专利名称：一种新的定性和/或定量检测方法
技术领域：
本发明涉及一种对样品的检测方法，特别是对含有生物活性的样品中的目标化合物进行定性和/或定量的检测方法，是一种以图形识别为基本检测内容、或基本检测内容之一的检测方法。
现有的利用快速诊断试剂条或试剂盒的检测方法的基本特征是，所用探针板上的选择性反应器，是以可进行位置识别的方式定量地固定有一组具有生物活性的探针(通常为二条到数条直线条或/和十字形线条)的吸水载体膜条。此探针线组可对样品中的目标物进行选择性捕捉，其所捕捉的目标物可用染色法和金属标记法等进行标记，标记物的位置和密度可通过肉眼或其它检出装置读取。现有快速诊断试剂条或试剂盒的探针线组中的每一条线含有一种探针，固定时尽可能使探针线上的探针量及其尺寸分布与参比探针线一致，并要使探针线的位置正确，前者保证其密度识别的可靠性，后者保证其位置识别的可靠性。由于探针线及其上固定的标记物缺乏明确丰富的图形识别信息，因而实际上被处理为仅有位置意义和密度意义的线。任何在同一位置上形成的失真现象，例如非特异性的标记物或杂质形成的背景对简单线条读取的干扰或位置漂移等，均可造成失真的位置识别和密度识别，或者说以此方法所获的检出结果仍具有较高的不确定性。
现在的生物芯片法的基本特征是，所用探针板上的选择性反应器，是以可进行位置识别的方式定量地固定有一组具有生物活性的探针(通常为微点组成的点阵)的固相载体。此探针阵列可对样品中的多种目标物同时进行选择性反应，其反应结果可用同位素法、化学荧光法、化学发光法、磁标记法或微电位检测法等进行标记，所标记的位置和密度可通过扫描仪等检出装置进行信号检出，再通过计算机软件分析，得出位置识别和密度识别的结论。生物芯片中的探针阵列，由于使用各种高精度的芯片印刷机、点样机来生成，和使用高灵敏度的荧光扫描仪来识别，每一个探针点的尺寸可以很小，每平方厘米可高达几千、上万个微样点(WO95/11995)。生物芯片上的探针阵列中每一个微样点含有一种探针物，样点的目标形状都是小圆点，点样时尽可能使探针点上的探针量及其尺寸分布与参比探针点一致，尽可能使探针点的位置准确，前者保证其密度识别的可靠性，后者保证其位置识别的可靠性。使用扫描仪等检出装置进行检测时，先对载体表面进行扫描，将信号采集到计算机，再由计算机进行密度与位置信号的解读。由于探针园点被简单重复使用不产生足够进行图形识别的信息，且在实际印刷过程中探针园点的随机变形，因而现有芯片仅有位置性质和密度性质，而无图形性质。任何与位置有关的干扰，例如位置误差、非特异性的标记等，均可造成位置识别失真从而密度识别失真。换言之，现有生物芯片法即使使用价格昂贵的定位系统(高精度印刷设备，高精度扫描仪及位置处理软件等)，其检测结果仍具有较高的不确定性。
总之，对现有的检测方法而言，由于采用了位置识别和/或密度识别，已经获得越来越广泛的应用，但又由于其仅采用了密度识别和/或位置识别，其检测结果的不确定性仍待进一步降低。
本发明的目的是通过实施下述技术方案实现的本发明的特征在于以图形识别为检测内容或检测内容之一，其基本过程为A、设计和制造具有图形识别性质或包含有图形识别性质的反应器、探针板及试剂盒；B、在探针板的反应器中加入样品进行探针一目标物反应，在需要时加入标记糸统进行目标物-标记物反应等操作；C、人工或仪器读取反应结果，然后人工或/和利用计算机软件进行图形识别或包含有图形识别的图像识别分析，得出检测结果。
本发明的图形符号包括除下列情况之外的所有可识别的图形、图案、字符等图形符号或符号或其组合，A、对生物芯片而言，不包括现有的仅由简单点状物构成的点阵，B、对快速试纸条而言，不包括现有的仅由直线条和十字线条构成的直线群。
本发明中所述的试剂盒是指某些定性和/或定量检测中必不可少的一种耗材，被用以同目标物进行反应并将反应结果以可确定的方式表达出来，其特征在于包含有具有图形识别性质的探针板，探针是以图形符号的形式分布在探针板上。例如，几何图形(例如，各种曲线，三角形、矩形、多边形、图形等各种面图型及其边等等)、图案(例如动、植物图型，花纹等等)、各种语言包括计算机语言的文字符号(例如，字母，字，词，句，科学符号，音符等等)。
本发明所述的探针板是指试剂盒中一种包含有一个或多个选择性反应器的产品，例如96孔(即96反应器)包被ELISA板和8反应池(即8反应器)生物芯片板等，其特征在于含有具有图形识别性质的选择性反应器，且探针以图形、图案、字符等图形符号的形式固定在此选择性反应器上。
本发明所述的一个探针板上包含一个或多个上述的具有图形识别性质的反应器，或将一个或多个上述的反应器与探针板上的其它反应器或其它结构连通。
本发明所述的的探针板是任何一种可在其上以图形符号的形式固定探针的材料或材料组合而构成。探针板在符合检测要求的条件下呈各种形状。
本发明所述的选择性反应器是指固定有探针的、可进行选择性反应及相关操作的固定场所，例如多池芯片板的反应池、ELISA微孔板的孔等等。
本发明所述的探针的种类范围包括所有可以以图形符号的形式固定在探针板固相载体上、且可与样品中目标物发生选择性反应的物质。例如DNA、人造或天然蛋白质、蛋白质片断、多肽、核苷酸、抗原、抗体、配体、受体及它们的活性片段，细胞或组织上的任何可用于捕捉目标分子的成分等等。
本发明所述探针板生产的基本过程为A，探针板的结构设计；B，包含反应器中探针图像设计的探针分布设计；C，获得能够赋于选择性反应器以图像性质的印刷设备，例如刻有图形符号的印章、可印刷图形符号的喷墨机、可点出图形符号的点样机等等；D，印刷出具有图像性质的反应器；E，完成探针板上其它结构的制备。
本发明所述的检测样品为各种动植物液体和/或组织，或上述物质成分或纯化物。例如血液、尿液、唾液、血清、脓液、腹水、粪便、发酵液、药物、培养液、花、果、叶、根、茎成分和植物液体成分等。
本发明的具体实施过程如下A、图形识别和图像识别设计在本发明中只以图形识别来进行检测时，根据图形识别的原则，使用可识别图形设计软件或人工对探针在固相载体上的固定、进行可识别性图形设计。
在本发明中以图形识别与密度识别和/或位置识别并用来进行检测时，根据图像识别的原则，对固定在固相载体上的探针的分布，就其位置、密度和图形符号，在充分考虑印制条件、反应条件、读取条件和信息分析条件的基础上，以获得最大的可识别性为目的进行图像设计。例如，位置可用坐标来表示，密度可用探针加样量(探针分布面积×单位面积加样体积×探针浓度)来表示，图形符号可以是空心的、实心的、规则的、不规则的几何图形、图案和各种字符等。
B、制备图形化或图像化的探针板及试剂盒利用喷墨、印章等印刷设备，依据探针图形或图像设计，将捕捉分子的探针固定在固相载体上，制成图形化或图像化的探针板。
C、检测在制得试剂盒和其它条件满足后，可进行检测。检测时加入待检样品，使目标物与具有图形/图像性质的探针相结合，必要时可对目标物进行标记。如果某探针的目标物以有意义的量存在，则该探针产生符合设计要求的图形或图像(位置、密度和图形的综合)的检测信号。
D、检测信号处理用肉眼和/或仪器、专用图形或图像识别软件对检测信号进行定性和/或定量判断，得到目标物的检测结果。
本发明的检测方法的优点是由于在已有的密度识别变量和位置识别变量之外，创造性地引入了图形识别变量，从而增加了检测方案可选择性即检测自由度，例如新增加了基于图形识别的检测方案；而且，当本发明中的图形识别，与已有的检测方法中的密度识别和/或位置识别，在更高的识别原则-图像识别下得以统一，可以进一步提高检测结果的确定性，以达到提高对目标物进行定性和/或定量检测的特异性和灵敏度的最终目的。
例如，按照本发明的检测方法和本发明中的探针板，可以生产特异性和灵敏度更高的新形快速诊断试剂条。这种快速诊断试剂条，是在试剂条上印制不同的图形而成，例如A探针以开口向上抛物线形式、B探针以直线形式、C探针以开口向下抛物线形式、D探针以开口向左抛物线形式和E探针以开口向右抛物线形式分布，当样品中的目标分子与载体上的捕捉分子和标记分子结合以后，快速诊断试剂条特定位置上显示出的不仅有颜色深浅，还有设定的图形。即便是试纸条上出现不规则非特异标识和线条有较大的位置漂移或误差，也不会像现有的试剂条上有7、8条平行线(ZL00226807.8；ZL00226808.6)，难于分出彼此，出现x条带误识为Y条带的错误。
又例如，按照本发明的检测方法和本发明中的探针板，可以生产特异性和灵敏度更高的新形生物芯片探针板。在此一探针板上，探针的分布，不再是简单的点阵而是具有多信息量的图形、图案，字符等形象符号。具体方式可以是一种或多种图像排成阵列，多种捕捉分子图像大小套迭排列、多组套迭又组合成阵列等各种方式。例如，A探针印刷成一个符号A、B探针印刷成一个符号B、...在反应器中形成一字母阵列。当探针与目标物结合后，再使目标物与加入的标记反应，反应结果可以根据探针板上出现字符的情况，人工或利用含有字符识别的计算机软件来分析。由于非特异性干扰形成字符的几率比形成不规则园点的几率要低得多，以及位置误差对本发明方法的影响要小得多。利用本发明方法和探针板，检测结果的不确定性要低得多。
实施例2一种荧光标记芯片试剂盒的生产例子本例中的试剂盒，探针板的固相载体为已活化的显微镜玻片(25×75mm)。此一玻片同已成型的一块塑料板粘合后，探针板被制成包含7个平行的选择性反应器(图2)，每个反应器尺寸为18×4×1mm(长×宽×高)。探针分别为乙肝e抗原、丙形肝炎抗原、含有HIV1基因工程抗原、梅毒抗原、HTLV抗原，和作为对照物的蛋白质A。每个反应器中各印有6个探针字符，每个字符尺寸为2X2mm。字符A、B、C、D、E和F分别以印章用乙肝e抗原、丙肝融合抗原、HIV1+2融合抗原、梅毒抗原、HTLV抗原和蛋白质A印成。反应器中未有字迹处的活性以封闭液失活。试剂盒中的标记系统为罗丹明标记的羊抗人IgG。
实施例3一种金银染色芯片试剂盒的生产例子本例中的试剂盒，探针板的固相载体为已活化的显微镜玻片(25×75mm)。探针分别为丙形肝炎NS3、NS4、核心抗原，和作为对照物的蛋白质A；探针的图形符号分别为等边三角形、园形、五角形和长方形。每个符号的外形尺寸为0.5×0.5mm，分别以印章印成。玻片上未有符号处的活性以封闭液失活。试剂盒中的标记系统为胶体金标记的羊抗人IgG和对标记金放大的硝酸银。
实施例4新型肝炎快速诊断试剂条的应用使用例一中制备的新型肝炎快速诊断试剂条，以人血清为样品，快速检测有无针对固定在试剂条上的HAV抗原、HCV融合抗原、HDV抗原、HEV抗原和HGV抗原的阳性反应。检测时，待加入的血清样品进入检测区后，再加入缓冲液，使样品经过检测区到吸水区。这时，通过肉眼或借助放大镜，如观察到试剂条中有显色垂直线，则对应于蛋白质A探针的阳性反应；同理，如观察到试剂条中有显色的抛物线或水平线，则血清样品与此图形对应的抗原有阳性反应，否则为阴性反应。即使试剂条上出现一定位置漂移或若干随机色斑，也不会影响结果的判断。血清样品中观察到的字符图形与elisa方法的检测结果列于表一中。
实施例5一种荧光标记芯片试剂盒的应用例子使用例二中制备的荧光标记芯片试剂盒，每个探针板可加入6分待测人血清和一分阳性血清对照，检测有无针对固定在芯片上的乙肝e抗原、丙肝融合抗原、HIV1+2融合抗原、梅毒抗原、HTLV抗原的阳性反应。阳性对照血清是37分人血清的混合物，这些血清在混合前后分别由elisa方法检测出对上述抗原有弱阳性反应。分别在探针板上7个反应器中加入6分待测人血清和一分阳性血清对照后，在37C反应30分针，用洗液洗去未结合的血清成分，再加入罗丹明标记的二抗，当标记二抗与被探针固定的检测样品中的相应抗体反应完成后，洗去未结合的标记物，干燥后将探针板放在荧光显微镜下观察。由于结合在目标分子上的二抗标记物显出荧光，在加入弱阳性对照血清中的出现字符图形，其它血清样品中观察到的字符图形与elisa方法的检测结果列于表二中。
实施例6丙形肝炎金银染色芯片试剂盒的应用例子使用例三中制备的金银染色标记芯片试剂盒，每个探针板可加入1分待测人血清，检测有无针对固定在芯片上的丙形肝炎NS3、NS4、核心抗原，和作为对照物的蛋白质A的阳性反应。本例中所用样品为已知RIBA检测结果的阴性和阳性的血清样品。分别在6个探针板上加入6分样品，在37C反应30分针，用洗液洗去未结合的血清成分，再加入胶体金标记的二抗，当二抗与检测样品中的相应丙形肝炎抗体反应完成后，洗去未结合的二抗，再加入硝酸银溶液，利用金微粒催化银离子还原成银晶粒并沉积在金粒子周围，使显色作用放大，颜色比胶体金显色更明显，放大镜下肉眼即可根据待检样点的字符出现与否判断出阴阳结果。为了与其他检测方法作比较，本试验使用CCD器件采集数据，结果用计算机软件处理，先在相同参考样品和待检样品图像中圈定相同面积的圆，再根据显色深浅转换成相应数据。表三是定量结果的比较，定性结果同放大镜观察的一致。
胶体金银染色芯片试剂盒检测结果样品检测结果NS3抗原 NS4抗原 核心抗原阴性对照 79(-) 85(-) 115(-)阳性对照 1271(++) 913(+)1721(+++)检测样品1 1354(++) 79(-) 135(-)检测样品2 121(-)813(+)109(-)检测样品3 132(-)98(-) 1697(+++)(括弧中为RIBA检测结果)本发明的方法，既可以单独应用图形性质、又可以将图形性质与密度性质和/或位置性质共用，来对样品、特别是含有生物活性的样品中的目标化合物进行定性和/或定量检测检测，以进一步提高检测的特异性和灵敏度。
权利要求
1，一种新的定性和/或定量检测方法，特别是对含有生物活性的样品中的目标化合物进行定性和/或定量的检测方法，其特征在于以图形识别为检测内容或检测内容之一，其基本过程为A、设计和制造具有图形识别性质或包含有图形识别性质的反应器、探针板及试剂盒；B、在探针板的反应器中加入样品进行探针-目标物反应，在需要时加入标记糸统进行目标物-标记物反应等操作；C、人工或仪器读取反应结果，然后人工或/和利用计算机软件进行图形识别或包含有图形识别的图像识别分析，得出检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于所述的图形识别包括除下列情况之外的所有可识别的图形、图案、字符等图形符号或符号或其组合，A、对生物芯片而言，不包括现有的仅由简单点状物构成的点阵，B、对快速试纸条而言，不包括现有的仅由直线条和十字线条构成的直线群。
3.根据权利要求1所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于所述的试剂盒包含有具有图形识别性质的探针板，探针是于图形符号的形式分布在探针板上。
4.根据权利要求1所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于所述的探针板含有具有图形识别性质的选择性反应器，且探针以图形、图案、字符等图形符号的形式固定在此选择性反应器上。
5.根据权利要求1或4所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于所述的一个探针板上包含一个或多个上述的具有图形识别性质的反应器，或将一个或多个上述的反应器与探针板上的其它反应器或其它结构连通。
6.根据权利要求1或4所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于所述的的探针板是任何一种可在其上以图形符号的形式固定探针的材料或材料组合而构成。
7.根据权利要求1或5所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于所述的选择性反应器是指固定有探针的、可进行选择性反应及相关操作的固定场所。
8.根据权利要求1所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于所述的探针的种类范围包括所有以图形符号的形式固定在探针板固相载体上、且可与样品中目标物发生选择性反应的物质。
9.根据权利要求1或4所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于所述的探针板的基本生产过程为A、探针板的结构设计；B、包含反应器中探针图像设计的探针分布设计；C、获得能够赋于选择性反应器以图像性质的印刷设备；D、印刷出具有图像性质的反应器；E，完成探针板上其它结构的制备。
10.根据权利要求1所述的一种新的定性和/或定量检测方法，其特征在于本发明所述的检测样品为各种动植物液体和/或组织，或上述物质成分或纯化物。
全文摘要
现有的对样品、特别是含有生物活性的样品中的目标化合物进行定性和/或定量的检测方法，仅采用了密度识别和/或位置识别，其检测结果的不确定性仍待进一步降低。本发明公开了一种对含有生物活性的样品中的目标化合物进行定性和/或定量的检测方法，该方法以图形识别为检测内容、或检测内容之一，可以进一步提高检测结果的确定性，从而提高检测的特异性和灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK1414386SQ0211386
公开日2003年4月30日 申请日期2002年6月12日 优先权日2002年6月12日
发明者邹方霖, 陈春生, 胡劲梅, 王建霞 申请人:成都夸常科技有限公司