专利名称：一种重组流感病毒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗生产领域中一种重组流感病毒及其制备方法与应用，特别是涉及一种多质粒系统拯救的重组流感病毒及其制备方法与以该重组流感病毒为流感减毒活疫苗的活性成分。
背景技术：
流感是一种由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，可引起严重的并发症。流感病毒的抗原不断发生变化，具有较强的传染性，经常造成大范围流行。在正常的流行季节，全球约10％的人口即6亿多人患流感，目前还未找到十分理想的防治药物，接种流感疫苗仍是当今预防流感的有效手段。给健康人群接种流感疫苗，70-80％的人会起到预防发病的效果(当传播的病毒毒株与疫苗采用毒株相同时)，更重要的是，给高危人群接种疫苗可以明显降低流感的发生，减少住院及死亡率，所以研制高效、安全的新一代流感疫苗对预防流感发生具有重要意义。目前主要使用流感灭活三价全病毒疫苗、流感三价裂解病毒疫苗和亚单位疫苗，及流感三价减毒活疫苗投放市场。但流感三价灭活全病毒疫苗、裂解流感疫苗和亚单位疫苗注射免疫不能诱发有效的细胞免疫，经鼻或口服免疫必须高浓度剂量免疫才能激发机体产生免疫应答，其效果远不及减毒疫苗的免疫保护效果。应用于临床的流感病毒冷适应性减毒活疫苗采用鼻通道免疫途径，其抗原的制备通过重配技术，将每年相应的甲乙型流感病毒流行株的HA、NA基因整合到减毒的冷适应性的宿主病毒中，这种制备方法费时、费力。另外，减毒活疫苗存在毒力恢复的问题。发展起来的多质粒拯救系统针对流感病毒这一特点，利用反义遗传学的方法，可针对当年流行的病毒株快速制备有效的流感病毒减毒疫苗，制备快速、省力、相对安全，为新一代流感减毒活疫苗的研制提供新的思路和方法。
流感病毒属于正粘病毒科，其基因组为单股负义RNA，分为八个片段，胞质连接蛋白与脂膜相连。A型流感病毒的基因组最少包括七个多肽，片段1-3编码了RNA依赖的RNA多聚酶。片段1编码多聚酶复合体蛋白PB2。片段2、3编码多聚酶剩余部分蛋白PB1和PA。另外，有些流感病毒的流行株还编码一种小的蛋白，PB1-F2由PB1读码框中的一段编码。片段4编码血凝素HA，它是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白。片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分。片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜蛋白。片段7编码两种胞质结合蛋白M1和M2，由两段不同拼接的mRNA翻译而来。片段8编码两种非结构蛋白NS1、NS2，也是由不同变异的mRNA拼接体翻译过来的。B型流感病毒的8个基因片段编码了11种蛋白，最大的基因片段编码了RNA多聚酶的成分，PB1、PB2、PA。片段4编码蛋白HA。片段5编码NP。片段6编码NA、NB蛋白，这两种蛋白是由biscistronicmRNA重叠的读码框编译。片段7也编码两种蛋白，分别是M1、BM2。B型流感病毒最小的片段编码两种蛋白，NS1是由全长的RNA翻译而来，NS2是由变异拼接后的mRNA翻译而来。
正因为流感病毒的基因组是负义RNA，因而不具有感染性，各个RNA片段必须与聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA，统称为P蛋白)及核蛋白(NP)结合在一起形成核糖核蛋白复合物即RNPs才有活性。流感病毒感染时，首先与宿主细胞表面的特异性HA受体结合，通过融膜进入细胞后释放出RNPs，RNPs进入细胞核才开始病毒基因组的复制和转录，每个RNA片段单独组成一个转录单位，转录出mRNA和互补RNA(cRNA)，mRNA翻译合成病毒蛋白，cRNA复制生成病毒负链子代RNA，进而在细胞浆中组装成完整的病毒粒子。
由于流感病毒的两个表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)经常发生抗原漂移和转换，流感病毒变异现象时有发生，这也是现有疫苗无法应对所有流感爆发的主要原因。WHO在全世界建立了完整的监测网络，分离、鉴定世界各地的流感毒株，并每年2-3月份组织专家召开会议，推荐流感流行季节疫苗中应包括的毒株，以便生产厂家在疫苗制备过程中采用与流行株一致的毒株，使疫苗达到最佳保护效力。然而即使这样，生产流感病毒疫苗仍存在许多亟待解决的问题1、生产周期较长，生产的流感疫苗往往错过流感流行季节。等再一次流感流行时，或许生产的疫苗已经失效。目前，美国所有商品化的流感疫苗都是由鸡胚来培养的。虽然流感病毒在鸡胚中生长良好，但疫苗的产量仍有赖于鸡胚的可获得性及其质量。鸡胚的提供必须有组织性，疫苗的生产周期较长，因为鸡胚供应不及时而限制了该种疫苗的生产。
2、近几年来，用细胞培养的方法生产疫苗也得到了发展。选择好的宿主细胞可以永久传代，这就克服了由鸡胚培养所带来的不便。然而，并不是所有的流感病毒株在组织细胞中都能很好生长。例如，象一些适合制备疫苗的病毒株，如温度敏感株等，用现有的方法并不能在组织细胞中培养。
3、全病毒灭活疫苗、裂解流感疫苗和亚单位疫苗免疫保护效果远不及减毒疫苗，而利用传统方法制备的流感减毒疫苗又存在着毒力恢复等缺陷。
基于以上情况，为了克服现有流感病毒疫苗生产中的不足，基于反向遗传操作技术，利用多质粒拯救系统能够显著增加流感疫苗生产的灵活性，同时能将组织细胞培养的方法更好地应用于该种疫苗的生产，使得制备的疫苗具有很好的时效性。同时利用反义遗传学和基因定点突变的方法，既保存了流感病毒减毒疫苗的免疫原性，又提高了其安全性。
反向遗传操作技术(reverse genetics)是近几年快速发展的一项新的生物技术，应用于病毒研究又叫“病毒拯救(rescue of virus)”，病毒拯救技术是在了解病毒复制特点等基础上利用分子生物学技术而建立和完善起来的，是指通过人工操作基因，用病毒核酸的适当形式，在一定条件下转染细胞产生有感染性的病毒子。由于RNA不稳定，病毒拯救技术尤其是完全以质粒为基础的操作技术实现了在cDNA水平上对RNA病毒的操作和方便地人工制造病毒，这是20世纪90年代RNA病毒研究中的重大突破，成为至今生命科学研究热点。现在，病毒拯救指的就是使用以质粒为基础的系统，即从克隆的cDNA产生病毒的过程，在对病毒的生活周期、基因结构与功能、致病基础、新型疫苗构建、表达外源蛋白等方面的研究中显示了良好的应用前景。
流感病毒的反向遗传操作技术的建立难度较大，因为要同时在细胞内形成8个功能性核糖核蛋白复合物(RNPs)，而且与大多数其它负义RNA病毒不同，流感病毒基因组在细胞核内复制，因此流感病毒拯救技术的发展落后于其它负义RNA病毒，但经过10年的发展，终于在1999年Neumann等和Fodor等分别报道了完全以多质粒为基础的技术，这是流感病毒拯救技术发展史上的转折点。其优点是不再象早期的方法那样，需要为RNA合成提供功能蛋白的辅助病毒一起感染细胞，从而避免了大量的筛选工作。为了减少共转染的质粒数，Hoffmann等首次建立了8质粒拯救系统，其启动子和终止序列为RNA聚合酶I/II即pol I-pol II系统，利用同一个载体实现了在细胞内的病毒RNA(vRNA)转录和病毒蛋白合成，进而包装成病毒。Hoffmann后来又对克隆载体作过一些修改。8质粒病毒拯救系统已应用于A型和B型流感病毒的拯救，多数都是对从人分离的病毒进行研究。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组流感病毒及其制备方法。
本发明提供的制备重组流感病毒的方法，由以下步骤组成1)将来自于A型或B型流感病毒冷适应株的PB2编码基因、PB1编码基因、PA编码基因、M编码基因、NS编码基因和NP编码基因，以及来自于当年流行的A或B型流感病毒毒株的HA编码基因和NA编码基因分别插入真核细胞表达质粒中得到8个重组表达质粒；所述8个重组表达质粒为含有PB2编码基因的重组表达质粒、含有PB1编码基因的重组表达质粒、含有PA编码基因的重组表达质粒、含有M编码基因的重组表达质粒、含有NS编码基因的重组表达质粒、含有NP编码基因的重组表达质粒、含有HA编码基因的重组表达质粒和含有NA编码基因的重组表达质粒；2)将所述8个重组表达质粒导入哺乳细胞中，培养所述哺乳细胞，得到重组A型流感减毒病毒或重组B型流感减毒病毒。
在实际应用中，所述当年流行的流感病毒毒株采用WHO确定流行的流感病毒毒株。所述A型流感病毒的冷适应株可为A/AnnArbor/6/60变异体。
所述B型流感病毒的冷适应株可为B/AnnArbor/1/66变异体变异体。
所述真核细胞表达质粒优选为如图1所示的pAD3000，pAD3000以pHW2000为基础构建，其特点具有双向表达系统，可以使流感病毒的转录和表达运用同一质粒系统，且不需要辅助病毒的存在。
所述8个重组表达质粒选自下述三个共转染质粒组中的任意一组1)A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA；2)A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB 1、pADA3NA和pADA3HA。
3)B型流感病毒共转染质粒组pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA。
所述方法中，可用于培养病毒的哺乳细胞均可，如293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、Vero细胞、WI-38(人胚肺细胞株)、HL-8(恒河猴胚细胞株)、Hela细胞(人子宫颈癌细胞系)或Chang C/I/L/K(人结肠C、肠I、肝L与肾K细胞系)等。
由上述方法制备的重组流感病毒也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种流感病毒疫苗。
本发明所提供的流感病毒疫苗，它的活性成分(抗原)为上述方法制备的重组A型流感减毒病毒和/或重组B型流感减毒病毒。
所述重组A型流感减毒病毒为A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组导入哺乳细胞中得到的重组流感病毒，和/或A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组导入哺乳细胞中得到的重组流感病毒；所述A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组由pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA组成，所述A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组由pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA组成；所述重组B型流感减毒病毒为B型流感病毒共转染质粒组导入哺乳细胞中，得到的重组流感病毒；所述B型流感病毒共转染质粒组由pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA组成。
所述流感病毒疫苗可制成滴鼻剂或注射剂或透皮剂；所述重组A型流感减毒病毒和/或重组B型流感减毒病毒不加佐剂可直接制备成注射剂型；所述重组A型流感减毒病毒和/或重组B型流感减毒病毒加入保护剂(0.1-0.5％海藻糖或壳聚糖，0.1-0.3％明胶，0.2-0.8％蔗糖，0.1-0.3％乳胶蛋白和0.1-0.8％白蛋白)，可制成滴鼻剂；所述重组A型流感减毒病毒和/或重组B型流感减毒病毒加入10-20％CTB可制成透皮剂；所述百分含量为质量百分含量。
可在MDCK细胞、Vero细胞、293T细胞、COS7细胞、WI-38、HL-8、Hela细胞或ChangC/I/L/K细胞等动物哺乳细胞中培养上述重组流感病毒。
本发明利用6+2质粒拯救系统来重组流感病毒，该重组病毒可用细胞培养的方法来大量扩增，该重组病毒不需任何处理可直接用于疫苗的制造。8质粒系统中6个质粒携带的病毒基因片段来源于流感冷适应减毒株，但另两个质粒所携带的表面抗原HA、NA，则来源于当年流行的流感病毒株(如当年WHO确定流行的流感病毒株)。例如，HA、NA基因片段可来源于H1、H3或者是B型流感毒株，三者循序用于流感减毒三价疫苗的生产。同时HA、NA也可来源于当时发病的其它亚型毒株，例如H2(H2N2)、H5(H5N1)、H7(H7N7)、H9(H9N3)等。运用该种方法可以迅速针对季节性流感病毒的流行情况，重组出可用于疫苗制备的病毒参考株。本发明制备的流感减毒疫苗经鼻免疫后取得了很好的免疫效果，同时用该种方法拯救的流感病毒具有时效性，能根据每年流感病毒的流行特点，针对性的制备有效的流感疫苗，制备快速，免疫原性、免疫保护效果显著，并且很好的具有安全性。
本发明所提供的6+2质粒系统拯救的流感病毒制备的流感减毒三价疫苗，人为的解决传统方法制备流感减毒疫苗的安全性、稳定性的问题，并且使流感疫苗保护谱更全面，同时重组的流感病毒可以在细胞中大量的扩增。
本发明所采用的反向遗传操作技术，应用于流感病毒的拯救先进而成熟，具有方便简捷、定位可控等优点。目前，人用流感灭活疫苗毒株要通过传统的重排技术，而且，由于抗原的变异，每年都要对人用疫苗进行评价，然后用经评价确定使用的流行毒株与高度鸡胚适应株A/PR/8/34(PR8)同时感染鸡胚，经过传代反复筛选，最终得到含有流行毒株HA和NA基因的重组病毒作为新疫苗株。这个过程费时又费力，但反向遗传操作技术可以大大加速进程，只需将用流行株的HA和NA基因与冷适应株病毒的内部基因构建的质粒组合共转染细胞，拯救的流感病毒就是所需要的疫苗株，Hoffmann等实验证明这是一个容易而又直接的过程。
由于流感灭活疫苗注射免疫不能激活有效的粘膜免疫和细胞免疫，以减毒弱毒活疫苗是一个重要的研究方向，但流感病毒抗原易变的特点，难以预测其毒力变化的特性制约着这个方向的研究，且安全性上难以保证。冷适应致弱活疫苗在临床有过尝试，它对小孩的保护力超过常规的灭活苗，其特性又不在体内大量扩增，对成人的保护效果也明显优于灭活疫苗。又由于自然减毒的流感病毒它只包含有限的少量氨基酸的替代变化，大量使用时可能会有毒力返强的潜在危险。本发明的重组病毒减毒疫苗保持了冷适应株病毒的特点，同时又具备多种流感病毒HA/NA表面抗原的活性、及快速制备的优势。本发明制备的流感减毒疫苗更具备广泛的适用性，并可激活有效的粘膜免疫和系统免疫，有效性、安全性更加确切。本发明用细胞培养系统替代鸡胚生产疫苗病毒抗原，可以解决由鸡胚培养带来的异源蛋白和标准化的等问题。
图1为疫苗载体pAD3000的结构示意2为双表达盒的结构示意3为反向遗传操作系统建立的技术路线图4为重组A型H1N1亚型流感病毒感染MDCK细胞后72小时后的显微镜照片图5为8质粒拯救系统模式6为重组A型H1N1、H3N2亚型流感病毒和重组B型流感病毒电镜照片
具体实施例方式
本发明有五个要点，每个要点包括以下步骤第一，疫苗载体pAD3000的构建及鉴定运用分子生物学的基本方法，在载体pHW2000的基础上构建pAD3000。即将pHW2000中的多聚A信号序列BGH(bovine growth hormone)改建成SV40(simian virus 40)，送公司测序及酶切鉴定其大小。
第二，构建流感病毒的8质粒拯救系统(1)分别选用A、B型流感病毒冷适应株A/AnnArbor/6/60变异体、B/AnnArbor/1/66变异体(中国华兰生物工程股份有限公司)为供体流感病毒提供PB1、PB2、NS、M、NP、PA的6个基因片段；当年流行的甲乙流感病毒疫苗毒株提供的HA、NA基因片段。如本发明以当年流行的A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/A/jiangxi/424/2004(H3N2)、B/Shanghai/361/2002(中国华兰生物工程股份有限公司)为供体病毒提供重组病毒的HA、NA基因片段。
(2)提取病毒的总RNA。从供体A、B型流感病毒冷适应株A/AnnArbor/6/60变异体、B/AnnArbor/1/66变异体病毒用PCR的方法扩增PB1、PB2、NS、M、NP、PA的基因片段，测序后分别连接于构建好的载体pAD3000上，构建6质粒系统。
(3)培养当年流行的流感病毒株，从WHO确定的当年疫苗流行株，比如供体A/NewCaledonia/20/99(H1N1)、A/A/jiangxi/424/2004(H3N2)、B/Shanghai/361/2002供体病毒用PCR的方法扩增流HA、NA基因片段，构建2质粒系统。
第三，利用反向遗传技术拯救流感病毒疫苗参考株(1)选取任一的共培养细胞系DMCK、293T、COS7、Vero细胞，通过脂质体或电穿孔转染受体细胞系。
(2)将含有流感病毒PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、NA基因片段的6+2质粒系统共转染上述细胞系。
(3)33℃培养后收集复活的重组H1、H3、乙型流感病毒，随后进入SPF鸡胚或Vero、MDCK等细胞系适应扩大增殖，建立重组流感病毒减毒疫苗参考株原代种子库、主种子库、工作种子库，放-80℃保存，并进行全面的检定。
(4)重组流感减毒疫苗参考株种子库毒株采用红细胞凝集试验测定病毒的滴度、细胞病变法测定病毒的TCID50、鸡胚感染力测定EID50、免疫扩散法测定HA滴度；(5)重组流感减毒疫苗参考株种子库毒株采用电镜观察病毒颗粒、SDS-PAGE测定病毒的主要蛋白抗原成分、间接免疫荧光测定病毒的特异性和血凝素型别；(6)重组流感减毒疫苗参考株种子库毒株采用无菌试验测定细菌、真菌、支原体，细胞培养测定外源因子；(7)重组流感减毒疫苗参考株种子库毒株或传代至15代的病毒株采用RT-PCR测定病毒HA、NA的稳定性；
(8)重组流感减毒疫苗参考毒株在不同动物体内进行安全性、有效性、稳定性的研究；第四，流感减毒三价活疫苗的生产(1)重组H1N1、H3N2、乙型流感减毒疫苗种子库参考毒株，分别进行哺乳细胞或鸡胚培养，增殖培养后收集流感病毒液；(2)收集的重组H1N1、H3N2、乙型流感减毒液超滤浓缩、柱层析纯化，制备流感减毒三价活疫苗半成品。进一步制备成喷鼻、注射、透皮流感减毒三价活疫苗成品剂型；(3)流感减毒三价活疫苗在不同动物体内外观察安全性、免疫原性、免疫保护性、稳定性和长效性，并确定疫苗的剂型、免疫用量、途径等免疫程序。
第五，建立哺乳细胞培养用于流感减毒三价活疫苗生产流感病毒的策略(1)重组H1N1、H3N2、乙型流感减毒疫苗种子库参考毒株，采用微载体技术生产流感病毒。既是用哺乳细胞Vero、MDCK等细胞，所用的细胞培养基可以是各种无血清培养基，如Iscove’s培养基、ultraCHO培养基、EX-CELL等，也可以应用常规的有血清培养基，MEM、DMEM等。培养器可用spinner培养瓶、滚动培养瓶、灌注型生物反应器等；(2)培养基的pH值为6.8-7.3，PO2为35％-60％。细胞培养是悬浮培养，而非贴壁生长。培养20-30h，达到细胞浓度8-25×106个/ml。流感病毒在细胞中培养，其m.o.i(multiplicity of infection)为0.002-0.5；(3)植入病毒后不久便可加入蛋白酶，首选胰酶、或者是丝氨酸蛋白酶。蛋白酶首先切割流感病毒HA的先驱蛋白，才能使流感病毒吸附于细胞，进而进入细胞进行复制。丝氨酸蛋白酶最开始的终浓度为5-30μg/ml，细胞感染后加入的蛋白酶终浓度可在1-80μg/ml。病毒是复制大约需要2-10天，收获病毒液，用于流感减毒三价活疫苗的生产。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、重组A型H1N1、H3N2流感减毒病毒和重组B型流感减毒病毒的制备1、载体pAD3000的构建运用分子生物学的基本方法，在载体pHW2000的基础上构建pAD3000。即将pHW2000中的多聚A信号序列BGH(bovine growth hormone)改建成SV40(simian virus 40)。
设计SV40扩增引物如下引物15’-AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT-3’引物25’-TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA-3’扩增的模板为载体pcDNA3.1(Invitrogen公司)。PCR扩增的程序为先94℃ 10min；然后94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 45s，共25个循环；最后72℃ 5min。扩增得到的138bp片段用内酶切EcoRV和BstEII进行双酶切后，与PvuII和BstEII双酶切pHW2000(pHW2000的构建参照Hoffmann E，Neumann G，Kawaoka Y，Hobom G，Webster RG.A DNA transfectionsystem for generation of influenza A virus from eight plasmids.Proc Natl Acad SciU S A.2000May 23；97(11)6108-13)得到的载体大片段连接构建新的载体，送公司测序，测序结果表明pHW2000中的多聚A信号序列BGH被改建成SV40(simian virus 40)多聚A信号序列，将该重组疫苗载体命名为pAD3000(图1，序列13)。
2、构建流感病毒的8质粒拯救系统为了克服流感病毒在细胞内繁殖需要辅助病毒这一障碍，构建了新的载体pAD3000。vRNA和mRNA合成的转录系统为pol I-pol II，双表达盒如图2所示。如图5所示，流感病毒8个片段的cDNAs分别反向插入RNA聚合酶I启动子(PIh)及其终止子(tI)之间构成转录单位，转录单位之外相连的是聚合酶II启动子(PIICMV)及其终止序列(aIISV40)，两个启动子方向相反。8个表达质粒共转染细胞，由细胞提供pol I和pol II，从PIh启动负义vRNA的合成，vRNA包含5′和3′端的非编码区，从PIICMV启动、pol II合成mRNA，mRNA带5′帽子结构和3′poly(A)尾，翻译成病毒蛋白。病毒cDNA的ATG是pol II下游的第一个ATG，是pol II转录的起始位点。
①流感病毒的制备甲乙流感冷适应株A/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66和WHO当年确定的流行毒株，如A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/jiangxi/424/2004(H3N2)、B/Shanghai/361/2002疫苗株分别接种于SPF鸡胚，按常规培养流感病毒，收集尿囊液300ml，6000rpm(30#转子)离心15min，取上清，18000rpm 4℃离心1.5h，用40ml STE(10mM pH8.0Tris-HCl，100mM NaCl，5mM pH8.0 EDTA)悬浮沉淀。用10％蔗糖垫底，小心加入悬浮液，18000rpm4℃离心1.5h去杂蛋白，去上清，沉淀用30ml STE悬浮，18000rpm 4℃离心1h去蔗糖，沉淀用7ml STE悬浮，分装，每管450μl。
②流感病毒基因组RNA的提取取450μl的纯化尿囊液，加入10％ SDS 50μl，颠倒混匀，置5min，中间轻轻振动数次。加入饱和酚500μl，混匀，5000×g离心15min，取上清，再加入饱和酚500μl，混匀，5000×g离心15min，取上清(约350μl)，加入DEPC处理的2M NaAc和4M LiCl各25μl，加入无水乙醇1000μl，颠倒混匀，-20℃过夜，12000×g离心15min，弃去上清，置超净台挥发干，用60μl DEPC-水悬浮沉淀，可立即使用或置-20℃备用。
③反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增各基因片段采用一步法RT-PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，CaliF)说明进行操作。已提取的流感病毒病毒RNA1μl，RT条件是50℃50min，PCR条件是先94℃ 15min；然后94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 3min，25循环。回收PCR产物进行酶切、测序，连于构建好的pAD3000载体上。
流感病毒冷适应株A/AnnArbor/6/60变异体、B/AnnArbor/1/66冷适应株分别作为主要的供体病毒提供6个基因片段，引物见表1，2。A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/jiangxi/424/2004(H3N2))、B/Shanghai/361/2002作为流行毒株(既是WHO确定的当年季节性流行株)来提供2个基因序列(NA、HA)，所用的引物为通用引物(表3)。
利用A/AnnArbor/6/60冷适应株的基因组RNA、表1中的引物分别进行RT-PCR扩增得到A型H1N1亚型流感病毒的PB2、PA、NP、M、NS、PB1基因片段，将PB2基因片段反向插入pAD3000的AarI和AarI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列2的核苷酸序列的PB2基因的重组载体，将其命名为pADAPB2；将PA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列5的核苷酸序列的PA基因的重组载体，将其命名为pADAPA；将NP基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列3的核苷酸序列的NP基因的重组载体，将其命名为pADANP；将M基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列6的核苷酸序列的M基因的重组载体，将其命名为pADAM；将NS基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列4的核苷酸序列的NS基因的重组载体，将其命名为pADANS；将PB1基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列1的核苷酸序列的PB1基因的重组载体，将其命名为pADAPB1。
利用B/AnnArbor/1/66冷适应株的基因组RNA、表2中的引物分别进行RT-PCR扩增得到B型流感病毒的PB2、PA、NP、M、NS、PB1基因片段，将PB2基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列8的核苷酸序列的PB2基因的重组载体，将其命名为pADBPB2；将PA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列11的核苷酸序列的PA基因的重组载体，将其命名为pADBPA；将NP基因片段反向插入pAD3000的BsaI和BsaI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列9的核苷酸序列的NP基因的重组载体，将其命名为pADBNP；将M基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列12的核苷酸序列的M基因的重组载体，将其命名为pADBM；将NS基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列10的核苷酸序列的NS基因的重组载体，将其命名为pADBNS；将PB1基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列7的核苷酸序列的PB1基因的重组载体，将其命名为pADBPB1。
利用A/New Caledonia/20/99(H1N1)或A/jiangxi/424/2004(H3N2)的基因组RNA，表3中的扩增HA的引物AHA-1和AHA-2、扩增NA的引物ANA-1和ANA-2分别进行RT-PCR扩增得到A型流感病毒A/New Caledonia/20/99(H1N1)或A/jiangxi/424/2004(H3N2)的HA、NA基因片段，将A/New Caledonia/20/99(H1N1)的NA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列14的核苷酸序列的NA基因的重组载体，将其命名为pADA1NA；将A/New Caledonia/20/99(H1N1)的HA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列15的核苷酸序列的HA基因的重组载体，将其命名为pADA1HA；将A/jiangxi/424/2004(H3N2)的NA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列18的核苷酸序列的NA基因的重组载体，将其命名为pADA3NA；将A/jiangxi/424/2004(H3N2)的HA基因片段反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列19的核苷酸序列的HA基因的重组载体，将其命名为pADA3HA。
利用B/Shanghai/361/2002中的基因组RNA、表3中的引物BHA/NA-1和BHA/NA-2进行RT-PCR扩增得到B型流感病毒的1701bp的HA和1413bp的NA基因片段，将HA和NA基因片段分别反向插入pAD3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，经筛选、测序得到含有具有序列表中序列16的核苷酸序列的HA基因的重组载体，将其命名为pADBHA；得到含有具有序列表中序列17的核苷酸序列的NA基因的重组载体，将其命名为pADBNA。
表1 扩增A型H1N1亚型流感病毒A/AnnArbor/6/60 6个基因片段的引物
注1代表正向引物，2代表反向引物表2 扩增B/AnnArbor/1/66型流感病毒6个基因片段的引物
注1代表正向引物，2代表反向引物表3 扩增A和B型流感病毒HA和NA基因的引物序列
注1代表正向引物，2代表反向引物3、重组流感病毒的复活及培养①质粒提取用Premega公司生产的小提质粒试剂盒，按说明操作提取质粒。最后用灭菌T1(2mM Tris.HCl)无菌操作洗脱质粒。用Eppendorf Biophotometer RS232C(德国Hamburg)测定质粒的含量和纯度，含量在100μg/ml以上、OD260/OD280为1.70-2.00的质粒备转染用。
②反向遗传操作技术制备重组流感病毒如图3所示，把已构建的8个质粒及阴性对照的质粒按设计的基因重排组合，等量混匀，共转染MDCK或Vero或293T或COS7共培养的细胞系，收集转染上清和细胞，用10日龄SPF鸡胚增殖，72h后收集尿囊液，HA试验检测血凝价，HA阳性的进一步验证重组病毒子是否为预先设计的病毒；HA阴性的再用SPF鸡胚传一代，HA阳性者验证重组病毒，HA仍为阴性则弃去。
共转染的质粒分为以下四组A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA；A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组pADAPA、pADANP、pADAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA；A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA；A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组pADAPA、pADANP、pADAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA；B型流感病毒共转染质粒组pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA；B型流感病毒共转染质粒的阴性对照组pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA。
将293T细胞用OptiMEMI-AB+5％FBS培养基(购自美国Sigma公司)培养；COS7细胞用DMEMI-AB+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)；MDCK细胞用1×MEM+10％FBS培养基培养。收集293T细胞、COS7细胞和MDCK细胞，用5mLPBS或者含有10％FBS的培养基洗细胞。将10mLtrypsin-EDTA加入75cm2的细胞培养瓶中，分别将MDCK细胞、293T、COS7或Vero细胞加入进行孵育，MDCK细胞孵育20-45min，293T、COS7和Vero细胞孵育1min。细胞离心后重悬于OptiMEM-AB中。每毫升的细胞悬液用18mLOptiMEM-AB稀释并混匀。将稀释好的细胞加入6孔板中，6-24h后，以上四个共转染组中的每种质粒1μg混匀(xμg质粒+xμLOptiMEM-AB+TransI1-LT1＝200μL(OptiMEM-AB和TransI1-LT1购自Mirus公司)，加入800μLOptiMEM-AB室温孵育45min。转染后的细胞更换培养基，移入33℃培养箱培养6-15h，轻轻移去培养基，再加入1mL的OptiMEM-AB培养基，继续在33℃条件下培养24h。
转染后48h，将1mL含有终浓度为1μg/μL的TPCK-trypsin的OptiMEM-AB加入细胞内，96h后再加入1mL含有终浓度为1μg/μL的TPCK-trypsin的OptiMEM-AB。
A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组，A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组和B型流感病毒共转染质粒组转染后的MDCK细胞、293T、COS7和Vero细胞在5-7天有CPE，说明病毒已被拯救复活，分别得到重组A型H1N1亚型流感病毒(重组H1N1流感减毒病毒)(图6中A)、重组A型H3N2亚型流感病毒(重组H3N2流感减毒病毒)(图6中B)和重组B型(乙型)流感病毒(重组乙型流感减毒病毒)(图6中C)。A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组、A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组和B型流感病毒共转染质粒阴性对照组转染后的MDCK细胞、293T、COS7和Vero细胞没有CPE。为了证明这个拯救系统的效应，转染后7天，收集细胞上清，1mL上清，5000rpm离心5min，再取离心后的上清，倍比稀释每孔500mL加入MDCK细胞中。上清与细胞共培养1h后去掉上清，代之以终浓度为1μg/μL的TPCK-trypsin的1×MEM，然后做HA实验和空斑实验。证明所有的阳性组(A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组，A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组和B型流感病毒共转染质粒组)该两项实验结果均阳性，而阴性对照组(A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组，A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组和B型流感病毒共转染质粒阴性对照组)结果均阴性。该实验粗步筛选出阳性者进行重组的H1N1、H3N2、乙型流感减毒病毒的验证。
4、重组H1N1、H3N2、乙型流感减毒病毒的验证①鸡胚传代流感减毒病毒的感染性HA实验和空斑实验阳性的转染上清-20℃和20℃冻融2次，经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，每个样品接种2个胚，置35℃培养至72h，收集尿囊液，参考OIE推荐的标准、用0.8％鸡红细胞进行血凝(HA)试验，HA阳性者用H1、H3、B亚型阳性血清(购于中国CDC国家流感中心)进行血凝抑制试验(HI)。
阳性的HI效价均在1∶28以上，而对照组HI实验均阴性。检测的阳性尿囊液代次及其HA效价见表4，阳性组合上清接种鸡胚在第一代(F1)尿囊液检测为阳性，检测阳性时的鸡胚平均HA效价范围为1∶27～1∶211，表明经上述传代后重组H1N1、H3N2、乙型流感病毒HA效价没有改变，证明重组H1N1、H3N2、乙型流感减毒病毒具有很高的滴度，表明重组H1N1、H3N2、乙型流感减毒病毒具有很好的稳定性。
表4.HA/HI实验检测鸡胚传代、血凝滴度及病毒亚型
#F1/F2鸡胚代次；AH1表示重组A型H1N1亚型流感病毒，AH3表示重组A型H3N2亚型流感病毒，B表示重组B型流感病毒，NC代表A/New Caledonia/20/99②重组流感减毒病毒全基因序列分析阳性尿囊液，用鸡胚传代的第2代尿囊液分别提取重组H1N1、H3N2、乙型流感病毒RNA、用通用引物(表1、表2和表3)、RT-PCR扩增8基因片段进行测序，未经反转录的RNA、用通用引物(表1、表2和表3)做PCR对照，以排除尿囊液中转染质粒DNA的存在。结果表明A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组、A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组和B型流感病毒共转染质粒组转染的293T、COS7、Vero细胞和MDCK细胞培养上清得到的尿囊液，RT-PCR均能扩增出PB1、PB2、NS、M、NP、PA、HA、NA的8基因片段，经测序与设计的相符，而未经反转录的RNA均不能扩增出8个基因片段，说明尿囊液中无质粒DNA的存在；A型流感病毒共转染质粒阴性对照组和B型流感病毒共转染质粒阴性对照组转染的293T、COS7、Vero细胞和MDCK细胞培养上清得到的尿囊液，RT-PCR不能扩增出8基因片段，未经反转录的RNA也不能扩增出8基因片段；说明尿囊液中无拯救病毒的存在。
③重组流感减毒病毒感染MDCK细胞的稳定性第2代阳性尿囊液在不加胰酶的情况下感染MDCK细胞，观察96h内的病变。结果表明重组A型H1N1亚型流感病毒、重组A型H3N2亚型流感病毒和重组B型(乙型)流感病毒感染72h后均使MDCK产生变圆、死亡、小块脱落并以丝相连等特征性病变。其中，重组A型H1N1亚型流感病毒感染MDCK细胞的照片如图4中B所示。图4中A为未经感染的MDCK细胞)。
进一步用SPF鸡胚(或细胞)传代20代，A/New Caledonia/20/99毒株做对照。HA试验检测每批次鸡胚(或细胞)的血凝价，对每代次取平均值。此结果表明重组病毒对鸡胚(或细胞)有很好的感染性。
表5.重组减毒病毒和A/New Caledonia/20/99用鸡胚传平均HA效价
F1-代表第2代、F2-代表第6代、F3-代表第12代、F4-代表第20代，AH1-表示重组A型H1N1亚型流感病毒，AH3-表示重组A型H3N2亚型流感病毒，B-表示重组B型流感病毒，NC代表A/New Caledonia/20/99。
同时对重组的流感减毒病毒EID50、序列分析，传20代后重组A型H1N1亚型流感病毒、重组A型H3N2亚型流感病毒和重组B型(乙型)流感病毒的EID50分别为10-11/0.2ml、10-8/0.2ml和10-9.25/0.2ml。序列分析结果显示无基因突变。所有的实验结果均表明，重组病毒具有很好的稳定性。
④鸡胚半数感染剂量(EID50)的测定按参考文献的方法。将共转染产生的重组A型H1N1亚型流感病毒，重组A型H3N2亚型流感病毒，重组B型流感病毒和野生型病毒A/New Caledonia/20/99第1代尿囊液作10倍递进稀释，经尿囊腔接种于10日龄非免疫鸡胚，每个稀释度接种4个胚，每胚0.2ml，35℃培养，取出24h后的死胚和培养至84h的胚，血凝价在1∶16以上的判定为鸡胚感染阳性，用Reed-Muench法计算EID50(表3)。共转染产生的重组A型H1N1亚型流感病毒，重组A型H3N2亚型流感病毒，重组B型流感病毒的EID50分别为10-7/0.2ml、10-6.75/0.2ml和10-10.75/0.2ml。鸡胚感染和死亡情况见表6。
表6.EID50测定中鸡胚感染和死亡数(n/4)
AH1表示重组A型H1N1亚型流感病毒，AH3表示重组A型H3N2亚型流感病毒，B表示重组B型流感病毒，NC代表A/New Caledonia/20/99。
⑤电镜观察重组流感减毒病毒的超微结构共转染产生的重组A型H1N1、H3N2亚型流感病毒和重组B型流感病毒感染MDCK细胞后72小时后分别用负染法处理，透射电镜下观察。结果表明所重组的H1N1、H3N2、B型流感病毒的电镜形态与野生型病毒无任何差异。
⑥重组流感减毒病毒的安全性按照2005年版《中国生物制品规程》要求，对不同代次重组A型H1N1、H3N2亚型流感病毒和重组B型流感病毒进行无菌实验、毒力实验、外源致热原等安全性实验，结果均阴性，表明重组的重组A型H1N1、H3N2亚型流感病毒和重组B型流感病毒作为疫苗株具有很好的安全性。
⑦重组流感减毒病毒的敏感及冷适应性在不同的温度培养条件下测定TCID50滴度。在不同的温度条件下，在96孔板内用病毒感染细胞的CPE来决定TCID50滴度，这个实验决定于温度和病毒株的不同，即病毒的复制能力。PCK(primary chicken kidney)细胞用含有5％的FCS的MEM悬浮，并种植于96孔板，48h后单克隆细胞数需达到90％以上，用含有1mM L-谷氨酰胺的非必需氨基酸的无血清的MEM来洗细胞1h。后种植96孔板，稀释10倍的病毒样品来感染细胞，设6个孔。未加病毒的细胞做阴性对照，也设6个孔。阳性对照为冷适应病毒及温度敏感毒株A/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66变异体。为了决定重组病毒的温度敏感性，加入病毒的板子分别在33℃、37℃的温度条件的CO2孵箱内培养6天，测定其冷适应性需要在25℃培养10天。病毒滴度用Karber方法计算，用log10平均值(n＝4)TCID50Titer/ml±SD来表示。此值在33℃-37℃之间的不同代表温度敏感现象，在25℃-33℃之间的差异代表冷适应性。
结果如表7，这一结果表明重组A型H1N1、H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型流感减毒病毒既有温度敏感现象，也有冷适应性。25℃-33℃之间病毒滴度的差异在0.3-0.4log10，说明了其具有冷适应性。37℃病毒生长滴度小于33℃病毒滴度2log10，33℃-37℃之间病毒滴度的差异在原病毒和重组病毒之间的差异是3.4-3.7log10。说明重组A型H1N1亚型流感病毒，重组A型H3N2亚型流感病毒和重组B型流感病毒在人体温下不会大量繁殖，可以直接用于流感减毒疫苗的生产。
表7.重组流感减毒病毒株稳定敏感及冷适应型结果
Ca-ts代表冷适应性和温度敏感性，NC代表A/New Caledonia/20/99实施例2.重组流感三价减毒活疫苗病毒的制备1、鉴定好的重组A型H1N1、H3N2亚型流感病毒和重组B型流感病毒按WO96/15231的方法感染鸡胚。
2、在接种鸡胚的当天，用PBS稀释病毒接种液，保存在2-8℃。
3、接种鸡胚，9-11日龄鸡胚被用于病毒复制。蛋壳除菌，每个鸡胚接种0.2ml的病毒接种液，接种好病毒的鸡胚在33℃下孵育48-96小时，在结束时，把鸡胚放在2-8℃冰箱12-60小时使鸡胚冻死。
4、流感病毒的收获，从冻死的鸡胚中收获尿囊液，通常一个鸡胚可以收获8-10ml。收获的鸡胚尿囊液4000-14000g离心。
5、将尿囊液离心后用超滤包(MW为20KD)浓缩全病毒液，蔗糖梯度超速离心或柱层析进行重组A型H1N1、H3N2亚型流感病毒和重组B型流感病毒的纯化；6、对纯化的病毒进行病毒滴度、HA含量、外源因子、纯度等理化性质检测，检测合格用于流感三价减毒活疫苗的制备。
实施例3.细胞培养生产流感三价减毒活疫苗病毒1、电转Vero细胞复制重组流感病毒以往用脂质体进行细胞转染，只能获得单株高复制的病毒，且只限于实验室阶段的应用，在疫苗的生产中受到了很大的限制。本发明提供了一种新的病毒拯救方法，即用电转的方法转染Vero细胞，此方法适用于A、B型流感病毒的复活。用这种方法复活的温度敏感、冷适应性、减毒流感病毒可用于减毒疫苗的生产，没用更多的化学物质的掺入。8质粒系统拯救流感病毒的过程中，电转的方法明显优于其它方法，且Vero细胞最适合。具体方法是；(1)将Vero细胞种植于T225细胞培养瓶中，所种植的细胞浓度为9×106个/瓶，所用的细胞培养基为含有L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、10％FBS的MEM。
(2)培养的第二天，收集细胞重悬于50mlPBS，再重悬于0.5mLoptiMEM(购于美国Sigma公司)。
(3)FCM 1∶40计数细胞，每5×106个细胞中加入0.4cm电穿孔杯(electroporationcuvette)和400μL optiMEMI(购于美国Sigma公司)。
(4)等比例混合实施例1中的A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组、A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组和B型流感病毒共转染质粒组中的8种质粒共20μg，控制在总体积为25μL，加入cuvette。轻混匀，300v电转28-33msec。
(5)电转后1-2min后，轻拍cuvette，加入0.7mL含有10％FBS的MEM，轻拍，使细胞悬浮，分成两份，加入已有2mL10％FBS MEM的六孔板。继续用1mL10％FBS MEM洗cuvette，仍分成两份加入六孔板，使得终体积为3.5mL。
(6)将六孔板放在适合病毒生存条件(33℃，5％CO2孵箱)下培养细胞。
(7)电转后19h移去培养基，用3mL OptiMEM冲洗细胞，每毫升OptiMEM含有低浓度的青/链霉素，收集上清-80℃保存。病毒生长的高峰在电转后2-3天即可以达到。
同时，用电转、脂质体转染和阳离子转染将重组病毒在表8中的细胞系上进行实验，实验结果如表8所示，用脂质体和阳离子转染COS-7或MDCK可以有阳性结果，但拯救的效率较低，实验具有不可重复型，而Vero细胞电转的方法，其病毒拯救的效率可达到100％。因此最适合流感病毒的大规模培养，电转的方法效率也是最高的。
表8.不同的细胞系和转染方法在病毒拯救上运用的比较
注Lipo代表脂质体转染，CaPO4代表阳离子转染，Electroporation代表电转。(1)(2)(3)方法参考卢圣栋《现代分子生物学实验技术》。
2、流感减毒活病毒的纯化从细胞培养的流感病毒用超滤包、蔗糖梯度超速离心或柱层析，进行重组A型H1N1、H3N2亚型流感病毒和重组B型流感病毒的浓缩和纯化，以用于疫苗流感病毒的制备。
实施例4.疫苗的制备与效果评价1、疫苗的制备将收获并纯化好的重组H1N1、H3N2和B型流感病毒以HA含量1∶1∶1的质量比混合，并加入保护剂(0.1-0.5％海藻糖或壳聚糖，0.1-0.3％明胶，0.2-0.8％蔗糖，0.1-0.3％乳胶蛋白和0.1-0.8％白蛋白)，制备重组流感三价减毒活疫苗的滴鼻剂，或不加佐剂制备成注射剂型，或加入10-20％CTB制备成透皮剂型。重组A型H1N1、H3N2亚型流感病毒或重组B型流感病毒分别制成重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗(重组H1N1流感病毒减毒活疫苗)、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗(重组H3N2流感病毒减毒活疫苗)或重组B型流感病毒活疫苗的滴鼻剂、注射剂或透皮剂。
2、疫苗的免疫原性评价将制备的重组流感三价减毒活疫苗(重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗和重组B型流感病毒活疫苗以HA含量1∶1∶1的质量比混合得到的疫苗)、重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗和重组B型流感病毒活疫苗分别进行喷鼻粘膜免疫，同时以A/AnnArbor/6/60作为重组A型H1N1亚型流感病毒减毒活疫苗和重组A型H3N2亚型流感病毒减毒活疫苗的阳性对照，B/AnnArbor/1/66作为重组B型流感病毒减毒活疫苗的阳性对照，以未接种病毒的鸡胚尿囊液为阴性对照，流感三价灭活疫苗(购自中国天坛药业)作为阳性对照。免疫方案如表9。
表9.小鼠免疫方案
注5×106EID50相当于50ug HA。
分别于0d、14d、21d喷鼻免疫Balb/c小鼠三次，于第28天取动物的唾液、肺脏及血清标本，测定每份标本的抗体效价，用0.5mlPBS注入小鼠口腔，收集唾液测定其IgA含量，肺组织裂解标本的制备处死小鼠，打开喉部，取出肺脏并用PBS清洗，研磨肺组织并离心匀浆去处细胞组织，收集上清液并储存于-20℃，用于IgA效价测定。IgG和IgA效价测定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA检测试剂盒(Genzyme Virotech)。37℃孵育2小时后加入羊抗鼠IgG或IgA抗体(Pharmigen)及底物液和显色液检测特异性IgG和IgA抗体效价。HAI效价测定取小鼠血液，按照Palmer et al指定方法测定甲型和乙型流感病毒HAI(红细胞凝集抑制实验)效价。唾液、血清及肺组织裂解物中IgA抗体效价和血清中IgG与HAI效价测定结果如表10所示，表明重组流感三价减毒活疫苗免疫原性好于重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗的效果，且重组流感三价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗都好于流感三价灭活疫苗的效果，与阳性对照组差别不明显。其中滴鼻免疫IgA的含量高于肌肉注射，但IgG含量差别并不明显。
表10.鼻粘膜免疫后抗体滴度的检测
3、疫苗免疫保护效果评价重组流感三价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗和重组B型流感病毒减毒活疫苗分别喷鼻免疫动物三次后7d，用50LD50甲、乙型流感病毒野生株A/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66(购于中国CDC国家流感中心)气溶胶攻击，其免疫保护效果是重组流感三价减毒疫苗好于重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗的免疫保护效果，且重组流感三价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗都好于流感三价灭活疫苗(购自中国天坛药业)的免疫保护效果(表11)。
表11.重组流感三价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗和流感三价灭活疫苗的免疫保护效果
4、疫苗的稳定性评价重组流感三价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗在不同温度下稳定性观察，通过电镜观察病毒形态、HA特异性含量与最初的量、病毒滴度可知，放-70℃可保存二年，-20℃可保存一年，4℃可保存三个月，表明重组流感三价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗具有很好的稳定性。
5、疫苗的安全性评价重组流感三价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗通过喷鼻或腹腔免疫Balb/c小鼠、SD大鼠、豚鼠、雪貂动物，免疫剂量是0.5-1.0ml，共三次，没有出现异常毒性和过敏反应，表明重组流感三价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗具有很好的安全性。
序列表<160>19<210>1<211>2341<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.一种制备重组流感病毒的方法，由以下步骤组成1)将来自于A型或B型流感病毒冷适应株的PB2编码基因、PB1编码基因、PA编码基因、M编码基因、NS编码基因和NP编码基因，以及来自于当年流行的A或B型流感病毒毒株的HA编码基因和NA编码基因分别插入真核细胞表达质粒中得到8个重组表达质粒；所述8个重组表达质粒为含有PB2编码基因的重组表达质粒、含有PB1编码基因的重组表达质粒、含有PA编码基因的重组表达质粒、含有M编码基因的重组表达质粒、含有NS编码基因的重组表达质粒、含有NP编码基因的重组表达质粒、含有HA编码基因的重组表达质粒和含有NA编码基因的重组表达质粒；2)将所述8个重组表达质粒导入哺乳细胞中，培养所述哺乳细胞，得到重组A型流感减毒病毒或重组B型流感减毒病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述A型流感病毒的冷适应株为A/AnnArbor/6/60变异体；所述B型流感病毒的冷适应株为B/AnnArbor/1/66变异体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述真核细胞表达质粒为如图1所示的pAD3000。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述8个重组表达质粒选自下述三个共转染质粒组中的任意一组1)A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA；2)A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA。3)B型流感病毒共转染质粒组pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA。
5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述哺乳细胞为293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、WI-38、HL-8、Hela细胞或Chang C/I/L/K。
6.由权利要求1至5中任一所述的方法制备的重组流感病毒。
7.一种流感病毒疫苗，它的活性成分为由权利要求1至5中任一所述的方法制备的重组A型流感减毒病毒和/或重组B型流感减毒病毒。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于所述重组A型流感减毒病毒为A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组导入哺乳细胞中得到的重组流感减毒病毒，和/或A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组导入哺乳细胞中得到的重组流感减毒病毒；所述A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组由pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA1NA和pADA1HA组成，所述A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组由pADAPB2、pADAPA、pADANP、pADAAM、pADANS、pADAPB1、pADA3NA和pADA3HA组成；所述重组B型流感减毒病毒为B型流感病毒共转染质粒组导入哺乳细胞中，得到的重组流感减毒病毒；所述B型流感病毒共转染质粒组由pADBPB2、pADBPA、pADBNP、pADBM、pADBNS、pADBPB1、pADBHA和pADBNA组成。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于所述流感病毒疫苗为滴鼻剂或注射剂或透皮剂；所述重组A型流感减毒病毒和/或重组B型流感减毒病毒不加佐剂直接制备成注射剂型；所述重组A型流感病毒和/或重组B型流感病毒加入保护剂制成滴鼻剂；所述重组A型流感减毒病毒和/或重组B型流感减毒病毒加入10-20％CTB制成透皮剂；所述保护剂由0.1-0.5％海藻糖或壳聚糖，0.1-0.3％明胶，0.2-0.8％蔗糖，0.1-0.3％乳胶蛋白和0.1-0.8％白蛋白组成；所述百分含量为质量百分含量。
10.一种培养流感病毒的方法，是在293T细胞、COS7细胞、MDCK细胞、VERO细胞、WI-38、HL-8、Hela细胞或Chang C/I/L/K细胞中培养权利要求6所述的重组流感病毒。
全文摘要
本发明公开了一种重组流感病毒及其制备方法与应用。该重组流感病毒按照以下方法制备1)将来自于A型或B型流感病毒的冷适应株的PB2编码基因、PB1编码基因、PA编码基因、M编码基因、NS编码基因和NP编码基因，以及来自于当年流行的致病流感病毒株的HA编码基因和NA编码基因分别插入真核细胞表达质粒中得到8个重组表达质粒；2)将所述8个重组表达质粒导入哺乳细胞中，培养所述哺乳细胞，得到重组A型流感病毒或重组B型流感病毒。用本发明的重组流感病毒作为减毒活疫苗具备广泛的适用性，并可激活有效的粘膜免疫和系统免疫。本发明用细胞培养系统替代鸡胚生产疫苗病毒抗原，可以解决由鸡胚培养带来的异源蛋白和标准化的等问题。
文档编号C12N15/40GK1810961SQ200610007909
公开日2006年8月2日 申请日期2006年2月22日 优先权日2006年2月22日
发明者王希良, 罗德炎, 杨鹏辉, 王栋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所