专利名称：棒状细菌的proB基因的突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有γ-谷氨酰激酶活性的酶。更特别地，本发明鉴定了在氨基酸序列的第149位或类似氨基酸位置(a comparableposition)具有除甘氨酸之外的蛋白质氨基酸(proteinogenic aminoacid)的那些酶。
具有γ-谷氨酰激酶活性的酶优选用于发酵生产L-脯氨酸。从谷氨酸起始的L-脯氨酸生物合成途径示于方案1。
-方案1 已知可以通过发酵例如棒状细菌(coryneform bacteria)菌株、特别是谷氨酸棒杆菌菌株而生产氨基酸。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有性质。
为改良这些微生物的性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或调节重要性代谢物是营养缺陷的并产生氨基酸的菌株。一种已知的抗代谢物是脯氨酸类似物3，4-脱氢-DL-脯氨酸(DHP)。
一段时间以来，重组DNA方法也已经用于改良生产L-氨基酸的棒杆菌菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。
谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列在EP-A-1108790中描述，并且储存在国立医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中，登记号为NC_003450.2和BX927148.1至BX927157.1。
Sleator等报道了通过突变Listeria monocytogenes proB-Gen而引起脯氨酸生物合成过量生产的可能性(Appl.Environ.Microbiol.2001，67，4560-5)。所述突变在该文中描述并称作编码γ-谷氨酰激酶的proB基因，其具有如下突变V121I、A144V和E146K。另外，需要提及的是发生这些突变的区域良好对应于也在其它生物体中作为有益突变的靶区域而被鉴别的区域。
因此本发明的目的是产生γ-谷氨酰激酶的进一步突变的以及当合适时改良的蛋白质变体，它们可有利地用于L-脯氨酸的发酵生产的技术方法中。
这一目的及其它未详细说明但从本领域可明显得出的目的通过权利要求1所述的γ-谷氨酰激酶即可实现。权利要求2描述优选的酶。权利要求3和4分别涉及编码这些酶的核苷酸序列，而权利要求5描述重组产生的具有刚刚提及的核苷酸序列的载体。最后，权利要求5涉及本发明的借助于所述酶生产L-脯氨酸的方法。
通过提供在第149位或类似氨基酸位置具有除甘氨酸之外的蛋白质氨基酸的γ-谷氨酰激酶(proB基因的产物)，令人惊奇地且有利地实现了所述目的。与野生型酶相对比，具有合适突变的γ-谷氨酰激酶有助于在发酵生产过程中以改良的方式生产L-脯氨酸。使用本发明的方法可以使得宿主生物体或者发酵方法的选自如下一组的一或多个参数的性能基于起始菌株或亲代菌株或者使用所述酶的发酵方法改良至少0.5％、至少1％、至少1.5％或者至少2％，所述的组为产物浓度(每体积的产物)、产物产量(形成的产物/消耗的碳源)及产物形成(每体积和时间形成的产物)，或者其它方法参数及其组合。
优选提供γ-谷氨酰激酶，其中在本发明定义的氨基酸位置或者类似位置存在选自如下的氨基酸、优选L-氨基酸Lys、Asn、Arg、Ser、Thr、Ile、Met、Glu、Asp、Ala、Val、Gln、His、Pro、Leu、Tyr、Trp、Cys或Phe。(所述氨基酸、包括甘氨酸，在本领域也称作蛋白质氨基酸)。非常优选的是在所述酶的第149位用L-天冬氨酸取代甘氨酸(G149D)。最优选的是如上所述的本发明的γ-谷氨酰激酶，其长度为369±40、优选±20、更优选±10及特别优选±5个氨基酸或者±3个氨基酸。已知称作氨基肽酶的宿主固有的酶能从形成的蛋白质中切割下N末端甲硫氨酸。进一步已知从蛋白质的C末端切割下1或2个及不超过3个氨基酸即使削弱所述酶活性，最多也仅是可忽略程度地削弱。然而，所述酶由于附加某些融合蛋白而可以增加长度(见下文描述)。
本发明还涉及SEQ ID NO2、优选SEQ ID NO4所示氨基酸序列或者与其至少90％相同的序列，所述序列在第149位或类似位置含有甘氨酸由另一氨基酸的取代，特别是由所述的任何优选的氨基酸的取代。本发明因此还涉及在氨基酸水平与SEQ ID NO2、优选SEQ ID NO4具有上述程度相同性的那些酶。这些酶可同样源自天然来源。或者，它们可以通过重组DNA技术修饰，由此技术人员可预测所述酶活性被保留或基本保留(参见例如Sambrook et al，“MolecularCloning，A Laboratory Handbook”，2nd edition 1989，CSH Press，ColdSpring Harbor，Ausubel et al.“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley&Sons，NY2001所述)。因此，不存在于活性位点并且其由“相同种类的”氨基酸的取代预期不导致三维结构实质改变的氨基酸可以由“相同种类的”氨基酸取代。可预期例如具有非极性侧链的某些氨基酸(相同种类的氨基酸)可以被取代，例如异亮氨酸由缬氨酸取代，而这对本发明的酶的生物学功能或酶功能或者对酶活性无(实质)影响。技术人员基于这种知识，可相应总结出其它类型氨基酸的取代(例如用其它碱性氨基酸置换碱性氨基酸，或者用其它不带电极性侧链氨基酸置换这一组的氨基酸)。
同样优选的是具有至少相应于SEQ.ID NO2、优选SEQ.IDNO4的第145-154位、更优选第130-169位、特别优选第110-1 89位或类似位置的氨基酸序列的γ-谷氨酰激酶，γ-谷氨酰激酶氨基酸序列的长度可相应于上述数值。
在另-优选的实施方案中，本发明的酶另外包含至少一个异源氨基酸节段，由于这个节段这些多肽的特征为融合蛋白。本发明的融合蛋白的异源成分的例子可以是标记(例如His标记或Flag标记)，其可用于本发明的融合蛋白的纯化中。在其它实施方案中，所述异源成分可具有单独的酶活性。在这种情况中，所述两种酶成分优选通过接头连接在一起，所述接头如长度为6-10个氨基酸的柔性甘氨酸或甘氨酸-丝氨酸接头，以保证所述成分的功能性。如本文所用，术语“异源”一方面可意味着所述融合蛋白的成分不是以共价键连接形式一起天然发生的，另一方面是指所述成分衍生自不同物种。融合蛋白通常是通过重组DNA技术制备(见Sambrook et al.，上述引文)。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明γ-谷氨酰激酶的核苷酸序列(核酸序列)。因此，本发明还涉及编码γ-谷氨酰激酶的可复制的核苷酸序列，由这些核苷酸序列编码的相应氨基酸序列可以在第149位或类似位置具有除了甘氨酸之外的任何蛋白质氨基酸。
本发明的核苷酸序列优选编码γ-谷氨酰激酶，相应的被编码的氨基酸序列在第149位或类似位置包含选自如下一组的一种氨基酸Lys、Asn、Arg、Ser、Thr、Ile、Met、Glu、Asp、Ala、Val、Gln、His、Pro、Leu、Tyr、Trp、Cys或Phe。特别优选的是编码在第149位或类似位置具有L-天冬氨酸的γ-谷氨酰激酶的核苷酸序列。
本发明还涉及编码在第149位或类似位置具有氨基酸取代的γ-谷氨酰激酶的可复制的核酸序列，这些序列a)与SEQ.ID NO1、优选SEQ.ID NO3至少70％相同，或者b)编码本发明的γ-谷氨酰激酶，其长度为369±40个氨基酸，或者c)编码本发明的γ-谷氨酰激酶，其具有SEQ.ID NO2、优选SEQ.ID NO4的氨基酸序列，至少在第145-154位，或者d)编码本发明的γ-谷氨酰激酶，其具有SEQ.ID NO2、优选SEQ.ID NO4的氨基酸序列，至少在第145-154位，并且在严格实验条件下与互补于SEQ.ID NO1或SEQ.ID NO3的核苷酸序列杂交，或者f)编码本发明γ-谷氨酰激酶的可复制的核苷酸序列，其碱基序列在第446位是腺嘌呤，如SEQ ID NO3所示。
权利要求书的范围优选地同样包含编码本发明γ-谷氨酰激酶的可复制的核酸序列，其长度为369±20、更优选±10及最优选±5或±3个氨基酸残基。
本发明还涉及如SEQ.ID NO1、优选SEQ.ID NO3所示的核苷酸序列。正如已经提及的，本发明还包含在核苷酸水平与所述序列至少70％相同的那些序列。与SEQ ID NO3至少70％相同的核苷酸序列例如SEQ ID NO5所示。SEQ ID NO6示出由SEQ ID NO5编码的γ-谷氨酰激酶的氨基酸序列。
本发明还涉及编码γ-谷氨酰激酶的可复制的核酸序列，所述的γ-谷氨酰激酶优选包括至少相应于SEQ ID NO2、优选SEQ.ID NO4的第130-169位或类似位置、特别优选第110-189位的氨基酸序列，并且所述核酸序列在严格实验条件下与互补于SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核苷酸序列杂交。
术语“互补”根据本发明是指互补性无缺口地延伸穿过本发明的核酸分子的全部区域。换句话说，优选本发明序列的全部区域、即从5’末端至3’末端、特别是编码区(cds)的100％互补性。在另外优选的实施方案中，互补性延伸穿过优选地不编码酶活性的活性位点的至少19个、优选至少21个连续核苷酸的区域。
优选所述核酸序列衍生自棒状细菌，优选衍生自谷氨酸棒杆菌。存在于一个物种种群中的基因或等位基因的核酸序列在本领域也称作内源基因或内源等位基因。
本发明进一步涉及具有本发明的核苷酸序列的重组(rec)运载体。合适的运载体可以是技术人员认为适合该目的的任何运载体，特别是载体和宿主生物体。
在这方面可以提及的宿主生物体的例子是酵母如Hansenulapolymorpha、毕赤氏酵母(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，原核生物如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，棒状细菌如谷氨酸棒杆菌，或者真核细胞如哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。当合适时在本发明之前这些生物体已经在其细胞中或其周围的发酵培养基中积累L-脯氨酸。因此，在这个优选的实施方案中，本发明的宿主是已经用本发明的核酸序列或本发明的载体(见下文描述)转化或转染或通过接合方式被提供了本发明的核酸序列或载体的重组细胞(术语“转化”、“转染”和“接合”根据本发明可同义使用)。转化和转染可分别根据已知方法进行，例如通过磷酸钙共沉淀、脂染、电穿孔、粒子轰击或病毒感染等方法进行。本发明的细胞可含有染色体外的或染色体内整合形式的重组核酸。换句话说，所述转染/转化可以是稳定或瞬时转染/转化。克隆方法为技术人员所熟知(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，2nded.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)。大肠杆菌菌株可用于重组制备和诱变方法中，所述大肠杆菌菌株特别包括E.coli XL1 Blue、NM 522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP10、HB101、BL21 codon plus、BL21(DE3)codon plus、BL21、BL21(DE3)、MM294。用于将具有本发明的核酸的基因构建体克隆进宿主生物体中的质粒同样为技术人员所已知(见PCT/EP03/07148所述；见下文所述)。
可特别提及的棒杆菌属的宿主是本领域已知的谷氨酸棒杆菌物种。已知的棒杆菌属的野生型菌株的例子是谷氨酸棒杆菌ATCC13032乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806乙酰谷氨酸棒杆菌ATCC13870Corynebacterium effiziens DSM44549Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869及分支短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020。
关于这组细菌菌株的分类信息可见于Kmpfer and Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42，989-1005(1996))及US-A-5,250,434所述。近年来(Liebl et al.，International Journal of SystematicBacteriology 41(2)，255-260(1991))，种名称作“黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)”、“乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)”和“分支短杆菌(Brevibacterium divaricatum)”的棒状细菌已经归划在谷氨酸棒杆菌物种中。种名为“Corynebacterium melassecola”的棒状细菌同样属于谷氨酸棒杆菌物种。
产生L-脯氨酸的棒状细菌菌株的例子是乳发酵短杆菌NRRL B-11421黄色短杆菌NRRL B-11422谷氨酸棒杆菌NRRL B-11423
Microbacterium ammoniaphilum NRRL B-11424谷氨酸棒杆菌ATCC 21157谷氨酸棒杆菌ATCC 21158谷氨酸棒杆菌ATCC 21159谷氨酸棒杆菌ATCC 21355Corynebacterium acetophilum FERM-P 4045Corynebacterium acetoacidophilum FERM-P 4962Arthiobacter citreus FERM-P 4963Microbacterium ammoniaphilum FERM-P 4964所有这些菌株均在US4,224,409和US4,444,885中描述。
在本发明的载体中，本发明的核酸序列优选与一个表达控制序列可操纵地连接，以便能被转录及当合适时在合适的宿主细胞中翻译。表达控制序列通常包含一个启动子，当合适时还包含调节序列如操纵子或增强子。其中还可以存在翻译起始序列。对于原核或真核宿主细胞而言合适的表达控制序列为技术人员所已知(见例如Sambrook et al.，见上述引文)。本发明的重组载体可进一步包括通常的元件如复制起点和选择标记基因。合适的重组载体的例子是质粒、粘粒、噬菌体或病毒(见例如Sambrook et al.，如前述)。
合适的质粒原则上可以是技术人员为此目的可获得的任何质粒。这类质粒可见例如Studier及其同事的文章所述(Studier，W.F.；Rosenberg A.H.；Dunn J.J.；Dubendroff J.W.；(1990)，Use of the T7RNA polymerase to direct expression of cloned genes，Methods Enzymol.185，61-89)，或者Novagen，Promega，New England Biolabs，Clontech或Gibco BRL的手册所述。另外优选的质粒和载体可见于Glover，D.M.(1985)，DNA cloninga practical approach，Vol.I-III，IRL Press Ltd.，Oxford；Rodriguez，R.L.and Denhardt，D.T(eds)(1988)，Vectorsasurvey of molecular cloning vectors and their uses，179-204，Butterworth，Stoneham；Goeddel，D.V.(1990)，Systems for heterologous geneexpression，Methods Enzymol.185，3-7；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York所述。
可用于以特别优选的方式将具有预定核酸序列的基因构建体克隆进宿主生物体中的质粒是或基于pUC18/19(RocheBiochemicals)、pKK-177-3H(Roche Biochemicals)、pBTac2(RocheBiochemicals)、pCR(Invitrogen)、pKK223-3(Amersham PharmaciaBiotech)、pKK-233-3(Stratagene)或pET(Novagen)。其它优选的质粒是pBR322(DSM3879)、pACYC184(DSM4439)和pSC101(DSM6202)，所有这些质粒均可得自DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Brunswick，Germany。优选的启动子例如是T7启动子、lac启动子、tac启动子、trp启动子、rha启动子和ara启动子。
优选地，本发明的γ-谷氨酰激酶或编码其的核酸在棒状细菌、优选在棒杆菌属、特别优选在谷氨酸棒杆菌菌种中过表达。
过表达意味着本发明的γ-谷氨酰激酶的胞内浓度或活性增加。
所述过表达措施使得相应蛋白质的活性或浓度基于起始微生物中蛋白质的活性或浓度增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，直至最大1000％或2000％。
过表达可以通过使本发明的基因或等位基因的拷贝数增加至少一个拷贝或者通过突变启动子区域和调节区或者位于结构基因上游的核糖体结合位点而实现。掺入结构基因上游的表达盒以相同方式起作用。另外，诱导型启动子可以增加发酵生产L-脯氨酸期间的表达。延长mRNA寿命的措施也改良表达。酶活性通过阻止酶的降解而进一步增强。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中或者以整合及扩增的方式存在于染色体中。或者，感兴趣的基因可通过改变培养基成分和培养方法而进一步过表达。
在棒状细菌中复制的质粒可用于增加本发明的proB等位基因的拷贝数。许多已知的质粒载体例如pZ1(Menkel et al.，Applied andEnvironmental Microbiology(1989)64549-554)、pEKEx1(Eikmannset al.，Gene 10293-98(1991))或者pHS2-1(Sonnen et al.，Gene 10769-74(1991))是基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。其它质粒载体如基于pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis et al.，FEMSMicrobiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的那些载体可以相同方式应用。关于谷氨酸棒杆菌质粒载体的综述可见于Tauch et al.(Journal of Biotechnology 104(1-3)，27-40(2003)所述。
也可以通过应用染色体基因扩增方法增加拷贝数，所述方法例如Reinscheid et al.(Applied and Environmental Microbiology 60，126-132(1994))在描述hom-thrB-operon的复制和扩增中所描述。这种方法包括将完整的基因或等位基因克隆进可以在宿主(典型为大肠杆菌)中复制但在谷氨酸棒杆菌中不复制的质粒载体中。合适的载体例如是pSUP301(Simon et al.，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schfer et al.，Gene 145，69-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation，Madison，WI，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman，Journal of Biological Chemistry 26932678-84(1994)；US-A5,487,993)、pCRBlunt(Firma Invitrogen，Groningen，theNetherlands；Bernard et al.，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))、pEM1(Schrumpf et al.，Journal of Bacteriology 1734510-4516(1991))或者pBGS8(Spratt et al.，Gene 41337-342(1986))。随后将含有被扩增的基因或等位基因的质粒载体通过接合或转化转移进希望的谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如在Schfer et al.(Applied andEnvironmental Microbiology 60，756-759(1994))中描述。转化方法例如由Thierbach et al.(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))，Dunican and Shivnan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))及Tauch et al.(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))描述。在通过“交换”同源重组后，所得菌株含有所述基因或等位基因的至少两个拷贝。为了使拷贝数增加至少1、2或3个，也可以使用如WO03/014330所述的串联扩增方法，或者使用如WO03/040373所述的通过在希望的位置整合的扩增方法。
使用现有技术描述的诱变方法在γ-谷氨酰激酶中产生本发明的氨基酸取代(例如SEQ ID NO2)及本发明的其它proB突变，其特征在于第149位的氨基酸取代。合适的诱变方法是技术人员据此目的可利用的任何方法。
使用诱变物质例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)或者紫外光的传统体内诱变方法可用于进行诱变。在适当情况中，被诱变的细胞随后被加至含有浓度为约0.5-1g/l、约1-2g/l或者约2-3g/l的3，4-脱氢-DL-脯氨酸的基本琼脂中。在克隆之后当合适时，分离各个突变体，确定proB基因或等位基因的核苷酸序列。
也可以使用体外诱变方法，例如用羟胺处理(Miller，J.H.A ShortCourse in Bacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，1992)或者用诱变寡核苷酸处理(T.A.BrownGentechnologie für Einsteiger[genetic engineering for beginners]，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1993；textbook byKnippers(，，Molekulare Genetik“[molecular genetics]，6thedition，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)；Winnacker(，，Gene undKlone“[genes and clones]，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)；Hagemann(，，Allgemeine Genetik“[general genetics]，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，Germany，1986))，或者如Newton andGraham的手册(PCR，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)所述的聚合酶链反应。体外诱变方法特别包括饱和诱变、随机诱变、体外重组方法及定向诱变(Eigen，M.and Gardiner，W.(1984)，Evolutionary molecular engineering based on RNA replication，Pure Appl.Chem.56，967-978；Chen，K.and Arnold，F.(1991)，Enzymeengineering for nonaqueous solventsrandom mutagenesis to enhanceactivity of subtilisin E in polar organic media.Bio/Technology 9，1073-1077；Horwitz，M.and Loeb，L.(1986)，Promoters Selected FromRandom DNA-Sequences，Proc Natl Acad Sci USA 83，7405-7409；Dube，D.and L.Loeb(1989)，Mutants Generated By The Insertion OfRandom Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-LactamaseGene，Biochemistry 28，5703-5707；Stemmer，P.C.(1994)，Rapidevolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature 370，389-391及Stemmer，P.C.(1994)，DNA shuffling by random fragmentation andreassemblyIn vitro recombination for molecular evolution.Proc NatlAcad Sci USA 91，10747-10751)。
体外方法的使用包括从分离自野生型菌株的总DNA开始，借助于聚合酶链反应如现有技术所述扩增proB基因，当合适时，将所述基因克隆进合适的质粒载体中，然后将所述DNA进行诱变。借助于聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导可见于GaitOligonucleotide SynthesisA Practical Approach(IRL Press，Oxford，UK，1984)及Newton and GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1994)所述。同样也可以使用例如熟知的Sambrook et al.(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA，1989)所述的体外诱变方法。相应方法也可以以“试剂盒”形式商购，例如Stratagene(La Jolla，USA)的QuikChange定向诱变试剂盒，如Papworth et al.(Strategies 9(3)，3-4(1996))所述。随后选择合适的proB突变体并通过上述方法研究。
为了生产L-脯氨酸，除了使用已经被过表达或扩增的或未被过表达或扩增的本发明的γ-谷氨酰激酶之外，还同时扩增特别是过表达除了所述激酶之外的脯氨酸生物合成的一或多种酶是有益的。优选使用内源基因。
“内源基因”或“内源核苷酸序列”是指存在于一个物种种群中的基因或核苷酸序列和等位基因。
文中术语“扩增”描述了微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度的增加，例如通过增加基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码高活性相应酶或蛋白质的基因或等位基因，及组合这些措施。
扩增、特别是过表达措施使得相应酶或蛋白质的活性或浓度基于野生型蛋白质或起始微生物中所述蛋白质的活性或浓度增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，直至最大1000％或2000％。
为了生产L-脯氨酸，除了使用本发明的proB基因的变体之外，也可以扩增、特别是过表达选自如下的一或多个基因●编码谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.4)的gdh基因，●编码γ-谷氨酰-磷酸还原酶(EC1.2.1.41)的proA基因，●编码吡咯啉-5-羧酸还原酶(EC1.5.1.2)的proC基因，●编码的鸟氨酸环化脱氨酶(EC4.3.1.12)的ocd基因。
为了生产L-脯氨酸，除了使用本发明的proB基因突变体之外同时弱化、特别是降低选自如下的一或多个内源基因的表达也是有益的●编码苏氨酸脱氨酶(EC4.2.1.16)的ilvA基因，●编码脯氨酸脱氢酶/吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(EC1.5.99.8)的putA基因，●编码2-酮戊二酸脱氢酶(EC1.2.4.2)的sucA基因，●编码二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶(EC2.3.1.61)的sucB基因，及●编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.11)的argD基因。
文中术语“弱化”描述了微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度的降低或消除，例如通过使用弱启动子或者使用编码低活性相应酶的基因或等位基因或者使相应基因或酶或蛋白质失活及在适当情况中组合这些措施而实现。
弱化可以通过降低或消除所述基因的表达或者所述酶蛋白质的催化或调节性质而实现。在适当情况中可以组合这两种措施。
基因表达可以通过合适的培养方法或通过对基因表达的信号结构进行遗传修饰(突变)而降低。基因表达的信号结构的例子是阻抑物基因、激活物基因、操纵基因、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子及终止子。关于这方面的信息可见于例如专利申请WO96/15246、Boyd and Murphy(Journal of Bacteriology 1705949-5952(1988))、Voskuil and Chambliss(Nucleic Acids Research 263584-3590(1998)、Pátek et al.(Microbiology 1421297-309(1996)及Journalof Biotechnology 104311-323(2003))及已知的遗传和分子生物学教科书所述，如Knippers(Molekulare Genetik，6thedition，Auflage，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)或者Winnacker(Gene undKlone，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)所著教科书中描述。
对基因表达进行特异性调节的例子是克隆被弱化的基因，使其在可通过添加定量的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)而诱导的启动子的控制下，例如trc启动子或tac启动子。本发明可用的载体例如是大肠杆菌表达载体pXK99E(WO0226787；根据布达佩斯条约于2001年7月31日保藏在Deutsche Sammlung fürMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ，Brunswick，Germany)的DH5alpha/pXK99E中，保藏号为DSM14440)或者pVWEx2(Wendisch，Ph.D.thesis，Berichte des Forschungszentrums Jülich，Jül-3397，ISSN 0994-2952，Jülich，Germany(1997))，其可以使克隆的基因以IPTG依赖性方式在谷氨酸棒杆菌中表达。
这种方法在例如专利WO02/26787中用于调节deaD基因的表达，通过将载体pXK99EdeaD整合在谷氨酸棒杆菌基因组中而进行，或者由Simic et al.(Applied and Environmental Microbiology 683321-3327(2002))用于调节glyA基因的表达，通过将载体pK18mobglyA′整合进谷氨酸棒杆菌中而进行。
特异性降低基因表达的另一种方法是反义技术，包括向靶细胞中导入短的寡核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸或合成较长的反义RNA的载体。在此所述反义RNA可以结合特异性mRNA的互补节段并降低其稳定性或阻断可翻译性。这种例子可见于Srivastava et al.(Applied Environmental Microbiology 2000 Oct；66(10)4366-4371)所描述。
导致酶蛋白质的催化性质改变或降低的突变为本领域技术人员所已知，可以提及的例子可见于Qiu and Goodman(Journal ofBiological Chemistry 2728611-8617(1997))、Sugimoto et al.(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 611760-1762(1997))和Mckel(Ph.D.thesis，Berichte des Forschungszentrums Jülich，Jül-2906，ISSN09442952，Jülich，Germany(1994))所进行的研究工作。这方面的综述可见于已知的遗传和分子生物学教科书描述，例如Hagemann(Allgemeine Genetik，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，Germany，1986)所述。
可提及的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸取代对酶活性的作用，可提及的是错义取代或无义突变。无义突变导致至少一个终止密码子位于基因的编码区中，结果翻译被过早地终止。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变，结果掺入不正确的氨基酸或者翻译被过早终止。一或多个密码子的缺失典型导致酶活性全部丧失。产生这种突变的指导可见于已知的遗传和分子生物学教科书所述，例如Knippers(“Molekulare Genetik”，6thedition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(“Geneund Klone”，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(“Allgemeine Genetik”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)所著教科书中描述。
使用实现弱化的措施的结果是相应蛋白质的活性或浓度通常降低至野生型蛋白质的活性或浓度或起始微生物中所述蛋白质的活性或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％、0-5％或者0-1％。
根据本发明制备的微生物(也是本发明的主题)可以分批或补料分批或者重复补料分批方法连续或非连续培养，以生产L-脯氨酸。已知的培养方法综述在Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführungin die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Technology 1.Introduction toBioprocess Technology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors andPeripheral Equipment](Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))所著教科书中描述。
使用的培养基必须符合特定菌株的需要。关于培养各种微生物的培养基的描述见American Society for Bacteriology(WashingtonD.C.，USA，1981)出版的Manual of Methods for General Bacteriology所描述。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，糖醇如核糖醇和甘露醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。另外培养基还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。上述加入的物质可以单批形式或在培养期间以适当方式补加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如氢氧化钠，氢氧化钾，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃-45℃、优选25℃-40℃。持续培养直至形成最大量的L-脯氨酸或者直至产量或生产力已经达到希望的最佳水平。此目的通常在10～160小时范围达到。
确定L-脯氨酸的方法是现有技术中已知的。所述分析方法可如Speckman et al.(Analytical Chemistry，30(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析，随后经茚三酮衍生化作用及在适当波长进行检测。
因此，本发明的另一实施方案包括通过如下步骤生产L-脯氨酸的方法a)发酵表达或过表达本发明的至少一个核苷酸序列的宿主生物体，b)分离或收集L-脯氨酸，当合适时伴有发酵肉汤和/或生物量成分。
优选应用生产L-脯氨酸的方法，所述方法包括如下步骤a)发酵表达或过表达本发明的至少一个核苷酸序列的棒状细菌，b)浓缩发酵肉汤或棒状细菌细胞中的L-脯氨酸，c)从发酵肉汤中分离或收集L-脯氨酸，适当时
d)具有发酵肉汤和/或生物量成分(具有从＞0至＜100％重量的生物量，优选从10-80％、更优选20-60％重量的生物量)。
技术人员可以收集和分离以这种方式产生的L-脯氨酸并在适当时进行纯化。
本发明的方法可用于经发酵生产L-脯氨酸。
本发明所用术语“类似位置”是指这样一个位置，其通过应用序列对比程序(BLAST，Altschul et al.J.Mol.Biol.1990，215，403-10)在起始序列预定位置对比起始序列与相应序列，提供在相应序列中与对比的所述位置相差不超过±5、更优选±4、更优选±3、更优选±2、最优选±1甚至为0的氨基酸位置。
关于杂交的指导可见于Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，Germany，1993)的The DIG System Users Guide forFilter Hybridization及Liebl et al.(International Journal of SystematicBacteriology 41255-260(1991))所著手册描述。所述杂交是在严格条件下进行，即仅形成其中探针例如与SEQ ID NO3互补的核苷酸序列与靶序列(即用所述探针处理的多核苷酸)至少70％相同的杂交体。杂交、包括洗涤步骤的严格性已知通过改变缓冲液成分、温度和盐浓度而受影响或决定。杂交反应通常在与洗涤步骤相比相对低的严格性下进行(Hybaid Hybridisation Guide，Hybaid Limited，Teddington，UK，1996)。
例如。可以使用相应于5×SSC缓冲液的缓冲液及在50℃-68℃的条件进行杂交反应。在这种情况中，探针也可以和与探针序列低于70％相同的多核苷酸杂交。这种杂交体稳定性差，通过在严格条件下洗涤除去。这可以例如通过将盐浓度降低至2×SSC及适当的随后至0.5×SSC(The DIG System User’s Guide for Filter Hybridisation，Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany，1995)，温度设定在大约50℃-68℃、52℃-68℃、54℃-68℃、56℃-68℃、58℃-68℃、60℃-68℃、62℃-68℃、64℃-68℃、66℃-68℃而实现。优选在大约62℃-68℃、特别优选在大约64℃-68℃或66℃-68℃温度进行洗涤步骤。在适当情况中，可以将盐浓度降低至相应于0.2×SSC或者0.1×SSC浓度。通过以大约1-2℃梯度将杂交温度从50℃逐步升高至68℃，可以分离与应用的探针序列至少70％、或至少80％、或者至少90％-95％、或者至少96％-98％或者至少99％相同的多核苷酸片段。关于杂交的进一步指导可以试剂盒形式商购(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalogue No.1603558)。
根据本发明，请求保护的多肽(氨基酸序列)及核酸序列也包含与任何这些序列分别具有70％以上、优选80％、更优选85％以上(关于核酸序列)或90％(也关于多肽)、优选91％、92％、93％或94％、更优选95％或96％及特别优选97％、98％或99％以上(关于这两种序列)的同源性(在氨基酸水平)及相同性(在核酸水平，天然简并除外)的那些序列，只要这个序列的作用或目的保留即可。如本文所用，术语“同源性”(或相同性)可以通过等式H(％)＝[1-V/X]×100表明，其中H是同源性，X是对比序列的核碱基/氨基酸总数，V是基于对比序列在研究序列中不同的核碱基/氨基酸数目。在任何情况中，术语编码多肽的核酸序列均包括根据遗传密码简并性似乎可能的任何序列。
与在本说明书中以SEQ ID编号示出的氨基酸序列的相同性百分比可易于由技术人员使用本领域已知的方法确定。根据本发明可以应用的一个合适程序是BLASTP(Altschul et al.，1997.Gapped BLASTand PSI-BLASTa new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402.)。本发明的核酸序列可以是DNA分子或者RNA分子。优选所述核酸序列是DNA分子或mRNA分子。根据本发明，所述DNA分子可进一步是基因组或分离的DNA分子。本发明进一步包含其中所述DNA分子是PNA分子或者DNA分子的另一种衍生物的实施方案。
本申请中以DSMZ编号提及的微生物可得自Deutsche Sammlungfür Mikroorganismen und Zellkulturen，Mascheroder Weg 4，Brunswick(Germany)。
序列表<110>德古萨有限责任公司<120>棒状细菌的proB基因的突变体<130>040071AM<160>6<170>PatentIn version3.3<210>1<211>1110<212>DNA<213>coryneform bacterium<220>
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权利要求
1.在第149位或类似氨基酸位置具有除了甘氨酸之外的蛋白质氨基酸的γ-谷氨酰激酶。
2.权利要求1的γ-谷氨酰激酶，特征在于在权利要求1所述的氨基酸位置或者类似位置存在选自如下一组的一个氨基酸Lys、Asn、Arg、Ser、Thr、Ile、Met、Glu、Asp、Ala、Val、Gln、His、Pro、Leu、Tyr、Trp、Cys或Phe。
3.编码权利要求1或2的γ-谷氨酰激酶的核酸序列。
4.权利要求3的核酸序列，特征在于其a)与SEQ.ID No1至少70％相同，或者b)编码权利要求1或2的γ-谷氨酰激酶，其长度为369±40个氨基酸，或者c)编码权利要求1或2的γ-谷氨酰激酶，其具有SEQ.ID No2的至少第145-154位或类似位置的氨基酸序列，或者d)编码权利要求1或2的γ-谷氨酰激酶，其具有SEQ.ID No2的至少第145-154位或类似位置的氨基酸序列，及在严格实验条件下与SEQ.ID NO1或SEQ.ID NO3互补的核苷酸序列杂交。
5.具有权利要求3或4的核苷酸序列的重组载体。
6.通过如下步骤生产L-脯氨酸的方法a)发酵表达或过表达权利要求3或4的核苷酸序列的宿主生物体，及b)分离或收集L-脯氨酸，其中当合适时具有发酵肉汤的成分和/或生物量。
全文摘要
本发明涉及编码γ－谷氨酰激酶的棒状细菌proB基因的突变变体，及涉及使用含有这种突变的细菌经发酵生产L－脯氨酸的方法。
文档编号C12R1/15GK101084312SQ200580044130
公开日2007年12月5日 申请日期2005年12月13日 优先权日2004年12月22日
发明者S·汉斯, B·巴特, G·蒂尔巴赫 申请人:德古萨有限责任公司