个细胞)以进行样本分析。
计数的重复性。相关的内级系数(R)用于在每个载片上进行的不同测量计算。每个细胞类型和用两数平均值的计算的指标结果在0.78-0.92之间变化，R值在0-1之间变化，显示得到高重复性(表5)。
表5冷冻。分析两个因素(保存方法和样本)的变化比较所得结果。显示新鲜处理的样本和液氮冷冻的样本的片段水平没有显著差异(P＞0.05)。冷冻时间看来也不影响有片段化的DNA精子的比例(表6)。
表6结论，直观目视分析所得结果的重复性已被证实。
实施例6用变性溶液和裂解溶液的孵育顺序变化分析人类精子染色质/DNA的完整性此变化中，在精子放入琼脂糖微凝胶中之后，第一步，22℃，将其在试剂盒所述的裂解溶液中在22℃孵育25分钟。然后，将载片在含0.88HCl的变性溶液中在22℃浸泡8分钟。最后，蒸馏水洗涤后，将载片脱水，Wright’s溶液染色，用清晰视野显微镜观察。
用此技术变化，有片段化的DNA精子表现不同。在此，它们分散染色质/DNA片段，增大了晕圈尺寸。
实施例7在不同动物精子样本上应用本方法的结果为了所建议的评估方法的普遍性的目标，选择不同种属的雄性个体进行精子DNA片段水平研究和平行观察它们作为区别性的细胞成分的尾部。精子样本取自以下物种属鼠(Mus musculus)，公牛(Bos taurus)，大菱鲆(Scophthalmus maximus)和蚯蚓(Lombricus terrestris)。所有种属中，应用该技术产生染色质分散晕圈和尾部可被识别，包括有正常DNA的和有片段化的DNA(图4)。精子形态和产生晕圈的类型是每个种属的特征(4a，对应公牛；4b，c，d对应鼠；4e对应蚯蚓；4f对应大菱鲆)。精子的形态，无论它是否含有片段化的DNA，在种属之间都是不同的，在人类身上发现的也不同。所有的情况中，染色质分散是平行的，与人类精子样本中发现的是可比的。换句话说，产生不同大小的染色质分散晕圈并可观察到精子尾部。
不同种属晕圈的形态和大小及所得结果如下公牛的情况，用5个观测者分析独立样本。这样，发现每个个体有片段化的DNA精子细胞核百分比不同，但是每个观测者得到的百分比之间没有发现不同(表7)。
表7鼠的情况，用两种不同的染色剂，一种标准的(M1-32NNC)，另一种同源的(M2-32BC)。标准染色剂(7.1)和同源染色剂(25.1)显示不同类型晕圈的百分比明显不同(表8)。
表8大菱鲆的特殊情况，有大染色质分散晕圈和小核心的精子最后可区别于有小分散晕圈和大核心的精子和其他无分散晕圈的。结果如表9所示。
表9蚯蚓的情况，晕圈的动态发生相似于前面所述的情况，在此情况中也能很好地区别精子头部和尾部。2个研究个体(一个幼小，一个成熟)含片段化的DNA精子的估计百分比分别为15％和22％。此情况下，精子头部出现部分晕圈构成，这在研究阶段具百分比分别为15％和22％。此情况下，精子头部出现部分晕圈构成，这在研究阶段具有普遍意义(见图4e)。
实施例8观察染色质分散晕圈，精子尾部和白细胞同样的细胞学制备。评估白细胞吞噬精子(leucocytospermia)对精子样本DNA完整性的影响。
白细胞吞噬精子是导致精液样本白细胞反常增加(＞5×106/毫升)的不受欢迎的侵袭过程。在10％-20％的不育男性中检验到白细胞吞噬精子。存在于精液中的嗜中性粒细胞和巨噬细胞似乎能产生带来氧化应激的ROS(活性氧类)，导致精子DNA损伤(Omu et al.，1999；Erenpreiss et al.，2002；Henkes et al.，2003)。事实上，白细胞吞噬精子与分析精子质量所使用的典型参数的不同反常有关。例如，没有白细胞吞噬精子的个体样本中仅47％出现反常精子，当存在白细胞吞噬精子时，这个百分比上升至88％(www.clevelandclinic.org)。
在5个患有不同病原的高水平l白细胞吞噬精子病人(前列腺炎和衣滴虫、细菌试剂引起的感染)的样本中，使用本技术进行研究以清楚区别精液样本中白细胞百分比和同一样本精子DNA片段水平。当样本接受同样处理时，两种细胞类型之间的区别明显，有片段化的DNA精子和没有片段化的DNA精子显示尾部是区别特征。白细胞中尾部的缺失能让我们将它们区别于其他细胞类型(图5)。
这样，每个样本的白细胞数和精子DNA片段水平之间能建立直接关系，表10显示5个患有不同病原白细胞吞噬精子病人的精液样本的白细胞水平和有正常DNA(大和中等；L/M)及片段化的晕圈(小晕圈和无晕圈(S/WH)精子的百分比。
表10参考文献
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权利要求
1评估动物精子和染色质/DNA完整性的方法，包括a)用DNA变性溶液处理含精子样本的步骤，b)用裂解溶液抽提核蛋白的单一处理步骤，c)精子染色质/DNA完整性的评估步骤特征在于所述的裂解溶液不含蛋白变性去污剂并本质上不破坏精子尾部。
2根据权利要求1所述的方法，特征在于步骤a)先于步骤b)，或所述方法仅进行b)和c)。
3根据权利要求1或2所述的方法，特征在于裂解溶液包括非离子非蛋白变性去污剂。
4根据权利要求1-3中任一项所述的方法，特征在于所述的非离子去污剂选自包括下列的组toctylphenoxypolyethoxyethanol(Triton X-100)，N，N-双(3-D-Gluconamidopropyl)cholamide(bigCHAP)，Brij(r)35 P，N-癸酰基-N-甲基葡糖胺，洋地黄皂苷，十二酰基-N-甲基葡萄糖酰胺，七酰基-N-甲基葡萄糖酰胺，支链辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(lgepal CA-630)，N-壬酰基-N-甲基葡糖胺，诺乃洗涤剂P40，N-辛酰基-N-甲基葡糖胺，Span 20溶液，聚山梨醇酯20(Tween 20)及其混合物，优选Triton X-100。
5根据权利要求1-4中任一项所述的方法，特征在于所述裂解溶液含1-3M的氯化钠，0.001-2M的二硫苏糖醇(DTT)，0.001-2M的2-氨基-2(羟甲基)-1，3-丙二醇(Tris)和0.1％-3％Triton X-100。
6根据权利要求1-5任一项所述的方法，特征在于所述裂解溶液含2.5M的氯化钠，约0.2M的DTT，约0.2M的Tris，约1％Triton X-100，且pH约7.5。
7根据权利要求1-6任一项所述的方法，特征在于所述DNA变性溶液是酸。
8根据权利要求7所述的方法，特征在于所述DNA变性溶液含有选自盐酸，醋酸，硝酸的组或其混合物的酸。
9根据权利要求8所述的方法，特征在于所述DNA变性溶液含有盐酸。
10根据权利要求1-9任一项所述的方法，特征在于步骤a)和b)之后有样本染色步骤。
11根据权利要求10所述的方法，特征在于用Wright型溶液染色。
12根据权利要求1-11任一项所述的方法，特征在于含精子的样本包含在与悬浮液相似的介质中，优选在微凝胶中。
13根据权利要求12所述的方法，特征在于含精子的样本包含在琼脂糖微凝胶中。
14评估动物精子质量的试剂盒，所述试剂盒包括a)DNA变性溶液，b)抽提核蛋白的裂解溶液，特征在于所述裂解溶液不含蛋白变性去污剂并本质上不破坏精子尾部。
15根据权利要求14所述的试剂盒，特征在于所述裂解溶液包括1-3M的氯化钠，0.001M-2M的二硫苏糖醇(DTT)，0.001M-2M的2-氨基-2(羟甲基)-1，3丙二醇(Tris)和0.1％-3％的Triton X-100。
全文摘要
本发明描述了一种测定动物精子中DNA片段的方法。尤其涉及评估精子染色质/DNA完整性的方法用变性溶液处理样本，再任选一种染色剂，接着用不含蛋白变性去污剂的裂解溶液处理，再任选一种染色剂，以及评估染色质/DNA的完整性。本发明还涉及评估动物精子质量的试剂盒，该试剂盒包括DNA变性溶液和不含蛋白变性去污剂的裂解溶液。
文档编号C12Q1/68GK1934272SQ200580003184
公开日2007年3月21日 申请日期2005年1月26日 优先权日2004年1月26日
发明者冈萨雷斯博润革·杰米, 佛男得兹加西亚·琼斯鲁伊斯, 古亚尼斯维拉伊斯库萨·维森特 申请人:马德里自治大学