专利名称：一种甲基对硫磷降解菌及其在降解甲基对硫磷中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物降解领域，具体地说是涉及一种甲基对硫磷降解菌，及其在降解甲基对硫磷中的应用。
背景技术：
甲基对硫磷(Methyl Parathion，简称MP)是一种高毒的有机磷杀虫剂，其化学分子式为C8H10NO5PS，化学名称为O，O-二甲基O-(对-硝基苯基)硫逐磷酸酯。由于这种杀虫剂具有高效、经济等特点，其被广泛应用于农业生产与害虫防治中。但是同时，由于其残毒将造成环境与食品的严重污染，并产生大量的杀虫剂废物，严重影响了人们的身体健康及出口农产品的质量，带来了一系列负面效应。如何有效地处理残留的甲基对硫磷，避免对环境及人类的损害，成为人们亟待解决的问题。
使用传统的物理化学方法处理残留的甲基对硫磷，难度大、成本较高，处理效率低，而且容易造成二次污染。所以目前一般选用比较环保的微生物降解技术，通过微生物对农药矿化、水解和共代谢等代谢方式，来处理残留的甲基对硫磷。如在文献1甲基对硫磷降解菌DLL-1的分离、鉴定及降解性研究，应用与环境生物学报[J]，1999，5(增刊)147-150中所公开的，将农药作为其唯一碳源或氮、磷源，使用甲基对硫磷降解菌DLL-1将其水解或矿化。这种方法在对甲基对硫磷的降解时，产生的中间产物是对硝基苯酚，而对硝基苯酚是一具有中等毒性的物质，会给人类的健康带来潜在的威胁。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从长期受农药污染土壤中筛选分离出的、具有广谱性降解有机磷类化合物、可以以共代谢的方式高效转化甲基对硫磷的甲基对硫磷降解菌，及其在降解甲基对硫磷中的应用。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供一种甲基对硫磷降解菌DM-1，该甲基对硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.1620，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.。
本发明提供的甲基对硫磷降解菌，是从长期受农药污染的土壤中分离和筛选的，具体步骤如下将采集的农药污染土样用无机盐培养液配制成20wt％的悬浮液，然后以5wt％的接种量接到含50mg/L甲基对硫磷的无机盐培养液中，振荡培养；传代培养6代，逐渐提高无机盐培养液中甲基对硫磷的浓度至600ppm；从最后的培养液取出1mL菌液，稀释后，涂布于含有500ppm甲基对硫磷的无机盐固体培养基上，30℃恒温箱培养；选取生长快(平板上有透明圈)，菌落规则，传代稳定的菌落，纯化2～3次后得到纯菌株；将分离出的5株菌作为复筛菌株在LB培养基中扩大培养至相同OD值1.0，以10％的接种量接入含100ppm甲基对硫磷的无机盐培养基中，于30℃，180rpm摇床培养48h，用气相色谱测定降解率，最终筛选到降解率最高的一株菌，转入牛肉膏蛋白胨斜面保存。
所述的无机盐培养液是按下述比例配制的在1000ml水中，0.5g NaCl，0.2gMgSO4，0.5g(NH4)2SO4，1.5g K2HPO4，0.5g KH2PO4，0.05g CaCl2，0.02g FeSO4，0.002g酵母粉，pH值7.0，121℃高压灭菌20min；所述的无机盐固体培养基是将上述无机盐培养液加入占无机盐培养液总重量的1.5～2％(w/v)的琼脂。
所述的LB培养基和牛肉膏蛋白胨与文献2微生物学实验[M]，北京高等教育出版社，1988，75-78中相同。
所用的气相色谱的检测条件为HP5890II型气相色谱仪，电子捕获检测器；色谱柱弱极性毛细管柱HP-1[100％聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane 25m×0.32mm(I.D.)×0.25μm]；操作温度检测器温度300℃，进样口温度300℃，柱温210℃；柱压6.9psi；柱流量0.748ml/min；最小检出量0.05μg/ml；标样浓度0.5ppm；甲基对硫磷出峰时间约7.0min。
根据样品峰面积、标样峰面积及进样量计算出培养液中甲基对硫磷的含量。计算公式为X=AXA0×a×V0VX]]>式中AX--待测样峰面积；A0--标准样峰面积；
a--标准样浓度；V0--标准样进样量；VX--未知样进样量。
降解率计算公式为
采用微生物计算机分类鉴定系统(Biolog.Inc.，USA)对该菌株进行了鉴定。将纯化的菌株在Biolog培养基上培养16～24h；采用干管法以GN/GP-IF制备菌悬液，调整浊度至52％T；菌悬液以每孔150μl接种于GN-Microplate鉴定板，鉴定板于30℃培养16～24h；以Reader扫描鉴定板，测定每个孔的吸光值，测定的结果与数据库比对，由软件自动给出鉴定结果。经Biolog技术鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为甲基对硫磷降解菌DM-1。鉴定结果见表1。
表1、甲基对硫磷降解菌菌种鉴定结果
本发明提供的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株的形态特征和生长特点为革兰氏阳性细菌，细胞为杆状，长1.2～1.5μm，宽0.8μm，能形成芽孢，严格的好氧生长，属于芽孢杆菌属。在营养琼脂上菌落形态规则，表面粗糙，边缘为锯齿状。在液体培养基中振荡通气培养产生菌膜，不产生色素。菌株在7％NaCl培养基中生长，最适生长温度为30℃，最适pH为7。
本发明提供的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株的生理生化性质为过氧化氢酶和氧化酶反应呈阳性；甲基红和V.P.试验呈阳性；吲哚试验呈阴性；硝酸盐还原试验呈阴性；葡萄糖发酵产酸、产气；能水解明胶和酪素；能利用柠檬酸盐；不能水解淀粉和尿素。
本发明提供的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株的代谢特性为目前已报道的有机磷降解菌代谢甲基对硫磷是通过水解反应产生对硝基苯酚，而本发明的菌株DM-1是通过还原和水解反应将甲基对硫磷转化为对氨基苯酚。该菌株能耐受0～600ppm的甲基对硫磷，并能迅速将其完全转化。更为重要的是，菌株DM-1具有很宽的底物利用范围，能高效地转化其他有机磷农药，如对氧磷、对硫磷和杀螟硫磷等，因此，该菌株在有机磷农药污染的土壤和水体的原位生物修复中具有极大的应用潜力。
对本发明提供的甲基对硫磷降解菌DM-1的降解性能进行测定。
一、葡萄糖浓度对菌株生长及降解率的影响将所分离的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株在LB培养基(同前)中扩大培养OD值约1.5，离心后用无菌水洗涤，配制成菌悬浮液，以10％的接种量接入到含甲基对硫磷200ppm的无机盐培养液(同前)中，分别加入不同浓度的葡萄糖的无机盐液体培养液(葡萄糖的浓度分别为0g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，20g/L，pH值为7.0的)中，并以不接菌为对照，每个样品设两个平行。30℃，180r/min摇床振荡培养32h。取培养液10ml，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，无水硫酸钠干燥，稀释，进行气相色谱测定(检测条件如前所述)，紫外分光光度计测定OD600。
结果如图1所示，可知，无葡萄糖时(葡萄糖的浓度为0g/L)，甲基对硫磷几乎不被降解；在葡萄糖作为外加碳源的条件下，DM-1对MP有较好的降解能力，能高效降解甲基对硫磷。葡萄糖浓度偏低时，菌株的生长较差，对农药的降解效果也不佳；葡萄糖浓度为2～20g/L范围内DM-1菌株均有良好的降解效果。
由此推断，DM-1是通过共代谢作用来降解MP，其在降解过程中需要环境提供初级碳源。由上图可知，葡萄糖存在与否对MP的降解起着决定性作用，其浓度高低对降解率也有一定的影响。本发明表明有毒化合物的共代谢降解过程是一个特殊的耗能过程，外界环境中能量的输人是必要的。自然界中某些有毒难降解化合物不能被微生物直接降解，但添加少量易被微生物利用的底物如葡萄糖等，可以促进或启动难降解化合物的降解，并将其导人循环。
二、初始pH值对菌株的生长及降解影响将所分离的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株在LB培养基(同前)中扩大培养至OD值约1.5，离心后用无菌水洗涤，配制成菌悬浮液，以10％的接种量接入含200ppm甲基对硫磷的无机盐培养液(同前)中，将培养液的初始pH值分别调为6.0，6.5，7.0，8.0，9.0，并以不接菌为对照，每个样品设两个平行。30℃，180r/min摇床培养32h。取培养液10ml，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，无水硫酸钠干燥，稀释，进行气相色谱测定(检测条件如前所述)，紫外分光光度计测定OD600。
结果如图2所示，可知，在pH值6.0～9.0的范围内，DM-1菌株生长和降解效果均较好，其中为pH值为7.0时的降解率最高，生长量最大。
三、底物浓度对菌株生长及降解率的影响将所分离的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株在LB培养基(同前)中扩大培养至OD值约1.5，离心后用无菌水洗涤，配制成菌悬浮液，以10％的接种量接入含50ppm，100ppm，200ppm，300ppm，400ppm，500ppm甲基对硫磷、pH值为7.0、葡萄糖浓度为5g/L的无机盐培养液(同前)中，并以不接菌为对照，每个样品设两个平行。30℃，180r/min摇床培养32h。取培养液10ml，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，无水硫酸钠干燥，稀释，进行气相色谱测定(检测条件如前所述)，紫外分光光度计测定OD600。
结果如图3所示，可知，底物(甲基对硫磷)浓度为50～500ppm时菌株生长和降解效果均较好，底物浓度高于300ppm后降解率有所下降，表明菌株对甲基对硫磷的降解受甲基对硫磷的浓度影响，甲基对硫磷的浓度超过一定浓度对菌株的代谢有抑制作用。
四、DM-1菌株对MP的降解动态研究将所分离的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株在LB培养基(同前)中扩大培养至OD值约1.5，离心后用无菌水洗涤，配制成菌悬浮液，以10％的接种量接入含200ppm甲基对硫磷、pH值为7.0、葡萄糖浓度为5g/L的无机盐培养液(同前)中，并以不接菌为对照，每个样品设两个平行。30℃，180r/min摇床培养。分别在3h，6h，12h，20h，28h，38h取培养液10ml，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，无水硫酸钠干燥，稀释，进行气相色谱测定(检测条件如前所述)，紫外分光光度计测定OD600。
结果如图4所示，可知，菌株经过12h的培养后，生长速度开始加快，28h后进入生长平台期，此后有缓慢下降。甲基对硫磷的浓度随着菌株的生长而降低，0～28h内降解较快，28h后由于农药含量很少，降解速率有所下降。可见菌株的共代谢能力跟菌株的生长量密切相关，随着OD600值的增加，甲基对硫磷的浓度逐渐降低，在28h后几乎被转化完全。
采用气谱-质谱联用(GC-MS)对本发明菌株DM-1降解甲基对硫磷的产物进行研究，GC-MS检测条件为采用Agilent6890N-5973N-MSDGC-MS分析仪，色谱柱DB-5MS[60m×0.25mm(I.D.)×0.25μm]毛细管柱。操作条件——色谱柱温度程序升温，60℃开始，保持1min，以20℃/min上升到120℃，保持2min，以10℃/min上升到280℃，保持2min；进样口温度250℃；载气(He)流量1.0mL/min；进样量1μL；电离方式EI；电离能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；扫描质量范围30～280amu；扫描速度1.0s/scan。
对本发明的降解产物进行质谱分析，其质谱图如图5和图6所示，分析可知该代谢物分别是O，O-二甲基O-(对氨基苯基)硫逐磷酸酯(氨基甲基对硫磷，C8H12NO3PS)，分子量为233，特征峰为233，124，108；和对氨基苯酚，分子量为109，特征峰为109，80，53。
以现有技术的方法对甲基对硫磷进行降解时，一般得到代谢产物为对硝基苯酚，其在中性或碱性水溶液中显黄色。而在本发明中，在降解过程中从未看见到黄色的现象，将培养后的无机盐溶液调pH值7.5，紫外扫描OD410(对硝基苯酚特征峰)，也没有吸收峰出现。可见，本发明的DM-1菌对甲基对硫磷的共代谢途径是一条完全不同于常规降解代谢的途径。
使用本发明的甲基对硫磷降解菌对甲基对硫磷进行降解时，使用含有5g/L葡萄糖pH值为7的无机盐培养液按10％接种量接种本发明的甲基对硫磷降解菌，在30℃对50～500ppm的甲基对硫磷有良好的降解效果。
图1是葡萄糖浓度对甲基对硫磷的降解率和菌株生长的影响曲线；图2是初始pH值对甲基对硫磷的降解率和菌株生长的影响曲线；图3是底物浓度对甲基对硫磷的降解率和菌株生长的影响曲线；图4是MP的降解曲线及DM-1的生长曲线；图5是DM-1降解甲基对硫磷的降解产物I氨基甲基对硫磷的质谱图；图6是DM-1降解甲基对硫磷的降解产物II氨基甲基对硫磷的质谱图。
具体实施例方式
实施例1、分离和筛选本发明的甲基对硫磷降解菌从天津农药厂周围采集的长期受农药污染的土壤中取样，将采集的农药污染土样用无机盐培养液配制成20wt％的悬浮液，然后以5wt％的接种量接到含50mg/L甲基对硫磷的无机盐培养液中，振荡培养；传代培养6代，逐渐提高无机盐培养液中甲基对硫磷的浓度至600ppm；从最后的培养液取出1mL菌液，稀释后，涂布于含有500ppm甲基对硫磷的无机盐固体培养基上，30℃恒温箱培养；选取生长快(平板上有透明圈)，菌落规则，传代稳定的菌落，纯化2～3次后得到纯菌株；将分离出的5株菌作为复筛菌株在LB培养基中扩大培养至相同OD值1.0，以10％的接种量接入含100ppm甲基对硫磷的无机盐培养基中，于30℃，180rpm摇床培养48h，用气相色谱测定降解率，最终筛选到降解率最高的一株菌，转入牛肉膏蛋白胨斜面保存。该甲基对硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCCNo.1620，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.。
所述的无机盐培养液是按下述比例配制的在1000ml水中，0.5g NaCl，0.2gMgSO4，0.5g(NH4)2SO4，1.5g K2HPO4，0.5g KH2PO4，0.05g CaCl2，0.02g FeSO4，0.002g酵母粉，pH值7.0，121℃高压灭菌20min；所述的无机盐固体培养基是将上述无机盐培养液加入占无机盐培养液总重量的1.5～2％(w/v)的琼脂。
所述的LB培养基和牛肉膏蛋白胨与文献2微生物学实验[M]，北京高等教育出版社，1988，75-78中相同。
所用的气相色谱的检测条件为HP5890II型气相色谱仪，电子捕获检测器；色谱柱弱极性毛细管柱HP-1[100％聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane 25m×0.32mm(I.D.)×0.25μm]；操作温度检测器温度300℃，进样口温度300℃，柱温210℃；柱压6.9psi；柱流量0.748ml/min；最小检出量0.05μg/ml；标样浓度0.5ppm甲基对硫磷出峰时间约7.0min。
根据样品峰面积、标样峰面积及进样量计算出培养液中甲基对硫磷的含量。计算公式为X=AXA0×a×V0VX]]>式中AX--待测样峰面积；A0--标准样峰面积；
a--标准样浓度；V0--标准样进样量；VX--未知样进样量。
降解率计算公式为
实施例2、鉴定实施例1的甲基对硫磷降解菌采用微生物计算机分类鉴定系统(Biolog.Inc.，USA)对实施例1得到的菌株进行了鉴定。将纯化的菌株在Biolog培养基上培养16～24h；采用干管法以GN/GP-IF制备菌悬液，调整浊度至52％T；菌悬液以每孔150μl接种于GN-Microplate鉴定板，鉴定板于30℃培养16～24h；以Reader扫描鉴定板，测定每个孔的吸光值，测定的结果与数据库比对，由软件自动给出鉴定结果。经Biolog技术鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为甲基对硫磷降解菌DM-1。鉴定结果见表1。
表1、甲基对硫磷降解菌菌种鉴定结果
实施例3、葡萄糖浓度对本发明的甲基对硫磷降解菌DM-1的生长及降解率的影响将实施例1中所分离的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株在LB培养基(同前)中扩大培养OD值约1.5，离心后用无菌水洗涤，配制成菌悬浮液，以10％的接种量接入到含甲基对硫磷200ppm的无机盐培养液(同前)中，分别加入不同浓度的葡萄糖的无机盐液体培养液(葡萄糖的浓度分别为0g/L，1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，20g/L，pH值为7.0的)中，并以不接菌为对照，每个样品设两个平行。30℃，180r/min摇床振荡培养32h。取培养液10ml，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，无水硫酸钠干燥，稀释，进行气相色谱测定(检测条件如前所述)，紫外分光光度计测定OD600。
结果如图1所示，可知，无葡萄糖时(葡萄糖的浓度为0g/L)，甲基对硫磷几乎不被降解；在葡萄糖作为外加碳源的条件下，DM-1对MP有较好的降解能力，能高效降解甲基对硫磷。葡萄糖浓度偏低时，菌株的生长较差，对农药的降解效果也不佳；葡萄糖浓度为2～20g/L范围内DM-1菌株均有良好的降解效果。
由此推断，DM-1是通过共代谢作用来降解MP，其在降解过程中需要环境提供初级碳源。由上图可知，葡萄糖存在与否对MP的降解起着决定性作用，其浓度高低对降解率也有一定的影响。本发明表明有毒化合物的共代谢降解过程是一个特殊的耗能过程，外界环境中能量的输人是必要的。自然界中某些有毒难降解化合物不能被微生物直接降解，但添加少量易被微生物利用的底物如葡萄糖等，可以促进或启动难降解化合物的降解，并将其导人循环。
实施例4、初始pH值对本发明的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株的生长及降解影响将实施例1所分离的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株在LB培养基(同前)中扩大培养至OD值约1.5，离心后用无菌水洗涤，配制成菌悬浮液，以10％的接种量接入含200ppm甲基对硫磷的无机盐培养液(同前)中，将培养液的初始pH值分别调为6.0，6.5，7.0，8.0，9.0，并以不接菌为对照，每个样品设两个平行。30℃，180r/min摇床培养32h。取培养液10ml，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，无水硫酸钠干燥，稀释，进行气相色谱测定(检测条件如前所述)，紫外分光光度计测定OD600。
结果如图2所示，可知，在pH值6.0～9.0的范围内，DM-1菌株生长和降解效果均较好，其中为pH值为7.0时的降解率最高，生长量最大。
实施例5、底物浓度对本发明的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株生长及降解率的影响将实施例1所分离的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株在LB培养基(同前)中扩大培养至OD值约1.5，离心后用无菌水洗涤，配制成菌悬浮液，以10％的接种量接入含50ppm，100ppm，200ppm，300ppm，400ppm，500ppm甲基对硫磷、pH值为7.0、葡萄糖浓度为5g/L的无机盐培养液(同前)中，并以不接菌为对照，每个样品设两个平行。30℃，180r/min摇床培养32h。取培养液10ml，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，无水硫酸钠干燥，稀释，进行气相色谱测定(检测条件如前所述)，紫外分光光度计测定OD600。
结果如图3所示，可知，底物(甲基对硫磷)浓度为50～500ppm时菌株生长和降解效果均较好，底物浓度高于300ppm后降解率有所下降，表明菌株对甲基对硫磷的降解受甲基对硫磷的浓度影响，甲基对硫磷的浓度超过一定浓度对菌株的代谢有抑制作用。
实施例6、本发明的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株对MP的降解动态研究将实施例1所分离的甲基对硫磷降解菌DM-1菌株在LB培养基(同前)中扩大培养至OD值约1.5，离心后用无菌水洗涤，配制成菌悬浮液，以10％的接种量接入含200ppm甲基对硫磷、pH值为7.0、葡萄糖浓度为5g/L的无机盐培养液(同前)中，并以不接菌为对照，每个样品设两个平行。30℃，180r/min摇床培养。分别在3h，6h，12h，20h，28h，38h取培养液10ml，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并三次提取液，无水硫酸钠干燥，稀释，进行气相色谱测定(检测条件如前所述)，紫外分光光度计测定OD600。
结果如图4所示，可知，菌株经过12h的培养后，生长速度开始加快，28h后进入生长平台期，此后有缓慢下降。甲基对硫磷的浓度随着菌株的生长而降低，0～28h内降解较快，28h后由于农药含量很少，降解速率有所下降。可见菌株的共代谢能力跟菌株的生长量密切相关，随着OD600值的增加，甲基对硫磷的浓度逐渐降低，在28h后几乎被转化完全。
实施例7、采用气谱-质谱联用(GC-MS)对本发明菌株DM-1降解甲基对硫磷的产物进行研究GC-MS检测条件为采用Agilent6890N-5973N-MSDGC-MS分析仪，色谱柱DB-5MS[60m×0.25mm(I.D.)×0.25μm]毛细管柱。操作条件——色谱柱温度程序升温，60℃开始，保持1min，以20℃/min上升到120℃，保持2min，以10℃/min上升到280℃，保持2min；进样口温度250℃；载气(He)流量1.0mL/min；进样量1μL；电离方式EI；电离能量70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；扫描质量范围30～280amu；扫描速度1.0s/scan。
对本发明的降解产物进行质谱分析，其质谱图如图5和图6所示，分析可知该代谢物分别是O，O-二甲基O-(对氨基苯基)硫逐磷酸酯(氨基甲基对硫磷，C8H12NO3PS)，分子量为233，特征峰为233，124，108；和对氨基苯酚，分子量为109，特征峰为109，80，53。
权利要求
1.一种甲基对硫磷降解菌DM-1，该甲基对硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCCNo.1620，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.。
2.如权利要求1所述的甲基对硫磷降解菌，是从长期受农药污染的土壤中分离和筛选的，具体步骤如下将采集的农药污染土样用无机盐培养液配制成20wt％的悬浮液，然后以5wt％的接种量接到含50mg/L甲基对硫磷的无机盐培养液中，振荡培养；传代培养6代，逐渐提高无机盐培养液中甲基对硫磷的浓度至600ppm；从最后的培养液取出1mL菌液，稀释后，涂布于含有500ppm甲基对硫磷的无机盐固体培养基上，30℃恒温箱培养；选取生长快，菌落规则，传代稳定的菌落，纯化2～3次后得到纯菌株；将分离出的5株菌作为复筛菌株在LB培养基中扩大培养至相同OD值1.0，以10％的接种量接入含100ppm甲基对硫磷的无机盐培养基中，于30℃，180rpm摇床培养48h，用气相色谱测定降解率，最终筛选到降解率最高的一株菌，转入牛肉膏蛋白胨斜面保存。
3.如权利要求2所述的甲基对硫磷降解菌，其特征在于所述的无机盐培养液是按下述比例配制的在1000ml水中，0.5g NaCl，0.2g MgSO4，0.5g(NH4)2SO4，1.5gK2HPO4，0.5g KH2PO4，0.05g CaCl2，0.02g FeSO4，0.002g酵母粉，pH值7.0，121℃高压灭菌20min。
4.如权利要求2所述的甲基对硫磷降解菌，其特征在于所述的无机盐固体培养基是将上述无机盐培养液加入占无机盐培养液总重量的1.5～2％(w/v)的琼脂。
5.一种权利要求1所述的甲基对硫磷降解菌在降解甲基对硫磷中的应用。
6.如权利要求5所述的甲基对硫磷降解菌在降解甲基对硫磷中的应用，其特征在于使用含有5g/L葡萄糖pH值为7的无机盐培养液按10％接种量接种本发明的甲基对硫磷降解菌，在30℃对50～500ppm的甲基对硫磷进行降解。
全文摘要
本发明提供一种甲基对硫磷降解菌DM－1，该甲基对硫磷降解菌已于2006年2月17日在保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1620，其分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.。本发明提供的甲基对硫磷降解菌，是从长期受农药污染的土壤中分离和筛选的。使用本发明的甲基对硫磷降解菌对甲基对硫磷进行降解时，使用含有5g/l葡萄糖pH值为7的无机盐培养液按10％接种量接种本发明的甲基对硫磷降解菌，在30℃对50～500ppm的甲基对硫磷有良好的降解效果。
文档编号C12N1/20GK101024819SQ20061000827
公开日2007年8月29日 申请日期2006年2月20日 优先权日2006年2月20日
发明者乔传令, 杨超, 董明, 黄瑶 申请人:中国科学院动物研究所