用于降解或转化植物细胞壁多糖的方法

专利名称：用于降解或转化植物细胞壁多糖的方法
关于对在联邦赞助的研究和发展下所制造发明的权利的声明本发明是在由能源部授予的基本合同DE-AC36-98GO10337，NREL转包合同号ZCO-30017-02下由政府支持制造的。政府对本发明拥有某些权利。
背景技术：
发明领域本发明涉及用于降解或转化植物细胞壁多糖的方法，以及由这种方法获得的产品。
相关技术的说明植物细胞壁由以复杂结构连锁的多糖的混合物组成(Carpita et al.，2001，Plant Physiology 127551-565)。多糖的混合物包括纤维素、木聚糖(半纤维素)、和果胶聚合物，其主要由己糖，例如葡萄糖、半乳糖、和甘露糖；戊糖，例如木糖和阿拉伯糖；糖醛酸，例如半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸；以及脱氧己糖，例如鼠李糖和岩藻糖组成。
植物细胞壁多糖可被酶促降解为随后可被转化为其他有机物的葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖，例如，葡萄糖被酵母容易地发酵成为乙醇。木材、农业残余物、草本作物、和城市固体废物可被用作植物细胞壁多糖的来源。
纤维素是植物细胞壁的主要成分。许多微生物生产降解纤维素的酶。这些酶包括，例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其打开而受到纤维二糖水解酶的攻击。纤维二糖水解酶顺序地从纤维素聚合物末端释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶β-1，4-连接的二聚体。β-葡糖苷酶水解纤维二糖成为葡萄糖。
降解纤维素和其他细胞壁多糖的天然微生物对于纤维素材料的大规模转化可能是不理想的，因为(a)可能缺乏酶的完全补足，(b)一种或多种酶成分表现较差，是不稳定的，或其动力学性能不符合所需要用途的规格，(c)转化和/或降解可通过表达增强转化/降解的异源酶基因而提高，或(d)酶的完全补足可能是不足够的数量而是经济可行的。对本领域来说有利的是，可通过使用来自重组微生物的完全发酵肉汤来提高植物细胞壁多糖的降解和转化以避开昂贵的细胞除去和酶制备步骤。
本发明的目的是提供利用来自重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤来降解或转化植物细胞壁多糖成为各种产品的新方法。
发明概述本发明涉及降解或转化植物细胞壁多糖成为一种或多种产品的方法，包括用有效量的重组微生物的耗尽(spent)的完全发酵肉汤处理植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一种或多种编码降解或转化该植物细胞壁多糖成为一种或多种产品的酶的异源基因。
本发明也涉及生产一种或多种有机物的方法，包括(a)用有效量的重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤糖化植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一种或多种表达降解或转化植物细胞壁多糖成为糖化材料的酶的异源基因；(b)用一种或多种发酵微生物发酵步骤(a)的糖化材料；以及(c)从发酵物回收一种或多种有机物。
本发明进一步涉及通过这种方法获得的产品或有机物。在优选的方面，该有机物是醇类。
附图简述

图1显示pAlLo01的限制图谱。
图2显示pMJ04的限制图谱。
图3显示pCaHj527的限制图谱。
图4显示pMT2188的限制图谱。
图5显示pCaHj568的限制图谱。
图6显示pMJ05的限制图谱。
图7显示pSMai130的限制图谱。
图8显示米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶分泌信号序列的DNA序列(SEQ ID NO32)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO33)。
图9显示Humicola insolens内切葡聚糖酶V分泌信号序列的DNA序列(SEQ ID NO36)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO37)。
图10显示pSMai135的限制图谱。
图11显示在酶剂量范围为2.5至20mg/g的PCS(在每个面板的下方右侧注明)，完全发酵肉汤(WB)(面板A)和无细胞肉汤(CB)(面板B)的PCS水解图谱。
图12显示来自新鲜收获的里氏木霉(Trichoderma reesei)RutC30发酵材料的WB和CB样品的PCS水解曲线。每个图谱以％RS产率(基于每ml 10mg PCS的葡聚糖组合物的理论最大还原糖值的％)对水解时间(1-120小时)的函数作图。酶剂量注明在每个面板的上方右侧。
图13显示在使用来自里氏木霉RutC30的WB和CB样品的PCS水解反应期间释放的总还原糖(RS)和葡萄糖的比较。酶剂量注明在每个面板的顶部。标注在X-轴上的样品号相应于跨越1至120小时的水解时间。
图14显示来自新鲜收获的里氏木霉SMA135-04发酵肉汤的WB和CB样品的PCS水解曲线。里氏木霉菌株SMA135-04表达重组的米曲霉β-葡糖苷酶。每个图谱以％RS产率(基于每ml 10mg PCS的葡聚糖组合物的理论最大还原糖值的％)对水解时间(1-120小时)的函数作图。酶剂量注明在每个面板的上方右侧。
图15显示在使用来自指导合成和分泌米曲霉β-葡糖苷酶的携带(harbor)表达载体的里氏木霉SMA135-04的WB和CB样品的PCS水解反应期间释放的总还原糖(RS)和葡萄糖的比较。酶剂量注明在每个面板的顶部。标注在X-轴上的样品号相应于跨越1至120小时的水解时间。
图16显示来自在4℃储存2周的里氏木霉RutC30发酵肉汤的WB和CB样品的PCS水解曲线。每个图谱以％RS产率(基于每ml 10mg PCS的葡聚糖组合物的理论最大还原糖值的％)对水解时间(1-120小时)的函数作图。酶剂量注明在每个面板的上方右侧。
图17显示来自在4℃储存2周的里氏木霉SMA135-04发酵肉汤的WB和CB样品的PCS水解曲线。每个图谱以％RS产率(基于10mg/ml PCS的葡聚糖组合物的理论最大值的％)对水解时间(1-120小时)的函数作图。酶剂量注明在每个面板的上方右侧。
发明详述本发明涉及用于降解或转化植物细胞壁多糖成为一种或多种产品的方法，包括用有效量的重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤处理植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一种或多种编码降解或转化该植物细胞壁多糖成为一种或多种产品的酶的异源基因。本发明也涉及用于生产一种或多种有机物的方法，包括(a)用有效量的重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤糖化植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一种或多种编码降解或转化该植物细胞壁多糖成为一种或多种产品的酶的异源基因；(b)用一种或多种发酵微生物使步骤(a)的糖化材料发酵；以及(c)从该发酵物回收一种或多种有机物。
植物细胞壁多糖在本发明的方法中，植物细胞壁多糖的来源可以是包含细胞壁多糖的任何植物生物质。这种来源包括但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、和纸浆和造纸厂的残余物。
在优选的方面，该植物细胞壁生物质是玉米秸。在另一个优选的方面，该植物细胞壁生物质是玉米纤维。在另一个优选的方面，该植物细胞壁生物质是稻草秆。在另一个优选的方面，该植物细胞壁生物质是纸和纸浆的加工废物。在另一个优选的方面，该植物细胞壁生物质是木本或草本植物。在另一个优选的方面，该植物细胞壁生物质是果浆。在另一个优选的方面，该植物细胞壁生物质是蔬菜浆。在另一个优选的方面，该植物细胞壁生物质是pumice。在另一个优选的方面，该植物细胞壁生物质是蒸馏的谷物。
植物细胞壁生物质可直接使用或可利用本领域已知的常规方法进行预处理。这种预处理包括物理、化学、和生物预处理。例如，物理预处理技术可包括各种类型的碾磨、挤压、照射、汽蒸/蒸汽喷发、和水热分解。化学预处理技术包括稀酸、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳、和pH-控制的水热分解。生物预处理技术可包括应用木质素-增溶的微生物(参见例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment of biomass，in Handbook on BioethanolProduction and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.，Singh，A.，1993，Physicochemical and biologicaltreatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl. Microbiol.，39295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosicbiomassa review，in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.，and Overend，R.P.，eds.，ACS Symposium Series566，American Chemical Society，Washington，DC，chapter 15；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，and Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewableresources，in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.，ed.，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65207-241；Olsson，L.，andHahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates forethanol production，Enz.Microb.Tech，18312-331；and Vallander，L.，andEriksson，K.-E.L.，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materialsState of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.，4263-95)。
在本发明中，植物细胞壁多糖包括但不限于纤维素、半纤维素、和果胶物质。
纤维素由β-1，4-葡聚糖组成。半纤维素由β-1，3-1，4-葡聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、木聚糖(阿拉伯基木聚糖)、甘露聚糖(半乳甘露聚糖)、半乳聚糖(阿拉伯半乳聚糖)、和阿拉伯聚糖(arabinan)组成。果胶物质由同型聚半乳糖醛酸(果胶)、鼠李半乳糖醛酸、和木糖聚半乳糖醛酸(xylogalacturonan)组成。
β-1，4-葡聚糖由β-1，4-连接的葡萄糖组成。降解β-1，4-葡聚糖的酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
β-1，3-1，4-葡聚糖由被β-1，3-连接的葡萄糖间断的β-1，4-连接的葡萄糖组成。降解β-1，3-1，4-葡聚糖的酶包括内-β-1，3(4)-葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(β-葡聚糖酶、纤维素酶)、和β-葡糖苷酶。
木葡聚糖由具有α-1，6-连接的木糖取代基的β-1，4-连接的葡萄糖组成。降解木葡聚糖的酶包括木葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、和纤维素酶。
木聚糖(阿拉伯木聚糖)由具有α-1，2或-1，3连接的阿拉伯糖的β-1，4-连接的木糖组成。该木糖可以是乙酰化的。也存在葡糖醛酸。降解木聚糖的酶包括木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖醛酸酶、和乙酰基木聚糖酯酶。
甘露聚糖(半乳甘露聚糖)由具有α-1，6-连接的半乳糖取代基的β-1，4-连接的甘露糖组成。甘露糖取代基还可以是乙酰化的。降解甘露聚糖的酶包括甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、和甘露聚糖乙酰基酯酶。
半乳聚糖(阿拉伯半乳聚糖)由通过β-1，3-键连接的D-半乳糖和3，6-脱水半乳糖组成。降解半乳聚糖的酶包括半乳聚糖酶。
阿拉伯聚糖由1，3-1，5-连接的L-阿拉伯糖组成。降解阿拉伯聚糖的酶包括阿拉伯聚糖酶。
同型聚半乳糖醛酸(homogalacturonan)由α-1，4-连接的半乳糖醛酸组成。半乳糖醛酸取代基可以是乙酰化和/或甲基化的。降解同型半乳糖醛酸的酶包括果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰基酯酶、和果胶甲基酯酶。
鼠李糖半乳糖醛酸聚糖由具有侧链1，4连接至鼠李糖的交替的α-1，4-鼠李糖和α-1，2-连接的半乳糖醛酸组成。该侧链包括具有α-1，3-连接的阿拉伯糖取代基的β-1，4-连接的半乳糖的I型半乳聚糖；具有阿拉伯糖取代基的β-1，3-1，6-连接的半乳糖(非常分支的)II型半乳聚糖；和具有α-1，3-连接的阿拉伯糖分支的α-1，5-连接的阿拉伯糖的阿拉伯聚糖。半乳糖醛酸取代基可以是乙酰化和/或甲基化的。降解鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的酶包括α-阿拉伯呋喃糖酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶。
木糖聚半乳糖醛酸(xylogalacturonan)由具有木糖侧链的α-1，4-连接的半乳糖醛酸组成。半乳糖和岩藻糖可连接至木糖取代基。也存在鼠李糖。半乳糖醛酸取代基可以是乙酰化和/或甲基化的。降解木糖聚半乳糖醛酸的酶包括木糖半乳糖醛酸苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
纤维素也可作为木质纤维素存在。木质素由通过醚键和C-C键连接的甲氧基化的苯基丙烷单位组成。木质素的化学组成根据植物品种而不同。这种成分包括愈创木基(guaiacyl)，4-羟苯基，和syringyl基团。降解木质纤维素的木质素成分的酶包括木质素过氧化物酶、锰-依赖的过氧化物酶、具有木质素过氧化物酶和锰-依赖的过氧化物酶综合性能的杂合过氧化物酶、和漆酶(Vicuna，2000，Molecular Biotechnology 14173-176；Broda et al.，1996，Molecular Microbiology 19923-932)。
重组微生物在本发明的方法中，重组微生物可以是用作重组生产对转化或降解植物细胞壁多糖有用的酶的宿主的任何微生物。选用作重组生产的宿主的微生物可以已经包含编码降解或转化植物细胞壁多糖的酶的一个或多个天然基因。然而，该宿主可能缺乏为降解或转化植物细胞壁多糖所必需的酶的全部，即该宿主可能缺乏一个或多个基因。备选地，该宿主可能包含酶的全部，但一个或多个酶可能是不充分表达的。此外，该宿主可能缺乏为生产全部酶所需要的一个或多个基因并且该宿主生产的一个或多个酶可能是不充分表达的。在本发明中可理解如在此所描述的，对于宿主天然的已经经受操作的基因可被认为是异源的基因。
宿主优选是真菌菌株。如在此使用的“真菌”(Fungi)包括子囊菌门(phylaAscomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义的)，以及卵菌门(Oomycota)(如在Hawksworth et al.，1995，supra，page 171中所引用的)和所有的mitosporic真菌(Hawksworth etal.，1995，supra)。
在优选的方面，真菌宿主是酵母菌株。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产生担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)、和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽生菌(Blastomycetes))的酵母。因为酵母的分类可能在将来有变化，为了本发明的目的，酵母应如在Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所定义的。
在更优选的方面，酵母宿主是假丝酵母(Candida)、汉逊氏酵母(Hansenula)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、糖酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或耶氏菌株(Yarrowiastrain)。
在最优选的方面，酵母宿主是卡尔斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomycesdiastaticus、Saccharomyces douglasii、克鲁弗糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地糖酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomycesoviformis)菌株。在另一个最优选的方面，酵母宿主是乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)菌株。在另一个最优选的方面，酵母宿主是Yarrowialipolytica菌株。
在另一个优选的方面，真菌宿主是丝状真菌菌株。“丝状真菌”包括真菌亚门和卵菌门的全部丝状体(如由Hawksworth et al.，1995，supra所定义的)。丝状真菌通常的特征在于菌丝的壁由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳聚糖、甘露聚糖、及其他复合多糖组成。营养生长是通过菌丝的伸长，而碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，例如酿酒酵母的酵母营养生长是通过单细胞叶状体(thallus)的出芽，而碳分解代谢可能是发酵性的。
在更优选的方面，丝状真菌宿主是但不限于支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐殖菌属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、柱霉属(Scytalidium)、草根霉属(Thielavia)、弯劲霉属(Tolypocladium)、或木霉属(Trichoderma)菌株。
在更优选的方面，丝状真菌宿主是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、或米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株。在另一个更优选的方面，丝状真菌宿主是杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellnse、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、或Fusarium venenatum菌株。在另一个更优选的方面，丝状真菌宿主是Humicols insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Scytalidium thermophilum、或Thielaviaterrestris菌株。在进一步更优选的方面，丝状真菌宿主是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichodermalongibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichodermaviride)菌株。
在最优选的方面，丝状真菌宿主是作为里氏木霉ATCC 56765可从美国典型培养物保藏中心的里氏木霉RutC30。
在优选的方面，宿主或重组微生物包括一个或多个编码选自内切葡聚糖酶(纤维素酶)、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶的酶的异源基因。
在更优选的方面，重组微生物包括编码内切葡聚糖酶的异源基因。在另一个更优选的方面，重组微生物包括编码纤维二糖水解酶基因的异源基因。在另一个更优选的方面，重组微生物包括编码β-葡糖苷酶的异源基因。
在最优选的方面，重组微生物包括编码内切葡聚糖酶(endoglucanase)和纤维二糖水解酶的异源基因。在另一个最优选的方面，重组微生物包括编码内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶的异源基因。
在另一个最优选的方面，重组微生物包括编码内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶的异源基因。
在另一个优选的方面，重组微生物进一步包括葡萄糖水解酶。
在另一个优选的方面，重组微生物进一步包括一个或多个编码选自木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖醛酸酶、和乙酰基木聚糖酯酶的酶的异源基因。
在另一个优选的方面，重组微生物进一步包括一个或多个编码选自甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰基酯酶、半乳聚糖酶、和阿拉伯聚糖酶的酶的异源基因。
在另一个优选的方面，重组微生物进一步包括一个或多个编码选自果胶酸裂合酶、胶质裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、果胶乙酰基酯酶、果胶甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶(galactanase)、阿拉伯聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶、木糖半乳糖醛酸苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶的酶的异源基因。
在另一个优选的方面，重组微生物进一步包括一个或多个编码选自木质素过氧化物酶、锰-依赖的过氧化物酶、和杂合过氧化物酶的酶的异源基因。
在另一个优选的方面，重组微生物更进一步包括一个或多个编码选自酯酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、和过氧化物酶的酶的异源基因。
编码植物细胞壁降解或转化酶的基因可以是真菌或细菌的起源，例如，腐殖菌属(Humicola)、鬼伞属(Coprinus)、草根霉属(Thielavia)、镰孢属(Fusarium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、支顶孢属(Acremonium)、头孢属(Cephalosporium)、柱霉属(Scytalidium)、青霉属或曲霉属(参见例如，EP458162)的种属，特别是选自种属Humicola insolens(重新分类为Scytalidiumthermophilum，参见例如美国专利号4,435,307)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、尖孢镰孢、嗜热毁丝霉、Meripilus giganteus、Thielavia terrestris，支顶孢霉属(Acremonium)种、Acremonium persicinum、Acremoniumacremonium、Acremonium brachypenium、Acremonium dichromosporum、Acremonium obclavatum、Acremonium pinkertoniae、Acremoniumroseogriseum、Acremonium incoloratum、和Acremonium furatum，优选来自种属Humicola insolens DSM 1800、尖孢镰孢DSM 2672、嗜热毁丝霉CBS117.65、头孢属(Cephalosporium)种RYM-202、支顶孢属CBS 478.94、支顶孢属CBS 265.95、Acremonium persicinum CBS 169.65、Acremoniumacremonium AHU 9519、头孢霉属(Cephalosporium sp.)CBS 535.71、Acremonium brachypenium CBS 866.73、Acremonium dichromosporum CBS683.73、Acremonium obclavatum CBS 311.74，Acremonium pinkertoniae CBS157.70、Acremonium roseogriseum CBS 134.56，Acremonium incoloratum CBS146.62、和Acremonium furatum CBS 299.70H。植物细胞壁水解酶基因也可获得自木霉属(特别是绿色木霉、里氏木霉、和康宁木霉)、嗜碱的杆菌(参见例如，美国专利号3,844,890和EP458162)、和链霉属(Streptomyces)(参见例如，EP458162)。
在此参考的酶及其基因可从任何合适的起源获得，包括细菌、真菌、酵母或哺乳动物的起源。如在此使用的术语“获得的”连同给定的来源是指由核苷酸序列编码的多肽是通过该来源或通过其中已经被插入来自该来源的核苷酸序列的菌株生产的。包括在天然酶的意义之内的是天然的变体或例如通过定点诱变或改组所获得的变体。
用于分离或克隆编码酶的基因的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。从这种基因组DNA克隆基因可受到例如，利用已知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共用结构特点的克隆DNA片段的影响。参见例如，Innis et al.，1990，PCRA Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可使用其他的核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化的转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。
真菌细胞可通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁再生的本质上已知的方法而被转化。用于转化曲霉和木霉宿主菌株的合适方法在EP 238 023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 811470-1474中有描述。用于转化镰孢种属的合适方法由Malardier et al.，1989，Gene 78147-156、和WO 96/00787描述。酵母可利用由Becker and Guarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journal ofBacteriology 153163；and Hinnen et al.，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751920描述的方法转化。
具有植物细胞壁水解活性的酶及其基因在本发明方法中，重组微生物包括一个或多个与该微生物异源或外来的基因，其中该一个或多个基因编码涉及降解或转化植物细胞壁多糖的酶。
该异源基因可编码降解β-1，4-葡聚糖的酶，例如内切葡聚糖酶(纤维素酶)、纤维二糖水解酶、葡萄糖水解酶、和β-葡糖苷酶；降解β-1，3-1，4-葡聚糖的酶，例如内-β-1，3(4)-葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(β-葡聚糖酶，纤维素酶)、和β-葡糖苷酶；降解木葡聚糖的酶，例如木葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、和纤维素酶；降解木聚糖的酶，例如木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖醛酸酶、和乙酰基木聚糖酯酶；降解甘露聚糖的酶，例如甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、和甘露聚糖乙酰基酯酶；降解半乳聚糖(galactan)的酶，例如半乳聚糖酶(galactanase)；降解阿拉伯聚糖的酶，例如阿拉伯聚糖酶；降解同型聚半乳糖醛酸的酶，例如果胶酸裂合酶、胶质裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰基酯酶、和果胶甲基酯酶；降解鼠李糖半乳糖醛酸聚糖的酶，例如α-阿拉伯呋喃糖酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶(galactanase)、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、α-阿拉伯呋喃糖酶(arabinofuranosidase)、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶；降解木糖聚半乳糖醛酸(xylogalacturonan)的酶，例如木糖半乳糖醛酸苷酶(xylogalacturonosidase)、木糖半乳糖醛酸酶、和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶(rhamnogalacturonanlyase)；和降解木质素的酶，例如木质素过氧化物酶、锰-依赖的过氧化物酶、具有木质素过氧化物酶和锰-依赖的过氧化物酶综合性能的杂合过氧化物酶、和漆酶。
编码降解多糖的酶的基因可从如B.Henrissat，1991，A classification ofglycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280309-316，and Henrissat B.，and Bairoch A.，1996，Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316695-696描述的来源获得，其在此引入作为参考。
重组微生物可进一步包括一个或多个编码例如酯酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、和过氧化物酶的酶的异源基因。
该酶可能在酸性、中性或碱性pH-范围中具有活性。在优选的方面，该酶在大约2至大约7的pH范围具有活性。
内切葡聚糖酶术语“内切葡聚糖酶”(endoglucanase)在此定义为催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉、混合有β-1，3葡聚糖的β-1，4键，例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖，及其他包含纤维素成分的植物材料中1，4-β-D-糖苷键内水解的内-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)。为了本发明的目的，内切葡聚糖酶活性利用Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59257-268的方法所述的羧甲基纤维素(CMC)水解来测定。
在优选的方面，内切葡聚糖酶基因从里氏木霉菌株获得。在另一个优选的方面，内切葡聚糖酶基因从米曲霉菌株获得。在另一个优选的方面，内切葡聚糖酶基因从棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株获得。在另一个优选的方面，内切葡聚糖酶基因从Humicola insolens菌株获得。
可用于本发明的内切葡聚糖酶基因的优选实例从棘孢曲霉(美国专利号6,623,949；WO 94/14953)、川地曲霉(Aspergillus kawachii)(美国专利号6623949)、米曲霉(Kitamoto et al.，1996，Appl.Microbiol.Biotechnol.46538-544；美国专利号6,635,465)、构巢曲霉(Lockington et al.，2002，FungalGenet.Biol.37190-196)、Cellulomonas fimi(Wong et al.，1986，Gene 44315-324)、枯草芽孢杆菌(MacKay et al.，1986，Nucleic Acids Res.149159-9170)、Cellulomonas pachnodae(Cazemier et al.，1999，Appl.Microbiol.Biotechnol.52232-239)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)(Goedegebuur et al.，2002，Curr.Genet.4189-98)、尖孢镰孢(Hagen et al.，1994，Gene 150163-167；Sheppard et al.，1994，Gene 150163-167)、Humicola insolens(美国专利号5,912,157；Davies et al.，2000，Biochem J.348201-207)、Hypocrea jecorina(Penttila et al.，1986，Gene 45253-263)、灰色腐质霉(Humicola grisea)(Goedegebuur et al.，2002，Curr.Genet.4189-98)、Micromonosporacellulolyticum(Lin et al.，1994，J.Ind.Microbiol.13344-350)、嗜热毁丝霉(美国专利号5,912,157)、米根霉(Rhizopus oryzae)(Moriya et al.，2003，J.Bacteriol.1851749-1756)、里氏木霉(Saloheimo et al.，1994，Mol.Microbiol.13219-228)、和绿色木霉(Trichoderma viride)(Kwon et al.，1999，Biosci.Biotechnol.Biochem.631714-1720；Goedegebuur et al.，2002，Curr. Genet.4189-98)获得。
纤维二糖水解酶纤维二糖水解酶，外-1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，催化纤维素、细胞寡糖、或包含聚合体的任何β-1，4-连接的葡萄糖中1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖。为了本发明的目的，纤维二糖水解酶活性根据由Lever et al.，1972，Anal.Biochem.47273-279；van Tilbeurgh et al.，1982，FEBS Letters，149152-156；and van Tilbeurgh andClaeyssens，1985，FEBS Letters，187283-288描述的方法来测定。在本发明中，Lever et al方法用于评估玉米秸中纤维素的水解，而van Tilbeurgh et al.的方法用于确定纤维二糖水解酶对荧光二糖衍生物的活性。
在优选的方面，纤维二糖水解酶基因从里氏木霉菌株获得。在另一个优选的方面，纤维二糖水解酶基因从棘孢曲霉菌株获得。在另一个优选的方面，纤维二糖水解酶基因从黑曲霉菌株获得。在另一个优选的方面，纤维二糖水解酶基因从米曲霉菌株获得。在另一个优选的方面，纤维二糖水解酶基因从Emericella nidulans菌株获得。
可用于本发明的纤维二糖水解酶基因的优选实例是从Acremoniumcellulolyticus(美国专利号6,127,160)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)(Chowet al.，1994，Appl.Environ.Microbiol.602779-2785；Yague et al.，1997，Microbiology(Reading，Engl.)143239-244)、棘孢曲霉(Takada et al.，1998，J.Ferment.Bioeng.851-9)、黑曲霉(Gielkens et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.654340-4345)、米曲霉(Kitamoto et al.，1996，Appl.Microbiol.Biotechnol.46538-544)、Athelia rolfsii(EMBL登录号AB103461)、嗜热性毛壳霉(Athelia rolfsii)(EMBL登录号AX657571和CQ838150)、Cullulomonas fimi(Meinke et al.，1994，Mol.Microbiol.12413-422)、Emericella nidulans(Lockington et al.，2002，Fungal Genet.Biol.37190-196)、尖孢镰孢(Hagen et al.，1994，Gene 150163-167)、地霉属128(EMBL登录号AB089343)、灰色腐质霉(Humicola grisea)(de Oliviera andRadford，1990，Nucleic Acids Res.18668；Takashima et al.，1998，J.Biochem.124717-725)、产黑色腐质霉(Humicola nigrescens)(EMBL登录号AX657571)、Hypocrea koningii(Teeri et al.，1987，Gene 5143-52)、嗜热毁丝霉(EMBL登录号AX657599)、Neocallimastix patriciarum(Denman et al.，1996，Appl.Environ.Microbiol.62(6)，1889-1896)、Phanerochaetechrysosporium(Tempelaars et al.，1994，Appl.Environ.Microbiol.604387-4393)、Thermobifida fusca(Zhang，1995，Biochemistry 343386-3395)、里氏木霉(Terri te al.，1983，Bio/Technology 1696-699；Chen et al.，1987，Bio/Technology 5274-278)、和绿色木霉(Trichoderma viride)(EMBL登录号A4368686和A4368688)获得的。
β-葡糖苷酶β-葡糖苷酶、β-D-糖苷葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，催化末端非还原的β-D-葡萄糖残基的水解而释放β-D-葡萄糖。为了本发明的目的，β-葡糖苷酶活性根据由Venturi et al.，2002，J.Basic Microbiol.4255-66描述的基本方法来测定，除非使用与在此所描述的不同条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在50℃，pH5，在100mM柠檬酸钠，0.01％Tween-20中从作为底物的4mMp-硝基苯基-β-D-glucopyranoside每分钟产生1.0μmole的p-硝基酚。
包括在β-葡糖苷酶定义内的是纤维二糖酶。纤维二糖酶水解纤维二糖为葡萄糖。
在优选的方面，β-葡糖苷酶基因从棘孢曲霉菌株获得。在另一个优选的方面，β-葡糖苷酶基因从川地曲霉菌株获得。在另一个优选的方面，β-葡糖苷酶基因从里氏木霉菌株获得。
可用于本发明的β-葡糖苷酶基因的优选实例从棘孢曲霉(Kawaguchi etal.，1996，Gene 173287-288)、川地曲霉(Aspergillus aculeatus)(Iwashita et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.655546-5553)、米曲霉(WO 2002/095014)、双氮纤维单孢菌(Cellulomonas biazotea)(Wong et al.，1998，Gene 20779-86)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)(WO 200478919)、肋状复膜孢糖酵母(Saccharomycopsis fibuligera)(Machida et al.，1988，Appl.Environ.Microbiol.543147-3155)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Woodet al.，2002，Nature 415871-880)、和里氏木霉(Barnett et al.，1991，Bio/Technology 9562-567)获得。
葡萄糖水解酶葡萄糖水解酶，外-1，4-β-D-葡聚糖葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.74)，催化1，4-β-D-葡聚糖中1，4-键(O-糖基键)的水解以除去顺序的葡萄糖单体。为了本发明的目的，外切葡聚糖酶活性根据由Himmel et al.，1986，J.Biol.Chem.26112948-12955描述的方法来测定。
在优选的方面，葡萄糖水解酶基因从里氏木霉菌株获得。在另一个优选的方面，葡萄糖水解酶基因从Humicola insolens菌株获得。在另一个优选的方面，葡萄糖水解酶基因从黑曲霉菌株获得。在另一个优选的方面，纤维二糖水解酶基因从嗜热性毛壳霉(Chaetomium thermophilum)菌株获得。在另一个优选的方面，葡萄糖水解酶基因从橙色热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)菌株获得。在另一个优选的方面，葡萄糖水解酶基因从Thielaviaterrestris菌株获得。
半纤维素酶半纤维素的酶促水解可通过多种真菌和细菌进行(Saha，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.30279-291)。类似于纤维素降解，半纤维素水解需要几个酶的协同作用。半纤维素酶可被分为3个广义种类攻击多糖链内的内在键的内-作用酶、从多糖链的还原或非还原端渐进作用的外-作用酶、和辅助酶，水解木质素糖苷键的乙酰酯酶和酯酶，例如香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶(Wong，K.K.Y，Tan，L.U.L.，and Saddler，J.N.，1988，Multiplicity ofβ-1，4-xylanase in microorganismsFunctions and applications，Microbiol.Rev.，52305-317；Tenkanen，M.，and Poutanen，K.，1992，Significance of esterases inthe degradation of xylans，in Xylans and Xylanases，Visser，J.，Beldman，G.，Kuster-van Someren，M.A.，and Voragen，A.G.J.，eds.，Elsevier，New York，NY，203-212；Coughlan，M.P.，and Hazlewood，G.P.，1993，Hemicellulose andhemicellulases，Portland，London，UK；Brigham，J.S.，Adney，W.S.，and Himmel，M.E.，1996，HemicellulasesDiversity and applications，in Handbook onBioethanolProduction and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，DC，119-141)。
内作用的半纤维素酶和辅助酶的实例包括阿拉伯聚糖内切酶、阿拉伯半乳聚糖内切酶(endoarabinogalactanase)、内切葡聚糖酶，甘露聚糖内切酶、木聚糖内切酶(endoxylanase)、和feraxan木聚糖内切酶。外-作用的半纤维素酶和辅助酶的实例包括α-L-阿拉伯糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶、α-1，2-L-岩藻糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-葡糖醛酸酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-木糖苷酶、外-葡糖苷酶、外-纤维二糖水解酶、外-甘露二糖水解酶、外-甘露聚糖酶、外-木聚糖酶、木聚糖α-葡糖醛酸酶、和松柏苷β-葡糖苷酶。酯酶的实例包括乙酰基酯酶(乙酰基半乳聚糖酯酶、乙酰基甘露聚糖酯酶、和乙酰基木聚糖酯酶)、和芳基酯酶(香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶)。
半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶(arabinofuranosidase)、乙酰基木聚糖酯酶、葡糖苷酸酶、半乳聚糖内切酶、甘露聚糖酶、内-或外切-阿拉伯糖酶、半乳聚糖外切酶、及其混合物。优选地，半纤维素酶是外-作用的半纤维素酶，更优选地，优选在大约2至大约7的pH范围具有水解半纤维素能力的外-作用的半纤维素酶。
半纤维素酶，例如木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶、半乳聚糖内切酶(endo-galactanases)、甘露聚糖酶、内或外切-阿拉伯糖酶、或半乳聚糖外切酶，或其基因可从任何合适的来源获得，包括真菌和细菌生物体，例如曲霉属、Disporotrichum、青霉属、脉孢菌属、镰孢属、木霉属、腐殖菌属、Thermomyces、和芽孢杆菌属。
可用于本发明的半纤维素酶基因的优选实例从Acidobacteriumcapsulatum (Inagaki et al.，1998，Biosci.Biotechnol.Biochem.621061-1067)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)(De Groot et al.，1998，J.Mol.Biol.277273-284)、棘孢曲霉(美国专利号6,197,564；美国专利号5,693,518)、川地曲霉(Ito et al.，1992，Biosci.Biotechnol.Biochem.56906-912)、黑曲霉(EMBL登录号AF108944)、Magnaporthe grisea(Wu et al.，1995，Mol.Plant MicrobeInteract.8506-514)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)(Haas et al.，1993，Gene 126237-242)、Talaromyces emersonii(WO 02/24926)、和里氏木霉(EMBL登录号X69573、X69574、和AY281369)获得。
隆解木质素的酶木质素是存在于高等植物木质组织中的芳族聚合物。由于其疏水性和缺乏规则可水解键的复杂随机结构，木质素不被大多数生物体所充分降解。木质素的最好降解者是产生涉及木质素最初攻击的胞外过氧化物酶和漆酶的白腐真菌(white rot fungi)。
降解木质素的酶包括但不限于，木质素过氧化物酶、锰-依赖的过氧化物酶、具有木质素过氧化物酶和锰依赖的过氧化物酶的综合性能的杂合过氧化物酶，和漆酶(Vicuna，2000，supra；Broda et al.，1996，supra)。作为共同底物为过氧化物酶所需要的过氧化氢可通过葡萄糖氧化酶、芳基醇氧化酶、和/或木质素过氧化物酶-活化的乙二醛氧化酶来产生。
锰-依赖的过氧化物酶经常遇到由白腐真菌产生的过氧化物酶。过氧化物酶具有涉及通过过氧化氢的亚铁原卟啉的2-电子氧化和以2个1-电子步骤至天然酶的借助于化合物II的化合物I的随后氧化的催化循环。化合物I和II的最佳还原底物是Mn(II)，天然存在于木材中的金属。形成的Mn(III)氧化其他的底物。
已知有机酸，例如草酸、乙醛酸、和乳酸在锰-依赖的过氧化物酶和木质素降解作用的机制中具有重要的作用。Mn(III)通过有机酸被从酶除去，并且产生的Mn(III)-有机酸复合物在借助锰-依赖的过氧化物酶的木质素氧化中作为可扩散的介质起作用。Mn(III)还可氧化有机酸而产生自由基。有机酸也可从木质素的降解并通过微生物来提供。
降解木质素的酶及其基因可从Bjerkandera adusta、Ceriporiopsissubvermispora (参见WO 02/079400)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙链孢霉、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Phanerochaete chrysosporium、Phlebia radiata、Pleurotuseryngii、Thielavia terrestris、Trametes villosa、Trametes versicolor，、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉、或绿色木霉菌株获得。
可用于本发明的编码降解木质素的酶的基因的优选实例从Bjerkanderaadusta(WO 2001/098469)、Ceriporiopsis subvermispora(Conesa et al.，2002，Journal of Biotechnology 93143-158)、Cantharellus cibariusi(Ng et al.，2004，Biochemical and Biophysical Research Communications 31337-4外灰盖鬼伞(WO 97/008325；Conesa et al.，2002，supra)、Lentinula edodes(Nagai et al.，2002，Applied Microbiology and Biotechnology 60327-335，2002)、Melanocarpus albomyces(Kiiskinen et al.，2004，FEBS Letters 576251-255，2004)、嗜热毁丝霉(WO 95/006815)、Phanerochaete chrysosporium(Conesaet al.，2002，supra；Martinez，2002，Enzyme and Microbial Technology 30425-444，2002)、Phlebia radiata(Conesa et al.，2002，supra)、Pleurotuseryngii(Conesa et al.，2002，supra)、Polyporus pinsitus(WO 96/000290)、Rigidoporus lignosus(Garavaglia et al.，2004，Journal of Molecular Biology3421519-1531)、Rhizoctonia solani(WO 96/007988)、Scytalidiumthermophilum(WO 95/033837)、Tricholoma giganteum(Wang et al.，2004，Biochemical and Biophysical Research Communications 315450-454)、和Trametes versicolor(Conesa et al.，2002，supra)获得。
酯酶酯酶，羧酸酯水解酶(EC 3.1.1)，催化酯键的水解。用于降解或转化植物细胞壁多糖的酯酶包括乙酰基酯酶，例如乙酰基半乳聚糖酯酶、乙酰基甘露聚糖酯酶、和乙酰基木聚糖酯酶，以及水解木质素糖苷键的酯酶，例如香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶。
酯酶的非限制实例包括芳基酯酶、三酰基甘油酯酶、乙酰酯酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱酯酶、托品酯酶(tropinesterase)、果胶酯酶、固醇酯酶、叶绿素酶、L-阿拉伯糖内酯酶、葡糖酸内酯酶、尿内酯酶、鞣酸酶、视黄基-棕榈酸酯酶、羟基丁酸-二聚物水解酶、酰基甘油脂肪酶、3-含氧己二酸烯醇-内酯酶、1，4-内酯酶、半乳糖脂酶、4-吡哆醇内酯酶、酰基肉毒碱水解酶、氨酰基-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖内酯酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷脂酶A1、6-乙酰基葡萄糖脱乙酰基转移酶、脂蛋白脂肪酶、二氢香豆素脂肪酶、柠檬苦素-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三醋酸-内酯酶、放线菌素内酯酶、苔色酸缩酚酸(orsellinate-depside)水解酶、头孢菌素-C脱乙酰基酶、氯原酸(chlorogenate)水解酶、α-氨基酸酯酶、4-甲基丁酮二酸酯酶、羧基亚甲基丁烯酸内酯酶、脱氧柠檬酸A-环-内酯酶、2-乙酰基-1烷基甘油磷酸胆碱酯酶、镰孢氨酸-C鸟氨酸酯酶、芥子碱(sinapine)酯酶、蜡酯水解酶、佛波醇-二酯水解酶、磷脂酰肌醇脱酰基酶、唾液酸O-乙酰酯酶、乙酰氧基丁基二噻吩脱乙酰基酶、乙酰水杨酸脱乙酰基酶、甲基伞形基-醋酸脱乙酰基酶、2-吡喃酮-4，6-dicarboxylate内酯酶、N-乙酰基乳糖氨基聚糖脱乙酰基酶、保幼激素酯酶、bis(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯酶、蛋白质-谷氨酸甲基酯酶、11-顺式-视黄基-棕榈酸水解酶、全部-反式-视黄基-棕榈酸水解酶、L-鼠李糖-1，4-内酯酶、5-(3，4-二乙酰氧基丁-1-基)-2，2′-二噻吩脱乙酰基酶、脂肪-脂酰基-乙基-酯合酶、木糖-1，4-内酯酶、N-乙酰基葡萄糖氨基磷脂酰肌醇脱乙酰基酶(N-acetylglucosaminylphosphatidylinositol deacetylase)、西曲酸酯二甲苯酯酶(cetraxate benzylesterase)、乙酰基烷基甘油乙酰基水解酶、和乙酰基木聚糖酯酶。
用于本发明的优选酯酶是脂肪分解酶，例如脂肪酶(EC 3.1.1.3、EC3.1.1.23和/或EC 3.1.1.26)和磷脂酶(EC 3.1.1.4和/或EC 3.1.1.32、包括分类为EC 3.1.1.5的溶血磷脂酶)。其他优选的酯酶是角质酶(EC 3.1.1.74)。进一步优选的酯酶是乙酰基木聚糖酯酶和果胶甲酯酶。
酯酶可以有效获得所需要益处的数量被加入而改善耗尽的完全肉汤或发酵微生物的性能，例如，改变发酵微生物内侧和/或外测或发酵微生物细胞膜中的脂类组合物/浓度，在发酵期间随着溶质进入和/或流出发酵微生物的运动而产生改进，和/或提供更多的可代谢能量来源(例如，例如通过转化成分，例如来自玉米底物的油，成为对发酵微生物有用的成分，例如不饱和脂肪酸和甘油)来增加乙醇产率。酯酶有效量的实例是0.01至400LU/gDS(干物质)。优选地，使用的酯酶的数量为0.1至100LU/gDS，更优选0.5至50LU/gDS，以及更优选1至20LU/gDS。酯酶数量的进一步优化可利用本领域已知的标准方法来获得。
一个脂肪酶单位(LU)是在30℃，pH7.0(磷酸盐缓冲液)，以三丁酸甘油酯作为底物，阿拉伯树胶作为乳化剂，每分钟释放1.0μmol可滴定的脂肪酸的酶的数量。
在优选的方面，酯酶是脂肪分解酶，更优选是脂肪酶。如在此使用的，“脂肪分解酶”是指脂肪酶和磷脂酶(包括溶血磷脂酶)。在更优选的方面，脂肪分解酶是脂肪酶。在此可应用脂肪酶改变三酸甘油酯油类和发酵培养基(包括发酵酵母)，例如由玉米底物产生的发酵培养基中脂肪的结构和组成的能力。脂肪酶催化不同类型的三酸甘油酯转化，例如水解、酯化作用和酯基转移。合适的脂肪酶包括本领域已知的酸性、中性、和碱性的脂肪酶，尽管酸性的脂肪酶(例如，例如脂肪酶G AMANO 50，获得自Amano)与中性或碱性脂肪酶相比似乎在较低浓度的脂肪酶时是更有效的。用于本发明的优选脂肪酶包括南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶和Candidacylindracea脂肪酶。更优选的脂肪酶是纯化的脂肪酶，例如南极假丝酵母脂肪酶(脂肪酶A)、南极假丝酵母脂肪酶(脂肪酶B)、Candida cylindracea脂肪酶、和Penicillium camembertii脂肪酶。
脂肪酶可以是在EP 258,068-A中公开的脂肪酶或可以是脂肪酶变体，例如在WO 00/60063或WO 00/32758中公开的变体，由此并入作为参考。
脂肪酶优选以大约1至400LU/gDS的数量存在，优选1至10LU/gDS，更优选1至5LU/gDS。
脂肪分解酶优选是微生物起源，特别是细菌、真菌或酵母起源。使用的脂肪分解酶或其基因可从任何来源获得，包括例如，犁头霉属(Absidia)，特别是Absidia blakesleena和伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)的菌株、无色杆菌属(Achromobacter)，特别是解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)的菌株、气单胞菌属(Aeromonas)的菌株、链格孢属(Alternaria)，特别是甘蓝格链孢(Alternaria brassiciola)的菌株、曲霉，特别是黑曲霉和黄曲霉(Aspergillusflavus)的菌株、无色杆菌属(Achromobacter)，特别是解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)的菌株、短梗霉属(Aureobasidium)，特别是出芽短梗霉(Aureobasidium pullullans)的菌株、芽孢杆菌，特别是短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus strearothermophilus)、和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株、白僵菌属(Beauveria)的菌株、Brochothrix，特别是Brochothrix thermosohata的菌株、假丝酵母，特别是Candidacylindracea(皱落念珠菌(Candida rugosa))、Candida paralipolytica、和南极假丝酵母(Candida Antarctica)的菌株、色杆菌属(Chromobacter)，特别是Chromobacter viscosum的菌株、鬼伞菌(Coprinus)，特别是灰盖鬼伞(Coprinuscinerius)的菌株、镰孢(Fusarium)，特别是尖孢镰孢、腐皮镰孢(Fusariumsolani)、豌豆腐皮镰孢(Fusarium solani pisi)、Fusarium roseum culmorum、和Fusarium venenatum的菌株、Geotricum，特别是Geotricum penicillatum的菌株、汉森酵母属(Hansenula)，特别是异常汉森酵母(Hansenula anomala)的菌株、腐质霉属(Humicola)，特别是Humicola brevispora、Humicola brevisvar.thermoidea、和Humicola insolens的菌株、Hyphozyma的菌株、乳杆菌属(Lactobacillus)，特别是弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的菌株、Metarhizium的菌株、毛霉(Mucor)的菌株、拟青霉属(Paecilomyces)的菌株、青霉属(Penicillium)，特别是圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、Penicilliumcrustosum和Penicillium expansum的菌株、假单胞菌(Pseudomonas)，特别是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、(同义为Burkholderiacepacia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、Pseudomonas mendocina、Pseudomonas mephitica lipolytica、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、Pseudomonas plantari、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、Pseudomonas putida、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、和Pseudomonas wisconsinensis的菌株、丝核菌属(Rhizoctonia)，特别是Rhizoctonia solani的菌株、根毛霉(Rhizomucor)，特别是米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株、根霉属(Rhizopus)，特别是Rhizopus japonicus、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、和Rhizopus nodosus的菌株、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，特别是Rhodosporidium toruloides的菌株、红酵母属(Rhodotorula)，特别是粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的菌株、掷孢酵母属(Sporobolomyces)，特别是Sporobolomyces shibatanus的菌株、Thermomyces，特别是Thermomyces lanuginosus(以前为Humicola lanuginosa)的菌株、Thiarosporella，特别是Thiarosporella phaseolina的菌株、木霉(Trichoderma)，特别是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和里氏木霉的菌株、和/或轮枝霉属(Verticillium)的菌株。
在优选的方面，脂肪分解酶或其基因从曲霉属、无色杆菌属、芽孢杆菌属、假丝酵母属、色杆菌属、镰孢属、腐殖菌属、Hyphozyma、假单胞菌属、根毛霉属、根霉属、或Thermomyces获得。
可用于本发明的脂肪酶基因的优选实例是从犁头霉种属(Absidia sp.)(WO 97/027276)、南极假丝酵母(EMBL登录号Z30645)、Candidacylindracea (EMBL登录号X64703、X64704、X66006、X66007、和X66008)、尖孢镰孢(WO 98/26057)、Penicillium camembertii(Yamaguchi etal.，1991，Gene 10361-67)、和Thermomyces lanuginosus(EMBL登录号AF054513)获得的。
在另一个优选的方面，至少一个酯酶是角质酶。角质酶是能够降解角质的酶。角质酶或其基因可从任何来源获得。在优选的方面，角质酶或其基因从曲霉，特别是米曲霉的菌株、链格孢属，特别是甘蓝格链孢的菌株、镰孢，特别是腐皮镰孢、碗豆腐皮镰孢、Fusarium roseum culmorum、或Fusarium roseum sambucium的菌株、Helminthosporum，，特别是Helminthosporum sativum的菌株、腐质霉属，特别是Humicola insolens的菌株、假单孢菌，特别是门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)或Pseudomonas putida的菌株、丝核菌属，特别是Rhizoctonia solani的菌株、链霉菌，特别是Streptomyces scabies的菌株、或单格孢属(Ulocladium)，特别是Ulocladium consortiale的菌株获得。
在最优选的方面，角质酶或其基因从Humicola insolens，特别是Humicola insolens DSM 1800的菌株获得。Humicola insolens角质酶在于此引入作为参考的WO 96/13580中有描述。角质酶基因可编码变体，例如在由此引入作为参考的WO 00/34450和WO 01/92502中公开的变体之一。优选的角质酶变体包括在由此并入作为参考的WO 01/92502的实施例2中列出的变体。角质酶的有效量在0.01和400LU/gDS之间，优选大约0.1至100LU/gDS，更优选1至50LU/gDS。
可用于本发明的角质酶基因的优选实例从腐皮镰孢(WO 90/09446；美国专利号5,827,719；WO 00/34450；和WO 01/92502)、Humicola insolens(WO96/13580)、及其变体获得。
在另一个优选的方面，至少一个酯酶是磷脂酶。如在此使用的，术语“磷脂酶”是对磷脂具有活性的酶。磷脂，例如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由用两个脂肪酸在外侧(sn-1)和中间(sn-2)位置酯化和用磷酸在第三位酯化的丙三醇组成。磷酸可依次被酯化为氨基醇。几种类型的磷脂酶活性可被区别开来，包括水解一个脂酰基(分别在sn-1和sn-2位置)以形成溶血磷脂的磷脂酶A1和A2；和水解溶血磷脂中的剩余脂酰基的溶血磷脂酶(或磷脂酶B)。磷脂酶C和磷脂酶D(二磷酸酯酶(phosphodiesterases))分别释放二酰基丙三醇或磷脂酸。
术语“磷脂酶”包括具有磷脂酶活性的酶，例如磷脂酶A(A1或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性、或磷脂酶D活性。磷脂酶活性可通过具有其他活性的酶来提供，例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。在本发明的其他方面，磷脂酶活性是通过基本上只具有磷脂酶活性并且其中磷脂酶酶活性不是次要活性的酶提供的。
磷脂酶或其基因可以是任何起源的，动物来源(例如，哺乳动物，例如来自牛或猪的胰腺)，或蛇毒或蜂毒来源。备选地，磷脂酶可以是微生物起源的，例如，来自丝状真菌、酵母、或细菌，例如曲霉，例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、和米曲霉；Dictyostelium，例如，Dictyostelium discoideum；镰孢，例如大刀镰孢、异孢镰孢、异孢镰孢、尖孢镰孢、腐皮镰孢、和Fusarium venenatum；毛霉，例如爪哇毛霉(Mucor javanicus)、蜂毛霉(Mucor mucedo)、和Mucorsubtilissimus；链孢酶(Neurospora)，例如粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；根毛霉，例如微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)；根霉属，例如无根根霉(Rhizopusarrhizus)、Rhizopus japonicus、和匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)；Sclerotinia，例如Sclerotinia libertiana；毛癣菌属(Trichopton)，例如红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)；Whetzelinia，例如Whetzelinia sclerotiorum；芽孢杆菌，例如巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如费氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)；爱德华菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)；欧文菌属(Erwinia)，例如草生欧文菌(Erwiniaherbicola)；埃希氏杆菌(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；克雷白菌属(Klebsiella)，例如肺炎克雷白菌(Klebsiella pneumoniae)；变形菌属(Proteus)，例如普通变形菌(Proteus vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)；沙门菌属(Salmonella)，例如Salmonellatyphimurium；沙雷菌属(Serratia)，例如Serratia liquefasciens和粘质沙雷菌(Serratia marcescens)；志贺菌属(Shigella)，例如弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)；链霉菌，例如Streptomyces violeceoruber；和耶尔森菌属(Yersinia)，例如Yersinia enterocolitica。优选的可商业购买的磷脂酶包括LECITASETM和LECITASETMULTRA(获得自Novozymes A/S，Denmark)。
磷脂酶的有效量在0.01和400LU/gDS之间，优选大约0.1至100LU/gDS，更优选1至50LU/gDS。磷脂酶数量的进一步优化可利用本领域已知的标准方法来获得。
磷脂酶的酶活性测定是本领域已知的(参见例如，Kim et al.，1997，Anal.Biochem.250109-116；Wu and Cho，1994，Anal.Biochem.221152-159；Hirashima et al.，1983，Brain and Nerve 35811-817；and Chen et al.，1997，Infection and Immun.65405-411)。
可用于本发明的磷脂酶基因的优选实例从Fusarium venenatum(WO00/028044)、米曲霉(WO 01/029222)、尖孢镰孢(WO 98/26057)、Penicillum notatum获得(Masuda et al.，1991，European Journal of Biochemistry202783-787)、Torulaspora delbrueckii(Watanabe et al.，1994，FEMSMicrobiology Letters 12429-34)、良酒酵母(Lee at al.，1994，Journal ofBiological Chemistry 26919725-19730)、曲霉(JP 10155493)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(EMBL O42791)、和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(EMBL O13857)。
蛋白酶在另一个优选的方面，蛋白酶可用于降解植物细胞壁多糖成为一个或多个产品。可使用蛋白酶，例如来消化蛋白质以产生游离的氨基氮(FAN)，其中这种游离氨基酸起酵母养料的作用，由此增强酵母的生长并且因此增加乙醇的产量。蛋白酶也可释放结合的多糖物质。
用有效量的至少一个蛋白酶繁殖发酵微生物可减少该发酵微生物的滞后时间。蛋白酶在繁殖过程中的作用被认为直接或间接地导致在发酵期间分别对发酵微生物有害或有益的基因的抑制或表达，由此减少滞后时间并且导致更快的发酵循环。
蛋白酶是本领域已知的并且是指催化肽键裂解的酶。合适的蛋白酶包括真菌和细菌的蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性的蛋白酶，即在低于pH 7的酸性条件下以能够水解蛋白质为特征的蛋白酶。酸性的真菌蛋白酶或其基因可从曲霉属、毛霉属、根霉属、假丝酵母属、采绒革盖菌(Coriolus)、Endothia、Enthomophtra、Irpex、青霉属、Sclerotium、和球拟酵母属(Torulopsis)获得。在优选的方面，蛋白酶或其基因获得自优选地，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，如在例如Handbook of ProteolyticEnzymes，Edited by A.J.Barrett，N.D.Rawlings and J.F.Woessner，AcademicPress，San Diego，1998，Chapter 270)中所描述的。
酸性蛋白酶，例如天冬氨酸蛋白酶的酶活性测定是本领域已知的(参见例如，Litvinov et al.，1998，Bioorg.Khim.24175-178)。
可用于本发明的酸性蛋白酶基因的优选实例从泡盛曲霉(Aspergillusawamori)(Berka et al.，1990，Gene 86153-162)、黑曲霉(Koaze et al.，1964，Agr.Biol.Chem.Japan 28216)、Aspergillus saitoi(Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan 2866)、泡盛曲霉(Hayashida et al.，1977，Agric.Biol.Chem.42927-933)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)、和米曲霉(Berka et al.，1993，Gene 125195-198)获得。
过氧化物酶过氧化物酶可以是任何过氧化物酶(例如，EC 1.11.1.7)，或由此获得的任何显示过氧化物酶活性的片段。
过氧化物酶或其基因可从植物(例如，辣根或大豆过氧化物酶)或微生物(例如，真菌或细菌)获得。
一些优选的真菌包括属于Deuteromycotina亚门、丝孢菌(Hyphomycetes)纲，例如，镰孢属、腐殖菌属、Tricoderma、漆斑菌属(Myrothecium)、轮枝霉属(Verticillum)、Arthromyces、Caldariomyces、单格孢属(Ulocladium)、Embellisia、芽枝霉属(Cladosporium)或Dreschlera，特别是尖孢镰孢(DSM2672)、Humicola insolens、Trichoderma resii、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)(IFO 6113)、Verticillum alboatrum、Verticillum dahlie、Arthromycesramosus(FERM P-7754)、Caldariomyces fumago、纸龈枝孢(Ulocladiumchartarum)、Embellisia alli、和Dreschlera halodes的菌株。
其他优选的真菌包括属于担子菌(Basidiomycotina)亚门、担子菌(Basidiomycetes)纲，例如鬼伞属、Phanerochaete、采绒革盖菌(Coriolus)或Tramete，特别是Coprinus cinereus f.microsporus(IFO 8371)、Coprinusmacrorhizus、Phanerochaete chrysosporium(例如NA-12)、或Trametes(以前称为多孔菌属)，例如T.versicolor(例如PR428-A)的菌株。
进一步优选的真菌包括属于接合菌(Zygomycotina)亚门，Mycoraceae纲的菌株，例如根霉属或毛霉属，特别是米赫毛霉(Mucor hiemalis)。
一些优选的细菌包括放线菌目的菌株，例如Streptomyces spheroides(ATTC 23965)、Streptomyces thermoviolaceus(IFO 12382)、和Streptoverticillum verticillium ssp.Verticillium。
其他的优选细菌包括Rhodobacter sphaeroides、Rhodomonas palustri、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、Pseudomonas purrocinia(ATCC 15958)、荧光假单胞菌(NRRL B-11)、和杆菌属菌株，例如短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)(ATCC 12905)和嗜热脂肪芽孢杆菌。
进一步优选的细菌包括属于Myxococcus，例如M virescens的菌株。
在优选的方面，编码过氧化物酶的基因获得自鬼伞属，特别是WO92/16634所述的Coprinus macrorhizus或灰盖鬼伞。
在本发明中，编码过氧化物酶的基因包括从细胞色素、血红蛋白、或过氧化物酶获得的过氧化物酶和过氧化物酶活性片段。
一个过氧化物酶单位(POXU)是在下列条件下每分钟催化1μmole过氧化氢转化酶量在30℃，0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0，0.88mM过氧化氢，和1.67mM2，2’-连氮基-bis(3-乙基苯并噻吩-6-磺酸)(ABTS)。为了418nm处的吸光率变化应在0.15至0.30的范围，跟踪该反应60秒(混合后15秒)。为了计算活性，使用36mM-1cm-1的氧化ABST的吸光系数，和每2μmole氧化ABST转化的1μmoleH2O2的化学计量法。
可用于本发明的过氧化物酶基因的优选实例从Bjerkandera adusta(WO2001/098469)、Ceriporiopsis subvermispora(Conesa et al.，2002，Journal ofBiotechnology 93143-158)、灰盖鬼伞(Conesa et al.，2002，supra)、Phanerochaete chrysosporium(Conesa et al.，2002，supra)、Phlebia radiata(Conesa et al.，2002，supra)、Pleurotus eryngii(Conesa et al.，2002，supra)、和Trametes versicolor(Conesa et al.，2002，supra)获得。
漆酶在本发明中，漆酶可以是任何漆酶或漆酶-相关的酶，包括任何漆酶(EC1.10.3.2)、任何儿茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、任何胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)、或任何单酚单加氧酶(EC 1.14.18.1)。
上述酶或其基因可从微生物，即细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)获得、或它们可从植物获得。
合适的真菌来源包括曲霉、链孢霉，例如粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、Podospora、葡萄孢属、Collybia、多孔菌(Fomes)、Lentinus、Pleurotus、Trametes，例如Trametes villosa和Trametes versicolor、丝核菌属，例如Rhizoctonia solani、鬼伞属，例如灰盖鬼伞、毛头鬼伞(Coprinus comatus)、Coprinus friesii、和Coprinus plicatilis、Psathyrella，例如Psathyrellacondelleana、斑褶菇属(Panaeolus)，例如Panaeolus papilionaceus、Myceliophthora，例如Myceliophthora thermophila、柱霉属(Scytalidium)，例如Scytalidium thermophilum、多孔菌属(Polyporus)、例如Polyporus pinsitus、Pycnoporus、例如Pycnoporus cinnabarinus、Phlebia，例如Phlebia radita(WO92/01046)、或采绒革盖菌(Coriolus)，例如毛革盖菌(Coriolus hirsutus)(JP2-238885)。合适的细菌来源是芽孢杆菌属。
漆酶或其基因优选获得自鬼伞属、Myceliophthora、多孔菌属、Pycnoporus、柱霉属或丝核菌属；特别是灰盖鬼伞、Myceliophthorathermophila、Polyporus pinsitus、Pycnoporus cinnabarinus、Scytalidiumthermophilum、或Rhizoctonia solani。
漆酶活性(LACU)从在好气条件下丁香醛连氮(syringaldazine)的氧化来测定。产生的紫色在530nm处分光光度测量。分析的条件是19mM丁香醛连氮，23mM醋酸缓冲液，pH5.5，30℃，1分钟反应时间。一个漆酶单位(LACU)是在这些条件下每分钟催化1.0μmole丁香醛连氮转化的酶量。
漆酶活性(LAMU)从在好气条件下丁香醛连氮的氧化来测定。产生的紫色在530nm处分光光度测量。分析的条件是19mM丁香醛连氮，23mMTris/马来酸pH7.5，30℃，1分钟反应时间。一个漆酶单位(LAMU)是在这些条件下每分钟催化1.0μmole丁香醛连氮转化的酶量。
可用于本发明的漆酶基因的优选实例获得自Cantharellus cibariusi(Nget al.，2004，Biochemical and Biophysical Research Communications 31337-41)、灰盖鬼伞(WO 97/008325)，Lentinula edodes(Nagai et al.，2002，Applied Microbiology and Biotechnology 60327-335，2002)、Melanocarpusalbomyces (Kiiskinen et al.，2004，FEBS Letters 576251-255，2004)、嗜热毁丝霉(WO 95/006815)、Polyporus pinsitus(WO 96/000290)、Rigidoporus lignosus(Garavaglia et al.，2004，Journal of Molecular Biology 3421519-1531)、Rhizoctonia solani (WO 96/007988)、Scytalidium thermophilum(WO95/033837)、和Tricholoma giganteum(Wang et al.，2004，Biochemical andBiophysical Research Communications 315450-454)。
核酸构建体编码植物细胞壁多糖的降解或转化酶的分离基因，例如，降解纤维素的酶、半纤维素酶、酯酶、漆酶、木质素酶、蛋白酶、或过氧化物酶可以多种方式被操作以提供该酶的表达。在其插入载体之前该基因的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变核苷酸序列的技术是本领域已知的。
术语″核酸构建体″如在此使用的，是指分离自天然存在的基因或已经被改变而以否则不会天然存在的方式包含核酸节段的单链-或双链的核酸分子。当核酸构建体包含为表达本发明的编码序列所需要的调控序列时，术语核酸构建体和术语“表达盒”同义。
术语“调控序列”在此定义为包括为表达具有感兴趣的酶活性的多肽所必需或有益的所有组分。每个调控序列与编码该多肽的核苷酸序列可能是天然或外来的。这种调控序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子信号肽序列、和转录终止子。至少该调控序列包括启动子、和转录和翻译终止信号。调控序列可能为了导入促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区连接的特异限制性位点的目的而拥有连接子。
术语“可操作地连接”如在此使用的，是指其中调控序列被置于相对于DNA序列编码序列的适当位置而使得该调控序列指导多肽表达的构型。
当在此使用时，术语“编码序列”旨在涵盖直接指定其蛋白质产品的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框来确定，其通常从ATG起始密码子或备选的起始密码子，例如GTG和TTG开始。编码序列一般包括DNA、cDNA、和重组的核苷酸序列。
术语“表达”包括涉及生产多肽的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
调控序列可以是适当的启动子序列，由表达该基因的宿主识别的核苷酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变体、截短的、和杂合启动子，并且可从编码与该宿主同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)，Fusarium venenatum Quinn(WO00/56900)、尖孢镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶、和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子杂合体)的基因获得的启动子；及其突变体、截短的、和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。用于酵母宿主的其他有用启动子由Romanos et al.，1992，Yeast8423-488描述。
就植物细胞壁多糖的降解或转化来说，启动子的选择必定需要其受到宿主在多糖生物质上生长的诱导。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主识别以终止转录的序列。终止子序列与编码酶的基因的3’末端可操作连接。在选择的宿主中有功能的任何终止子可用于本发明。
用于丝状真菌宿主的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、里氏木霉CBHI、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶的基因。
用于酵母宿主的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。用于酵母宿主的其他有用的终止子由Romanos et al.，1992，supra描述。
调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与基因的5’末端可操作连接。在选择的宿主中有功能的任何终止子都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得。
用于酵母宿主细胞的合适前导序列获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。
调控序列也可以是多腺苷酸化序列，与基因的3’末端可操作连接，并且当转录时，由宿主识别为向转录的mRNA添加多腺苷残基的信号的序列。在选择的宿主中有功能的任何多腺苷酸化序列都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主的优选多腺苷酸化序列获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
用于酵母宿主的有用多腺苷酸化序列由Guo and Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990描述。
调控序列也可以是编码与酶的氨基末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的酶进入细胞分泌途径的信号肽编码区。基因编码序列的5’端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5’端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列天然地没有包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强酶的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径，即分泌进入培养基的任何信号肽编码区都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主的有效信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶、Humicola lanuginosa脂肪酶、里氏木霉CBHI、里氏木霉CBHII、里氏木霉EGI、和里氏木霉CBHII的基因获得的信号肽编码区。
用于酵母宿主的有用信号肽获得自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他有用的信号肽编码区由Romanos et al.，1992，supra描述。
调控序列也可以是编码位于酶的氨基端的氨基酸序列的前肽编码区。所得到的多肽被称为前酶或前多肽(或有时候为酶原)。前多肽通常是无活性的并且可通过前肽从前多肽的催化或自催化裂解而被转化为成熟的活性酶。前肽编码区可从酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得。
当信号肽和前肽区都存在于酶的氨基端时，前肽区位于紧接着酶的氨基端而信号肽区位于紧接着前肽区的氨基端。
可能也需要添加容许调节酶相对于宿主生长而表达的调节序列。调节系统的实例是导致基因表达根据化学或物理的刺激，包括存在调节化合物而打开或关闭的调节系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可被用作调节序列。调节序列的其他实例是容许基因扩增的调节序列。在真核系统中，这些包括在存在氨甲蝶呤时扩增的二氢叶酸还原酶基因，和伴随重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，基因与调节序列可操作地连接。
表达载体如上所述的各种核酸和调控序列可被连接在一起以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或置换基因的方便的限制性位点的重组表达载体。备选地，基因可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体而被表达。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达的适当调控序列。
术语“表达载体”包括线性或环形的DNA分子，其包括编码酶的节段，并且其可操作地连接保证其转录的附加节段。
重组表达载体可以是能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣基因表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。
载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。
载体优选包含一个或多个容许容易选择转化宿主的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。。
用于酵母宿主的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于丝状真菌宿主的可选择标记包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(phosphinothricin转乙酰酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，及其等同物。优选用于曲霉的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，和Streptomyces hygroscopicus的bar基因。优选用于木霉属的是bar和amdS。
载体优选包含容许载体整合进入宿主基因组或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
对于整合进入宿主基因组，载体可依赖于基因的序列或用于通过同源或非同源重组使该载体整合进入基因组的载体的任何其他元件。备选地，载体可包含用于指导通过同源重组整合进入宿主基因组的附加核苷酸序列。附加的核苷酸序列使该载体能够在染色体的精确位置被整合进入宿主基因组。为了增加在精确位置整合的可能性，该整合元件应优选包含足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、优选400至10,000个碱基对，最优选800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列是高度同源的以增强同源重组的概率。该整合元件可以是与宿主基因组中靶序列同源的任何序列。此外，该整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组被整合进入宿主的基因组。
对于自主复制，该载体可进一步包括使载体能够在所述的宿主中自主复制的复制原点。复制原点可以是在细胞中起作用的调节自主复制的任何质粒复制子。术语“复制原点”或“质粒复制子”在此定义为使质粒或载体能够体内复制的序列。用于酵母宿主的复制原点的实例是2个微粒复制原点，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。用于丝状真菌细胞的复制原点的实例是AMA1和ANS1(Gems et al.，1991，Gene9861-67；Cullen et al.，1987，Nucleic Acids Research 159163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883中公开的方法来实现。
一个以上拷贝的基因可被插入宿主以增加该基因产物的产量。基因拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的基因整合进入宿主基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该核苷酸序列来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝基因的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法对于本领域的技术人员来说是已知的(参见例如，Sambrook et al.，1989，supra)。
制备耗尽的完全发酵肉汤在本发明的方法中，重组微生物耗尽的完全发酵肉汤的制备可利用本领域已知的任何培养方法来实现而导致植物细胞壁多糖降解或转化酶的表达。因此发酵可被理解为包括摇瓶培养，在实验室或工业发酵罐中，在合适的培养基中并且在容许纤维素酶表达或分离的条件下进行的小-或大规模的发酵(包括连续的、分批的、饲喂-分批的、或固态发酵)。术语“耗尽的完全发酵肉汤”在此定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如酶)、和细胞生物质的发酵材料的未分馏内容物。可理解术语“耗尽的完全发酵肉汤”也包括已经利用本领域的已知方法裂解或透化的细胞生物质。
通常重组微生物培养在适于生产具有植物细胞壁降解或转化活性的酶的培养基中。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)来制备。适于生长和纤维素酶生产的温度范围及其他条件是本领域已知的(参见例如，Bailey，J.E.，andOllis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-Hill BookCompany，NY，1986)。
酶可利用本领域已知的特异于例如上述多肽的方法来检测。
在本发明的方法中，耗尽的完全发酵肉汤优选是“原样”(as is)使用而没有任何加工或最小处理的，例如冷冻以保持活性、热处理以防止或降低生物体存活力、或加入预防或降低生物体存活力的化学试剂。
耗尽的完全发酵肉汤的降解纤维素活性可利用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来测定。羧甲基纤维素(CMC)的水解降低测定混合物的粘度，其可通过振动粘度计来测定(例如，MIVI 3000 from Sofraser，France)。按照纤维素酶粘度单位CellulaseViscosityUnit(CEVU)测量的纤维素降解活性的测定，通过测量该样品减少羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力定量了存在于耗尽的完全发酵肉汤中催化活性的数量。该测定在40℃；pH9.0；0.1M磷酸盐缓冲液；时间30分钟；CMC底物(33.3g/L羧甲基纤维素Hercules7LFD)；酶浓度为大约3.3-4.2CEVU/ml进行。CEVU活性相对于公布的酶标准，例如CelluzymeTM标准17-1194(获得自Novozymes A/S，Bagsvrd，Denmark)来计算。
其他的酶活性可如在此描述的加以测量。
添加物在本发明的方法中，耗尽的完全发酵肉汤可补充有不是由重组微生物表达的一种或多种酶活性以改善植物细胞壁多糖的降解或转化。
优选的附加酶包括但不限于，内切葡聚糖酶(纤维素酶)、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内-β-1，3(4)-葡聚糖酶、葡萄糖水解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶，α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰基酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶酸裂合酶、胶质裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰基酯酶、果胶甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶、木糖半乳糖醛酸苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木质素过氧化物酶、锰-依赖的过氧化物酶、具有木质素过氧化物酶和锰-依赖的过氧化物酶综合性能的杂合过氧化物酶、和漆酶。
酶可从合适的微生物或植物来源或通过如在此描述的重组方式获得或可从商业来源获得。
作为添加物加入耗尽的完全肉汤的附加酶可“原样”使用或可被纯化。术语“原样”如在此使用的，是指通过没有经历或经历最小回收和/或纯化的发酵所产生的酶制剂。术语″纯化的″如在此使用的，涵盖来自获得其的生物体的没有其他成分的酶。术语″纯化的″如在此使用的，也涵盖来自获得其的天然生物体的没有其他成分的酶。该酶可被纯化，而只有少量的其他蛋白质存在。术语″纯化的″如在此使用的，也是指除去其他的成分，特别是其他的蛋白质，以及最特别的是存在于酶来源的细胞中的其他酶。该酶可以是″基本上纯的″，也就是说，没有来自其中产生该酶的生物体，即例如通过重组方式产生酶的宿主生物体的其他成分。在优选的方面，酶是如通过SDS-PAGE所测定的至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，更优选至少80％纯，更优选至少90％纯，最优选至少95％纯，以及最优选至少99％纯。
当酶是从合适的微生物或植物来源或通过重组方式获得时，该酶可利用本领域已知的回收方法回收。例如，酶可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀而从培养基回收。
酶可通过本领域已知的多种方法纯化，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲合性的、疏水性的、色谱聚焦、和大小排阻)、电泳方法(例如，预备的等电聚焦)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
酶也可从商业来源获得。
适用于本发明的纤维素酶的实例包括例如，CELLUCLASTTM(可获得自Novozymes A/S)、NOVOZYMTM188(可从Novozymes A/S获得)。包括可被使用的纤维素酶的其他可商业购买制剂包括CELLUZYMETM、CEREFLOTM和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)、LAMINEXTM和SPEZYMETMCP(Genencor Int.)和ROHAMENTTM7069W(Rhm GmbH)。加入纤维素酶的有效量是固体的大约0.001至5.0％wt.，更优选固体的大约0.025％至4.0％wt.，以及最优选固体的大约0.005％至2.0％wt.。
包括木聚糖酶的可商业购买的优选制剂包括SHEARZYME、BIOFEED WHEAT、BIO-FEED PlusL、CELLUCLAST、ULTRAFLO、VISCOZYME、PENTOPAN MONOBG、PULPZYMEHC(NovozymesA/S)；LAMINEX、SPEZYMECP(Genencor Int.)。优选加入半纤维素酶的有效量是固体的大约0.001至5.0％wt.，更优选固体的大约0.025至4.0wt.，以及最优选固体的大约0.005至2.0wt.。
包括半纤维素酶的可商业购买的优选制剂包括VISCOZYMETM(Novozymes A/S)。加入半纤维素酶的有效量是固体的大约0.001至5.0％wt.，更优选固体的大约0.025％至4.0％wt.，以及最优选固体的大约0.005％至2.0％wt.。
优选的商业化脂肪酶包括LECITASETM、LIPOLASETM和LIPEXTM(Novozymes A/S，Denmark)和G AMANOTM50(Amano)。脂肪酶优选以大约1至400LU/gDS的数量添加或存在，优选1至10LU/gDS，更优选1至5LU/gDS。
优选的商业化磷脂酶包括LECITASETM和LECITASETMULTRA(Novozymes A/S，Denmark)。
优选的商业化蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、和NEUTRASETM(Novozymes A/S)、GC106(Genencor Int，Inc.)、和NOVOZYMTM50006(Novozymes A/S)。
用于本发明的附加酶可以是适用于在此描述的方法的任何形式，例如干燥粉末或颗粒状、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体、或保护酶的形式。颗粒可例如，如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开的来生产，并且可任选地通过本领域已知的方法来包被。液体酶制剂可例如根据已建立方法，通过加入例如糖、糖醇或另一种多元醇、乳酸或另一种有机酸的稳定剂来稳定。保护酶可根据EP 238,216中公开的方法来制备。
植物细胞壁多糖的加工本发明的方法可用于生产作为来自生物质的化学或发酵原料的单糖、二糖、和多糖而用于生产有机产品、化学和燃料、塑料、及其他产品或中间产品。特别地，加工残余物(干燥的蒸馏谷物、来自酿酒的酒糟、甘蔗甜菜渣等)的价值可通过纤维素或半纤维素的部分或完全增溶而增加。除乙醇外，可从和半纤维素生产的一些商品和特殊化学品包括木糖、丙酮、醋酸酯(acetate)、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如乳酸)、1，3-丙二醇、丁二醇、丙三醇、乙二醇、糠醛、polyhydroxyalkanoates、cis、顺式粘康酸、和动物饲料(Lynd，L.R.，Wyman，C.E.，and Gemgross，T. U.，1999，Biocommodity engineering，Biotechnol.Prog.，15777-793；Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，in Handbook on BioethanolProduction and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；and Ryu，D.D.Y.，and Mandels，M.，1980，Cellulasesbiosynthesis and applications，Enz.Microb.Technol.，291-102)。潜在的农产品效益延伸超过来自发酵性碳水化合物的多种有机产物的合成。植物细胞壁多糖的生物加工后剩余的富含木质素的残余物可被转化为木质素获得的化学品，或被用于动力生产(Lynd et al.，1999，supra；Philippidis，1996，supra；Ryu and Mandels，1980，supra)。
根据本发明方法的用于加工植物细胞壁多糖的常规方法是本领域技术人员很好理解的。本发明的方法可利用根据本发明而配置操作的任何传统的生物质加工设备来被实现。
这种设备可包括但不限于，分批搅拌的反应器、具有超滤作用的恒流搅拌反应器、连续推流柱的反应器(Gusakov，A.V.，and Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose1.A mathematical modelfor a batch reactor process，Enz.Microb.Technol.，7346-352)、摩擦反应器(Ryu，S.K.，and Lee，J.M.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using anattrition bioreactor，Biotechnol.Bioeng.，2553-65)、或通过电磁场感应具有加强搅拌的反应器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.，Protas，O.V.，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using anovel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.Biotechnol.，56141-153)。
常规方法包括但不限于糖化、发酵、单独的水解和发酵(SHF)、同时发生的糖化和发酵(SSF)、同时发生的糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、和直接的微生物转化(DMC)。
SHF使用单独的加工步骤，首先酶促水解纤维素为葡萄糖然后发酵葡萄糖为乙醇。在SSF中，纤维素的酶促水解和葡萄糖发酵至乙醇组合为一个步骤(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，inHandbook on BioethanolProduction and Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF包括多种糖的共同发酵(Sheehan，J.，and Himmel，M.，1999，Enzymes，energy and the environmentA strategicperspective on the U.S.Department of Energy’s research and developmentactivities for bioethanol，Biotechnol.Prog.，15817-827)。混合的水解和发酵(HHF)加工包括在相同反应器中但在不同温度进行的两个单独步骤，高温酶促糖化，然后是在该发酵菌株能够忍受的较低温度的SSF。DMC组合全部的3个步骤(纤维素酶生产、纤维素水解、和发酵)成为一个步骤(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，and Pretorius，I.S.，2002，Microbialcellulose utilizationFundamentals and biotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews，66506-577)。
“发酵”或“发酵方法”是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。发酵方法包括而不限于用于生产包括乙醇(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇、甲醇、1，3-丙二醇、山梨糖醇、和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、蚁酸(formic acid)、富马酸(fumaric acid)、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、丁二酸、和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、和苏氨酸)；和/或气体(例如，甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)、和一氧化碳(CO))的发酵产品的发酵方法。发酵方法也包括用于可消费乙醇工业(例如、啤酒和葡萄酒)、乳业(例如、发酵乳制品)、皮革工业、和烟草工业的发酵方法。
本发明也涉及用于生产一种或多种有机物的方法、包括(a)用有效量重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤糖化植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一个或多个编码降解或转化该植物细胞壁多糖成为糖化材料的酶的异源基因；(b)用一个或多个发酵微生物使步骤(a)的糖化材料发酵；以及(c)从该发酵物回收一种或多种有机物。
有机物可以是来源于发酵的任何物质。在优选的方面，有机物是醇类。可理解术语“醇类”包括包含一个或多个羟基部分的有机物。在更优选的方面，醇类是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面，醇类是丁醇。在另一个更优选的方面，醇类是乙醇。在另一个更优选的方面，醇类是丙三醇。在另一个更优选的方面，醇类是甲醇。在另一个更优选的方面，醇类是1，3-丙二醇。在另一个更优选的方面，醇类是山梨糖醇。在另一个更优选的方面，醇类是木糖醇。参见例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，and Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，in Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper，T.，ed.，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65207-241；Silveira，M.M.，and Jonas，R.，2002，Thebiotechnological production of sorbito1，Appl.Microbiol.Biotechnol.59400-408；Nigam，P.，and Singh，D.，1995，Processes for fermentative productionof xylitol-a sugar substitute，Process Biochemistry 30(2)117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.and Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol andethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping，World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6)595-603。
在另一个优选的方面，有机物是有机酸。在另一个更优选的方面，有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，有机酸是蚁酸。在另一个更优选的方面，有机酸是富马酸。在另一个更优选的方面，有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，有机酸是戊二酸。在另一个更优选的方面，有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，有机酸是丁二酸。在另一个更优选的方面，有机酸是木糖酸。参见例如，Chen，R.，and Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid productionfrom cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65435-448。
在另一个优选的方面，有机物是酮类。可理解术语“酮类”包括包含一个或多个酮部分的有机物。在另一个更优选的方面，酮类是丙酮。参见例如，Qureshi and Blaschek，2003，supra。
在另一个优选的方面，有机物是醛类。在另一个更优选的方面，醛类是糠醛。
在另一个优选的方面，有机物是氨基酸。在另一个更优选的方面，有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是丙氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是精氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是天门冬酰胺。在另一个更优选的方面，氨基酸是谷氨酰胺。在另一个更优选的方面，氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是组氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是异亮氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是亮氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是甲硫氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是苯基丙氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是脯氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是苏氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是色氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是酪氨酸。在另一个更优选的方面，氨基酸是缬氨酸。参见例如，Richard，A.，and Margaritis，A.，2004，Empirical modelingof batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and othermicrobial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering87(4)501-515。
在另一个优选的方面，有机物是气体。在另一个更优选的方面，气体是甲烷(CH4)。在另一个更优选的方面，气体是氢(H2)。在另一个更优选的方面，气体是二氧化碳(CO2)。在另一个更优选的方面，气体是一氧化碳(CO)。参见例如，Kataoka，N.，A.Miya，and K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogenproduction by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobicbacteria，Water Science and Technology 36(6-7)41-47；and Gunaseelan V.N.inBiomass and Bioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion ofbiomass for methane productionA review。
从多糖，例如纤维素生产有机物，一般需要4个主要步骤。这4个步骤是预处理、酶促水解、发酵、和回收。下列的例证是用于生产乙醇的方法，但可理解相似的方法可用于生产其他的有机物，例如如上所述的物质。
预处理在预处理或预水解步骤中，纤维素质受热破坏木质素和碳水化合物结构以使得纤维素部份易受纤维素分解酶作用。加热用蒸汽直接进行或在浆液中进行，其中也可将催化剂加入材料以加速反应。催化剂包括强酸，例如硫酸和SO2，或碱，例如氢氧化钠。预处理阶段的目的是促进酶和微生物的渗透。纤维素生物质也可经受水热蒸汽喷发预处理(参见美国专利申请号20020164730)。
糖化作用。在酶促水解步骤中，亦称为糖化作用，如在此描述的酶被加入预处理材料以转化纤维素部份成为葡萄糖和/或其他糖。糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中在控制的pH、温度、和混合条件下进行。糖化步骤可持续达到200个小时。糖化可在大约30℃至大约65℃的温度范围进行，特别是大约50℃，并且在pH范围为大约4和大约5之间，特别是大约pH 4.5进行。为了生产可被酵母代谢的葡萄糖，水解一般在存在β-葡糖苷酶时进行。
发酵。在发酵步骤中，由于预处理和酶促水解步骤释放自植物细胞壁多糖的糖被例如酵母的发酵生物，或发酵生物群发酵为一种或多种有机物，例如乙醇。发酵还可与酶促水解在相同的容器中也在控制的pH、温度和混合条件下同时进行。当糖化和发酵在相同容器中同时进行时，该方法通常称为同时发生的糖化和发酵或SSF。
任何合适的植物细胞壁生物质可用于本发明的发酵方法。植物细胞壁生物质通常根据所需要的发酵产品和使用的方法加以选择，这是本领域众所周知的。适用于本发明方法的底物的实例包括包含纤维素的材料，例如木材或植物残余物或获得自可被发酵微生物代谢的加工植物细胞壁多糖的低分子糖DP1-3，并且其可通过直接加入发酵培养基而补充。
术语“发酵培养基”可理解为是指加入发酵微生物前的培养基，例如由糖化方法产生的培养基，以及用于同时发生的糖化和发酵方法(SSF)的培养基。
“发酵微生物”是指适用于所需要发酵方法的任何微生物。本发明所述的合适发酵微生物能够发酵，即直接或间接转化糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、或寡聚糖成为所需要的发酵产品。发酵微生物的实例包括真菌生物体，例如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母的菌株。可商业购买的酵母包括例如，Red Star/Lesaffre EthanolRed(可获得自Red Star/Lesaffre，USA)FALI(available from Fleischmann’sYeast，a division of Burns Philp Food Inc.，USA)，SUPERSTART(availablefrom Alltech)、GERT STRAND(可获得自Gert Strand AB，Sweden)和FERMIOL(可获得自DSM Specialties)。其他的微生物也可根据所需要的发酵产品而被使用。这些其他的微生物包括革兰氏阳性细菌，例如，乳杆菌属，例如乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，丙酸杆菌属(Propionibacterium)，例如Propionibacterium freudenreichii；梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，例如Clostridium butyricum、Clostridium beijerinckii、Clostridium diolis、Clostridiumacetobutylicum、和Clostridium thermocellum；革兰氏阴性细菌，例如，单胞发酵菌属(Zymomonas)，例如Zymomonas mobilis；和丝状真菌，例如米根霉(Rhizopus oryzae)。
在优选的方面，酵母是酵母种属。在更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Saccharomyces distaticus。在另一个更优选的方面，酵母是Saccharomyces uvarum。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维氏酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)。在另一个更优选的方面，酵母是Candida brassicae。在另一个优选的方面，酵母是Clavispora。在另一个更优选的方面，酵母是卢西坦棒孢(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是Clavispora opuntiae。在另一个更优选的方面，酵母是Pachysolen。在另一个更优选的方面，酵母是Pachysolen tannophilus。在另一个优选的方面，酵母是Bretannomyces。在另一个更优选的方面，酵母是Bretannomyces clausenii(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，in Handbook on BioethanolProductionand Utilization，Wyman，C.E.，ed.，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。
可有效发酵葡萄糖为乙醇的细菌包括例如，Zymomonas mobilis和Clostridium thermocellum(Philippidis，1996，supra)。
本领域已知如上所述的生物体还可用于生产在此描述的其他有机物。
将异源基因克隆进入酿酒酵母(Chen，Z.，Ho，N.W.Y.，1993，Cloning andimproving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene inSaccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.，39-40135-147；Ho，N.W.Y.，Chen，Z，Brainard，A.P.，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.641852-1859)，或细菌，例如大肠杆菌(Beall，D.S.，Ohta，K.，Ingram，L.O.，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38296-303)、Klebsiella oxytoca(Ingram，L.O.，Gomes，P.F.，Lai，X.，Moniruzzaman，M.，Wood，B.E.，Yomano，L.P.，York，S.W.，1998，Metabolic engineering of bacteriafor ethanol production，Biotechnol.Bioeng.，58204-214)、和Zymomonasmobilis(Zhang，M.，Eddy，C.，Deanda，K.，Finkelstein，M.，and Picataggio，S.，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenicZymomonas mobilis，Science，267240-243；Deanda，K.，Zhang，M.，Eddy，C.，and Picataggio，S.，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonasmobilis strain by metabolic pathway engineering，Appl.Environ.Microbiol，624465-4470)已经导致能够转化己糖和戊糖为乙醇(共发酵)的生物体的构建。
酵母或其他的微生物一般被加入水解产物并且容许发酵进行24-96个小时，例如35-60个小时。温度一般在26-40℃之间，特别是在大约32℃，并且在pH3-6，特别是大约pH4-5。
在优选的方面，酵母被应用于水解产物并且发酵进行24-96个小时，例如一般为35-60个小时。在另一个优选的方面，温度通常在26-40℃之间，特别是大约32℃，并且pH通常是pH3至6，优选大约pH4-5。酵母细胞优选用量为每ml发酵肉汤105至1012，优选107至1010，尤其是5×107个活酵母计数。在乙醇生产阶段期间，酵母细胞计数应优选范围是107至1010，尤其是大约2×108。关于利用酵母发酵的进一步指导可在例如中“The Alcohol Textbook”(Editors K.Jacques，T.P.Lyons and D.R.Kelsall，Nottingham University Press，United Kingdom 1999)找到，其在此引入作为参考。
本领域中最广泛使用的方法是同时发生的糖化和发酵(SSF)方法，其中没有糖化的保持阶段，意味着该发酵微生物和酶被一起加入。
对于乙醇生产，发酵后，蒸馏糊状物以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作例如，燃料乙醇；饮料乙醇，即，可饮用的中性酒精、或工业乙醇。
发酵刺激物可与在此描述的任何酶促方法组合使用以进一步改善该发酵方法，以及特别地，改善发酵微生物的性能，例如增强速率和提高乙醇产率。“发酵刺激物”是指用于发酵微生物，特别是酵母生长的刺激物。用于生长的优选发酵刺激物包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸盐、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、和维生素A、B、C、D、和E。参见例如，Alfenore et al.，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process，”Springer-Verlag(2002)，其在此引入作为参考。矿物质的实例包括可提供包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn、和Cu的养分的矿物质和无机盐。
回收。发酵后，感兴趣的有机物通过本领域已知的任何方法从糊状物回收。这种方法包括但不限于，色谱法(例如离子交换、亲合的、疏水性的、色谱聚焦、和大小排阻)、电泳方法(例如预备的等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、蒸馏、或萃取。例如，在乙醇发酵中，醇类从发酵的植物细胞壁多糖分离并且通过常规的蒸馏方法纯化。可获得纯度达到大约96vol.％乙醇的乙醇，其可用作例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，可饮用的中性酒精、或工业乙醇。
本发明通过不应被理解为限制本发明范围的下列实例进一步描述。
实施例材料用作缓冲液和底物的化学制品至少是试剂级的商品。
菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)(同义词Hypocrea jecorina)RutC30用作纤维素酶的来源。里氏木霉RutC30获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC56765)。里氏木霉SMA135-04是携带有在里氏木霉cbh1基因启动子转录调控下表达的多拷贝米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶基因的里氏木霉RutC30的重组衍生物。
实施例1pAlLo01表达载体的构建表达载体pAlLol通过改变包括来自黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子杂合体(NA2-tpi启动子)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子序列(AMG终止子)、和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶基因(amdS)的pBANe6(美国专利号6,461,837)构建。全部诱变步骤通过利用Big-DyeTM终止剂化学(Applied Biosystems，Inc.，FosterCity，CA)测序验证。pBANe6的改变首先通过定点诱变从amdS选择标记的第2051、2722、和3397bp位置消除3个Nco I限制位点来进行。全部变化被设计为是“沉默的”而使得amdS基因产物的实际蛋白序列并没有变化。这3个位点的除去根据制造商的指导用GeneEditorTM体外定点诱变试剂盒(Promega，Madison，WI)，利用下列引物(加下划线的核苷酸表示变化的碱基)同时进行AMDS3NcoMut(2050)5’-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQ ID NO1)AMDS2NcoMut(2721)5’-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQ ID NO2)AMDS1NcoMut(3396)5’-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3’(SEQ ID NO3)包括全部3个预期序列变化的质粒然后利用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)经受定点诱变，以消除第1643位AMG终止子末端的Nco I限制位点。下列引物(加下划线的核苷酸表示变化的碱基)被用于诱变
诱变AMG终止子序列的上游引物5’-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQ ID NO4)诱变AMG终止子序列的下游引物5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQ ID NO5)pBANe6改变的最后步骤是利用QuickChangeTM定点诱变试剂盒和下列引物(加下划线的核苷酸表示变化的碱基)在多接头的起始加入新的Nco I限制位点以产生pAlLol(图6)。
诱变NA2-tpi启动子的上游引物5’-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3’(SEQ ID NO6)诱变NA2-tpi启动子的下游引物5’-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3’(SEQ ID NO7)实施例2pMJ04表达载体的构建表达载体pMJ04通过利用如下所示的引物993429(反义)和993428(正义)从里氏木霉RutC30基因组DNA PCR扩增里氏木霉纤维二糖外切水解酶1基因(cbh1)终止子来构建。反义引物被工程化为在5’-端具有PacI位点，而在正义引物的3’-端具有SpeI位点。
引物993429(反义)5’-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3’(SEQ ID NO8)引物993428(正义)5’-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3’(SEQ ID NO9)里氏木霉RutC30基因组DNA利用Dneasy Plant大提试剂盒(QIAGENInc.，Valencia，CA)来分离。
扩增反应(50μl)由1×ThermoPol反应缓冲液(New England BioLabs，Beverly，MA)，0.3mM dNTPs，100ng里氏木霉RutC30基因组DNA，0.3μM引物993429，0.3μM引物993428，和2单位Vent聚合酶(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler 5333中，程序设置如下30个循环的94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，30秒(15分钟最终延伸)。
反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上，利用40mM Tis碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液分离，其中从凝胶切下229bp的产物条带并根据制造商的指导利用QIAGEN QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
所得到的PCR片段用PacI和SoeI消化，并利用快速连接试剂盒(Roche，Indianapolis，IN)连接到用相同限制酶消化的以产生pMJ04(图2)。
实施例3pCaHj568表达载体的构建表达质粒pCaHj568从pCaHj170(美国专利5,763,254)和pMT2188构建。质粒pCaHj170包括Humicola insolens内切葡聚糖酶V(EGV)编码区。质粒pMT2188如下构建pUC19复制原点用下列所示的引物142779和142780从pCaHj483(WO 98/00529)PCR扩增。引物142780在PCR片段中导入BbuI位点。
1427795’-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3’(SEQ ID NO10)1427805’-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3’(SEQ ID NO11)扩展(Expand)PCR系统(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switserland)根据制造商的指导被用于此扩增和随后的PCR扩增。PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，并且分离出1160bp的片段并利用Jetquick凝胶提取旋转试剂盒(Genomed，Wielandstr，Germany)纯化。
利用下列引物14028和142778从普通的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)克隆表达载体pYES2(Invitrogen，Carlsbad，CA)扩增URA3基因。引物140288在PCR片段中导入Eco RI位点。
1402885’-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3’(SEQ ID NO12)1427785’-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3’(SEQ ID NO13)PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，并且分离出1126bp的片段，利用Jetquick凝胶提取旋转试剂盒纯化。
2个PCR片段通过混合来融合且利用上述所示的引物142780和140288通过重叠法拼接(Horton et al.，1989，Gene 7761-68)扩增。PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，并分离出2263bp的片段，利用Jetquick凝胶提取旋转试剂盒纯化。
所得到的片段用Eco RI和BbuI消化，并连接至用相同酶消化的pCaHj483的最大片段。连接混合物用于转化通过Mandel and Higa，1970，J.Mol.Biol.45154的方法被制备为感受态的pyrF E.coli菌株DB6507(ATCC 35673)。转化子在每升补充有1g casamino acids，500μg硫胺素，和10mg卡那霉素的固态M9培养基(Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)上被选择出来。从一个转化子分离质粒，并被命名为pCaHj527(图3)。
存在于pCaHj527上的NA2/tpi启动子通过简单的PCR方法进行定点诱变。利用诱变引物141223，第134-144位核苷酸从GTACTAAAACC被转换为CCGTTAAATTT引物1412235’-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3’(SEQ ID NO14)利用诱变引物141222，第423-436位核苷酸从ATGCAATTTAAACT被转换为CGGCAATTTAACGG引物1412225’-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3’(SEQ ID NO15)所得到的质粒被命名为pMT2188(图4)。
Humicola insolens内切葡聚糖酶V编码区从pCaHj170作为Bam HI-SalI片段被转移进入用Bam HI和Xho I消化的pMT2188以产生pCaHj568(图5)。
实施例4pMJ05表达载体的构建表达载体pMJ05利用下列所示的引物HiEGV-F和HiEGV-R，通过PCR扩增来自pCaHj568的915bp的Humicola insolens内切葡聚糖酶V编码区来构建。
HiEGV-F(正义)5’-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’(SEQ ID NO16)HiEGV-R(反义)5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO17)扩增反应物(50μl)由1×ThermoPol反应缓冲液，0.3 mM dNTPs，10 ng/μlpCaHj568质粒，0.3μM HiEGV-F引物，0.3μM HiEGV-R引物，和2U Vent聚合酶组成。该反应物孵育在EppendorfMastercycler5333中，程序设置如下5个循环的94℃，30秒；50℃，30秒；和72℃，60秒；然后是25个循环的94℃，30秒；65℃，30秒；和72℃，120秒(5分钟的最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下937bp的产物条带，并根据制造商的指导利用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
这个937bp的纯化片段被用作使用下列引物的后继扩增的模板DNAHiEGV-R(反义)5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO18)HiEGV-F-重叠(正义)5’-ACCGCGGACTGCGCATCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’(SEQ IDNO19)斜体的引物序列与17bp的里氏木霉cbh1启动子同源，而加下划线的引物序列与29bp的Humicola insolens内切葡聚糖酶V编码区同源。启动子和编码序列之间36bp的重叠容许包括里氏木霉cbh1启动子的994bp片段与包括Humicola insolens内切葡聚糖酶V开放阅读框的918bp片段的精确融合。
扩增反应物(50μl)由1×ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，1ul937bp纯化的PCR片段，0.3μM HiEGV-F-重叠引物，0.3μM HiEGV-R引物，和2U Vent聚合酶组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler5333中，程序设置如下5个循环的94℃，30秒；50℃，30秒；和72℃，60秒；然后是25个循环的94℃，30秒；65℃，30秒；和72℃，120秒(5分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下945bp的产物条带，并用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导进行纯化。
利用下列引物(正义引物被工程化为在5’-端具有SalI限制位点)，进行单独的PCR来扩增从来自里氏木霉RutC30基因组DNA的基因的ATG起始密码子上游994bp延伸的里氏木霉cbh1启动子序列TrCBHIpro-F(正义)5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO20)TrCBHIpro-R(反义)
5’-GATGCGCAGTCCGCGGT-3’(SEQ ID NO21)扩增反应物(50μl)由1×ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，100ng里氏木霉RutC30基因组DNA，0.3μM TrCBHIpro-F引物，0.3μMTrCBHIpro-R引物，和2U Vent聚合酶组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler 5333中，程序设置如下30个循环的94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，120秒(5分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下998bp的产物条带，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导纯化。
998bp纯化的PCR片段被用作使用下列引物的后继扩增的模板DNATrCBHIpro-F5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO22)TrCBHIpro-R-重叠5’-GGAGGGGGGAGGAACGCATGATGCGCAGTCCGCGGT-3’(SEQ IDNO23)斜体的序列与17bp的里氏木霉cbh1启动子同源，而加下划线的序列与29bp的Humicola insolens内切葡聚糖酶V编码区同源。启动子和编码序列之间的36bp重叠容许包括里氏木霉cbh1启动子的994bp片段与包括Humicola insolens内切葡聚糖酶V开放阅读框的918bp片段的精确融合。
扩增反应物(50μl)由1×ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，1μl998bp纯化的PCR片段，0.3μM TrCBH1pro-F引物，0.3μM TrCBH1pro-R-重叠引物，和2 U Vnt聚合酶组成。反应物孵育在Eppendorf Mastercycler 5333中，程序设置如下5个循环的94℃，30秒；50℃，30秒；和72℃，60秒；然后是25个循环的94℃，30秒；65℃，30秒；和72℃，120秒(5分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下1017bp的产物条带，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导纯化。
1017bp的里氏木霉cbh1启动子PCR片段和945bp的Humicolainsolens内切葡聚糖酶V PCR片段被用作使用下列引物的后继扩增的模板DNA，以利用重叠搭接(overlapping)PCR精确融合994bp的里氏木霉cbh1启动子和918bp的Humicola insolens内切葡聚糖酶V编码区TrCBHIpro-F5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO24)
HiEGV-R5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO25)扩增反应物(50μl)由1×ThermoPol反应缓冲液，0.3mM dNTPs，0.3μMTrCBH1pro-F引物，0.3μM HiEGV-R引物，和2U Vent聚合酶组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler 5333中，程序设置如下5个循环的94℃，30秒；50℃，30秒；和72℃，60秒；然后是25个循环的94℃，30秒；65℃，30秒；和72℃，120秒(5分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下1926bp的产物条带，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导纯化。
所得到的1926bp片段利用ZeroBlunt TOPO PCR克隆试剂盒根据制造商的方案克隆到pCR-Blunt-II-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。所得到的质粒用NotI和SalI消化，纯化1926bp的片段，并且连接到也用相同的2个限制酶消化的pMJ04中以产生pMJ05(图6)。
实施例5pSMai130表达载体的构建跨越ATG起始密码子至TAA终止密码子的米曲霉β-葡糖苷酶编码序列的2586bp DNA片段(SEQ ID NO26的cDNA序列和SEQ ID NO27推导的氨基酸序列；E coli DSM 14240)从作为模板的pJaL660(WO2002/095014)，用下列所示的引物993467(正义)和993456(反义)通过PCR扩增。SpeI位点被工程化至反义引物的5’端以促进连接。斜体的引物序列与24 bp的里氏木霉cbh1启动子同源，而加下划线的序列与22bp的米曲霉β-葡糖苷酶编码区同源。
引物9934675’-ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTTGGTTGGATCGAGG-3’(SEQ IDNO28)引物9934565’-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3’(SEQ ID NO29)扩增反应物(50μl)由Pfx扩增缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，0.25mMdNTPs，10ng pJaL660质粒，6.4μM引物993467，3.2μM引物993456，1mMMgCl2，和2.5U Pfx聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，California)组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler5333中，程序设置如下30个循环的94℃，60秒；55℃，60秒；和72℃，180秒(15分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下2586bp的产物条带，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导纯化。
进行单独的PCR以利用下列所示的引物993453(正义)和引物993463(反义)扩增从基因的ATG起始密码子上游1000bp延伸的里氏木霉cbh1启动子序列以产生1000bp的PCR片段。斜体的引物序列与24bp的里氏木霉cbh1启动子同源，而加下划线的引物序列与22bp的米曲霉β-葡糖苷酶编码区同源。启动子和编码序列之间46bp的重叠容许包括里氏木霉cbh1启动子的1000bp片段与包括米曲霉β-葡糖苷酶开放阅读框的2586bp片段的精确融合。
引物9934535’-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3’(SEQ ID NO30)引物9934635’-CCTCGATCCAACCAAGCTTCATGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA-3’(SEQ ID NO31)扩增反应物(50μl)由Pfx扩增缓冲液，0.25mM dNTPs，100ng里氏木霉RutC30基因组DNA，6.4μM引物993453，3.2μM引物993463，1mMMgCl2，和2.5U Pfx聚合酶组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler5333中，程序设置如下30个循环的94℃，60秒；55℃，60秒；和72℃，180秒(15分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下1000bp的产物条带，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导纯化。
纯化的片段用作使用上述所示引物993453(正义)和引物993456(反义)的后继扩增的模板DNA，以通过重叠搭接PCR精确融合1000bp的里氏木霉cbh1启动子和2586 bp的米曲霉β-葡糖苷酶片段。
扩增反应物(50μl)由Pfx扩增缓冲液，0.25mM dNTPs，6.4μM引物99353，3.2μM引物993456，1mM MgCl2，和2.5U Pfx聚合酶组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler5333中，程序设置如下30个循环的94℃，60秒；60℃，60秒；和72℃，240秒(15分钟最终延伸)。
所得到的3586 bp片段用SalI和SpeI消化，并连接到用相同的2个限制酶消化的pMJ04中以产生pSMai130(图7)。
实施例6pSMai135的构建从Lys-20至TAA终止密码子的的米曲霉β-葡糖苷酶编码区(WO2002/095014，E.coli DSM14240，减去信号序列，参见图8，DNA序列(SEQID NO32)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO33))从作为模板的pJaL660(WO 2002/095014)用下列所示的引物993728(正义)和引物993727(反义)PCR扩增。斜体的序列与20bp的Humicola insolens内切葡聚糖酶V信号序列同源，而加下划线的序列与22bp的米曲霉β-葡糖苷酶编码区同源。SpeI位点被工程化到反义引物的5’端。
引物9937285’-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCCAAGGATGATCTCGCGTACTCCC-3’(SEQ ID NO34)引物9937275’-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3’(SEQ ID NO35)扩增反应物(50μl)由Pfx扩增缓冲液，0.25mM dNTPs，10ng/μl Ja1660，6.4μM引物993728，3.2μM引物993727，1mM MgCl2，和2.5U Pfx聚合酶组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler 5333中，程序设置如下30个循环的94℃，60秒；55℃，60秒；和72℃，180秒(15分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下2523bp的产物条带，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导纯化。
进行单独的PCR扩增以利用下列所示的引物993724(正义)和引物993729(反义)来扩增1000bp的里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子和63bp推定的Humicola insolens内切葡聚糖酶V信号序列(ATG起始密码子至Ala-21，图9，SEQ ID NOs36(DNA序列)和37(推导的氨基酸序列；DNA序列的登录号AAB03660)。斜体的引物序列与20bp的Humicolainsolens内切葡聚糖酶V信号序列同源，而加下划线的引物序列与22bp的米曲霉β-葡糖苷酶编码区同源。包括在cbh1启动子调控下的Humicolainsolens内切葡聚糖酶V编码区的质粒pMJ05被用作模板以产生包括里氏木霉cbh1启动子/Humicola insolens内切葡聚糖酶V信号序列片段的1063bp片段。42bp的重叠在里氏木霉cbh1启动子/Humicola insolens内切葡聚糖酶V信号序列和米曲霉编码序列之间共享以提供2523bp米曲霉β-葡糖苷酶片段的启动子和ATG起始密码子之间的完美连接。
引物9937245’-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3’(SEQ ID NO38)引物993729
5’-GGGAGTACGCGAGATCATCCTTGGCAAGGGCCAACACCGGCA-3’(SEQ ID NO39)扩增反应物(50μl)由Pfx扩增缓冲液，0.25mM dNTPs，10ng/μl pMJ05，6.4μM引物993728，3.2μM引物993727，1mM MgCl2，和2.5U Pfx聚合酶组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler5333中，程序设置如下30个循环的94℃，60秒；60℃，60秒；和72℃，240秒(15分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下1063bp的产物条带，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导纯化。
纯化的重叠片段被用作使用上述引物993724(正义)和引物993727(反义)的扩增的模板，以通过重叠搭接PCR精确融合1063bp的里氏木霉cbh1启动子/Humicola insolens内切葡聚糖酶V信号序列片段和2523bp的米曲霉β-葡糖苷酶片段。
扩增反应物(50μl)由Pfx扩增缓冲液，0.25mM dNTPs，6.4μM引物993724，3.2μM引物993727，1mM MgCl2，和2.5U Pfx聚合酶组成。反应物孵育在EppendorfMastercycler5333中，程序设置如下30个循环的94℃，60秒；60℃，60秒；和72℃，240秒(15分钟最终延伸)。反应产物在1.0％琼脂糖凝胶上利用TAE缓冲液分离，其中从凝胶切下3591bp的产物条带，并利用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的指导纯化。
所得到的3591bp片段用SalI和SpeI消化，并连接到用相同的限制酶消化的pMJ04中以产生pSMai135(图10)。
实施例7米曲霉β-葡糖苷酶在里氏木霉中的表达其中米曲霉β-葡糖苷酶从cbh1启动子和天然的分泌信号表达的质粒pSMai130(图8)，或编码连接至Humicola insolens内切葡聚糖酶V分泌信号的成熟米曲霉β-葡糖苷酶的pSMai135(图9)通过下文所述PEG-介导的转化被导里氏木霉RutC30。两个质粒都包含构巢曲霉amdS基因以使得转化子能够在作为唯一氮源的乙酰胺上生长。
里氏木霉RutC30在27℃，90rpm，补充有2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的25ml YP培养基(组成为每升10g酵母提取物和20g细菌蛋白胨Bactopeptone)中培养17小时。菌丝体通过利用Millipore’s真空驱动一次性过滤系统(Millipore，Bedford，MA)过滤收集，并用去离子水洗涤2次，用1.2M山梨糖醇洗涤2次。原生质体通过将洗涤过的菌丝体悬浮在每ml含有15mg Glucanex(Novozymes A/S，Bagsvrd，Denmark)和每ml含有0.36单位几丁质酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的20ml1.2 M山梨糖醇，并且在34℃以90rpm的温和摇动孵育15-25分钟来产生。原生质体通过在400×g离心7分钟来收集，并用冷的1.2M山梨糖醇洗涤2次。该原生质体利用血球计数器计数，并重悬在STC(1M山梨糖醇，10mM Tris-HCl，pH6.5，10mM CaCl2)中至终浓度为每ml1×108个原生质体。剩余的原生质体于-80℃储存在Cryo 1℃冷冻容器(Nalgene，Rochester，NY)中。
大约7μg PmeI消化的表达质粒(pSMai130或pSMai135)被加入100μl原生质体溶液并温和混合，然后加入260μl PEG缓冲液(60％PEG-4000，10mM Tris-HCl，pH 6.5，10mM CaCl2)，混合，并在室温培养30分钟。然后加入STC(3ml)并混合，随后转化溶液被接种到COVE平板(组成为每升342.3g蔗糖，10ml1M乙酰胺溶液，10ml1.5M CsCl溶液，25g琼脂，和20mlCove盐溶液；Cove盐溶液的组成为每升26gKCl，26gMgSO4·7H2O，76gKH2PO4，和50ml Cove痕量金属溶液；Cove痕量金属溶液的组成为每升0.04g Na2B4O7·10H2O，0.4g CuSO4·5H2O，1.2g FeSO4·7H2O，0.7gMnSO4·H2O，0.8g Na7MoO7·2H2O，和10g ZnSO4·7H2O)上。该平板28℃培养5-7天。转化子被次培养到COVE2平板(组成为每升30g蔗糖，10ml1M乙酰胺溶液，20mlCove盐溶液，和25g琼脂)上并在28℃生长。
用pSMai130获得110个amdS阳性转化子，而用pSMai135获得65个转化子。20个pSMai130(天然分泌信号)和67个pSMai135(异源分泌信号)转化子被次培养到含有乙酰胺的新鲜平板上，并容许在28℃形成孢子7天。
20个pSMA130和67个pSMA135里氏木霉转化子在含有接种有转化子孢子的25ml纤维素酶-诱导培养基pH6.0的125ml有挡板摇瓶中培养，并在28℃，200rpm培养7天。里氏木霉RutC30用作对照。在第7天移出培养物肉汤样品。1ml的各个培养物肉汤在微离心机中于15,700×g离心5分钟，上清液被转移到新的试管中。样品储存在4℃直到进行酶测定。利用p-硝基苯基(nitrophenyl)-β-D-葡糖吡喃糖苷(glucopyranoside)作为底物如下所述分析上清液的β-葡糖苷酶活性。
β-葡糖苷酶活性在环境温度利用在50mM琥珀酸酯(succinate)pH5.0中1∶10稀释的25μl等分的培养物上清液，利用在50mM琥珀酸酯pH5.0中的200μl 0.5mg/mlp-硝基苯基(nitrophenyl)-β-D-葡糖吡喃糖苷(glucopyranoside)作为底物来测定。孵育15分钟后，通过加入100μl1MTris-HClpH8.0终止反应，并且在405nm处以分光光度术读取吸光率。
1个单位的β-葡糖苷酶活性相当于在pH5.0，环境温度下每分钟每升产生1μmol p-硝基苯基。黑曲霉β-葡糖苷酶(Novozyme188，Novozymes A/S，Bagsvrd，Denmark)用作酶标准。
全部20个SMA130转化子显示与宿主菌株，里氏木霉RutC30相等的β-葡糖苷酶活性。相比之下，许多SMA135转化子显示大于里氏木霉RutC30几倍的β-葡糖苷酶活性。转化子SMA135-04产生大于作为对照的里氏木霉RutC30所产生的β-葡糖苷酶活性7倍的最高β-葡糖苷酶活性。
利用标准的Tris-HCl(5％分辨率)凝胶(BioRad，Hercules，CA)以标准系统(BioRad，Hercules，CA)进行SDS聚丙烯酰胺电泳。5μl第7天的上清液(见上文)悬浮在2×浓度的Laemmli样品缓冲液(BioRad，Hercules，CA)中，并在存在5％β-巯基乙醇时煮沸3分钟。上清液样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并用1×Tris/甘氨酸/SDS作为电泳缓冲液(BioRad，Hercules，CA)进行电泳。所得到的凝胶用BioRad’s Bio-Safe Coomassie Stain考马斯染料染色。
通过SDS-PAGE对于里氏木霉SMA130转化子培养物肉汤上清液没有观察到β-葡糖苷酶蛋白质。相比之下，38个里氏木霉SMA135转化子中的26个产生在作为对照的里氏木霉RutC30中没有见到的大约110kDa的蛋白质。转化的里氏木霉SMA135-04产生最高水平的β-葡糖苷酶。
实施例8里氏木霉SMA135-04的发酵进行里氏木霉SMA135-04的发酵以确定β-葡糖苷酶活性的生产水平。里氏木霉RutC30(宿主菌株)用作对照。里氏木霉SMA135-04的孢子被接种到含有100ml接种培养基的500ml摇瓶中，该接种培养基的组成为每升20g葡萄糖，10g玉米浸渍固体(corn steep solids)，1.45g(NH4)2SO4，2.08gKH2PO4，0.36g CaCl2·2H2O，0.42g MgSO4·7H2O，和0.2ml痕量金属溶液。该痕量金属溶液的组成为每升216g FeCl3·6H2O，58g ZnSO4·7H2O，27gMnSO4·H2O，10g CuSO4·5H2O，2.4g H3BO3，和336g柠檬酸。培养瓶被置于28℃的轨道摇动器中大约48小时，此时50ml培养物被接种到在2升发酵容器中的1.8升发酵培养基中，该发酵培养基的组成为每升4g葡萄糖，10g玉米浸渍固体，30g纤维素，2.64g CaCl2·2H2O，3.8g(NH4)2SO4，2.8g KH2PO4，1.63g MgSO4·7H2O，0.75ml痕量金属溶液(如上所述)。发酵在pH5.0，28℃进行，其最小溶解氧在1.0VVM的气流和1100的搅拌下为25％。在第18小时，饲养培养基以3.6g/小时的给料速率被传送进入发酵容器33小时，然后速率为7.2g/小时。发酵进行165小时，此时离心最后的发酵肉汤，并且上清液储存在-20℃直到利用实施例7中所描述的方法进行β-葡糖苷酶活性测定。
里氏木霉SMA135-04发酵样品的β-葡糖苷酶活性确定为大于由里氏木霉RutC30所产生酶活性的大约8倍。
实施例9使用新鲜发酵样品的PCS水解利用以升高的温度和压力用稀硫酸预处理的洗涤和碾磨的玉米秸配制PCS水解反应物。下列条件用于预处理酸浓度-1.4wt％；温度-165℃；压力107psi；时间-8分钟。在酶促水解前，预处理的玉米秸(PCS)用大量的蒸馏-去离子(DDI)水在玻璃滤器上洗涤。发现水洗PCS的干重是24.54％。PCS中不溶于水的固体含有56.5％的纤维素、4.6％的半纤维素、和28.4％的木质素。
在酶促水解前，如下制备在DDI水中的碾磨PCS悬浮液DDI水洗的PCS另外用95％乙醇在22μm Millipore滤器(6P Express Membrane，Stericup)上洗涤，然后用咖啡研磨器碾磨以减小颗粒的大小。发现碾磨PCS的干重是41.8％。碾磨的PCS用DDI水洗涤3次以除去乙醇。每次洗涤后，该悬浮液在4℃，17,000×g离心10分钟以分开固体。最后，将DDI水加入碾磨的水洗固体而制得20mg/ml的悬浮液。该悬浮液储存在4℃，并用于终浓度为10mg/ml的1ml规格的PCS水解。
里氏木霉菌株利用纤维素酶生产培养基于28℃，pH4.5生长在2升的Applikon实验室发酵罐中，生长时间为大约120小时。该纤维素酶生长培养基的组成为每升5g葡萄糖，10g玉米浸渍固体，2.08g CaCl2，3.87g(NH4)2SO4，2.8g KH2PO4，1.63g MgSO4·7H2O，0.75ml痕量金属溶液，和1.8ml pluronic，以及每升20g的纤维素饲料。痕量金属溶液的组成为每升216g FeCl3·6H2O，58g ZnSO4·7H2O，27g MnSO4·H2O，10g CuSO4·5H2O，2.4gH3BO3，和336g柠檬酸。
用于制备完全发酵肉汤(WB)和无细胞肉汤(CB)样品的步骤略述如下。简要地，在圆锥形的离心管中无菌收获2个50ml等分的里氏木霉培养物。这些试管中的一个被指定为WB酶制剂而无需进一步的处理，另一个离心2次以除去细胞和不溶性的材料以产生CB酶样品。第1次离心以低速进行(1800×g，10分钟)，第2次以较高的速度进行(12,000×g，15分钟)。
PCS(10mg/ml，56.5％纤维素)于50℃在0.05M乙酸钠缓冲液(pH5.0)中伴随间断的搅拌来酶促水解。2个类型的酶制剂被用于这些实验如上定义的(a)完全发酵肉汤(WB)和(b)离心的发酵肉汤(CB)。在一系列的实验中，将在于4℃储存2周之前离心的CB(CB-A)与储存后离心的肉汤(CB-B)进行比较。测试4个酶剂量2.5、5.0、10、和20mg/g的PCS。这些剂量是以标准实验室-规模发酵评估的60g/L蛋白质浓度为基础的。每个反应的体积是在MicroWell96TM深孔平板(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)中的1ml。在指定的时间点(1、3、6、9、12、24、48、72、96、和120小时)，利用8-道移液器从微平板移出20μl等分，并加入在96-孔平底平板(Millipore，Billerica，MA)中的180μl碱性混合物(0.102M Na2CO3+0.058MNaHCO3)以终止反应。样品在1800×g离心15分钟以除去未反应的PCS残余物。适当稀释后，利用微平板测定(见下文)分析滤过液的还原糖(RS)。
水解PCS样品中还原糖(RS)的浓度利用被改进并适合于96-孔微平板格式的p-羟苯甲酸酰肼(hydrazide)(PHBAH)测定(Lever，1972，Anal.Biochem，47273-279)来测量。测定前，分析样品在水中稀释以使得RS浓度在0.005-0.200mg/ml范围之中。
将90μl等分的每个稀释的反应样品置于96-孔锥形底的微平板中(Corning Inc.，Costar，澄清的聚碳酸酯)。该反应通过加入60μl在2％氢氧化钠中的1.25％PHBAH来起始。每个测定平板在定制的加热块上于95℃加热10分钟，并容许冷却至室温。冷却后，向各个孔加入60μl水。移出100μl等分并转移至平底的96-孔平板(Corning Inc.，Costar，中等结合的聚苯乙烯)，利用UltraMark微平板阅读仪(Bio-Rad，Hercules，CA)测量在405nm处的吸光率(A405)。利用标准曲线将A405值转化为葡萄糖等价值。为了增加该测定的统计学精度，在每个酶剂量对于每个时间点进行32个重复。
标准曲线用与样品同样处理的8个葡萄糖标准(0.000、0.005、0.010、0.020、0.030、0.050、0.075、和0.100mg/ml)产生。葡萄糖标准通过用碳酸钠/碳酸氢钠(0.102M Na2CO3+0.058M NaHCO3)混合物稀释10mg/ml的葡萄糖原液来制备。各个标准进行8个重复以增加该测定的精度。该标准曲线的平均相关系数大于0.99。
每个水解样品中葡萄糖的浓度利用酶联分析法测量，其中50μl的各个稀释的PCS水解产物与100μl分析缓冲液(100mM MOPS，pH7，0.01％Tween-20)和150μl葡萄糖分析试剂混合。该分析试剂含有下列成分(每升)0.5511g ATP，0.9951g NAD，0.5176g MgSO4·7H2O，1000单位/L的己糖激酶300型(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，1000单位/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，0.1g Tween-20，和20.9gMOPS，pH7.0。该反应物在环境温度下孵育30分钟，并且在340nm处测量吸光率。以0葡萄糖对照为基础减去背景吸光率，对于用范围为0.00至0.25mg/ml的葡萄糖浓度产生的标准曲线来确定葡萄糖的浓度。
利用来自在特定酶剂量和孵育时间的全部重复的数据计算平均RS产率。平均标准误差(SEM)计算为半标准偏差除以重复数，n的平方根。利用下列等式计算纤维素转化为还原糖的程度(RS产率，百分比)RS产率(％)＝RS(mg/ml)×100×162/(5.65(mg/ml)×180)＝RS(mg/ml)×100/(5.65(mg/ml)×1.111)在这个等式中，RS是测量为葡萄糖等价物的溶液中还原糖的浓度(mg/ml)，5.65mg/ml是纤维素的起始浓度，而因子1.111反映了纤维素转化为葡萄糖中的重量增加。
在每个时间点WB和CB数据点表现统计上显著差异群体的概率利用Student t-检验(使用不等方差)来评估。
如图11所示，使用新鲜收获的酶样品(WB和CB)产生几乎相同的PCS水解图谱。这些图谱不能用Student t-检验加以区分，表明它们在统计学上是不可区别的。利用来自里氏木霉RutC30的酶样品，最终的RS产生范围是在最低酶剂量总的葡聚糖转化大约30％至最高酶剂量为大约50％(图11)。当测量葡萄糖代替还原糖的浓度时，呈现葡萄糖产率相当的相似图谱，而无论使用的是WB或CB(图12)。然而，值得注意的是葡萄糖产率比还原糖浓度低大约20至25％，表明β-葡糖苷酶在这些条件下可能是限制的酶活性。
为了尽量转化更高百分比的RS成为葡萄糖，从表达米曲霉β-葡糖苷酶基因的重组里氏木霉菌株SMA135-04配制酶样品。当使用具有升高的β-葡糖苷酶活性的这些制剂时，基于与来自里氏木霉RutC30酶样品结果的比较观察到几个差别。首先，在系统和实验误差的范围内，WB和CB的PCS水解曲线是非常相似的(图13)。第二，在最低酶剂量(2.5mg/g的PCS)，从里氏木霉SAM135-04酶样品获得的最终RS产率与里氏木霉RutC30酶的30％相比是总的水解葡聚糖的大约40％。第三，最高酶剂量的最终RS滴度与使用来自里氏木霉RutC30的WB和CB制品时获得的相比是基本上未变化的。这个现象的原因尚不清楚，但它可能反映了在50℃延长孵育期间内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的热失活，或米曲霉β-葡糖苷酶的终产物抑制。根据这些比较，该数据一致表明WB和CB水解图谱之间差异很小(littledifference)。反应动力学和最终的RS滴度似乎是相似的。
当产生自里氏木霉SMA135-04的WB和CB样品的RS和葡萄糖产率与从里氏木霉RutC30获得的制品进行比较时，我们观察到更高百分比的RS被SMA135-04酶样品转化为葡萄糖(图14)。这是可以预料到的，因为里氏木霉SMA135-04比里氏木霉RutC30产生更高水平的β-葡糖苷酶。有趣的是，在早期时间点(达到24小时)，从里氏木霉SMA135-04酶制剂产生的RS和葡萄糖水平只有很少百分比的不同(图14)。然而，在反应的较后阶段期间，RS和葡萄糖曲线明显偏离，表明β-葡糖苷酶活性在PCS水解后期阶段的这些条件下可能有衰退。对于最高的酶剂量(20mg/g的PCS)这在后期是特别明显的。此外，看来在这个相同的时间段，在RS和葡萄糖的形成中WB胜过CB。Student t-检验预测RS值中的变异对于48-120小时的时间范围是统计上显著的(P＜0.05)。在性能上所观察到的差异是否可归因于特异的酶或归因于菌丝体存在的非特异影响是未知的。然而，应注意到当使用来自里氏木霉RutC30的WB和CB酶样品时，没有观察到这种现象(图15)，表明了在延长的孵育期间由里氏木霉SMA135-04表达的异源米曲霉β-葡糖苷酶的不稳定性。
实施例10使用在4℃储存2周的发酵肉汤的PCS水解涉及定点on-site酶制造的乙醇生物质biomass-to-ethanol加工方案应整合入足够的机动性以提供酶制剂的暂时储存而没有效力的显著损失。因此，研究在微滴定-规模的PCS水解反应中酶样品的延长冷藏是否影响其性能。除WB之外，测试两个类型的CB制品。CB-A样品在收获的时候离心并于4℃储存为无细胞的上清液；CB-B制品以完全肉汤储存在4℃，然后在测定的时候离心以除去细胞。
PCS水解反应如实施例9中所描述的进行。
图16和17显示WB、CB-A、和CB-B的水解曲线主要是相似的。使用Student t-检验的统计分析支持这些数据点没有可感知的差异。而且，利用储存2周的酶样品获得的最终RS产率与从使用新鲜发酵肉汤所得到的基本相同。如对于新鲜肉汤材料所观察到的，最低剂量的里氏木霉SMA135-04酶(2.5mg/g的PCS)比相同剂量的Tv10材料产生略高的RS产率，表面上看来是由于里氏木霉SMA135-04产生的更高β-葡糖苷酶水平。
这些结果可总结如下1.WB在这个系列实验中所描述的测定条件下对于PCS水解看来似乎与CB一样表现良好。
2.有可能在4℃储存来自里氏木霉发酵物的WB和CB酶样品至少2周，而在我们的水解测定中没有显著的效力损失。
3.CB可从已经在4℃储存2周的WB加工得来而在我们的水解测定中没有可感知的活性损失。
总之，该结果表明利用WB代替分馏或配制的培养物滤出液可能得到相似的PCS水解结果。应强调的是该水解实验是以等量的体积基础为剂量，并且其并没有以酶活性或蛋白质浓度为基础而被标准化。因此，令人惊讶地已经观察到以这种方式为剂量的WB和CB的相当性能，因为真菌细胞质量占据WB中体积的大约20-30％。这暗示了WB制品中胞外酶的有效剂量比CB低大约20-30％。
在此描述和所要求保护的发明并不限于在此公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为例证来说明本发明的几个方面。任何等效方面都确定为在本发明的范围之内。事实上，除在此显示和描述的之外，本发明的各种修改从前述说明书来说对于本领域的技术人员是显而易见的。这种修改也确定为属于所附权利要求的范围之内。在有抵触的情况下，包括定义的本公开的内容将加以控制。
在此引用多种参考文献，其公开的内容全部引入作为参考。
序列表<110>诺维信股份有限公司(Novozymes inc.)<120>用于降解或转化植物细胞壁多糖的方法<130>10595.204-WO<150>60/556,779<151>2004-03-25<160>39<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>22<212>DNA<213>Aspergillus nidulens<400>1gtgccccatg atacgcctcc gg 22<210>2<211>26<212>DNA<213>Aspergillus nidulens<400>2gagtcgtatt tccaaggctc ctgacc 26<210>3<211>24<212>DNA<213>Aspergillus nidulens<400>3ggaggccatg aagtggacca acgg 24<210>4<211>45<212>DNA<213>黑曲霉<400>4caccgtgaaa gccatgctct ttccttcgtg tagaagacca gacag45<210>5<211>45<212>DNA<213>黑曲霉<400>5ctggtcttct acacgaagga aagagcatgg ctttcacggt gtctg 45
<210>6<211>44<212>DNA<213>黑曲霉<400>6ctatatacac aactggattt accatgggcc cgcggccgca gatc 44<210>7<211>44<212>DNA<213>黑曲霉<400>7gatctgcggc cgcgggccca tggtaaatcc agttgtgtat atag 44<210>8<211>29<212>DNA<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)<400>8aacgttaatt aaggaatcgt tttgtgttt 29<210>9<211>29<212>DNA<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)<400>9agtactagta gctccgtggc gaaagcctg 29<210>10<211>31<212>DNA<213>Humicola insolens<400>10ttgaattgaa aatagattga tttaaaactt c31<210>11<211>25<212>DNA<213>Humicola insolens<400>11ttgcatgcgt aatcatggtc atagc 25<210>12<211>26<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>12ttgaattcat gggtaataac tgatat 26<210>13<211>32<212>DNA<213>酿酒酵母<400>13aaatcaatct attttcaatt caattcatca tt 32<210>14<211>45<212>DNA<213>Aspergillus nidulens<400>14ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc 45<210>15<211>44<212>DNA<213>Aspergillus nidulens<400>15ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc 44<210>16<211>29<212>DNA<213>Humicola insolens<400>16aagcttaagc atgcgttcct cccccctcc 29<210>17<211>32<212>DNA<213>Humicola insolens<400>17ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag 32<210>18<211>32<212>DNA<213>Humicola insolens<400>18ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag 32
<210>19<211>36<212>DNA<213>Humicola insolens<400>19accgcggact gcgcatcatg cgttcctccc ccctcc 36<210>20<211>29<212>DNA<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)<400>20aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 29<210>21<211>17<212>DNA<213>里氏木霉<400>21gatgcgcagt ccgcggt 17<210>22<211>29<212>DNA<213>里氏木霉<400>22aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 29<210>23<211>36<212>DNA<213>里氏木霉<400>23ggagggggga ggaacgcatg atgcgcagtc cgcggt 36<210>24<211>29<212>DNA<213>里氏木霉<400>24aaacgtcgac cgaatgtagg attgttatc 29<210>25<211>32<212>DNA<213>Humicola insolens
<400>25ctgcagaatt ctacaggcac tgatggtacc ag 32<210>26<211>2771<212>DNA<213>米曲霉<220>
<221>CDS<222>(30)..(2612)<220>
<221>mat_peptide<222>(87)..()<400>26ctgttctgct ggttacctgc cacgttatc atg aag ctt ggt tgg atc gag gtg 53Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val-15gcc gca ttg gcg gct gcc tca gta gtc agt gcc aag gat gat ctc gcg 101Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val Val Ser Ala Lys Asp Asp Leu Ala-10 -5 -11 5tac tcc cct cct ttc tac cct tcc cca tgg gca gat ggt cag ggt gaa 149Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu10 15 20tgg gcg gaa gta tac aaa cgc gct gta gac ata gtt tcc cag atg acg 197Trp Ala Glu Val Tyr Lys Arg Ala Val Asp Ile Val Ser Gln Met Thr25 30 35ttg aca gag aaa gtc aac tta acg act gga aca gga tgg caa cta gag 245Leu Thr Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly Trp Gln Leu Glu40 45 50agg tgt gtt gga caa act ggc agt gtt ccc aga ctc aac atc ccc agc 293Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser Val Pro Arg Leu Asn Ile Pro Ser55 60 65ttg tgt ttg cag gat agt cct ctt ggt att cgt ttc tcg gac tac aat 341Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu Gly lle Arg Phe Ser Asp Tyr Asn70 75 80 85tca gct ttc cct gcg ggt gtt aat gtc gct gcc acc tgg gac aag acg 389Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr90 95 100ctc gcc tac ctt cgt ggt cag gca atg ggt gag gag ttc agt gat aag 437Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala Met Gly Glu Glu Phe Ser Asp Lys105 110 115ggt att gac gtt cag ctg ggt cct gct gct ggc cct ctc ggt gct cat 485Gly Ile Asp Val Gln Leu Gly Pro Ala Ala Gly Pro Leu Gly Ala His120 125 130
ccg gat ggc ggt aga aac tgg gaa ggt ttc tca cca gat cca gcc ctc 533Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly Phe Ser Pro Asp Pro Ala Leu135 140 145acc ggt gta ctt ttt gcg gag acg att aag ggt att caa gat gct ggt 581Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly150 155 160 165gtc att gcg aca gct aag cat tat atc atg aac gaa caa gag cat ttc 629Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Met Asn Glu Gln Glu His Phe170 175 180cgc caa caa ccc gag gct gcg ggt tac gga ttc aac gta agc gac agt 677Arg Gln Gln Pro Glu Ala Ala Gly Tyr Gly Phe Asn Val Ser Asp Ser185 190 195ttg agt tcc aac gtt gat gac aag act atg cat gaa ttg tac ctc tgg 725Leu Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp200 205 210ccc ttc gcg gat gca gta cgc gct gga gtc ggt gct gtc atg tgc tct 773Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser215 220 225tac aac caa atc aac aac agc tac ggt tgc gag aat agc gaa act ctg 821Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Glu Asn Ser Glu Thr Leu230 235 240 245aac aag ctt ttg aag gcg gag ctt ggt ttc caa ggc ttc gtc atg agt 869Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser250 255 260gat tgg acc gct cat cac agc ggc gta ggc gct gct tta gca ggt ctg 917Asp Trp Thr Ala His His Ser Gly Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu265 270 275gat atg tcg atg ccc ggt gat gtt acc ttc gat agt ggt acg tct ttc 965Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val Thr Phe Asp Ser Gly Thr Ser Phe280 285 290tgg ggt gca aac ttg acg gtc ggt gtc ctt aac ggt aca atc ccc caa 1013Trp Gly Ala Asn Leu Thr Val Gly Val Leu Asn Gly Thr Ile Pro Gln295 300 305tgg cgt gtt gat gac atg gct gtc cgt atc atg gcc gct tat tac aag 1061Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys310 315 320 325gtt ggc cgc gac acc aaa tac acc cct ccc aac ttc agc tcg tgg acc 1109Val Gly Arg Asp Thr Lys Tyr Thr Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr330 335 340agg gac gaa tat ggt ttc gcg cat aac cat gtt tcg gaa ggt gct tac 1157Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Ala His Asn His Val Ser Glu Gly Ala Tyr345 350 355gag agg gtc aac gaa ttc gtg gac gtg caa cgc gat cat gcc gac cta 1205Glu Arg Val Asn Glu Phe Val Asp Val Gln Arg Asp His Ala Asp Leu360 365 370
atc cgt cgc atc ggc gcg cag agc act gtt ctg ctg aag aac aag ggt 1253Ile Arg Arg Ile Gly Ala Gln Ser Thr Val Leu Leu Lys Asn Lys Gly375 380 385gcc ttg ccc ttg agc cgc aag gaa aag ctg gtc gcc ctt ctg gga gag 1301Ala Leu Pro Leu Ser Arg Lys Glu Lys Leu Val Ala Leu Leu Gly Glu390 395 400 405gat gcg ggt tcc aac tcg tgg ggc gct aac ggc tgt gat gac cgt ggt 1349Asp Ala Gly Ser Asn Ser Trp Gly Ala Asn Gly Cys Asp Asp Arg Gly410 415 420tgc gat aac ggt acc ctt gcc atg gcc tgg ggt agc ggt act gcg aat 1397Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Ala Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn425 430 435ttc cca tac ctc gtg aca cca gag cag gcg att cag aac gaa gtt ctt 1445Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile Gln Asn Glu Val Leu440 445 450cag ggc cgt ggt aat gtc ttc gcc gtg acc gac agt tgg gcg ctc gac 1493Gln Gly Arg Gly Asn Val Phe Ala Val Thr Asp Ser Trp Ala Leu Asp455 460 465aag atc gct gcg gct gcc cgc cag gcc agc gta tct ctc gtg ttc gtc 1541Lys Ile Ala Ala Ala Ala Arg Gln Ala Ser Val Ser Leu Val Phe Val470 475 480 485aac tcc gac tca gga gaa agc tat ctt agt gtg gat gga aat gag ggc 1589Asn Ser Asp Ser Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly490 495 500gat cgt aac aac atc act ctg tgg aag aac ggc gac aat gtg gtc aag 1637Asp Arg Asn Asn Ile Thr Leu Trp Lys Asn Gly Asp Asn Val Val Lys505 510 515acc gca gcg aat aac tgt aac aac acc gtg gtc atc atc cac tcc gtc 1685Thr Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn Thr Val Val Ile Ile His Ser Val520 525 530gga cca gtt ttg atc gat gaa tgg tat gac cac ccc aat gtc act ggt 1733Gly Pro Val Leu Ile Asp Glu Trp Tyr Asp His Pro Asn Val Thr Gly535 540 545att ctc tgg gct ggt ctg cca ggc cag gag tct ggt aac tcc atc gcc 1781Ile Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser Gly Asn Ser Ile Ala550 555 560 565gat gtg ctg tac ggt cgt gtc aac cct ggc gcc aag tct cct ttc act 1829Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr570 575 580tgg ggc aag acc cgg gag tcg tat ggt tct ccc ttg gtc aag gat gcc 1877Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr Gly Ser Pro Leu Val Lys Asp Ala585 590 595aac aat ggc aac gga gcg ccc cag tct gat ttc acc cag ggt gtt ttc 1925Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Ser Asp Phe Thr Gln Gly Val Phe
600 605 610atc gat tac cgc cat ttc gat aag ttc aat gag acc cct ate tac gag 1973Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys Phe Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu615 620 625ttt ggc tac ggc ttg agc tac acc acc ttc gag ctc tcc gac ctc cat 2021Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Glu Leu Ser Asp Leu His630 635640 645gtt cag ccc ctg aac gcg tcc cga tac act ccc acc agt ggc atg act 2069Val Gln Pro Leu Asn Ala Ser Arg Tyr Thr Pro Thr Ser Gly Met Thr650 655 660gaa gct gca aag aac ttt ggt gaa att ggc gat gcg tcg gag tac gtg 2117Glu Ala Ala Lys Asn Phe Gly Glu Ile Gly Asp Ala Ser Glu Tyr Val665 670 675tat ccg gag ggg ctg gaa agg atc cat gag ttt atc tat ccc tgg atc 2165Tyr Pro Glu Gly Leu Glu Arg lle His Glu Phe Ile Tyr Pro Trp Ile680 685 690aac tct acc gac ctg aag gca tcg tct gac gat tct aac tac ggc tgg 2213Asn Ser Thr Asp Leu Lys Ala Ser Ser Asp Asp Ser Asn Tyr Gly Trp695 700 705gaa gac tcc aag tat att ccc gaa ggc gcc acg gat ggg tct gcc cag 2261Glu Asp Ser Lys Tyr Ile Pro Glu Gly Ala Thr Asp Gly Ser Ala Gln710 715 720 725ccc cgt ttg ccc gct agt ggt ggt gcc gga gga aac ccc ggt ctg tac 2309Pro Arg Leu Pro Ala Ser Gly Gly Ala Gly Gly Asn Pro Gly Leu Tyr730 735 740gag gat ctt ttc cgc gtc tct gtg aag gtc aag aac acg ggc aat gtc 2357Glu Asp Leu Phe Arg Val Ser Val Lys Val Lys Asn Thr Gly Asn Val745 750 755gcc ggt gat gaa gtt cct cag ctg tac gtt tcc cta ggc ggc ccg aat 2405Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn760 765 770gag ccc aag gtg gta ctg cgc aag ttt gag cgt att cac ttg gcc cct 2453Glu Pro Lys Val Val Leu Arg Lys Phe Glu Arg Ile His Leu Ala Pro775 780 785tcg cag gag gcc gtg tgg aca acg acc ctt acc cgt cgt gac ctt gca 2501Ser Gln Glu Ala Val Trp Thr Thr Thr Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala790 795 800 805aac tgg gac gtt tcg gct cag gac tgg acc gtc act cct tac ccc aag 2549Asn Trp Asp Val Ser Ala Gln Asp Trp Thr Val Thr Pro Tyr Pro Lys810 815 820acg atc tac gtt gga aac tcc tca cgg aaa ctg ccg ctc cag gcc tcg 2597Thr Ile Tyr Val Gly Asn Ser Ser Arg Lys Leu Pro Leu Gln Ala Ser825 830 835ctg cct aag gcc cag taaggggcaa gtcctgattg tacagagcat ttcgagattt 2652
Leu Pro Lys Ala Gln840atgatgtaca tgtttatgaa tgacctaggg tagggtaata cttagtaggg ttagttctaa 2712ttcttggagt caagtattga ctcactgggc cgataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa2771<210>27<211>861<212>PRT<213>米曲霉<400>27Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val-15 -10 -5Val Ser Ala Lys Asp Asp Leu Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser-1 1 5 10Pro Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Val Tyr Lys Arg Ala15 20 25Val Asp Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Thr Glu Lys Val Asn Leu Thr30 35 40 45Thr Gly Thr Gly Trp Gln Leu Glu Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser50 55 60Val Pro Arg Leu Asn Ile Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu65 70 75Gly Ile Arg Phe Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn80 85 90Val Ala Ala Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala95 100 105Met Gly Glu Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ile Asp Val Gln Leu Gly Pro110 115 120 125Ala Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu130 135 140Gly Phe Ser Pro Asp Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr145 150 155Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr160 165 170Ile Met Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Gln Pro Glu Ala Ala Gly175 180 185Tyr Gly Phe Asn Val Ser Asp Ser Leu Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys190 195 200 205Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala
210 215 220Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr225 230 235Gly Cys Glu Asn Ser Glu Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu240 245 250Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Thr Ala His His Ser Gly255 260 265Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Val270 275 280 285Thr Phe Asp Ser Gly Thr Ser Phe Trp Gly Ala Asn Leu Thr Val Gly290 295 300Val Leu Asn Gly Thr Ile Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val305 310 315Arg Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Thr Lys Tyr Thr320 325 330Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Ala His335 340 345Asn His Val Ser Glu Gly Ala Tyr Glu Arg Val Asn Glu Phe Val Asp350 355 360 365Val Gln Arg Asp His Ala Asp Leu Ile Arg Arg Ile Gly Ala Gln Ser370 375 380Thr Val Leu Leu Lys Asn Lys Gly Ala Leu Pro Leu Ser Arg Lys Glu385 390 395Lys Leu Val Ala Leu Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Ser Trp Gly400 405 410Ala Asn Gly Cys Asp Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met415 420 425Ala Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu430 435 440 445Gln Ala Ile Gln Asn Glu Val Leu Gln Gly Arg Gly Asn Val Phe Ala450 455 460Val Thr Asp Ser Trp Ala Leu Asp Lys Ile Ala Ala Ala Ala Arg Gln465 470 475Ala Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ser Asp Ser Gly Glu Ser Tyr480 485 490Leu Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Asn Asn Ile Thr Leu Trp495 500 505Lys Asn Gly Asp Asn Val Val Lys Thr Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn510 515 520 525
Thr Val Val Ile Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Glu Trp530 535 540Tyr Asp His Pro Asn Val Thr Gly Ile Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly545 550 555Gln Glu Ser Gly Asn Ser Ile Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn560 565 570Pro Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr575 580 585Gly Ser Pro Leu Val Lys Asp Ala Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln590 595 600 605Ser Asp Phe Thr Gln Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys610 615 620Phe Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr625 630 635Thr Phe Glu Leu Ser Asp Leu His Val Gln Pro Leu Asn Ala Ser Arg640 645 650Tyr Thr Pro Thr Ser Gly Met Thr Glu Ala Ala Lys Asn Phe Gly Glu655 660 665Ile Gly Asp Ala Ser Glu Tyr Val Tyr Pro Glu Gly Leu Glu Arg Ile670 675 680 685His Glu Phe Ile Tyr Pro Trp Ile Asn Ser Thr Asp Leu Lys Ala Ser690 695 700Ser Asp Asp Ser Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Lys Tyr Ile Pro Glu705 710 715Gly Ala Thr Asp Gly Ser Ala Gln Pro Arg Leu Pro Ala Ser Gly Gly720 725 730Ala Gly Gly Asn Pro Gly Leu Tyr Glu Asp Leu Phe Arg Val Ser Val735 740 745Lys Val Lys Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Asp Glu Val Pro Gln Leu750 755 760 765Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Val Val Leu Arg Lys770 775 780Phe Glu Arg Ile His Leu Ala Pro Set Gln Glu Ala Val Trp Thr Thr785 790 795Thr Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Ser Ala Gln Asp800 805 810Trp Thr Val Thr Pro Tyr Pro Lys Thr Ile Tyr Val Gly Asn Ser Ser815 820 825Arg Lys Leu Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Lys Ala Gln
830 835 840<210>28<211>46<212>DNA<213>米曲霉<400>28atagtcaacc gcggactgcg catcatgaag cttggttgga tcgagg 46<210>29<211>26<212>DNA<213>米曲霉<400>29actagtttac tgggccttag gcagcg 26<210>30<211>26<212>DNA<213>米曲霉<400>30gtcgactcga agcccgaatg taggat 26<210>31<211>45<212>DNA<213>米曲霉<400>31cctcgatcca accaagcttc atgatgcgca gtccgcggtt gacta45<210>32<211>57<212>DNA<213>米曲霉<400>32atgaagcttg gttggatcga ggtggccgca ttggcggctg cccctcagta gcagtgc 57<210>33<211>19<212>PRT<213>米曲霉<400>33Met Lys Leu Gly Trp Ile Glu Val Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val1 5 10 15Val Ser Ala
<210>34<211>42<212>DNA<213>米曲霉<400>34tgccggtgtt ggcccttgcc aaggatgatc tcgcgtactc cc 42<210>35<211>28<212>DNA<213>米曲霉<400>35gactagtctt actgggcctt aggcagcg 28<210>36<211>63<212>DNA<213>Humicola insolens<400>36atgcgttcct cccccctcct ccgctccgcc gttgtggccg ccctgccggt gttggccctt60gcc 63<210>37<211>21<212>PRT<213>Humicola insolens<400>37Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Arg Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro1 5 10 15Val Leu Ala Leu Ala20<210>38<211>30<212>DNA<213>米曲霉<400>38acgcgtcgac cgaatgtagg attgttatcc 30<210>39<211>42<212>DNA<213>米曲霉<400>39gggagtacgc gagatcatcc ttggcaaggg ccaacaccgg ca 4权利要求
1.一种降解或转化植物细胞壁多糖成为一种或多种产品的方法，包括用有效量的重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤处理植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一种或多种编码降解或转化该植物细胞壁多糖成为一种或多种产品的酶的异源基因。
2.权利要求1的方法，其中该植物细胞壁多糖获得自选自草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、和纸浆及造纸厂残余物的来源。
3.权利要求1的方法，其中该植物细胞壁多糖的来源是玉米秸。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种异源基因编码选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶的酶。
5.权利要求1的方法，其中该异源基因编码纤维素酶。
6.权利要求1的方法，其中该异源基因编码内切葡聚糖酶。
7.权利要求1的方法，其中该异源基因编码纤维二糖水解酶。
8.权利要求1的方法，其中该异源基因编码β-葡糖苷酶。
9.权利要求1的方法，其中所述一种或多种异源基因编码进一步选自下列酶的酶葡萄糖水解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰基酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰基酯酶、果胶甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶、木糖半乳糖醛酸苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木质素过氧化物酶、锰依赖的过氧化物酶、杂合的过氧化物酶、和漆酶。
10.权利要求1的方法，其中该一种或多种异源基因编码更进一步选自酯酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、和过氧化物酶的酶。
11.权利要求1的方法，其中该重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤通过加入选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶的一种或多种酶而被补充。
12.权利要求1的方法，其中该重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤通过进一步加入选自葡萄糖水解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰基酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰基酯酶、果胶甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶、木糖半乳糖醛酸苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木质素过氧化物酶、锰依赖的过氧化物酶、杂合的过氧化物酶、和漆酶的一种或多种酶而被补充。
13.权利要求1的方法，其中所述重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤通过更进一步加入选自酯酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、和过氧化物酶的一种或多种酶而被补充。
14.权利要求1的方法，其中该方法是预处理的过程。
15.权利要求1的方法，其中该方法是同时发生糖化和发酵过程(SSF)中的步骤。
16.权利要求1的方法，其中该方法是混合水解和发酵过程(HHF)中的步骤。
17.权利要求1的方法，进一步包括回收获得自降解或转化的植物细胞壁多糖的一种或多种产品。
18.权利要求17的方法，其中所述产品是糖。
19.权利要求18的方法，其中所述糖选自葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、和阿拉伯糖。
20.通过权利要求17的方法获得的产品。
21.一种生产一种或多种有机物的方法，包括(a)用有效量的重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤糖化植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一种或多种编码降解或转化该植物细胞壁多糖成为糖化材料的酶的异源基因；(b)用一种或多种发酵微生物使步骤(a)的糖化材料发酵；以及(c)从发酵物回收一种或多种有机物。
22.权利要求21的方法，其中该植物细胞壁多糖获得自选自草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、和纸浆及造纸厂残余物的来源。
23.权利要求21的方法，其中该植物细胞壁多糖的来源是玉米秸。
24.权利要求21的方法，其中所述一种或多种异源基因编码选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶的酶。
25.权利要求21的方法，其中该异源基因编码纤维素酶。
26.权利要求21的方法，其中该异源基因编码内切葡聚糖酶。
27.权利要求21的方法，其中该异源基因编码纤维二糖水解酶。
28.权利要求21的方法，其中该异源基因编码β-葡糖苷酶。
29.权利要求21的方法，其中所述一种或多种异源基因编码进一步选自葡萄糖水解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰基酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰基酯酶、果胶甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶、木糖半乳糖醛酸苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木质素过氧化物酶、锰依赖的过氧化物酶、杂合的过氧化物酶、和漆酶的酶。
30.权利要求21的方法，其中所述一种或多种异源基因编码更进一步选自酯酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、和过氧化物酶的酶。
31.权利要求21的方法，其中该重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤通过加入选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶的一种或多种酶而被补充。
32.权利要求21的方法，其中该重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤通过进一步加入选自木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰基酯酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶乙酰基酯酶、果胶甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶、木糖半乳糖醛酸苷酶、木糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木质素过氧化物酶、锰依赖的过氧化物酶、杂合的过氧化物酶、和漆酶的一种或多种酶而被补充。
33.权利要求21的方法，其中所述重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤通过更进一步加入选自酯酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、和过氧化物酶的一种或多种酶而被补充。
34.权利要求21的方法，其中步骤(a)和(b)在同时发生的糖化和发酵中同时进行。
35.权利要求21的方法，其中所述一种或多种有机物选自醇类、有机酸、酮类、醛类、氨基酸、气体，及其组合。
36.权利要求35的方法，其中所述醇类是阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇、或木糖醇。
37.权利要求35的方法，其中所述有机酸是乙酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸、或木糖酸。
38.权利要求35的方法，其中所述酮类是丙酮。
39.权利要求35的方法，其中所述醛类是糠醛。
40.权利要求35的方法，其中所述氨基酸是天门冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、或缬氨酸。
41.权利要求35的方法，其中气体是甲烷、氢、二氧化碳、和一氧化碳。
42.通过权利要求22的方法获得的有机物。
全文摘要
本发明涉及将植物细胞壁多糖转化成为一种或多种产品的方法，包括用有效量的重组微生物的耗尽的(spent)完全发酵肉汤处理植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一种或多种编码降解或转化该植物细胞壁多糖成为一种或多种产品的酶的异源基因。本发明也涉及生产有机物的方法，包括(a)用有效量的重组微生物的耗尽的完全发酵肉汤糖化植物细胞壁多糖，其中该重组微生物表达一种或多种编码降解或转化该植物细胞壁多糖成为糖化材料的酶的异源基因；(b)用一种或多种发酵微生物使步骤(a)的糖化材料发酵，以及(c)从发酵物回收有机物。
文档编号C13B35/00GK1997736SQ200580017065
公开日2007年7月11日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月25日
发明者兰迪·伯卡, 乔尔·彻里 申请人:诺维信股份有限公司