耐胁迫转基因小麦植物的制作方法

专利名称：耐胁迫转基因小麦植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因小麦植物(wheat plants)。具体地，本发明涉及对环境胁迫，例如盐胁迫的耐性增加的转基因小麦植物。
背景技术：
在全世界范围内，盐度升高对农业造成的威胁正以令人警觉的速度增长。随着世界人口的增加和耕地的减少，充分利用植物生物技术提高作物产量具有了关键性的意义。为了减少盐胁迫对作物产量的影响，人们需要植物例如谷类(cereal)植物的耐盐性品种。
人们已经多次尝试培育对盐胁迫耐性提高的植物。例如，通过常规的野生种杂交育种(crossbreeding)，已经产生了对盐胁迫有一些抗性的小麦新品种。但是，常规的杂交育种对产生新作物品种而言是一个缓慢的过程，而且有限的胁迫抗性的种质来源，以及亲缘关系较远的植物种类之间杂交的不相容性，都给常规的育种技术造成了其它的问题。而且，常规杂交育种成功产生的植物的耐盐性仍然相对较低，商品化品种的耐性不过100mM的盐。
盐胁迫是受影响的植物的细胞中水势的下降，以及影响植物细胞的关键生化途径的过量的钠离子造成的。近来，研究已经转向分子手段，以发展对盐胁迫的抗性增加的作物。积累的实验观察结果和理论思考都提示，植物对盐胁迫的耐性背后可能存在的机制，是相容性低分子量渗透质，例如多元醇/糖类(sugars)，特定的氨基酸，以及鎓类(onium)化合物的积累。
许多研究已经把植物中脯氨酸的积累与耐盐性的提高，以及对脱水(water deprivation)、高温和低温、重金属毒性、病原体感染、厌氧生活、营养物不足、大气污染以及紫外照射的耐性增加联系起来(见例如Stewart和Lee；1974；Planta；120279-289；Briens和Larher；1982；Plant；Cell &Environ.；5287-292；Barnett和Naylor；1966；Plant Physiol.；411222-1230；Boggess等；1976；Aust.J.Plant Physiol.；3513-525；Jones等；1980；Aust.J.Plant Physiol.；7193-205；Katz和Tal；1980；Z.Pflanzenphysiol.Bd.；98283-288；Treichel；1986；Plant Physiol.；67173-181；Thomas等；1992；PlantPhysiol.98626-631)。Hare和Cress(1997)所综述的研究指出，对植物施加胁迫的过程中，植物中脯氨酸水平的增加与负面生理效应的减轻相联系。例如，对多次研究中收集的实验证据的分析提示，脯氨酸的积累可能起到保护植物细胞膜和多肽不受无机离子和极端温度的不良影响的作用。
植物细胞中的脯氨酸浓度可以通过增加脯氨酸生产和/或减少脯氨酸降解来提高。在植物细胞中生产脯氨酸的途径有两条。它们是谷氨酸途径(glutamate pathway)和鸟氨酸途径(orthinine pathway)。有人提出，在年幼的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株中脯氨酸是通过谷氨酸或鸟氨酸途径生产的，而在成熟的植株中，或当遭受胁迫时，通常是谷氨酸途径占主导地位(参见例如Roosens等；1998；Plant Physiol；117263-271)。
编码参与特定的渗透质例如脯氨酸的生物合成的酶的数种基因已经被导入了双子叶植物烟草中。然而，虽然再生的烟草植株对盐胁迫显示了部分的耐性(参见例如Tarczynski等；1993；Science；259508-510；Kishor等；1995；Plant Physiol.；1081387-1394；Lilius等；1966；Biotech.；14177-180)这些研究却似乎没有继续下去。
更重要的是，虽然目前已经用双子叶植物烟草作了一些研究，但还没有参与渗透质例如脯氨酸的生物合成的基因被导入到小麦植物中。因此，对能够耐受的胁迫的商品化小麦植物仍然存在需求。
发明概述发明人惊奇地发现，通过将编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子导入小麦植物中，提供了对胁迫的抗性诱导的或增加的转基因小麦植物。由此，本文所公开的发明的最一般的形式提供耐胁迫小麦植物及保护所述植物的方法。该方法使用编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子。
本发明的第一个方面中提供一种耐胁迫小麦植物，其已被编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子转化。
本发明的第二个方面中提供保护小麦植物免受胁迫的方法，包括将编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子导入小麦植物的步骤。
在一个实施方案中，所述胁迫选自干旱(drought)、盐、脱水(dehydration)、热(heat)、寒冷(cold)、冻结(freezing)、水浸(water logging)、伤害(wounding)、机械胁迫(mechanical stress)、氧化胁迫(oxidative stress)、臭氧、高光(high light)、重金属、营养物剥夺(nutrient deprivation)和有毒化学品。更优选地，所述胁迫是盐、霜冻(frost)或干旱。最优选地，所述胁迫是多于100mM的盐或低于0℃的温度的存在。
所述核酸分子可以是cDNA、RNA或其杂交分子。优选地，所述核酸分子是编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的cDNA分子。最优选地，所述cDNA分子具有核苷酸序列，其基本上如图2(SEQ ID NO1)所示或为其生物学活性片段。
所述核酸分子可以整合(integrate)到宿主细胞的基因组中，或可以作为染色体外元件(extrachromosomal element)存在。
鸟氨酸氨基转移酶(OAT)核酸分子可以分离自任何植物物种。优选地，所述植物是拟南芥。
被所述鸟氨酸氨基转移酶(OAT)核酸分子转化的小麦植物可以是任何品种的小麦植物。优选地，所述小麦植物选自普通小麦(Triticum aestivum)和Triticum durum。
在第三个方面中，本发明提供包含编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子的转基因小麦植物，植物材料，种子或其后代，其中所述核酸分子的表达导致产生能在高于(more than)100mM的盐存在下生长的转基因植物、植物材料、种子或其后代。
在第四个方面中，本发明提供一种核酸构建体，其包含从植物分离的启动子和如本文所定义的鸟氨酸氨基转移酶(OAT)基因。
所述启动子可以是组成性(constitutive)，遍在性(ubiquitous)、胁迫诱导性(stress-inducible)、组织特异性(tissue specific)或发育控制性(developmentally controlled)的。优选地，所述启动子是泛素启动子。
在一个实施方案中，所述构建体基本上如图1所示。然而应当理解，可以通过化学或酶促处理在体外、或利用重组DNA技术在体内生成这些构建体的修饰和改变的形式。这样的构建体与公开的那些可以有例如一个或多个核苷酸替换、缺失或插入的不同，但基本上保持本发明的构建体或核酸分子的生物活性。
在另一个实施方案中，所述转基因小麦植物还包含已被下调的内源性脯氨酸降解系统。
所述转基因小麦植物还可包含编码选择标记的多核苷酸，该多核苷酸与编码OAT的多核苷酸可操作地连接，从而便于所述转基因小麦植物的选择。
在另一个实施方案中，本发明提供由本发明的转基因小麦植物生产的食物。
在第五个方面中，本发明提供生产具有被诱导的或提高的耐盐性的转基因小麦植物的方法，该方法包括下列步骤a)用编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子转化小麦植物的植物组织或细胞；b)将该组织或细胞再生为完整植株；c)以足够诱导或增加植物对高于(greater than)100mM的盐的耐性的条件和时间在再生的植物中表达OAT。
在另一个实施方案中，所述方法还包括用多核苷酸转化所述小麦植物的步骤，从而便于选择所述转基因小麦植物，其中所述多核苷酸编码选择标记并与编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子可操作地连接。
在另一个实施方案中，所述方法还包括下调所述转基因小麦植物中的内源性小麦脯氨酸降解系统的步骤。


图1显示包含与OAT可操作地连接的泛素启动子的核酸构建体。
图2显示OAT的核酸序列。
图3显示OAT的氨基酸序列。
图4显示品系2490.1的高、中和低度耐性水平。该转基因品系分成3个不同的组。
图5显示单次霜冻事件13天后转基因植物(2490.1和2721.1)及其各自的对照品种(Westonia和Carnamah)的种子发育所受的影响。
定义下面的叙述用到重组DNA技术中使用的多种术语。除非另有定义，本文中使用的所有的技术和科学术语都具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下面这些参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的多个术语的一般性定义Singleton；等；《Dictionary of Microbiology andMolecular Biology》(第二版.1994)；《The Cambridge Dictionary of Science andTechnology》(Walker编；1988)；《The Glossary of Genetics》；第五版；Rieger；R等人编；Springer Verlag(1991)；及Hale和Marham；The Harper CollinsDictionary of Biology(1991)。但是，为了便于清楚、一致地理解对本说明书和权利要求书，包括给予这些术语的范围，提供了下面的定义。
术语“细胞”可以指来自植物的任何细胞，包括但不限于体细胞(somaticcells)、配子(gemetes)或胚(embryos)。
“胚”是指萌发(germination)开始前的孢子体(sporophytic)植物。胚可以通过有性杂交(sexual crossing)或自交的配子受精作用而形成。“有性杂交”是指一植株被另一植株传粉。“自交”(selfing)是通过自体受粉，即花粉和胚珠来自同一植株，而产生种子。术语“回交”(backcrossing)是指将F1杂种植株与其两亲之一杂交。典型地，回交被用来将赋予简单遗传的、高度可遗传的性状的基因转移到近交系(inbred line)中。该近交系称为轮回亲本(recurrent parent)。所希望的性状的来源称为供体亲本(donorparent)。供体亲本和轮回亲本有性杂交后，选择具有供体亲本的所希望的性状的F1杂种植株，并重复地与轮回亲本或自交系杂交(即回交)。
胚还可以由“胚体质发生”(embryo somatogenesis)和“克隆”(cloning)形成。体细胞胚胎(somatic embryogenesis)是指由植物的细胞、组织或器官直接或间接地形成胚。
间接体细胞胚胎的特征在于愈伤组织的生长和愈伤组织表面上胚的形成。
直接体细胞胚胎是指从外植体组织上的单个细胞或细胞群形成无性胚(asexual embryo)，中间未插入愈伤组织阶段(intervening callus phase)。由于愈伤组织倾向于衍生物异常的植株，直接体细胞胚胎是优选的。
通用的术语“颗粒”(grain)是指植株的胚珠中存在的胚乳。
短语“导入核酸序列”指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入核酸序列。术语“核酸”与DNA、RNA和多核苷酸同义。含有导入的核酸序列的植物在这里称为R，代植物。R1植物也可以由导入了所述核酸的植物的克隆、有性杂交或自交而产生。
“核酸分子”或“多聚(polynucleic acid)核酸分子”在这里指所有形式的脱氧核糖核酸和核糖核酸，即，单链和双链的DNA、cDNA、mRNA等。
“双链DNA分子”指形成正常的双链螺旋的多聚体形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)。该术语仅仅指所述分子的一级和二级结构，而不将其局限于任何具体的三级结构形式。因此该术语包括出现在线性DNA分子(例如限制片段)、病毒、质粒和染色体中以及其它地方的双链DNA。在讨论具体的双链DNA分子结构时，本文可能依照只给出沿DNA非转录链(即具有与mRNA同源的序列的链)上5’到3’方向的序列的常规来描述序列。
如果按照遗传密码翻译某DNA序列产生某氨基酸序列(即该DNA序列“编码”该氨基酸序列)，则称该DNA序列“对应于”(corresponds)该氨基酸序列。
如果一个DNA序列和另一DNA序列编码相同的氨基酸序列，则称该DNA序列“对应于”另一DNA序列。
如果两个DNA序列在规定的长度上有至少约85％，优选至少约90％，最优选至少约95％的核苷酸匹配，则称这两个DNA序列“基本上相似”。
DNA构建体的“异源”区或域，是指较大的DNA分子中可辨别的DNA片段，在自然界中该片段不与所述较大的DNA分子相伴随地出现。因此，当所述异源区编码植物基因时，通常位于该基因侧翼的DNA在来源生物的基因组中并不位于该植物基因组DNA的侧翼。异源区的另一例子是编码序列本身不出现在自然界中(例如，基因组编码序列含有内含子的cDNA，或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)的构建体。等位变异或天然发生的突变事件不产生本文所定义的DNA异源区。
“编码序列”是对应于或编码蛋白质或肽序列的密码子的符合阅读框的(in-frame)序列。如果两个编码序列或它们的互补序列编码相同的氨基酸序列，则称它们彼此对应。伴随有合适的调控序列的编码序列可以在体内被转录并翻译为多肽。在编码序列的3’一侧通常会有聚腺苷酸化信号和转录终止序列。
多核苷酸“同源物”(homologs)是指单链或双链形式的、含有天然核苷酸的已知类似物的DNA或RNA和其聚合物，它们与参比的核酸具有相似的结合性质，并且其代谢的方式与天然存在的核苷酸相似。
“转基因植物”是指已经通过重组技术，例如含核酸的载体，导入了核酸的植物。“载体”是指这样的核酸组合物，其能够转导、转化或感染细胞，从而导致该细胞表达载体编码的核酸，并且可选地，表达不同于细胞的天然蛋白质的蛋白质，或以非细胞天然的方式表达蛋白质。载体包括要被所述细胞表达的核酸(通常是RNA或DNA)。载体可选地包括帮助核酸实现进入细胞的物质，例如反转录病毒粒子(retroviral particle)，脂质体，蛋白质外壳(protein coating)等等。载体包含允许它们在细菌或其它非植物生物中扩增和被选择的核酸序列。对载体和分子生物学技术的描述可见Current Protocols in Molecular Biology；Ausubel等人编；CurrentProtocols；Greene Publishing Associates；Inc.和John Wiley & Sons；Inc.联合出版；(through and including the 1998 supplement)(Ausubel)。
“质粒”是载体的一类，其包含能够在植物细胞中在染色体外或作为植物细胞染色体的一部分复制的DNA；并且表示为在大写字母和/或数字前/后的小写的“p”。本文所用的起始质粒是可商购的、并且公众可以在不受限制的基础上得到的质粒，或者可以从这些可得到的质粒出发通过本文公开的方法和/或依照已公开的方法构建。在某些情形下，本领域一般技术人员显然可知，本领域已知的其它质粒可以与本文描述的质粒互换地使用。
短语“表达盒”指载体中要被转录的核酸序列，以及指导表达的控制序列。术语“控制序列”指在特定的宿主细胞中表达可操作地连接的核苷酸编码序列所需的DNA序列。适于原核生物中表达的控制序列包括例如复制起点、启动子、核糖体结合位点和转录终止位点。适于真核生物中表达的控制序列包括例如复制起点、启动子、核糖体结合位点，聚腺苷酸化信号和增强子。最重要的控制序列之一是启动子。
“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列的排列(array)。如本文中使用的，启动子包含转录起始位点附近的必要的核酸序列，例如，对聚合酶II型启动子而言，TATA元件。
启动子还可选地包含远端的(distal)增强子或阻抑蛋白(repressor)元件，它们可以位于距离转录起始位点达数千个碱基对的地方。启动子可以是同源的，即，天然存在时指导所需核酸的表达，或者是异源的，即在天然存在时指导源自不同于所需核酸的基因的核酸的表达。具有异源启动子的融合基因对于例如调控被编码的蛋白的表达是理想的。“组成性”启动子是指在大多数环境和发育条件下，在所选生物体中有活性的启动子。“诱导型”(inducible)启动子是指在所选的生物体中受环境或发育性调控的启动子。
例子包括来自植物病毒的启动子，例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell等；(1985)；Nature；313810-812，以及来自例如稻肌动蛋白(McElroy等；(1990)；Plant Cell；163-171)；泛素(Christensen等；(1992)；Plant Mol.Biol.12619-632；和Christensen；et al.；(1992)；Plant Mol.Biol.18675-689)；pEMU(Last等；(1991)；Theor.Appl.Genet.81581-588)；MAS(Velten等；(1984)；EMBO J.32723-2730)；和玉米H3组蛋白(Lepetit等；(1992)；Mol.Gen.Genet.231276-285；and Atanassvoa等；(1992)；PlantJournal 2(3)291-300)的基因的启动子。
其它可以与OAT多核苷酸连接以供在植物细胞中表达的调控元件包括终止子、聚腺苷酸化序列、以及编码允许蛋白质在植物细胞中定位或从细胞分泌的信号肽的核酸序列。已知这样的调控元件，以及添加这些元件或将这些元件与复制酶基因的调控元件交换的方法，包括但不限于，3’终止区和/或聚腺苷酸化区，例如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合酶(nos)基因(Bevan等；(1983)；Nucl.Acids Res.12369-385)；马铃薯蛋白酶抑制物II(PINII)基因(Keil等；(1986)；Nucl.Acids Res.145641-5650；和An等；(1989)；Plant Cell；1115-122)；以及CaMV 19S基因(Mogen等；(1990)；Plant Cell；21261-1272)的3’终止区和/或聚腺苷酸化区。
植物信号序列，包括但不限于，使蛋白质靶向植物细胞的细胞外基质的信号肽编码DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等，(1989)，J.Biol.Chem.2644896-4900)，Nicotiana plumbaginifolia延伸基因(extension gene)(DeLoose等，(1991)，Gene，9995-100)，将蛋白质靶向液泡的信号肽，如甘薯(sweet potato)sporamin基因(Matsuka等，(1991)，PNAS，88834)，以及大麦凝集素基因(Wilkins等，(1990)，Plant Cell，2301-313)，导致蛋白质被分泌的信号肽，例如PRIb的信号肽(Lind等，(1992)，Plant Mol.Biol.1847-53)，或大麦α淀粉酶(BAA)的信号肽(Rahmatullah等(1989)，Plant Mol.Biol.12119，在此并入作为参考)。
对本发明而言，启动子序列的3’末端与编码序列的翻译起始密码子相邻，并且向上游延伸，包括引发高于背景可检测的水平的转录所需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列中可存在转录引发位点(transcriptioninitiation site)(可用S1核酸酶作图来方便地确定)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合域(共有序列)(consensus sequence)。
“外源”元件是指这样的元件，其对宿主细胞而言是外来的，或者对宿主细胞而言是同源的，但处在该宿主细胞中其通常不出现的位置。
DNA的“消化”，是指用仅作用于该DNA中特定位置的酶来催化切割该DNA。这样的酶称为限制酶或限制性内切核酸酶，而DNA中被这些酶切割的位点称为限制位点。如果DNA中有多个限制位点，则消化会产生两个或更多的线性化DNA片段(限制片段)。本文中使用的多种限制酶是可商购的，而且它们的反应条件，辅因子，及其它要求均按照酶制造商所确定的使用。限制酶通常用缩写来指代，该缩写包括大写字母及后随的其它字母，表示各限制酶所最初来源的微生物；以及数字，指明具体的酶。一般而言，在约20μl的缓冲溶液中用1-2个单位的酶消化1μg的DNA。对于具体的限制酶，合适的缓冲液和底物量由制造商所规定，和/或者是本领域公知的。
从限制消化物“回收”或“分离”特定的DNA片段，典型地是通过下述实现的在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上电泳分离消化产物(其称为“限制片段”)，根据相对于已知分子量的标记DNA片段的迁移率鉴定目标片段，切下含有所需片段的部分凝胶，然后从该凝胶分离DNA，例如通过电洗脱(electroelution)。
“连接”(ligation)指在两条双链DNA片段间形成磷酸二酯键的过程。除非另有说明，连接使用已知的缓冲液和条件，且对于每0.5μg的大约等摩尔量的待连接DNA片段使用10个单位的T4 DNA连接酶。
“寡核苷酸”是指长度较短的单链或双链多聚脱氧核苷酸，其用已知方法化学合成(涉及例如，三酯，亚磷酰胺，或膦酸化学)的、例如Engels等，(1989)，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28716-734所描述的。它们然后用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
如本文所使用的，“聚合酶链式反应”或“PCR”是指一种在体外扩增所需的核苷酸序列的方法，如美国专利4,683,195所述。一般而言，PCR方法涉及重复的引物延伸合成循环，使用两条能够优先与模板核酸杂交的寡核苷酸引物。典型地，PCR方法中使用的引物与模板中位于要扩增的核苷酸序列的两端或两侧的核苷酸序列互补，虽然也可以使用与要扩增的核苷酸序列互补的引物。Wang等人，《PCR Protocols》，pp.70-75(Academic Press，1990)；Ochman等人，《PCR Protocols》，pp.219-227；Triglia等人，(1988)，Nucl.Acids Res.168186。
“PCR克隆”是指用PCR方法扩增特定的所需核苷酸序列，所述核苷酸序列存在于来自合适的细胞或组织来源的核酸，包括全基因组DNA和从全细胞RNA转录的cDNA之中。Frohman等，(1988)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，858998-9002；Saiki等，(1988)，Science，239487-492；Mullis等，(1987)，Meth.Enzymol.155335-350.
短语“可操作地编码”(operably encodes)指启动子和第二核酸序列之间的功能性联接(functional linkage)，其中所述启动子序列引发对应于所述第二序列的RNA的转录。
术语“后代”(progeny)指某一特定植株(自交)或植株对(杂交或回交)的后裔(descendants)。这些后裔可以是F1，Fez或任何后续的代。
典型地，亲本(parents)是花粉供体和胚珠供体，将它们杂交以产生本发明的后代植物。
亲本还指本发明的杂种植物(F2植物)的F1亲本。最后，亲本指轮回亲本，其与本发明的杂种植物回交而产生本发明的另一种杂种植物。
术语“产生转基因植物”是指产生本发明的植物。所述植物是通过重组技术，例如克隆、体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)或本领域技术人员用于产生植株的任何其它技术而产生的。
DNA的“整合”可以通过使用微注射、生物射弹、电穿孔或脂质体转染(lipofection)将DNA大量导入细胞后进行非同源重组来实现。其它方法，例如同源重组，和/或限制酶介导的整合(restriction enzyme mediatedintegration，REMI)或转座子也被涵盖在内，并被认为是改进的整合方法。
“克隆”是从单个细胞或共同的祖先通过有丝分裂而来的细胞群体。
“核酸序列同源物”指含有天然核苷酸的已知类似物的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，它们与参比核酸具有类似的结合性质，并且以与天然出现的核苷酸类似的方式被代谢。
除非另有说明，特定的核酸序列还默认涵盖其被保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代(degenerate codon substitution)可以通过产生这样的序列来实现该序列中，一个或多个被选择的(或所有的)密码子的第三位被取代为混合的碱基(mixed-base)和/或脱氧肌苷残基(Batzer等，(1991)，Nucleic AcidRes.195081；Ohtsuka等，(1985)，J.Biol.Chem.2602605-2608；和Rossolini等，(1994)，Mol.Cell.Probes 891-98)。术语“核酸”与基因、cDNA和基因编码的mRNA可以互换使用。
术语“氨基酸序列同源物”是指具有相似的氨基酸序列的蛋白质。本领域的技术人员将认识到，关键的氨基酸序列位于蛋白质的功能域之中。因此，对于同源蛋白质而言，可能在氨基酸序列的全长上的同源性少于40％，但在一个功能域中同源性大于90％。除了天然出现的氨基酸外，同源物还涵盖这样的蛋白质，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然出现的氨基酸的人造化学类似物，以及天然出现的蛋白质。
在本文中可以用通用的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指称氨基酸。
类似地，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母编码来指称。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码一致的或基本上一致的(identical)氨基酸序列的核酸，或者，核酸不编码氨基酸序列时，指基本上一致的序列。
由于遗传密码的简并性，任何特定的蛋白都被大量功能上一致的核酸序列所编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，任何用密码子确定丙氨酸之处，该密码子都可以被变换为任何所述的相应密码子而不改变被编码的多肽。这样的核酸变化是“沉默变化”(silent variations)，是保守修饰变化的一种。本文中每个编码多肽的核酸序列，也都描述了该核酸的每种可能的沉默变化形式。本领域技术人员将认识到，密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)中的特定核酸可以被修饰而产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变化形式，都默示地包含在被描述的序列之中。
对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，在核酸、肽、多肽或蛋白质序列中发生个别的取代、缺失或添加，使得在被编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小部分氨基酸时，如果这样的改变导致氨基酸被替换为化学上相似的氨基酸，则这样的单个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表是本领域公知的。
下面的六个组分别包含相互为保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷胺酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W).
(见，例如，Creighton，PROTEINS(1984))。
如本文中所用的，术语“转化”和“转染”指使用分子生物学家所用的多种手段，在培养物中或在植物的器官中，将所需的核酸例如质粒或表达载体导入植物的细胞的过程。因此，当外源DNA被导入细胞的细胞壁之内时，称该细胞已经被该外源DNA“转化”。外源DNA可以整合于(共价地连接)也可以不整合于构成该细胞基因组的染色体DNA。例如在原核生物和酵母中，外源DNA可能被保持在附加型元件(episomal element)例如质粒上。对于真核细胞而言，稳定转染的细胞是指这样的细胞，其中外源DNA通过染色体复制而被遗传给子细胞。这种稳定性表现在真核细胞能够建立由含有外源DNA的子细胞群体构成的细胞系或克隆。
有多种已知的将外来基因导入植物的方法，可以用来将修饰的核酸插入植物宿主，这些方法包括生物的和物理的植物转化规程。可参考例如Miki等，(1993)，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”，于《Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnology》，Glick及Thompson编，CRCPress，Inc.，Boca Raton，67-88页。所选的方法随宿主植物而不同，包括化学转染方法例如磷酸钙，微生物介导的基因转移例如土壤杆菌(Agrobacterium)(Horsch等，(1985)，Science，2271229-31)，电穿孔，显微注射和生物射弹轰击。
用于植物细胞或组织转化和再生的表达盒、载体以及体外培养方法是已知并可以获得的。参考例如Gruber等，(1993)，“Vectors for PlantTransformation”于《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》中，Glick和Thompson编，CRC Press，Inc.，Boca Raton，89-119页。
使用最广的导入表达载体到植物中的方法是基于天然的土壤杆菌转化系统。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)是植物致病性的土壤细菌，其遗传转化植物细胞。根癌土壤杆菌的Ti质粒和发根土壤杆菌的Ri质粒分别携带负责遗传转化植物的基因。参见，例如，Kado(1991)，Crit.Rev.Plant Sci.101。对土壤杆菌载体系统和土壤杆菌介导的基因转移方法的描述在Gruber等，同上；Miki等，同上；及Moloney等，(1989)，Plant CellReports，8238中有提供。
类似地，可以将基因插入源自根癌土壤杆菌的或源自发根土壤杆菌的Ti质粒或Ri质粒。这样，使用这些质粒可以象上述那样构建表达盒。已知有很多控制序列，当它们与异源编码序列偶联并转化宿主生物体时，其基因表达对于原编码序列的组织/器官特异性而言具有保真性。参见，例如，Benfey和Chua(1989)，Science，244174-181。特别适用于这些质粒中的控制序列是供所述基因在多种目标植物中组成性叶特异性表达的启动子。其它有用的控制序列包括来自胭脂氨酸合成酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子在质粒pARC2中存在，该质粒可获自美国典型培养物保藏中心，指定名称为ATCC 67238。如果使用这样的系统，还必须有来自Ti和Ri质粒的毒力(vir)基因，该vir基因或者与T-DNA部分一起，或者借助双元系统(binary system)，其中vir存在于另一载体上。这样的系统、用于该系统的载体以及转化植物细胞的方法在下列文献中有描述被美国专利4,658,082；1993年11月16日授权给Robeson等的美国专利5,262,306引用的、于1986年10月1日提交的美国申请序列号913,914；以及Simpson等(1986)，Plant Mol.Biol.6403-415(也被上述’306专利引用)；这些文献都以及全部内容并入本文作为参考。
一旦构建了这些质粒，就可将它们置入发根土壤杆菌或根瘤土壤杆菌中，并用这些载体转染一般对盐度敏感的植物种类的细胞。其它数种转基因植物也在本发明的考虑之内，包括但不限于大豆(soybean)、玉米(corn)、高粱(sorghum)、苜蓿(alfalfa)、稻(rice)、三叶草(clover)、甘蓝(cabbage)、香蕉(banana)、咖啡(coffee)、芹菜(celery)、烟草(tobacco)、豇豆(cowpea)、棉(cotton)、甜瓜(melon)和胡椒(pepper)。选择根瘤土壤杆菌或是发根土壤杆菌将取决于用其来转化的植物。一般而言根瘤土壤杆菌是优选用于转化的生物。大多数双子叶植物(dicotyledons)，某些裸子植物(gymnosperms)，以及少数单子叶植物(monocotyledons)(例如Liliales和Arales的某些成员对根瘤土壤杆菌感染敏感。发根土壤杆菌的宿主范围也很宽，包括大多数双子叶植物(dicots)和某些裸子植物，包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。其它已证明对遗传转化植物有效的技术包括粒子轰击(particlebombardment)和电穿孔。参见，例如，Rhodes等，(1988)，Science，240204-207；Shigekawa和Dower，(1988)，Bio/Techniques，6742-751；Sanford等，(1987)，Particulate Science & Technoligy，527-37；和McCabe，(1988)，Bio/Technology，6923-926。
这些细胞一旦被转化，则可以用来再生出能够耐受环境胁迫的转基因植物。例如，可以通过对植物致伤，然后将载体导入创伤部位，来用这些载体感染整株植物。植物的任何部位都可以被致伤，包括叶、茎和根。或者，可以用这些载体接种外植体形式的植物组织，例如子叶组织(cotyledonary tissue)或叶盘(leaf disk)，并在促进植株再生的条件下培养。用发根土壤杆菌或根瘤土壤杆菌接种植物组织而转化的、含有编码目的基因的基因的根(roots)或者枝(shoots)，可以用作植物组织的来源，通过体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)或器官发生(organogenesis)再生出转基因植物。这样的再生植物组织的方法的例子在下列文献中有记载Shahin，(1985)，Theor.Appl.Genet.69235-240；美国专利4,658,082；Simpson等，(1986)，Plant Mol.Biol.，6403-415；及1993年11月16日授权给Robeson等的5,262,306中所引用的、同于1986年10月1日提交的美国专利申请序列号913,913和913,914，在此将它们的全部公开并入作为参考。
虽然土壤杆菌介导的转化的宿主范围宽，但这种基因转移模式对一些重要的作物物种和裸子植物难以奏效(recalcitrant)，尽管近来在稻中获得了某些成功(Hiei等，(1994)，The Plant Journal，6271-282)。作为土壤杆菌介导的转化的替代方式，已经发展了数种植物转化方法，它们被统称为直接基因转移技术(direct gene transfer techniques)。
一种普遍适用的植物转化方法是微粒(microprojectile)介导的转化，其中DNA被携带在尺寸为约1到4μm的微粒表面上。通过生物射弹(biolistic)装置将表达载体导入植物组织，该装置将微粒加速到300到600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜。(Sanford等，(1987)，Part.Sci.Technol.527；Sanford，1988，Trends Biotech，6299；Sanford，(1990)，Physiol.Plant 79206；Klein等，(1992)，Biotechnology 10268)。
另一种将DNA物理地送入植物的方法是超声处理(sonification)目标细胞，如Zang等，(1991)，Bio/Technology，9996所述。作为选择，脂质体(liposome)或原生质球(spheroplast)融合已被用来将表达载体导入植物。参见例如，Deshayes等，(1985)，EMBO J.42731；及Christou等，(1987)，PNAS USA，843962。还有使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)或聚-L-鸟氨酸(poly-L-ornithine)将DNA直接摄入原生质体(protoplasts)的报道。参见，例如，Hain等，(1985)，Mol.Gen.Genet.199161；和Draper等，(1982)，Plant Cell Physiol.23451。
还描述了原生质体和完整细胞及组织的电穿孔。参见，例如，Donn等，(1990)，于《Abstracts of the VIIthInt′l.Congress on Plant Cell and TissueCulture IAPTC》中，A2-38，第53页；D′Halluin等，(1992)，Plant Cell41495-1505；及Spencer等，(1994)，Plant Mol.Biol.2451-61。
或者，将DNA构建体与合适的T-DNA侧翼区(fianking regions)组合并导入常规的根瘤土壤杆菌宿主载体。当根瘤土壤杆菌宿主感染植物细胞时，该细菌的毒力功能引导构建体和邻接的标记(marker)插入该细胞。
显微注射技术是本领域已知的，并且在科研和专利文献中有充分的描述。使用聚乙二醇沉淀的DNA构建体导入在Paszkowski等，1984，EMBOJ.32717中有描述。电穿孔技术在Fromm等，1985，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，825824中有描述。射弹转化则在Klein等，1987，Nature 32770-73中有描述。
根瘤土壤杆菌介导的转化技术，包括卸甲(disarming)和双元载体(binary vectors)的应用，也在科研文献中有充分描述。参见，例如，Horsch等，1984，Science，233496-498，及Fraley等，1983，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，804803。
转化本发明的植物的一种优选的方法是微粒轰击(microprojectilebombardment)。在这种方法中，用渗压剂(osmoticum)处理目标组织。然后将修饰的OAT基因DNA沉淀，并包被到钨或金微颗粒(microparticles)上。然后将这些微颗粒装载到微粒或生物射弹装置中，并轰击被处理过的细胞(Bower等，1996)。
发明详述对本文提及的所有出版物而言，本文引用它们是为了描述并公开这些出版物中报道的、可能用于本发明的规程和试剂。不应将本文的任何内容解释为承认本发明无权以发明在先为依据使这些公开成为相对本发明的在后公开。
除非另有说明，本发明的实践中用到现有技术之内的常规分子生物学、植物生物学和重组DNA技术。这些技术对本领域技术人员而言是熟知的，并得到了文献的充分描述。参见，例如，Maniatis，Fritsch及Sambrook，《Molecular CloningA Laboratory Manual》(1982)；《DNA CloningAPractical Approach》，卷I和II(D.N.Glover编，1985)；《OligonucleotideSynthesis》(M.J.Gait编，1984)；《Nucleic Acid Hybridization》(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1985)；《Transcription and Translation》(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；B.Perbal，《A Practical Guide to Molecular Cloning》(1984)，和Sambrook，等，《Molecular Cloninga Laboratory Manual》第12版(1989)。
应当理解本发明不限于被描述的具体材料和方法，因为它们是可变化的。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述具体的实施方案，而并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅被所附的权利要求所限制。必须注意，本文中和所附权利要求中使用的单数形式“a”“an”和“the”包括复数的含义，除非上下文另有明确的指示。因此，例如，提到“a polynucleotide(多核苷酸)”时，包括了多个这样的多核苷酸，提到“an enhancer element(增强子元件)”时，包括了一个或更多的增强子元件。虽然与本文所述的那些相似或等同的任何材料或方法都可用来实践或测试本发明，优选的材料和方法是下面所描述的。
本发明的一个最广泛的方面考虑使用转基因(transgene)，其被工程操作(engineered)以产生表达鸟氨酸氨基转移酶(OAT)基因的转基因小麦植物。鸟氨酸氨基转移酶(OAT)是鸟氨酸途径(ornithine pathway)的一种酶，其在植物细胞中产生脯氨酸。OAT催化氨基从鸟氨酸转移到α-酮戊二酸(alpha-ketoglutarate)，产生谷氨酸-5-半醛(glutamic-5-semi-aldehyde)和谷氨酸。因此，本文所用的术语“转基因植物”意指这样的植物，其中已纳入(incorporate)了OAT多核苷酸序列，包括但不限于可能不是通常地存在的多核苷酸，不是通常地转录为RNA或翻译为蛋白质(表达)的DNA序列。
本文所用的术语“小麦植物”包括，例如，选自普通小麦、Triticum durum，Triticum aestivum var.westonia，一粒小麦(Triticum monococcum)，Triticumaegilopoides，圆锥小麦(Triticum turgidum)，Triticum polonicum，Triticumcarthlicum，Triticum dicoccum，Triticum paleocolchicum，Triticum aestivum var.carnamah和Triticum turanicum的小麦家族的任何植物。
本文所用的术语“转基因”指编码OAT多肽，且通过实验操作被导入到小麦植物的基因组中的任何多核苷酸序列。转基因可以是“内源DNA序列”或“异源DNA序列”(即“外来的”(foreign)DNA)。术语“内源DNA序列”指天然地出现在其被导入的细胞中的核苷酸序列，只要其相对于天然存在的序列而言不含有某些修饰(例如点突变、选择标记基因的存在，等等)。术语“异源DNA序列”指这样的核苷酸序列，其连接于，或通过操作而被连接到，在自然状态下不与其连接或者在自然状态下与其在别处连接的核苷酸序列。异源DNA对于其被导入的细胞而言不是内源的，而是从另一细胞获得的。异源DNA还包括含有某些修饰的内源DNA序列。一般说来，虽然不是一定如此，异源DNA编码这样的RNA和蛋白质，它们通常不被表达该DNA的细胞所产生。异源DNA的例子包括突变的野生型基因(即，受到修饰从而不再是野生型基因的野生型基因)，报道基因，转录和翻译调控基因，选择标记蛋白(例如赋予药物抗性的蛋白质)，等等。
因此，一旦如上面讨论地确定了合适的小麦宿主植物，则构建包含一种或多种OAT多核苷酸或其功能活性的片段的转基因。术语“功能活性的”(functionally active)，当用来指本发明的OAT多肽时，是指这样的模式，其中核苷酸序列的改变并不一定影响该序列编码能够执行与未改变的“亲本”多肽基本上相同的功能的多肽的能力。例如，核苷酸序列可以被截短、伸长或突变使得该核苷酸序列编码的多肽与“亲本”序列不同，但仍然编码能够与“亲本”分子基本上类似地执行功能的多肽。因此，本发明的OAT多核苷酸的功能活性的衍生物(derivatives)、类似物(analogs)或变体(variants)将具有与图2(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列，但该功能活性的衍生物、类似物或变体所编码的多肽能够表现出与所述OAT多肽相关的一种或多种已知的功能活性。这样的修饰可以是任意的，如通过定点诱变，或者可以是自发的。
OAT(EC号2.6.1.13)的同义词包括L-鸟氨酸2-氧-酸氨基转移酶(L-ornithine2-oxo-acid aminotransferase)，鸟氨酸氨基转移酶(ornithineaminotransferase)，鸟氨酸-氧-酸转氨酶(ornithine-oxo-acid transaminase)，氨基转移酶鸟氨酸-酮酸(aminotransferase ornithine-keto acid)，L-鸟氨酸-5-氨基转移酶(L-ornithine 5-aminotransferase)，L-鸟氨酸氨基转移酶(L-ornithine aminotransferase)，L-鸟氨酸α-酮戊二酸δ氨基转移酶(L-ornithinealpha-ketoglutarate delta aminotransfer)，鸟氨酸5-氨基转移酶(ornithine 5-amino transferase)，鸟氨酸δ-转氨酶(ornithinedelta-transaminase)，鸟氨酸转氨酶(ornithine transaminase)，鸟氨酸-2-氧酸氨基转移酶(ornithine-2-oxoacid aminotransferase)，鸟氨酸-α-酮戊二酸氨基转移酶(ornithine-alpha-ketoglutarate aminotransferase)，鸟氨酸-酮酸氨基转移酶(ornithine-keto acid aminotransferase)，鸟氨酸-酮酸转氨酶(ornithine-keto acid transaminase)，鸟氨酸酮戊二酸氨基转移酶(ornithineketoglutarate aminotransferase)，鸟氨酸-氧酸-氨基转移酶(ornithine-oxo acidaminotransferase)和鸟氨酸α-氧戊二酸转氨酶(ornithinealpha-oxoglutaratetransaminase)。
本领域的技术人员将会理解，本发明的OAT多核苷酸的功能活性的衍生物、类似物、同源物或变体，可以在重要区域例如受体结合位点之外发生显著的变化，但是，从不同种病毒分离的OAT多核苷酸之间的高序列保守性区域可能编码重要的区域，例如受体结合位点等。因此，在这些高度保守区域中发生的突变可能不会产生功能活性的衍生物、类似物、同源物或变体。例如，表1所示的保守的核苷酸序列可能保持不被改变，除非该改变是极度保守的。
基本上相似的序列可以在Southem杂交实验中得以鉴定，例如在具体的系统所定义的高度、中度或低度严紧条件下。确定合适的杂交条件是现有技术之内的。参见例如Sambrook等，《DNA Cloning》，卷I，II和III.NucleicAcid Hybridization。但通常地，核酸分子杂交或退火的“严紧条件”是如下所述的(1)洗涤使用低离子强度和高温，例如0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，50℃，或(2)在杂交过程中使用变性剂(denaturing agent)如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5及750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，42℃。
杂交的中度严紧条件的一个例子是使用50％甲酰胺，5XSSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5XDenhardt′s溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/mL)，0.1％SDS，及10％硫酸葡聚糖，42℃，在42℃，0.2XSSC和0.1％SDS中洗涤。
进一步举例说明，且并非意在限制，低严紧度条件包括Shilo和Weinberg在1981年描述的那些(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，786789-6792)。当使用这样的条件处理含有DNA的滤膜(filter)时，它们通常在40℃，在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，和500μg/ml变性鲑精DNA的溶液中被预处理6小时。杂交在做了如下改变的相同溶液中进行0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑精DNA，10％(w/v)硫酸葡聚糖，并使用5-20X106cpm的32P标记的探针。滤膜在杂交混合物中40℃温育18-20h，然后在含2XSSC，25mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA，和0.1％SDS的溶液中55℃洗涤1.5h。用新鲜溶液更换洗涤溶液并在60℃再温育1.5h。吸干滤膜并曝光以进行放射自显影。需要的话，将滤膜在65-68℃洗涤第三次并对胶片再次曝光。可能使用的其它低严紧度条件是本领域熟知的(例如跨种杂交(cross-species hybridization)所用的那些)。
本发明的OAT多核苷酸，其功能性活性衍生物、类似物或变体可用本领域的多种方法生产。例如，可以使用本领域已知的多种方法中的任何方法(参见例如Maniatis，T.，1990，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)修饰克隆的OAT多核苷酸。可以用限制性内切核酸酶在合适的位点切割该序列，然后如果需要，进行进一步酶修饰、分离和体外连接。
另外，可以在体外或体内突变编码OAT的多核苷酸序列，从而生成或破坏功能性区域，或在功能性区域中生成变异，和/或形成新的限制性内切核酸酶位点或破坏先前存在的位点，以便于进一步的体外修饰。可以使用本领域已知的任何诱变技术，包括但不限于化学诱变(chemicalmutagenesis)，体外定点诱变(in vitro site-directed mutagenesis)(Hutchinson等，1978，J.Biol.Chem 2536551)。
或者，所述OAT多核苷酸的多核苷酸变体可能来自简并密码子取代或互补序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生这样的序列而实现该序列中，一个或多个所选的(或全部的)密码子的第三位被混合碱基(mixed-base)和/或脱氧肌苷残基所取代(Batzer等，1991，Nucleic Acid Res.195081；Ohtsuka等，1985，J.Biol.Chem.2602605-2608；和Rossolini等，1994，Mol.Cell.Probes，891-98)。或者，变体可以是这样的多核苷酸其与SEQ ID NO1(图2)基本上相似，或者在该多核苷酸的3’和/或5’端，或在该多核苷酸内添加、缺失或取代了一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中，所述OAT多核苷酸是与SEQ ID NO1具有至少85％的核苷酸序列同一性的双链DNA分子。一旦合适的转基因被确定，并被分离或者构建，则通过标准技术将其整合到表达载体中。因此，本发明还考虑包含本发明的转基因的表达载体。因此，在一个实施方案中构建这样的表达载体，其包含分离并纯化的DNA分子，该DNA分子包含启动子，该启动子与OAT编码区域可操作地连接，该编码区域可操作地连接于转录终止区域，由此该终止子驱动该编码区域的转录。该编码区域可包含编码OAT基因的片段或序列。包含表达载体的DNA分子还可含有植物内含子，还可含有其它植物元件例如编码非翻译序列(untranslated sequences)(UTL’s)的序列和充当转录或翻译增强子的序列。
优选的植物转化载体包括但不限于源自根癌土壤杆菌Ti质粒，和公开在例如Herrera-Estrella(1983)，Bevan(1983)，Klee(1985)和欧洲专利申请号EP 0120516(特此分别并入作为参考)中的那些载体。
由于本发明的表达载体优选用于转化小麦植物，因此选择能够在所述的植物种中驱动表达的启动子。在不同种植物中起作用的启动子也是本领域熟知的。可用于在植物中表达所述多肽的启动子有诱导性的、病毒的(viral)、合成的(synthetic)或组成性的启动子，如上所述(Odell等，1985同上)，和/或受时序调控的(temporally regulated)、受空间调控的(spatiallyregulated)，和受时空调控的(spatio-temporally regulated)启动子。优选的启动子包括增强的CaMV35S启动子，以及FMV35S启动子。
以双链DNA形式定位于植物核基因组的基因的表达涉及由RNA聚合酶(RNA polymerase enzyme)从DNA的编码链转录出信使RNA(mRNA)，和随后在核中mRNA初级转录物的加工。被称为“启动子”的DNA区域调控DNA转录为mRNA。包含启动子的DNA表现为这样的碱基序列，它向RNA聚合酶发出信号(signal)，让其与该DNA结合(associate)，并引发(initiate)mRNA的转录，用DNA的一条链作为模板生成相应的RNA链。所选择的具体启动子应当能够导致OAT编码序列的充分转录，以在所得的植物中产生针对环境胁迫的实质的(substantial)保护。
本发明的OAT多核苷酸在植物组织中可以由多种启动子驱动。启动子可以是近于(near)组成性的(即它们在所有组织中驱动转基因的转录)，例如CaMV35启动子，源自根癌土壤杆菌T-DNA的1’-或2’-启动子，或组织特异性的或发育特异性的。在本发明的实践中，CaMV35S和FMV35S启动子的增强的或重复的(duplicate)形式是特别有用的(Kay等，1987；Rogers，美国5,378,619)。
或者，植物启动子可能受环境控制。这样的启动子被称为“诱导性”启动子。可能导致诱导性启动子的转录的环境条件的例子包括病原体攻击，无氧环境或光的存在。
优选地，使用能够指导强表达的启动子。这样的启动子包括但不限于Christensen和Quail(1996)所描述的玉米泛素启动子(maize ubiquitinpromoter)，McElroy D，Blowers AD Jenes B和Wu R(1990)描述的稻肌动蛋白启动子(rice actin promoter)，Medberry SL，Lockhart BEL和Olszewskine(1992)所描述的鸭跖草花叶病毒(commelina mosaic virus)启动子。
本领域技术人员将会认识到，有多种启动子在植物细胞中有活性且已被文献描述。这样的启动子可以从植物或植物病毒中获得，包括胭脂氨酸合酶(nopaline synthase)(NOS)和章鱼氨酸合酶(octopine synthase)(OCS)启动子(它们由根癌土壤杆菌的根瘤诱导性(tumor inducing)质粒所携带)，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)19S和35S启动子，来自核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase)(ssRUBISCO，一种非常丰富的植物多肽)小亚基的光诱导性启动子，稻Actl启动子和玄参花叶病毒(Figwort Mosaic Virus)(FMV)35S启动子。所有这些启动子都已经被用来产生多种DNA构建体，并在植物中表达(参见例如McElroy等，1990，美国专利5,463,175)。
另外，可能优选使用含有组织特异性启动子的植物整合载体(plant-integrating vectors)来产生OAT多核苷酸的表达。具体的目标组织可包括叶(leaf)、茎(stem)、根(root)、块茎(tuber)、种子(seed)、果实(fruit)等等。所选的启动子应该具有所希望的组织和发育特异性。因此，应当通过选择具有所希望的组织表达能力和大致启动子强度，及选择在目标组织中产生所希望的胁迫抗性水平的转化体(transformant)，来优化启动子功能。在植物中表达异源结构基因时通常要利用这种从转化体池选择的手段，因为含有相同基因的转化体之间存在由于基因插入植物基因组的位置所导致的差异(一般称为“位置效应”(position effect))。除了已知导致DNA在植物细胞中表达(组成性或组织特异性的)的启动子之外，可以通过对在目标组织中选择性地或优选地表达的基因的植物cDNA文库进行筛选，然后确定启动子区域，来鉴定其它的启动子用于本发明。
其它示例性的组织特异性启动子有玉米蔗糖合成酶1(sucrosesynthetase 1)(Yang等，1990)，玉米醇脱氢酶1(alcohol dehydrogenase 1)(Vogel等，1989)，玉米捕光复合物(light harvesting complex)(Simpson，1986)，玉米热休克蛋白(heat shock protein)(Odell等，1985同上)，豌豆(pea)小亚基RuBP羧化酶(small subunit RuBP carboxylase)(Poulsen等，1986；Cushmore等，1983)，Ti质粒甘露氨酸合酶(mannopine synthase)(McBride和Summerfelt，1989)，Ti质粒胭脂氨酸合酶(Langridge等，1989)，矮牵牛(petunia)查耳酮异构酶(chalcone isomerase)(Van Tunen等，1988)，菜豆(bean)富甘氨酸蛋白1(glycine rich protein 1)(Keller等，1989)，CaMV35s转录物(Odell等，1985同上)及马铃薯patatin(Wenzler等，1989)的启动子。优选的启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)启动子和S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
如果需要，本发明的DNA构建体中使用的启动子可以被修饰，以影响它们的控制特性。例如，可以将CaMV35S启动子与ssRUBISCO基因中抑制ssRUBISCO在无光条件下表达的部分连接，以产生在叶中有活性但在根中没有活性的启动子。因而，对于本说明书而言，短语“CaMV35S”启动子包括CaMV35S启动子的变化形式，例如通过与操纵子区域连接、随机或受控的诱变等等而得到的启动子。另外，可改变启动子以使其包含多个“增强子序列”，来帮助提高基因表达。Kay等(1987)已经报道了这样的增强子的例子。
对于由被组织特异性启动子转化的植物细胞产生的本发明的转基因植物，可以将其与被另一组织特异性启动子转化的植物细胞所产生的第二转基因植物杂交，以产生在多于一种的特定组织中显示转化效果的杂种转基因植物。
本发明的DNA构建体所产生的RNA也可以含有5’非翻译前导序列(5′non-translated leader sequence)(5’UTL)。该序列可以来自表达该基因所选用的启动子，可以被特别地修饰以增加mRNA的翻译。5’非翻译区也可以从病毒RNA、合适的真核基因、或合成的基因序列获得。本发明不限于这样的构建体，其中非翻译区来自伴随启动子序列的5’非翻译序列。用于本发明的一种植物基因前导序列是矮牵牛(penuia)热休克蛋白70(hsp70)前导序列(Winter等，1988)。
5’UTL当定位于DNA序列的转录起始位点和编码序列的开头之间时能够调控基因表达。有人已经对前导序列进行编辑(compilation)，以预测最优和次优序列和产生“共有”(consensus)及优选的前导序列(Joshi，1987)。本文考虑优选的前导序列包括这样的序列，它们包含预计将指导其所连接的结构基因最优地表达的序列，也就是说，包括优选的共有前导序列，该共有前导序列可增加或维持mRNA的稳定性，并防止不合适的翻译起始。本领域技术人员结合本文的公开可以知道如何选择这样的序列。最优选的序列将是来自在植物中特别是玉米中高表达的基因的序列。矮牵牛HSP70前导序列可以是一种特别有用的前导序列。
为了优化表达，DNA表达构建体中还可以包含内含子。这样的内含子典型地位于非翻译序列中靠近mRNA 5’端处。该内含子可以来自，但不限于来自，由下列组成的内含子组玉米热休克蛋白(HSP)70内含子(美国专利5,424,412；1995)，稻Act1内含子(McElroy等，1990)，Adh内含子1(Callis等，1987)，或蔗糖合酶内含子(Vasil等，1989)。
定位于植物核基因组的本发明的基因的3’非翻译区还含有聚腺苷酸化信号，其在植物中起作用导致腺苷酸核苷酸添加到mRNA的3’端。RNA聚合酶转录核基因组编码DNA序列通过发生聚腺苷酸化的位点。典型地，聚腺苷酸化位点下游几百个碱基对处的DNA序列起终止转录的作用。本文将这样的DNA序列称为转录终止区域。这些区域对被转录的信使RNA(mRNA)的高效聚腺苷酸化是必需的。优选的3’区域的例子有(1)3’转录而非翻译的区域，其含有例如胭脂氨酸合酶(NOS)基因等土壤杆菌根瘤诱导性(Ti)质粒的基因的聚腺苷酸化信号；(2)例如豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因等植物基因的3’末端，称为本文中E9(Fischhoff等，1987)。构建体典型地包括OAT多核苷酸以及3’末端DNA序列，其中3’末端DNA序列充当终止转录的信号，并且，在用于核基因表达的构建体中，为所得的mRNA聚腺苷酸化作准备。最优选的3’元件考虑是来自下述的那些根瘤土壤杆菌胭脂氨酸合酶基因(nos 3’端)(Bevan等，1983)，根瘤土壤杆菌章鱼氨酸合酶基因的T7转录物的终止子，和马铃薯或西红柿(tomato)蛋白酶抑制物I或II基因的3’末端。如果需要，还可以包括例如TMV OMEGA元件(Gallie等，1989)等调控元件。
转录增强子或重复的增强子可以用于增加表达。这些增强子通常出现在真核细胞中执行功能的启动子中转录开始处的5’侧，但是经常可被正向或反向地插入编码序列的5’或3’侧。增强子的例子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼氨酸合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌动蛋白基因和来自非植物真核生物(例如酵母；Ma等，1988)的启动子的元件。
在本发明的特定实施方案中，使用内部核糖体结合位点(IRES)元件来产生多基因(multigene)或多顺反子(polycistronic)的信息(messages)。IRES元件能够绕开(bypass)5’甲基化Cap依赖的翻译的核糖体扫描模型而在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1985)。已经描述了来自小RNA病毒(picornavirus)家族的两个成员(脊髓灰质炎(polio)和脑心肌炎(encephalomyocarditis))的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源开放阅读框连接。各自被IRES隔开的多个开放阅读框可以一起被转录，产生多顺反子信息。通过IRES元件，每个开放阅读框都可为核糖体所及，以实现高效的翻译。使用单个启动子/增强子来转录单条信息，可以高效地表达多个基因。
IRES元件可以与任何异源的开放阅读框连接。这包括分泌蛋白质、由独立的基因编码的多亚基蛋白质、胞内或膜结合蛋白质和选择标记的基因。通过这种方式，可以用单个构建体和单个选择标记，通过工程加工手段在细胞中同时导入数种蛋白的表达。
选择什么表达载体，以及最终OAT多核苷酸与什么启动子可操作连接，直接依赖于要转化的宿主细胞。已知在构建重组DNA分子的技术中存在固有的限制。但是，可用于实践本发明的载体能够指导与其可操作连接的OAT编码区的表达。
包含OAT序列的载体还通常包含标记(marker)基因，其赋予植物细胞可选择的表型。例如，所述标记可编码杀生物剂(biocide)抗性，特别是抗生素抗性，例如对卡那霉素(kanamycin)、G418、博来霉素(bleomycin)、潮霉素(hygromycin)的抗性，或除草剂(herbicine)抗性，例如对chlorosluforon，或phosphinothricin(双丙氨磷(bialaphos)和草氨膦(Basta)中的有效成分)的抗性。
可用于在高等植物中表达基因的典型的载体是本领域熟知的，包括已有记载的源自根瘤土壤杆菌根瘤诱导性(Ti)质粒(Rogers等，1987)。但是，已知有数种其它的植物整合性(plant integrating)载体系统在植物中起作用，包括已有记载的pCaMVCN转移控制(transfer control)载体(Fromm等，1985)。pCaMVCN(可从Pharmacia，Piscataway，N.J.获得)包括所述CaMV35S启动子。
在一个实施方案中，用于表达OAT多核苷酸的载体包含在植物细胞中有效的选择标记。在另一个实施方案中，编码OAT多核苷酸和/或选择标记的基因处在两个或更多不同的载体上。选择标记可以是药物抗性选择标记或代谢选择标记。一种优选的药物抗性选择标记是这样的基因，其表达导致卡那霉素抗性；即，含有胭脂氨酸合酶启动子、Tn5新霉素磷酸转移酶II(neomycin phosphotransferase II)(nptII)和胭脂氨酸合酶3’非翻译区域的嵌合(chimeric)基因，如Rogers等，1988所述。
制备表达载体的手段是本领域熟知的。用于转化植物的表达(转化)载体和制造这些载体的方法记载于美国专利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011中(特此将其分别并入本文作为参考)。可以修饰这些载体使其包含本发明的编码序列。
已经发展了多种方法将DNA通过互补粘性末端或平末端可操作地连接到载体。例如，可以将互补的均聚物段(homopolymer tract)添加到要插入的DNA片段和载体DNA。然后通过互补的均聚物尾巴之间的氢键连接(join)载体和DNA片段而形成重组DNA分子。
在一个实施方案中，将图2(SEQ ID NO1)所示的编码OAT的双链DNA与泛素启动子和玉米醇溶蛋白(zein)终止子连接(ligate)以形成名为“pGBA2”的表达载体，如图1所示。
用本发明的表达载体转化的小麦植物也在本文的考虑之内。源自这样的转化或转基因细胞的转基因植物也在本文的考虑之内。本领域技术人员将认识到，可以通过本领域熟知的方法将含有本发明的结构编码序列的嵌合植物基因插入植物的基因组。这样的DNA转化植物细胞的方法包括土壤杆菌介导的植物转化，使用脂质体，使用病毒或花粉(pollen)的转化，电穿孔，原生质体转化，基因转入花粉，注射到生殖器官(reproductive organs)中，注射到未成熟的胚(embryos)中，以及粒子轰击。这些方法各自有优缺点。因此，向特定的植物株(strain)导入基因的一种特定的方法，对于其它的植物株可能不一定是最有效的，但对于特定的植物株而言哪些方法有用则是公知的。
将转化DNA片段导入细胞的方法有多种，但不全都适于将DNA送入植物细胞。合适的方法认为包括几乎任何可以将DNA导入细胞的方法，例如根瘤土壤杆菌和相关的土壤杆菌菌株感染，直接送递DNA，例如通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993)，通过干燥/抑制介导的DNA摄取(desiccation/inhibition-mediated DNA uptake)，通过电穿孔，通过碳化硅纤维搅拌，通过加速DNA包被的颗粒，等等。在某些实施方案中，优选加速方法，这些方法包括例如微粒轰击等等。
导入DNA到细胞的技术对本领域技术人员而言是公知的。已经有四种送递基因进入细胞的通用方法被描述(1)化学方法(Graham和van der Eb，1973)；(2)物理方法例如显微注射(Capecchi，1980)，电穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985)和基因枪(gene gun)(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受体介导的机制(receptor-mediatedmechanisms)(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。
对多种动物和植物细胞施加短暂的高压电脉冲，将在质膜中产生纳米尺寸的孔(pores)。DNA或者通过这些孔，或者作为这些孔被封闭的同时膜组分发生重分配(redistribution)的结果而被直接摄入细胞质。电穿孔可具有极高的效率，而且可以用于瞬时表达克隆的基因和建立携带目标基因的整合拷贝的细胞系。与磷酸钙介导的转染或原生质体融合形成对照的是，电穿孔经常产生携带外来基因的一个，或最多少数个整合拷贝的细胞系。
通过电穿孔导入DNA对于本领域技术人员而言是公知的。为了实现电穿孔转化，可以使用脆性的(friable)组织例如细胞悬浮培养物(suspensionculture)或胚性愈伤组织(embryogenic callus)，或者作为选择，可以直接转化未成熟胚或其它有组织结构的(organized)组织。可使所选细胞暴露于果胶降解酶(pectin-degrading enzymes)(pectolyases(溶果胶酶))或有控制地对其机械致伤，以部分降解其细胞壁，使这些细胞更易于被转化。这样的细胞将作为此阶段可能实行的电穿孔DNA转移的受体，然后根据新并入的DNA的性质，采用合适的选择或筛选程序来鉴定被转化的细胞。
将转化DNA片段送递到植物细胞中的另一种较好的方法是微粒射弹。在这种方法中，可以用核酸包被颗粒，并通过推进力(propelling force)送递到细胞中。示例性的颗粒包括由钨、金、铂等构成的那些。使用这些颗粒，位于小金属颗粒表面上的DNA被通过细胞壁运载到胞质中，如Klein等，1987；Klein等，1988；Kawata等，1988所描述的。这些金属颗粒穿过数层细胞，因而使得转化组织外植体(tissue explants)中的细胞成为可能。
微粒射弹除了是一种可重复地稳定转化植物的有效手段外，还有一大优点是其既不需要原生质体的分离(Cristou等，1988)，也不要求对土壤杆菌感染的敏感性。通过加速将DNA送递入植物细胞的方法的一个说明性的实施方案是生物射弹颗粒送递系统(Biolistics Particle Delivery System)，该系统可用来推动包被有DNA的颗粒或细胞通过屏(screen)，例如不锈钢或Nytex屏，到达被悬浮的植物培养细胞覆盖的滤器表面上。所述屏分散该颗粒，使得它们不以大的聚团(aggregates)形式被送递给受体细胞。人们相信，在射弹设备和要被轰击的细胞之间置入屏，可减少射弹聚团的大小，还可减少过大的射弹对受体细胞造成的伤害，从而促进转化频率的提高。
为了轰击，优选将悬浮细胞在滤器或固体培养基上集中(concentrate)。或者，可以将未成熟胚或其它目标细胞布置(arrange)在固体培养基上。将要被轰击的细胞定位于微粒截止板(microprojectile stopping plate)下方合适距离处。如果需要，还在加速装置和要被轰击的细胞之间放置一个或多个屏。通过使用本文提出的技术，可获得多达1000或更多个瞬时表达标记基因的细胞的焦点(focus)。轰击后48小时焦点中表达外源基因产物的细胞数通常在1到10个之间，平均为1到3个。
在轰击转化中，可以对轰击前的(pre-bombardment)培养条件和轰击参数进行优化以产生最大数目的稳定转化体。在这种技术中，物理参数和生物参数都是重要的。物理因素是指那些涉及操作DNA/微粒沉淀(precipitate)的因素，或那些影响大射粒(macroprojectiles)或微粒的飞行距离(flight)和速度(velocity)的因素。生物因素包括在轰击之前和轰击后立即对细胞进行的操作、以及为了帮助减轻轰击相关的创伤(trauma)而对目标细胞施行的渗透压调整中涉及的所有步骤，还包括转化DNA的性质，例如线性化(linearized)的DNA或完整的超螺旋质粒。轰击前的操作被认为对于未成熟植物胚的成功转化特别重要。
因此，本文考虑到，可能希望在小规模的研究中调整一些轰击参数，以全面地优化条件。可能特别希望调整例如间距(gap distance)、飞行距离(flight distance)，组织距离(tissue distance)和氦气压力等物理参数。还可以使创伤减少因子(trauma reduction factors)通过改变那些影响受体细胞的生理状态，并因此可能影响转化和整合效率的条件。例如，可以调节受体细胞的渗透压状态、组织水化(tissue hydration)、及传代培养阶段或细胞周期以获得最优的转化。本领域技术人员结合本公开将了解其它的常规调节方式。
颗粒介导的转化方法对本领域技术人员而言是公知的。美国专利5,015,580(特此将其并入作为参考)记载了使用该技术对大豆的转化。
土壤杆菌介导的转移是一种广泛适用的导入基因到植物细胞的方法，因为DNA可以被导入整个植物组织，从而无需从原生质体再生完整植株。使用土壤杆菌介导的植物整合载体来导入DNA到植物细胞是本领域熟知的。参见例如已有记载的方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。用土壤杆菌介导的转移对棉类植物(cotton plants)进行的基因工程改造在美国专利5,004,863中有记载(特此并入作为参考)；在美国专利5,349,124中描述了类似的莴苣类植物的转化(特此并入作为参考)；在美国专利5,416,011中描述了土壤杆菌介导的大豆转化(特此并入作为参考)。另外，Ti-DNA整合是相对比较精确的过程，几乎不产生重排(rearrangements)。要转移DNA的区域由边界序列(border sequences)确定，而且通常在植物基因组中插入间插DNA(intervening DNA)，如Spielmann等，1988；Jorgensen等，1987所述。
新型的土壤杆菌转化载体能够在大肠杆菌(E.coli)和土壤杆菌中复制，从而可以进行方便的操作，如Klee等，1985所述。另外，近来随着用于土壤杆菌介导的基因转移的载体的技术进步，载体中基因和限制位点的排列已经得到改良，以便于构建能够表达多种多肽编码基因的载体。Rogers等，1987所述的载体具有方便的多接头区域(multi-linker regions)，其侧翼为启动子和聚腺苷酸化位点，用于直接表达插入的多肽编码基因，该载体适用于本发明的目的。另外，转化还可以使用同时含带甲(armed)和卸甲Ti基因的土壤杆菌。对于土壤杆菌介导的转化效率较高的植物品种，土壤杆菌介导的转化是优选的方法，因为其基因转移具有简便性和确定性。
叶盘和其它组织例如子叶和下胚轴(hypocotyl)的土壤杆菌介导的转化，似乎仅限于土壤杆菌天然感染的植物。土壤杆菌介导的转化在双子叶植物中效率最高。几乎没有单子叶植物表现为土壤杆菌的天然宿主，虽然使用土壤杆菌载体在天冬(asparagus)中产生了转基因植物，如Bytebier等，1987描述的。近来也已用土壤杆菌转化了其它单子叶植物。这些中包括玉米(corn)(Ishida等1996)和稻(Cheng等1998)。
使用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物通常在一个染色体上含有单个基因。这样的转基因植物对所加入的基因而言可以称为杂合的(heterozygous)。但是，由于“杂合”一词通常暗示一对染色体中的另一染色体中的相同座位上存在互补的基因，而这里含有一个加入的基因的植物中并不存在这样的基因，故认为对于这样的植物更确切的名称是独立分离子(independent segregant)，因为所加入的外源基因在有丝分裂和减数分裂中独立地分离。
当该植物作为杂种商品化时，例如玉米，独立分离子可能是优选的。此时，将含有所述基因的独立分离子与另一植物杂交，以形成对目标基因而言杂合的杂交植物。
另一优先的选择是对加入OAT多核苷酸而言纯合(homozygous)的转基因植物，即转基因植物含有两个加入的基因，在成对染色体的每条染色体的相同座位上各有一个。纯合的转基因植物可以通过使含有使单个加入的基因的独立分离子转基因植物有性交配(自交)，使所产生的种子发芽，并且相对于对照(天然非转基因的)或独立分离子转基因植物，分析所产生的植株的指征纯合性孟德尔遗传及目标基因活性。
可以使两个不同的转基因植物交配，产生含有两个独立分离的加入的外源基因的后代。通过使合适的后代自交，可以产生对于所加入的编码目标多肽的外源基因二者而言均为纯合的植物。本文还考虑(contemplate)与亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交(out-crossing)。
植物原生质体的转化可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法来实现(参见例如Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1985；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。
这些系统在不同植物种质(germplasm)中的应用取决于从原生质体再生那种植物品种的能力。从原生质体再生谷类的示例性方法已有描述(参见例如Fujimura等，1985；Toriyama等，1987；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。
为了转化从原生质体再生不能成功的植物种质，可以利用其它导入DNA到完整细胞或组织的途径。例如，可以从未成熟胚或外植体再生谷类，如Vasil，1988所述。
还可以通过直接转移DNA到花粉中来将DNA导入植物，如Zhou等，1983；Hess，1987所述。可以通过注射DNA到植物的生殖器官中而获得多肽编码基因的表达，如De La Pena等，1987所述。DNA还可以直接注射到未成熟胚的细胞中，和通过干燥胚的复水(rehydration)导入细胞中，如Neuhaus等，1987；Benbrook等，1986所述。
在实现送递外源OAT多核苷酸到受体小麦细胞之后，为了获得本发明的转基因小麦植物，下一步骤通常涉及鉴定被转化的细胞用于进一步培养和植株再生。如本文提到的，为了改善鉴定转化体的能力，最好使用可选择或筛选的标记基因作为所述OAT多核苷酸，或者除了所述OAT多核苷酸之外还使用可选择或筛选的标记基因。在这种情况下，一般可以通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来分析可能被转化的细胞群体，或筛选细胞中所需的标记基因性状。
一种鉴定转化细胞的方法的示例性实施方案涉及使转化的培养物暴露于选择剂，例如代谢抑制剂(metabolic inhibitor)，抗生素，除草剂等。已被转化且已稳定整合了赋予对所用选择剂的抗性的标记基因的细胞将在培养中生长和分裂。敏感的细胞将难以进一步培养。一个优选的标记基因的例子赋予对草甘膦(glyphosate)的抗性。当用该基因作为选择标记时，使用草甘膦来处理认为被转化的细胞的培养物。处理后，转基因细胞可供进一步培养，而敏感的，或者说非转化的细胞则不可。该方法在美国专利5,569,834中有详细的描述，特此并入作为参考。另一个优选的选择标记系统的例子是新霉素磷酸转移酶(nptII)抗性系统，其赋予对抗生素卡那霉素的抗性，如美国专利5,569,834(特此并入作为参考)。同样，用该系统转化后，经过卡那霉素处理，被转化的细胞将可供进一步培养，而没有被转化的细胞则不能。另一种优选的选择标记系统涉及使用赋予对巴龙霉素(paramomycin)的抗性的基因构建体。这类选择标记系统的使用在美国专利5,424,412中有描述(特此并入作为参考)。
另一种优选的选择标记系统涉及使用本发明考虑到的基因。具体地，用OAT多核苷酸和功能性等价物转化的细胞将产生盐抗性(salt resistance)。因此，通过培养细胞并分离对高盐水平有抗性的细胞，基因组中导入了重组DNA分子的植物细胞可以从没有纳入该重组分子的细胞群体中被选择出来。
本发明还考虑到，筛选和选择标记的组合可用于鉴定被转化的细胞。在某些类型的细胞和组织中，选择剂，例如草甘膦和卡那霉素，或者不能提供足够的杀灭活性以清楚地识别被转化的细胞，或者可能对转化体以及非转化体同样地导致显著的非选择性抑制，从而使得该选择技术无效。本文认为，通过使用生长抑制性化合物例如草甘膦，在低于导致100％抑制的浓度条件下进行选择，然后对生长的组织中可筛选标记基因例如编码卡那霉素抗性的基因的表达进行筛选，可以从不适于单独选择细胞和组织类型中回收转化体。本文还认为，通过选择和筛选的结合，可以从更多的细胞和组织类型中鉴定转化体。
从单个植物原生质体和多种外植体生发(development)和再生植物是本领域熟知的(Weissbach and Weissbach，1988)。该再生和生长过程通常包括这样的步骤选择被转化的细胞，并培养个体化(individualized)细胞，通过通常的胚胎发育阶段，直到(并包括)生根小植物(root plantlet)阶段为止。转基因胚和种子的再生是类似的。然后将所得的转基因生根苗(rootedshoots)种植在合适的植物生长培养基，例如土壤中。
含有通过土壤杆菌导入并编码目标多肽的外来外源性基因的植物，可以通过本领域熟知的方法例如Horsch等，1985所描述的方法，从叶外植体发育或再生而得到。该过程中，在选择剂的存在下，用诱导被转化的植株产生再生苗的培养基培养转化体，如Fraley等，1983所述。具体地，美国专利5,349,124(特此并入作为参考)详细描述了遗传转化的莴苣细胞的产生及由此获得的植物，该植物表达杂合的晶体蛋白，该蛋白赋予该植物针对鳞翅目(Lepidopteran)幼虫的杀虫(insecticidal)活性。
该过程通常在2到4个月之内产生苗，然后将这些苗转移到合适的含有选择剂和防止细菌生长的抗生素的生根诱导培养基中。生根的苗在选择剂存在下形成小植物，然后将其移植到土壤或其它培养基中以供根的产生。这些过程依赖于所采用的特定植物株而变化，这些变化形式是本领域熟知的。
优选地，使再生的植物自体受粉(self-pollinated)以产生纯合的转基因植物，或者，将从再生植物获得的花粉与农业上重要的品系(line)的由种子生长的(seed-grown)植物杂交。这些品系可以是近交系(inbred lines)或远交系(out bred lines)。反过来，使用那些重要品系对再生植物授粉。含有所需多肽的本发明的转基因植物用本领域技术人员熟知的技术来培育。
因此，在一个实施方案中，本发明的转基因植物对于OAT mRNA具有增加的基因量。优选的转基因植物是独立分离子，并能够将这些基因和它们的活性传给其后代。更优选的转基因植物对于所述OAT多核苷酸是纯合的，并在有性交配时将它们传给其所有后代。来自转基因植物的种子可以在田间或温室种植，并使所得的性成熟转基因植物自体受粉以产生纯种的(true-breeding)植物。这些植物的后代形成纯种品系(true breeding lines)，评估该品系OAT转基因的表达。
本文认为，在某些情况下，通过稳定导入一种或多种天然的、合成修饰的或突变的OAT转基因，转基因植物的基因组已被扩大。在某些情况下，将有多于一个转基因被纳入转化的宿主植物细胞的基因组。当多于一个OAT编码DNA片段被纳入这样的植物的基因组时即是如此。在特定情况下，最好有一个，两个，三个，四个，或更多的OAT基因(天然的或重组改造的)被纳入转化的转基因植物并在其中表达。
在本发明的一个实施方案中，所述具有增加的OAT多肽的转基因小麦植物具有对胁迫的诱导的或增加的耐性。术语“耐性”(tolerance)覆盖下列范围的保护作用，即从延迟乃至完全抑制胁迫条件所导致的细胞代谢改变、细胞生长降低和/或细胞死亡。优选地，本发明的转基因小麦植物对胁迫条件具有耐性表现为下面的意义，即在同样的条件下，小麦植物可以基本上正常地生长，而相应的野生型小麦植物显示出生长、代谢、生存力(viability)和生产力(productivity)的降低，和/或雄性或雌性不育。
本文所用的“胁迫耐性”指在胁迫中生长和生产生物质(biomass)的能力，在胁迫后重新开始(reinitiate)生长和生物质生产的能力，和历经胁迫而存活(survive)的能力。术语“胁迫耐性”还覆盖植物在胁迫中能以类似于未受胁迫的条件下的方式经历其发育程序(developmental program)的能力，例如，在胁迫条件下，以类似于未受胁迫的条件下的方式从休眠(dormacy)转换到萌发(germination)，从营养(vegetative)阶段转换到生殖(reproductive)阶段。确定植物的生长或对胁迫的响应(response)的方法包括，但不限于高度测量(height measurements)，叶面积(leaf area)、植物水关系(plant water relations)、开花能力(ablity to flower)，以及产生后代能力和生产能力，或本领域技术人员已知的任何其它方法。
术语“胁迫”包括生物性胁迫(biotic stress)，例如病原体(包括病毒、细菌、真菌、昆虫和线虫)造成的胁迫及这些的组合，和环境胁迫，特别是因为不利的环境条件可能使病原体克服植物对胁迫的天然耐性。
术语“病原体”(pathogens)指对植物的生理状态具有负面影响的生物。病原体的例子包括能够对植物的生理状态造成负面影响的病毒、细菌、真菌、及寄生虫(parasties)和害虫(pests)例如线虫和昆虫。
术语“环境胁迫”在现有技术中已被以几种不同的方式定义，其大体上和术语“渗透胁迫”(osmotic stress)一致。例如Holmberg和Bulow，1998，(Trends Plant Sci.3，61-66)定义了造成非生物胁迫(abiotic stress)的不同环境胁迫因素。盐、干旱、热、寒冷(chilling)和冻结都已作为诱导渗透胁迫的条件的例子被描述。本说明书所用的术语“环境胁迫”指无生命的(non-living)或非生物的(non-biological)环境胁迫对代谢、生长或生存力细胞、组织、种子、器官或整株植物所产生的任何不利影响。更具体地，其还涵盖环境因素例如盐胁迫(salt stress)、水胁迫(water stress)(淹水(flooding)、水浸(water logging)、干旱、脱水)、无氧(低水平的氧、CO2等)、氧胁迫(aerobic stress)、渗透胁迫、温度胁迫(temperature stress)(热(hot/heat)、寒冷、冻结、霜)或营养物剥夺，污染物胁迫(pullutantstress)(重金属，有毒化学品)、臭氧、高光和上述的组合。
在一个优选的实施方案中，本发明的转基因小麦植物具有增加的耐受盐胁迫能力。术语“盐胁迫”、“盐度诱导的胁迫”(salinity-induced stress)或类似的术语，是指与提高的盐浓度相关或被提高的盐浓度诱导，并对细胞的胞内和胞外环境的渗透势(osmotic potential)造成扰动(perturbation)的任何胁迫。具体地，本发明的耐盐性小麦植物在至少150mM NaCl的存在下相对于未转化的“野生型”小麦植物能够显示至少350％的种子产量增加。
可以使用例如后述实施例6列出的程序，在水培系统(hydroponicssystem)中150mM盐条件下，对照商业小麦栽培种例如Westonia测试转基因植物。例如，耐盐品系2490.1的10株转基因植物分离为3个水平的耐盐性(见图4)。2490.1的最高组的每株种子数(seed number)、种子重量(seedweight)、分蘖数(tiller number)和穗数(head number)高于Westonia和低耐盐性转基因组3.5倍以上。
在一个实施方案中，本发明提供由本发明的植物生产的食物(food)。本文所用的“食物”是指可被生物代谢以产生能量和构建组织的任何物质，包括液体和固体食物。
在整个本说明书中，“包含”(comprise)一词，以及其变化形式，如“comprising”和“comprises”，意思是“包括但不限于”，而不意在排除其它的添加成分(additives)、组分(components)、完整实体(integers)或步骤。
下面将参考如下的非限制性实施例对本发明作进一步的描述，这些实施例仅作为参考。但应当理解，下面的实施例仅仅是说明性的，不应看作是对上述发明的一般性的任何限制。特别地，当就本发明在两种小麦品种中使用某一OAT基因作详细描述时，显然能够理解，本文的研究结果并不限于所述的这些OAT基因来源或小麦品种。
实施例1鸟氨酸氨基转移酶(OAT)基因将OAT基因从拟南芥分离到双元载体中。为了转化该基因到小麦中，通过PCR扩增过程扩增该基因，并使用BamH1和Kpn1限制位点将其转入载体pGBA2。
用于扩增带有限制位点BamH1(5’端)和Kpn1(3’端)OAT基因的引物如下正向引物5’GCATGGATCCGCTTCACAATGGCAGCAGCCACCACG下划线部分是BamH1位点，粗体部分是起始密码子。
反向引物5’GCATGGTACCGAAAGCTGGGTTCAAGCATAGAGG下划线部分是Kpn1位点，粗体部分是起始密码子。
用于鉴定转基因小麦中的拟南芥(Arabidopsis)OAT基因的引物如下。
正向引物5’GAGTTGTGACAATGATGCTACTCGTGG反向引物5’CGAGTACATCGTGAAGAGCCTCAGATCC预测的PCR产物的长度是770bp的片段。
用Pfu DNA聚合酶(Promega)扩增带有BamH1和Kpn1限制位点的OAT基因。所用的试剂和程序如Pfu所附说明书所列出的。在1％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，与1kb+DNA分子量标记(molecularladder)比较。使用UltracleanTMDNA纯化试剂盒(Geneworks)根据制造商的指示从琼脂糖凝胶纯化扩增产物。简单的说，从凝胶切出目标条带，加入3倍凝胶体积的Ultra-salt，并在65℃温育混合物5min以溶解琼脂糖。加入5-7μL的Ultra-Bind二氧化硅基质，充分混合溶液并在室温温育该管5min以结合DNA。20,800g离心5秒以沉降Bresa-Bind/DNA基质，弃去上清液，涡旋混合10秒将沉淀重悬于1ml的Ultra-Wash溶液中。将管离心5秒并吸去所有上清液。通过将重悬沉淀在2倍体积的蒸馏水中从Ultra-Bind上洗脱DNA，室温温育5min，20,800g离心1min，将含有DNA的上清液移出到新管中。
如下所述扩增片段OAT基因，以筛选含有该基因的小麦植物PCR成分为4mM MgCl2，10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.75mM dNTP和每种引物0.2pmol。反应条件为94℃，3min，然后35个94℃，30秒、60℃，30秒和72℃，2分钟的循环。将反应在72℃保持7分钟，然后在保持在15℃的温度。然后在1％的琼脂糖凝胶上运行PCR反应物并与1kb+DNA分子量标记比较。
实施例2克隆OAT基因到pGBA2载体中来自实施例1的带有BamH1和Kpn1限制位点的OAT基因产物用BamH1和Kpn1限制酶切割后，连接到同样被BamH1和Kpn1切割的pGBA2载体中的泛素启动子和玉米醇溶蛋白终止子之间。泛素启动子、OAT基因和玉米醇溶蛋白终止子构成了OAT构建体(图1)。用连接混合物转化大肠杆菌DH10b菌株感受态细胞后，铺在含有氨苄青霉素的LB琼脂上，以选择被pGBA2转化的大肠杆菌细胞。然后通过PCR扩增OAT基因的770bp片段，来检验被转化的大肠杆菌菌落中pGBA2质粒内OAT基因的存在。进行限制性消化，然后将所得图式与预测的片段大小的图式相匹配，来确认OAT基因的存在。
实施例3OAT基因的测序使用ABI377自动测序仪(Applied Biosystems Industries)按照制造商的指示对实施例2鉴定的一个克隆进行测序。测序是进行使用实施例1的产生770bp片段的正向和反向引物，加上另一内部引物(internal primer)(5’ACAATTGCTAATGTACGTCC)。使用SeqEdTM1.0.3版软件(AppliedBiosystems Industries)分析原始序列数据，并使用基于万维网的(web based)程序MultAlin(Corpet，1988)与来自Genbank的推定的拟南芥OAT基因序列(NM 123987)进行序列比对。图2显示所得的OAT核苷酸序列，而图3显示OAT的氨基酸序列。
实施例4用OAT构建体产生转基因小麦植物使用下列程序产生含有实施例2所述的OAT构建体的转基因小麦植物群体。
OAT构建体的制备用HaeII消化含有OAT构建体的pGBA2，产生这样的片段，其含有OAT构建体，位于该构建体5’端的pGBA2的177bp，和位于该构建体的3’端的pGBA2的283bp(图1)。在1％琼脂糖凝胶上运行OAT构建体，并如实施例1所述从凝胶抽提出DNA。将DNA以500ng/μL的浓度重悬在水中。
目标组织在玻璃温室中22-24℃种植小麦植物(栽培品种Westonia和Carnamah)。开花后11-15天收集含有未成熟胚的种子并将其表面消毒。切下未成熟胚，并且在轰击之前放在含有2.5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)MS(Murashige和Skoog，1962)培养基上。
微粒轰击目标组织的渗透剂处理、DNA沉淀以及微粒轰击均按照已描述的对甘蔗的方法进行(Bower等，1996)，不同的是使用钨颗粒。每次轰击用50μg金颗粒轰击小麦组织。用于轰击的线性片段是CAH线性构建体(Weeks等，2000)，其编码氨腈水合酶以降解氨腈，以及等摩尔浓度的OAT构建体。
选择轰击之后，在24℃、黑暗中将胚置于含有2.5mg/l的2，4-D的MS培养基上2周，然后转移到加了40mg/l的氨腈(Sigma)的相同的培养基中，在相同的培养条件下经过6周，每两周更换新鲜培养基。将组织转移到含有0.1mg/L 2，4-D和40mg/l氨腈的MS培养基上，并转移到光照下以供再生。2周后，将组织转移到不合天冬酰胺和谷胺酰胺，并含有0.1mg/L的2，4-D和55mg/l氨腈的MS培养基(C2培养基)上。2周后将组织转移到不含2，4-D、含65mg/l氨腈的C2培养基(C3培养基)上。然后将从这些组织生发出的健康小植物转移到加有65mg/l氨腈的1/2MS培养基上。一旦它们生发出根，即将它们转移到温室中的盆栽混合土(potting mix)中。
实施例5基于PCR的转基因分析为了证明实施例4中产生的植物是否的确含有拟南芥OAT基因的转基因，用PCR扩增该基因的片段。
从小麦叶提取DNA的方法，如提取植物DNA用的Nucleon PhytoPureTM(Amersham Biosciences)的说明中所详述的。
用于扩增770 bp片段的PCR引物和条件如实施例1和2所述。
本选择系统产生的的转基因产物(transgenics)中有大约50％含有OAT基因。
实施例6使用盐水水培系统(saline hydroponics system)筛选耐盐性鉴定了带有OAT基因的小麦植物后，让转基因T0植物产种，并收集种子用于盐水栽培筛选。
根据先前的实验，发现150mM的盐可显著地导致植物生长中断，并造成早期产种。
种子种植到石棉小室(rockwool cubes)中(每室一个种子)，让其在水中萌发并生长到大约10cm高。然后将植物转移到装有玄武岩(basaltrock)(2cm blue metal)的开孔的4L盆中。将盆置于水培连续流系统中，使1/2霍格兰溶液(Hoaglands solution)充入到低于玄武岩顶部2cm的高度。每盆5株植物，每个转基因品系2盆。让植物适应水培系统3天时间后，用9∶1比例的NaCl∶CaCl2将溶液分别调节为50mM盐。每3天将溶液调高50mM，直至达到150mM。然后将溶液保持在150mM盐。考虑到蒸发和植物的营养物摄取，用1/2霍格兰溶液有规律地对储液罐加以调整。
一旦植物完成其生命周期，则将其收集用于表型测定。测定包括每株植物的分蘖数、每株植物的穗数(head number)、每株植物的种子重量和每株植物的种子数。
转基因品系2490.1在所述水培系统中显示150mM盐的耐盐性。测试的10株2490.1植物显示，耐盐性分离为三个显著不同的组(图4)。高耐盐性组、中度耐盐性组和无耐盐性组，比例分别为1∶2.5∶1.5。表1中“转基因2490.1植物”代表高耐盐性组，而“无效分离体”(null segregates)表示无耐性组中的植物。
表1显示，2490.1高盐分离体相对于Westonia和2490.1低盐(无耐性)分离体，分蘖数、穗数和种子重量增加了2.5倍(3.5fold)以上。高盐分离体的种子数高于所述两种对照3倍(4-fold)以上。
表1耐盐性阳性转基因植物、商业品种(Westonia)和无效分离体的分蘖数、穗数、种子数和种子重量。S.D.为相对平均值的标准偏差。转基因2490.1有Westonia背景。

实施例7耐霜冻性评分将来自含有OAT转基因(品系2490.1和2721.1)的植物T2代的种子种植在4L盆(含有无菌的盆栽混合土和肥料)中，每盆4个种子，在环境受控的房间里生长。房间中的条件为昼间(12h，3:00pm开始)20℃，夜间(12h)14℃。开花大约20天之前，每2天将昼间的温度线性递减(rampdown)2℃，每3天将夜间的温度线性递减2℃，直到最终昼间的温度为8℃，夜间的温度为4℃。
一旦开始开花，即将植物转移到霜冻室(frosting chamber)中(辐射线性递减降温(radative chilling ramp)且地面/根部温度(floor/root temperature)受控)，其中温度从4℃降低到-4℃，保持3小时后，再线性递增回4℃。该过程经过12小时，一旦完成，即将植物转回环境受控的房间。从霜冻后7天起，以昼间温度每2天升高2℃、夜间温度每3天升高4℃的速率升高环境受控的房间中的温度，直到最终的温度为昼间24℃，夜间18℃。
将转基因植物和各个对照霜冻后13天，对与麦穗发育阶段相应的种子发育水平进行评分。评分方法用未受霜冻的Westonia非转基因植物作为受过霜冻的Westonia植物和转基因品系2490.1的基线(0值)；用未受霜冻的Carnamah作为受过霜冻的Carnamah及2721.1的基线。评分的标度为0到5，其中5表示与对照相比没有或几乎没有种子发育(基线)。
两种受过霜冻的转基因品系都显示，相对于受过霜冻的对照(Westonia和Carnamah小麦品种)，种子发育受影响的水平显著地降低(图5)。所受影响平均减少到三分之一以下(three fold less)。由此，这些初步结果显示这些转基因植物也具有霜冻抗性。
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1.耐胁迫小麦植物，其中所述小麦植物已经被编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子转化。
2.权利要求1的耐胁迫小麦植物，其中所述核酸分子是具有基本上如图2(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的cDNA分子或者是其生物活性片段。
3.权利要求1的耐胁迫小麦植物，其中所述植物与未被转化的小麦植物相比，具有增加的耐受选自下列胁迫的能力干旱胁迫、盐胁迫、脱水胁迫、热胁迫、寒冷胁迫、冻结胁迫、水浸胁迫、伤害胁迫、机械胁迫、氧化胁迫，臭氧胁迫、高光胁迫、重金属胁迫、营养物剥夺胁迫和毒性化学品胁迫。
4.保护小麦植物免受胁迫的方法，包括将编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子导入小麦植物的步骤。
5.权利要求4的方法，其中所述胁迫选自干旱、盐、脱水、热、寒冷、冻结、水浸、伤害、机械胁迫、氧化胁迫，臭氧、高光、重金属、营养物剥夺和毒性化学品。
6.权利要求4的方法，其中所述胁迫是盐或干旱。
7.权利要求4的方法，其中所述胁迫是存在高于100mM的盐。
8.权利要求4-7任一项的方法，其中所述鸟氨酸氨基转移酶(OAT)核酸分子是从拟南芥分离的。
9.权利要求4-8任一项的方法，其中所述小麦植物选自普通小麦和Triticum durum。
10.转基因小麦植物、植物材料、种子或其后代，其包含编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子，其中所述核酸分子的表达导致产生能在高于100mM的盐存在下生长的转基因植物、植物材料、种子或其后代。
11.核酸构建体，其包含鸟氨酸氨基转移酶(OAT)基因和分离自植物的启动子，其中所述核酸构建体能够转化小麦植物，致使该小麦植物具有耐胁迫性。
12.权利要求11的核酸构建体，其中所述启动子是组成性启动子、遍在性启动子、胁迫诱导性启动子、组织特异性启动子或发育控制型启动子。
13.权利要求11的核酸构建体，其中所述启动子是泛素启动子。
14.权利要求11的核酸构建体，其中所述核酸分子是具有基本上如图2(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列的cDNA分子或其生物活性片段。
15.产生具有增加的或被诱导的耐盐性的转基因小麦植物的方法，该方法包含下列步骤a)用编码鸟氨酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子转化小麦植物的植物组织或细胞；b)使所述组织或细胞再生为完整植物；及c)以足够诱导或增加植物对高于100mM盐的耐性的条件和时间在再生的植物中表达OAT。
全文摘要
本发明涉及转基因小麦植物。具体地，本发明涉及耐胁迫的小麦植物，其中该植物已被编码鸟苷酸氨基转移酶(OAT)的核酸分子转化。
文档编号C12N15/82GK101048060SQ200580033672
公开日2007年10月3日 申请日期2005年7月29日 优先权日2004年8月3日
发明者斯科特·D·麦克尼尔, 道格拉斯·A·张伯伦, 罗伯特·S·鲍尔 申请人:谷物生物技术澳大利亚有限公司