防止aav载体聚集的组合物和方法

专利名称：防止aav载体聚集的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及制备和存储防止聚集的AAV病毒粒子的组合物和方法。
背景技术：
重组腺相关病毒(rAAV)是用于人基因转移的远景载体。Grimm，D.和Kleinschmidt，J.A.(1999)Hum Gene Ther.102445-2450；High，K.A.(2001)Ann.N.Y.Acad.Sci.95364-67；Pfeifer，A.和Verma，I.M.(2001)Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.2177-211。AAV是细小病毒科依赖病毒属的成员。AAV血清型2(AAV2)由编码两侧为末端反向重复(ITR)序列的复制(rep)和壳体化(cap)基因的4680个核苷酸的单链DNA分子构成。Bers，K.I.(1996)Fields Virology(B.N.Fields等编辑)，pp.2173-2197。Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia。基因组由三个壳体蛋白(VP1、VP2和VP3)包装，壳体蛋白是cap基因产物的氨基末端变体。所得到的二十面病毒颗粒具有～26nm的直径。已经报道了AAV2高度溶解的晶体结构。Xie，Q等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9910405-10410。
纯化AAV2病毒颗粒的溶解度是有限的，已经描述了AAV2颗粒聚集是一个问题。Croyle，M.A.等(2001)Gene Therapy 81281-1290；Huang，J.等(2000)Mol.Therapy 1S286；Wright，J.F.等(2003)Curr.Opin.Drug Disc.Dev.6174-178；Xie，Q.等(2004)J.Virol.Methods 12217-27。在常用的缓冲盐水溶液中，1013颗粒/mL的浓度产生显著的聚集，且在更高的浓度聚集增强。Huang和合作者报道了AAV载体经受浓度依赖性的聚集。Huang，J.等，(2000)Mol.Therapy 1S286。Xie和合作者(Xie，Q.等(2004)J. Viral.Methods 12217-27)类似地报道了在超过0.1mg/ml的浓度，AAV2载体需要提高浓度的盐来防止聚集。AAV2载体在常用中性缓冲溶液如磷酸盐-和Tris-缓冲盐水中颗粒浓度超过1013颗粒/mL产生聚集。这对应于～0.06mg/mL的蛋白质浓度，且强调这些条件下AAV2的低溶解度。对于使用柱色谱技术纯化的载体，有效的载体浓度极限甚至更低，因为共同纯化了过量的空壳体并归因于颗粒浓度。
颗粒聚集对于腺病毒载体同样是显著的且是没有完全解决的问题。最近报道了最新建立的腺病毒参照材料(ARM)的稳定性。Adadevoh，K.等(2002)BioProcessingl(2)62-69。通过动态光散射、光子关联能谱法和外观来测量配制于pH8.0的20mM Tris，25mM NaCl和2.5％甘油中的参照材料的聚集。观察三次冻-融循环或非冰冻存储后载体聚集的可变水平，形成使用ARM的限制性实施方案。
聚集可能导致纯化过程中的损耗和纯化载体制剂测试中的不一致性。将AAV2载体在体内给药于特定部位，如中枢神经系统，可能需要小体积的高度浓缩载体，且最大可获得的剂量受到低载体溶解度的限制。
载体聚集似乎还影响体内给药后的生物分布，并导致给药后对载体的不利免疫应答。如对于蛋白质已经报道的(Braun，A.等，(1997)Pharm.Res.141472-1478)，通过将载体对准抗原递呈细胞并诱导对壳体蛋白和转基因产物提高的免疫应答，载体的聚集提高了免疫原性。临床前(Chenuaud，P等(2004)Blood 1033303-3304；Flotte，T.R.(2004)Human Gene Ther.15716-717；Gao，G等，(2004)Blood 1033300-3302)和临床(High，K.A.等，(2004)Blood 104121a)研究中对AAV载体免疫应答的报道说明了需要解决引起载体免疫原性的所有因素。
表征纯化载体的测试实验方案似乎也受到载体聚集的影响。报道了载体感染性滴定度的测定对载体聚集高度敏感。Zhen，Z.等(2004)Human Gene ther.15709-715。重要的关注是载体聚集在体内给药后具有不利后果，因为它们的转导效率、生物分布和免疫原性不同于单体颗粒。例如，将AAV载体脉管内传送至肝细胞需要穿过肝窦状隙网状内皮细胞层的载体。这些网状布局具有50至150nm的半径(Meijer，K.D.F.和Molema，G(1995)Sem.Liver Dis.15206)，预测该半径使得单体AAV载体(直径～26nm)能够通过，但阻止较大载体聚集物的通过。小鼠体内生物分布研究中，用荧光分子Cy3标记的聚集AAV2载体在脉管传送后隔绝于肝巨噬细胞中。Huang，J.等(2000)Mol.Therapy lS286。
对于基于病毒的基因转移载体的制剂研发是相对近期的研究领域，且只有少数描述最佳化AAV载体制剂和稳定性的系统努力的研究得到了报道。Croyle，M.A.等(2001)Gene Therapy 81281-1290；Wright，J.F.等(2003)Curr.Opin.DrugDisc.Dev.6174-178；Xie，Q.等(2004)J.Virol.Methods 12217-27。与最小化载体制剂改变的临床前和临床应用相适的定义制剂是一贯获得高度载体安全性和功能特征的重要要求。如对于蛋白质治疗公知的(Chen，B.等(1994)J. Pharm.Sci.831657-1661；Shire，S.J.等(2004)J. Pharm.Sci.931390-1402；Wang，W.(1999)Int.J. Pharm.185129-188；Won，C.M.等，(1998)Int.J.Pharm.16725-36)，载体稳定性的重要方面是制备和存储过程中的稳定性，载体聚集是需要彻底解决的问题。载体聚集导致载体纯化过程中的损耗，尽管可以通过过滤来除去聚集物，但当生产用于临床前和临床研究的载体时，产量损耗导致较高的成本和产量限制。甚至在过滤除去聚集物后，在缓冲盐溶液中的浓缩AAV2载体制剂中形成新的聚集物。
存在对防止病毒颗粒聚集的用于纯化和存储AAV2载体如rAAV2的改良制剂和方法的需要。

发明内容
通过本发明满足了本领域中的上述这些和其它需要，本发明提供了用于制备和存储AAV载体的高离子强度溶液，该AAV载体保持高感染性滴定度和转导效率，甚至在冻-融循环后也是如此。
在本发明的一个方面中，涉及防止病毒粒子制剂中病毒粒子聚集的方法，该方法通过加入赋形剂来获得足以防止聚集的离子强度。本发明的另一方面中，涉及具有足以防止聚集的离子强度的病毒粒子组合物。
在本发明的一些实施方案中，所述离子强度至少为约150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、600mM、700mM或更高。在一些实施方案中，使用含有一种或多种多价离子例如柠檬酸盐、硫酸盐、镁或磷酸盐的赋形剂来获得这些离子强度。
在其它一些实施方案中，将病毒粒子制剂的摩尔渗透压浓度维持于接近等渗水平，例如，200mOsm、250mOsm、280mOsm、300mOsm、350mOsm或400mOsm，即使离子强度足够高来防止病毒粒子聚集。
在一些实施方案中，病毒粒子是腺相关病毒(AAV)的病毒粒子，例如AAV-2。
在本发明方法的其他一些实施方案中，用核酸酶例如Benzonase来处理病毒粒子的制剂。在进一步的实施方案中，将核酸酶处理与赋形剂的加入相结合，其中该赋形剂的加入获得足以防止聚集的离子强度。
在本发明的一些实施方案中，将表面活性剂PluronicF68加入病毒粒子制剂中，例如至0.001％。在一个实施方案中，组合物包括纯化的病毒颗粒、10mM Tris pH8.0、100mM柠檬酸钠和0.001％的PluronicF68。
在一个实施方案中，可以将AAV载体作为本发明的组合物来存储，浓度超过1×1013vg/mL，例如，2×1013、3×1013、4×1013、5×1013和高达6.4×1013vg/mL，而没有显著聚集。在一些实施方案中，使用本发明的方法和组合物存储的AAV载体在4℃存储5天时没有呈现显著的聚集。在其他实施方案中，作为这样组合物存储的AAV载体在-20℃或-80℃的一个、五个、十个或更多冻-融循环后没有呈现显著的聚集。
在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物存储的病毒粒子制剂所呈现的平均颗粒半径(Rh)(如通过动态光散射来测得的)表明没有发生病毒粒子的显著聚集。在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物存储的病毒粒子制剂呈现高于约15nm、20nm或30nm的平均颗粒半径(Rh)。
在一些实施方案中，根据本发明的方法和组合物存储的病毒粒子制剂在通过0.22μm滤器的过滤后回收的病毒粒子高于约85％、90％或95％。
在再一方面，本发明涉及含有本发明高离子强度制剂的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包括预先混合的赋形剂溶液。在另一实施方案中，所述试剂盒包括两种或更多种分开的本发明高离子强度组合物的部分，通过使用者来混合。在一些实施方案中，所述试剂盒包括柠檬酸钠、Tris和PluronicF68。在其他实施方案中，所述试剂盒进一步包括制备组合物或进行本发明方法的说明书。


图1A和1B呈现的数据表明了AAV2-FIX颗粒聚集作为各种缓冲组合物的摩尔渗透压浓度(图1A)或离子强度(图1B)的函数。通过实施例1的方法2来制备AAV2-FIX载体。用10mM pH7.5的磷酸钠缓冲的不同浓度的赋形剂稀释载体后通过动态光散射(DLS)来测量平均颗粒半径。所述赋形剂包括氯化钠( )、柠檬酸钠( )、磷酸钠( )、硫酸钠( )、硫酸镁( )和甘油( )。
图2呈现了AAV2-FIX聚集作为纯化方法的函数的数据。用10mMpH7.5磷酸钠缓冲的不同浓度的氯化钠稀释载体后通过动态光散射(DLS)来测量平均颗粒半径。通过方法1(双CsCl梯度)( )；方法2(阳离子交换色谱)( )；方法2加核酸酶消化( )；或方法3(色谱加上一个CsCl梯度)来纯化载体。纯化方法1-3描述于实施例1中。
图3呈现了在高离子强度制剂( )或对照制剂( )中制备并存储的rAAV2-AADC病毒粒子转导的D7/4细胞转基因表达的数据。转导后72小时通过ELISA来测量AADC的浓度(每个数据点重复三次)。误差范围表示标准偏差。
具体实施例方式
通常在载体的浓缩制剂中观察到AAV2载体聚集并影响纯化回收以及体内的功效和安全性。因此，对于发展AAV2载体的重要目的是鉴定制备浓缩储液时防止载体聚集的方法和制剂。
除非另外指出，如在此所用的术语“载体”指的是重组AAV病毒粒子或病毒颗粒，而不像在其他内容中通常使用的“载体”那样还指非病毒DNA分子(如质粒)。
本发明部分基于如下观察溶液离子强度是AAV载体聚集中的重要参数，意味着涉及聚集过程中病毒颗粒之间的离子相互作用。升高的离子强度提高了AAV2载体的溶解度与带电赋形剂性质无关的这一观察支持了溶液离子强度本身(而非涉及特定离子物质的相互作用)是相关的物理-化学参数的假设。防止在此研究的载体颗粒浓度的聚集需要至少200mM的极限离子强度。
实际应用中，常用的缓冲盐溶液具有的离子强度不足以防止浓度超过1013颗粒/mL的AAV2载体的聚集。已知高盐浓度提高AAV2载体的溶解度(例如，从梯度回收的高度浓缩AAV2载体通常在浓缩CsCl中保持溶解)。然而，用于临床前和临床研究的最佳制剂应当接近于等渗(280-400mOsm)，尤其是对于将载体体内给药于高渗溶液稀释缓慢的部位。在本发明的实施方案中，将离子强度和电荷价的指数关系用于发展具有高离子强度的等渗制剂。通常用作人非肠道制剂中赋形剂的具有多电荷价的盐物质(例如，硫酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)以等渗浓度使用时可以提供防止AAV2载体聚集需要的离子强度水平。尽管等渗(150mM)氯化钠具有150mM的离子强度，该数值不足以维持高载体浓度下AAV2溶解度，等渗柠檬酸钠具有～500mM的离子强度，可以支持至少6.4×1013vg/ml的AAV2载体浓度而没有聚集。
不希望受到理论的限制，AAV2颗粒的低溶解度是由高度对称性质结合聚集物中临近颗粒之间互补电荷部分的稳定效果而引起的。基于AAV2晶体结构的表面电荷密度(Xie，Q.等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9910405-10410)揭示了病毒表面上正电荷和负电荷的模式。之前的报道表明AAV2载体聚集是pH依赖性的，其假设了具有带电侧基的氨基酸涉及颗粒间结合。Qu，G等，(2003)Mol.Therapy7S238。这些报道假设了如果带电的氨基酸侧链涉及载体聚集，高浓度的游离氨基酸可以阻止载体颗粒的相互作用。然而，我们已经发现具有带电侧链的氨基酸在防止AAV2载体聚集中是无效的，超过它们对离子强度的贡献。
还发现通过纯化载体颗粒的有效核酸酶处理降低了但没有防止低离子强度的载体聚集。纯化过程早期的消化(澄清的HEK细胞裂解物)在载体纯化后没有降低聚集。大概是由于酶与核酸底物较高的比例，已经纯化的病毒粒子的消化更有效。解释这些结果的一种机理是结合载体表面的残余核酸杂质(例如，宿主细胞和质粒DNA)可以桥接至临接病毒颗粒上的结合位点并因此引起聚集。已经报道纯化的AAV2载体(无空壳体)含有约1％的非载体DNA。Smith，P.等，(2003)Mol.Therapy 7S348。尽管报道了这种非载体DNA＞50％是核酸酶抗性的，且包装于壳体颗粒中，一些杂质DNA是核酸酶抗性的且似乎与纯化的载体颗粒表面相连。有效核酸酶处理可以降低载体聚集的观察表明不高于每个载体颗粒～25个核苷酸平均水平的与载体表面相连的核酸引起AAV载体聚集。
总之，在AAV2载体纯化和最终的配制过程中高离子强度溶液的使用，和残余载体表面DNA的有效去除是获得用于临床前和临床研究中的高度浓缩AAV2溶液的两种有效策略。高离子强度溶液和核酸酶处理可以结合使用或分开使用。尽管使用AAV2载体获得了数据，本发明的组合物和方法对于其他AAV血清型/变体或其他病毒载体如腺病毒、晶状体病毒和逆转录病毒也是有用的。
AAV聚集为赋形剂浓度的函数进行初始筛选实验来阐明AAV载体聚集的机理并鉴定可以降低/防止聚集的赋形剂的类别。载体聚集可以由低浓度缓冲液(20mM磷酸钠，pH7.2)的中性缓冲盐水中载体的稀释(5倍)引起。使用该“稀释-应力”方法来筛选赋形剂以鉴定包括于稀释剂中时能够防止载体聚集的赋形剂。为了筛选，通过动态光散射(DLS)来测量聚集。所研究赋形剂的类别包括选定的无机盐、氨基酸、不带电的碳水化合物和表面活性剂。结果呈现于表1中。
表1使用稀释-应力方法来筛选防止AAV2载体聚集的赋形剂

NIA没有聚集抑制如表1中所说明的，当以足够的浓度存在时，带电的赋形剂(无机盐和氨基酸)防止了聚集。然而，防止载体聚集所需要的盐浓度是不同的，对于硫酸镁为180mOsm，对于氯化钠为320mOsm。氨基酸精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸在200mOsm没有防止聚集，但是赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸在300-320mOsm防止了聚集。精氨酸、甘氨酸和组氨酸在200mOsm以外的浓度没有测试。当以高达5％w/v的浓度存在时，选定的碳水化合物对载体颗粒聚集没有效果。例如，5％w/v的甘油(543mOsm)没有防止聚集。表面活性剂聚山梨酸酯80(1％w/v)和PluronicF68(10％w/v)使用“稀释-应力”方法相似地对聚集没有效果。
AAV聚集作为摩尔渗透压浓度和离子强度的函数图1A和1B表明了载体聚集随各种盐浓度函数的更详细分析的结果。图1A表明了载体聚集为选定赋形剂摩尔渗透压浓度的函数。对于带电的物质，观察到AAV2载体聚集浓度依赖性的抑制。多价离子的盐在低于单价氯化钠的浓度获得相似的聚集抑制程度。例如，200mOsm的硫酸镁防止了聚集，而氯化钠需要350mOsm来获得相似的效果。柠檬酸钠、硫酸钠和磷酸钠在防止载体聚集的效力中处于中间。
尽管图1A和表1的结果表明高达5％浓度的甘油和特定的糖对低离子强度引起的AAV2载体聚集没有效果，数据没有排除甘油浓度高于5％时AAV2溶解度的提高。例如，Xie和合作者报道了25％(w/v)的甘油能够使低离子强度溶液中的AAV2浓度达到非常高的浓度(4.4至18×1014颗粒/mL)。Xie，Q等，(2004)J. Virol.Methods 12217-27。
对于每种赋形剂，除了摩尔渗透压浓度以外，图1B显示了图1A的数据作为所计算离子强度函数的曲线。图1B证明了当离子强度是～200mM或更高时防止了载体聚集，与使用哪种盐无关。这些数据表明溶液的离子强度(μ)(其为取决于溶质浓度和电荷价两者的参数)是影响聚集的主要因素。
本发明实施方案中防止聚集有用的离子强度包括，例如，250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、600mM、700mM或更高的离子强度。在本发明的方法和制剂中优选多价离子来获得这些离子强度，如二价、三价、四价、五价离子和甚至更高价的离子。本发明溶液和制剂中的pH缓冲剂可以是磷酸盐、Tris或HEPES(或其他Good’s缓冲剂)，但可以使用任何其他的合适pH缓冲剂。优选实施方案中，选择多价离子和缓冲剂与目标组织相容用于待制备的载体。
本发明方法和组合物中多价离子的使用使得可以形成高离子强度但摩尔渗透压浓度相对低的组合物。本发明的高离子强度组合物可以接近等渗，并可以是，例如，约200mOsm、250mOsm、280mOsm、300mOsm、350mOsm或400mOsm，尽管其他摩尔渗透压浓度对于组合物的一些用途也是可接受的。
AAV聚集作为AAV纯化方法的函数期望使用不同方法(例如，密度梯度纯化对离子交换色谱)纯化的重组AAV2具有不同的杂质特征。图2表明了对于纯化方法不同的几种AAV制剂，载体聚集作为离子强度的函数。纯化方法描述于实施例1中。使用氯化钠来改变离子强度。通过双氯化铯梯度超速离心(方法1)，通过阳离子交换柱色谱(方法2)，或通过结合的柱和氯化铯梯度超速离心(方法3)纯化的AAV2-FIX载体各自证明了随着离子强度降低相似的聚集响应。相反，通过柱方法纯化然后接受核酸酶消化步骤(方法2+核酸酶)的AAV2-FIX表明在低离子强度时聚集降低。
制备规模的AAV聚集表1以及图1A、1B和2中的数据涉及分析级的载体聚集，使用DLS来测量聚集。相反，表2表明了升高的离子强度和核酸酶处理对更大规模AAV2载体聚集的效果，使用诱导和定量与制备级载体纯化相关的载体聚集的方法。实施例2中提供了实验的详细内容。将纯化的AAV载体渗滤至各种离子强度的溶液中，降低体积来获得高载体浓度，然后测量通过0.22μm滤器过滤后的载体回收来测量聚集。将通过第二个CsCl梯度离心步骤的方法1纯化的AAV2-AADC载体单个集合的等份试样(91mL中1.8×1015vg，1.8×1013vg/mL，～3MCsCl中)用作渗滤实验中的起始原料。使用空心纤维的切向流过滤用于渗滤，因为其是可升级的且仍然能够制备体积(分钟.1.4mL)，并因此能够制备AAV浓度，期望在中性缓冲盐水中在该浓度聚集。
在实验1中，将三个空心纤维装置用于渗滤制剂CF、TF1或TF2中的AAV2-AADC载体，且将体积减少至2.5×1013vg/mL的目标。参见实施例2。然后将样品通过0.22μm的滤器进行过滤。结果显示于表2中。对于升高离子强度的制剂TF1(95±7.4％)和TF2(93±7.4％)的载体回收(“收率％”)显著高于使用对照制剂CF(77±6.6％)所回收的。
表2处理级的AAV载体回收

在实验2中，将AAV2-AADC在CF或TF2中浓缩至较高的目标值(6.7×1013vg/mL)。使用TF2(96±4.4％)的载体回收再次显著高于使用CF所回收的(59±6.0％)。在所用测试的可变性内，在使用TF2的两个目标浓度全部回收了载体，表明聚集得到了防止。相反，在使用CF的两个目标浓度观察到显著聚集，且聚集的程度(即，0.22μm过滤后的损耗)在较高的目标载体浓度较高。在另一实验中(未显示)，在实验2的浓缩后但在0.22μm过滤步骤之前取出50μL的AAV2载体样品，并通过光学显微镜来检测。CF中浓缩的载体含有明显量的可见物质(未显示)，然而在TF2中浓缩的载体中没有看到这样的物质。
实验3研究了纯化载体预先核酸酶消化对聚集的效果。核酸酶消化不存在时，CF中AAV2-AADC回收为68±11％，与实验1和2中的回收相似。相反，用核酸酶处理纯化的载体，然后在CF中浓缩，获得较高的回收(91±12％)。这些制备级结果反映出图2中所示的使用“稀释-应力”(分析级)方法的核酸酶消化的相同结果。
表2中呈现的结果证明了本发明的方法和组合物提高了AAV载体的回收。例如，本发明的各种实施方案中，将回收从低于约80％提高至至少约85％、90％、95％或更高。
存储或冻-融循环后的AAV稳定性和活性Croyle和合作者报道了在磷酸钠缓冲液中多次冻-融循环后AAV和腺病毒滴定度的显著损耗，并证明了冻-融循环中通过磷酸钾提供的较好的pH缓冲防止了滴定度损耗。Croyle，M.A.等(2001)Gene Therapy81281-1290。我们使用磷酸钠的冻-融稳定性研究的结果支持这些发现。我们发现尽管150mM的磷酸钠提供了足够的离子强度来防止浓缩AAV2-AADC载体在制备和非冷冻存储过程中的聚集，但是-20℃或-80℃的单次冻-融循环导致聚集。
在如下的本发明缓冲剂中测试存储或冻-融(F/T)循环后的AAV稳定性。将CF、TF1和TF2中制备的浓缩载体(表2，实验1)接受短的稳定性研究来调查研究是否在冷冻存储过程中或在多次冻-融(F/T)循环后将发生聚集。使用未稀释的样品通过DLS来测量聚集，且认为Rh值＞20nm表示产生了一定水平的聚集。
表3AAV2载体的稳定性

Pre0.2μm过滤后立即测量的DLS半径。
载体浓度(vg/mL)CF1.93E13，TF12.38E13，TF22.33E13。
TH由于强烈的聚集，信号强度太高以致不能测量。
如表3所示，CF中制备的AAV2-AADC载体在4℃存储5天后以及在-20℃或-80℃的一次或多次F/T循环后显示出一些聚集。对于TF1中制备的载体，在4℃下5天后没有产生聚集，但是在-20℃或-80℃的单次F/T循环后产生聚集，如通过DLS所示的信号强度太高以致不能测量。这些样品的肉眼观察表明了轻微的混浊，这与聚集相一致。对于TF2中制备的载体，在4℃或在-20℃高达10F/T后没有观察到聚集。在-80℃下在5和10F/T循环后观察到一些聚集。
如下测量TF2中存储或F/T循环后的AAV活性。如上所述，高离子强度的等渗制剂TF2有效地防止了浓缩和存储过程中的载体聚集，并因此表明是用于进一步研究的远景候选物。重要的问题是高离子强度TF2中的载体制备和存储是否不利地影响了其功能活性。为了测试这个，进行了测试来测量在TF2中制备并存储延长时间段的载体的感染滴定度和转导效率。
对于感染性，使用了能够检测单次感染事件的高度灵敏感染性测试。Zhen，Z等，(2004)Human Gene Ther.15709-715。以6.4×1013vg/mL的浓度在TF2中制备AAV2-AADC。在4℃存储45天后，与对于参照载体来说16vg/IU的值相比较，制剂具有的载体基因组对感染单位的比例为13(vg/IU)。设定该测试为报道的可变性(RSD～50％)，该差异不是显著的。
通过D7/4细胞转导后的ELISA测量AADC蛋白的表达来测试转导效率。图3显示了对于10至105vg/细胞的载体输入，TF2中制备的载体和参照对照之间没有显著差异。总而言之，这些数据表明高离子强度TF2中的AAV2载体制备和存储对载体感染性或转导效率没有不利影响。
结论测定离子强度(μ)对病毒颗粒相互作用的影响来阐明载体聚集的机理。中性缓冲等渗盐水的离子强度(μ＝150mM)不足以防止通过梯度超速离心或通过阳离子交换色谱纯化的浓度超过～1013颗粒/mL的AAV2载体的聚集。包括浓度高达5％(w/v)的糖(山梨糖醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘油)或表面活性剂吐温80(1％)或PluronicF68(10％)没有防止载体颗粒的聚集。
相反，在纯化和最终载体配制过程中使用升高的离子强度溶液(μ＞200mM)时载体颗粒保持溶解。使用用于体内给药的等渗赋形剂浓度的升高的离子强度溶液用多价离子盐来制备，包括柠檬酸钠、磷酸钠和硫酸镁。含有10mM Tris、100mM柠檬酸钠、0.001％PluronicF68、pH8.0(μ～500mM)的等渗制剂能够使AAV2-AADC载体的浓度达到6.4×1013vg/mL，在制备过程中和-20℃十次冻-融循环后观察到没有聚集。参见以下的表3和附带的讨论。在升高的离子强度制剂中制备并存储延长时间段的AAV2-AADC载体保持高的感染性滴定度(13IU/vg)和转导效率。
纯化AAV2载体的核酸酶处理降低了载体聚集的程度，载体表面核酸杂质涉及颗粒间相互作用。因此，有效除去载体表面残余核酸的纯化方法结合使用离子强度升高的等渗制剂，是防止AAV2载体聚集的有用方法。
实施例1AAV纯化方法如之前所述的(Matsushita，T.等(1998)Gene Therapy 5938-945)通过HEK293细胞的三次转染来产生表达人凝血因子IX(FIX)或人氨基酸脱羧酶(AADC)的AAV2载体，进行了改进。对于大规模的制备，在850mm2的摇瓶(Corning)中培养并转染细胞。通过三种方法中的一种来纯化载体。
在纯化方法1中，从Matsushita改进，通过离心(1000g，15分钟)来收集摇瓶中的转染HEK293细胞，重悬浮于10mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH7.2中，并通过三次冻/融循环来裂解(可替换的乙醇/干冰浴和37℃水浴)。通过离心来澄清细胞裂解物(8,000g，15分钟)。然后通过加入10mM磷酸钠，pH7.2将上清液稀释至200mM NaCl并用Benzonase(Merck，纯度级1；200U/mL，1h，37℃)消化。使用1M储液将裂解物调节至25mM CaCl2，并在4℃孵育一小时。
将混合物离心(8,000g，15分钟)，并收集含有载体的上清液。为了从澄清的细胞裂解物沉淀病毒，加入聚乙二醇(PEG8000)至8％的终浓度，将混合物在4℃孵育三小时，然后离心(8,000g，15分钟)。将含有载体的丸粒通过混合重悬浮于0.15M NaCl、50mM Hepes、25mMEDTA，pH8.0中并在4℃孵育16小时。合并重悬浮的物质，并加入固体氯化铯至1.40gm/ml的最终密度。然后使用Beckman型号LE-80离心机通过超速离心将载体分层(SW28，27,000rpm，24h，20℃)。将离心管分级，并合并含有载体的1.38至1..42gm/mL的密度。将该物质通过超速离心来第二次分层(NVT65转子，65,000rpm，16h，20℃)，并合并含有纯化AAV2载体的级分。为了浓缩载体并进行缓冲液交换，将浓缩氯化铯溶液中的载体通过如下所述(实施例2)的切向流过滤接受超滤/渗滤(UF/DF)。
在纯化方法2中，将含有AAV的细胞收集物微流体化并按序通过0.65和0.22μm的滤器(Sartorius)过滤。如之前所述的通过阳离子交换色谱使用Poros HS50树脂从澄清的细胞裂解物纯化病毒。U.S.专利No.6,593,123。对于图2中所述的核酸酶消化，用100U/mL Benzonase和10U/mL DNA酶I(无RNA酶，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana)孵育柱纯化的载体(4h，RT)。
对于纯化方法3，在UF/DF之前，将阳离子交换色谱纯化的AAV2载体接受另外的氯化铯梯度超速离心步骤(SW28，27,000rpm，20h)来除去空壳体。
如之前所述的使用实时定量PCR(Q-PCR)来定量AAV制剂。Sommer，J.M.等，(2003)Mol.Therapy 7122-128。通过SDS-PAGE/银染分析来分析三种方法各自纯化的载体，且在所有情况中，VP1、VP2和VP3以预期的比例存在，壳体蛋白表示＞总蛋白的95％，如通过扫描显像测密术所测定的。然而，与使用方法1和3纯化的梯度纯化AAV2载体不同，通过方法2(柱色谱)纯化的载体含有空壳体，每个载体基因组含有3-10个空壳体。
实施例2超滤和渗滤来检测AAV聚集将可随意使用的空心纤维切向流过滤装置(Amersham BioSciences8”Midgee，100kDa额定孔径大小)用于浓缩和渗滤通过上述方法纯化的AAV2载体，且用于表2中所述的UF/TF实验。对于所有的UF/DF程序，使用对应于10×产物体积的渗滤缓冲液体积，并以～1mL的增量加至接近连续渗滤。使用该方法，渗滤后所计算的残余CsCl＜0.5mM。
将以下三种制剂用于UF/DF对照制剂(CF140mM氯化钠、10mM磷酸钠、5％山梨糖醇，pH7.3)；测试制剂1(TF1150mM磷酸钠，pH7.5)；和测试制剂2(TF2100mM柠檬酸钠、10mM Tris，pH8.0)。对于表2中所示的实验1，在对应于1×1013vg/mL载体浓度的体积进行渗滤，渗滤后体积减少至对应于2.5×1013vg/mL的值(假设没有载体损耗)。
对于实验2，在对应于2×1013vg/mL体积进行渗滤，然后体积减少至对应于6.7×1013vg/mL的值。
对于实验3(CF±Bz)，首先将AAV2-AADC(大约1.2×1014vg)渗滤至TF1中(与核酸酶活性相容的制剂)，然后通过0.22μm的滤器。测定这种物质的滴定度，并将体积调节至对应于1×1013vg/mL的浓度。向10mL该物质中，加入MgCl2至2mM的浓度，然后分成两个等份试样。一个等份试样用Benzonase孵育(200U/mL，4h，RT)，第二个为模拟孵育。然后在对应于2×1013vg/mL载体浓度的体积将每个等份试样渗滤，然后浓缩至3.6×1013vg/mL目标。所有UF/DF实验方案后，将来自1％储液的PluronicF-68(BASF Corp.，Mount Olive，NJ)加入载体产物中至0.001％的最终浓度，将溶液通过0.22μm注射器滤器(Sartorius)。所有UF/DF程序在层流室里进行。
实施例3通过动态光散射来测量载体聚集通过动态光散射(DLS)使用蛋白质溶液DynaPro99(λ＝825.4nm)来分析纯化载体的聚集。原始数据(颗粒半径-Rh，在30个循环中测量的平均值，10个循环/分钟)用于所报道的全部分析。将“稀释-应力”方法用于测试各种赋形剂对载体聚集的影响。在该方法中，将80μL测试稀释剂加入20μL载体溶液中，并混合于用于DLS测量的实际比色皿中，并在混合10秒内开始收集数据。在加入测试稀释剂之前，测量AAV2载体制剂的Rh值并证实＜15nm来确保起始原料是单体的。将不是100％单体的样品穿过0.22μm注射器盘式过滤器(Sartorius，低蛋白质结合)来除去聚集物。
使用混合物(即，称重的测试稀释剂(80％)和起始载体制剂(20％))中存在的所有赋形剂来计算图1和2中给出的摩尔渗透压浓度和离子强度。根据等式摩尔渗透压浓度＝ci来计算摩尔渗透压浓度，其中ci是每种溶质物质的摩尔浓度。根据等式μ＝1/2cizi2来计算离子强度(μ)，其中zi是每种物质上的电荷。在导致载体聚集(例如，低μ)的条件下，观察到随着数据收集的过程Rh渐进性的增加。为了确定稀释后3分钟间隔所测量的平均Rh能用作聚集的可靠测量，还测定了相同时间间隔Rh增加的平均速率(ΔRh/Δt)(未显示)。ΔRh/Δt的分析给出了与使用图1和2中所记载的平均Rh值获得的那些相一致的结果。
实施例4AAV病毒粒子感染性使用如之前所述的高度灵敏测试来测定AAV2-AADC载体的感染性。Zhen，Z等，(2004)Human Gene Ther.15709-715。简而言之，将样品连续稀释(10-倍稀释，10个平行测定/稀释)并加入生长于96孔组织培养平板(Falcn，cat.#353227)上含有10％FBS的DMEM培养基中的D7/4细胞中(表达AAV rep和cap的改造Hela细胞)。将腺病毒(Ad-5，100vp/细胞)加入每个孔中来提供辅助功能。48h后，通过Q-PCR使用转基因-特异性引物和探针来定量每个孔中AAV载体的复制，并通过Karber方法来计算感染性滴定度以分析极限稀释度的感染频率。同时用之前在CF中制备并存储于-80℃的AAV2-AADC参照来运行试样。
通过全细胞ELISA来定量AAV2载体的转导效率。用10倍连续稀释的试样和参照载体感染生长于96孔平板中的D7/4细胞，对应于10至105vg/细胞输入(5个平行测试/稀释度)。在48h后，除去培养基，用200μL的PBS(10mM磷酸钠、140mM氯化钠，pH7.2)将细胞洗涤两次。然后通过将100μL含有0.5％曲通X-100和4％多聚甲醛的PBS加入每个孔中(15分钟)来透化并固定细胞。除去固定溶液，并用含有0.5％曲通X-100的PBS将细胞洗涤两次。通过加入含有3％牛血清白蛋白(BSA)和0.5％曲通X-100的PBS来阻断非特异性位点(60分钟)。
洗涤后，用兔子抗-ADCCIgG抗体(Chemicon，AB136)将细胞孵育一小时，并洗涤。然后用碱性磷酸盐偶联的山羊抗-兔子IgG将细胞孵育一小时，并洗涤。将抗体以1∶1000稀释于含有1％BSA、0.5％曲通X-100的PBS中。然后加入底物(PNPP，Pierce，cat.#34047)(1X二乙醇胺底物缓冲液中1mg/mL，Pierce，cat.#34064)，孵育30分钟后，通过分光光度测量分裂底物的浓度(λ＝405nm)。使用适配曲线(SigmaPlot)来符合人ADCC表达随载体输入函数。同时用试样测量AAV2-AADC参照载体。
尽管描述了本发明的优选示范性实施方案，可以形成没有脱离本发明的各种改变和改进是本领域技术人员显而易见，且确定所附的权利要求涵盖了落入本发明真实的精神和范围内的所有这样的改变和改进。
权利要求
1.一种防止病毒粒子制剂中病毒粒子聚集的方法，包括将一种或多种赋形剂加入病毒粒子制剂中来获得至少约200mM的离子强度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒粒子是AAV病毒粒子。
3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括用核酸酶处理所述的病毒粒子制剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸酶是Benzonase。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种赋形剂包括多价离子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述多价离子是柠檬酸根。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在加入一种或多种赋形剂后病毒粒子制剂的摩尔渗透压浓度不高于约280mOsm。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在加入一种或多种赋形剂后，病毒粒子制剂中通过动态光散射测量的病毒粒子平均颗粒半径(Rh)低于约20nm。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在加入一种或多种赋形剂后，病毒粒子制剂通过0.22μm滤器过滤后的病毒粒子回收至少约90％。
10.一种用于存储纯化病毒颗粒的组合物，包括纯化的病毒颗粒；pH缓冲剂；和含有一种或多种多价离子的赋形剂；其中组合物的离子强度高于约200mM。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述纯化的病毒颗粒是AAV病毒颗粒。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述一种或多种多价离子中的一种是柠檬酸根。
13.根据权利要求10所述的组合物，进一步包括PluronicF68。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述PluronicF68以0.001％存在。
15.根据权利要求10所述的组合物，其中所述pH缓冲剂是10mM Tris，pH8.0，且赋形剂包括100mM柠檬酸钠。
16.根据权利要求10所述的组合物，其中通过动态光散射测量的纯化病毒颗粒的平均颗粒半径(Rh)低于约20nm。
17.根据权利要求10所述的组合物，其中在病毒粒子组合物通过0.22μm滤器过滤后，纯化病毒颗粒的回收至少为约90％。
18.一种防止病毒粒子制剂中病毒粒子聚集的方法，包括用Benzonase处理所述的病毒粒子制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在Benzonase处理后，病毒粒子制剂中通过动态光散射测量的病毒粒子平均颗粒半径(Rh)低于约20nm。
20.根据权利要求18所述的方法，其中在Benzonase处理后，在病毒粒子制剂通过0.22μm滤器过滤后的病毒粒子回收至少为约90％。
全文摘要
本发明提供了用于制备浓缩AAV病毒粒子储液而没有聚集的组合物和方法。用于AAV制备和存储的制剂是与确定的目标组织等渗的高离子强度溶液(例如，μ～500mM)。使用高价盐如柠檬酸钠来获得这种高离子强度和适度摩尔渗透压浓度的结合。使用本发明的制剂获得高达6.4×10
文档编号C12N7/02GK101018858SQ200580017618
公开日2007年8月15日 申请日期2005年6月1日 优先权日2004年6月1日
发明者J·F·赖特, G·曲 申请人:建新公司