基于复制型痘苗病毒载体的sars疫苗的制作方法

专利名称：基于复制型痘苗病毒载体的sars疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗病毒免疫学领域。更具体地，本发明涉及基于复制型痘苗病毒载体的针对SARS-CoV的疫苗及其制备方法和用途。
背景技术：
自2002年11月在中国广东省发现第一例传染性非典型肺炎病例以来，该传染病曾一度在全世界范围内广泛流行。世界卫生组织就此于2003年3月向全球发出警告，并将其命名为严重急性呼吸综合征(severe acuterespiratory syndrome，SARS)。SARS主要通过呼吸道传播，传染性强，死亡率高达5％-15％，严重危害了人民的生命健康安全。世界卫生组织于2003年4月16日宣布，引起SARS的病原体属于冠状病毒的一个新变种，并被命名为“SARS-CoV”(Peiris J S M，Lai S T，Poon M L L，et al.Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome.TheLancet.2003，April 8)。经过包括中国在内的多个国家科学家的共同努力，SARS-CoV全基因组的测序工作已经完成，序列分析显示SARS-CoV基因组含有5个主要的开放阅读框架(ORF)，分别编码DNA聚合酶蛋白、突起蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和核壳蛋白(NC蛋白)。
突起蛋白是冠状病毒主要的细胞受体结合蛋白，其氨基酸的变化能够显著地影响病毒的毒力。另外对SARS-CoV的突起蛋白进行功能部位预测，发现该蛋白中可能存在多个抗原决定簇，并且目前世界上流行的SARS-CoV的突起蛋白具有较高的保守性，可以作为疫苗研究的重要靶点(Walgate R.SARS vaccine raceUS and European groups movingforward，but WHO would rather put SARS“back in the box”，Available May2 at http://www.Biomedcentral.Com/news/20030502/03)。
核壳蛋白是冠状病毒中另一种重要的结构蛋白，它位于病毒颗粒的核心部分，对于病毒颗粒的准确组装有着重要意义。中国研究人员从SARS病人恢复期血液中获得淋巴细胞，通过基因工程手段得到的人源化Fab抗体能够与SARS-CoV核壳蛋白特异性结合，这说明核壳蛋白也是SARS-CoV的重要的抗原位点(杜润蕾，于建石，梁米芳等.人源抗严重急性呼吸综合征(SARS)病毒基因工程抗体的初步研究.病毒学报.2003，19(2)104-108)。
尽管SARS的疫情在全世界范围内已得到有效控制，但仍不排除其重新爆发的可能性。抗SARS-CoV疫苗是预防SARS流行的最有效的一条途径。目前中国研发的SARS全病毒灭活疫苗已进入临床实验阶段，该疫苗携带了病毒所有的抗原，免疫原性好。但是从SARS病理学来看，SARS全病毒灭活疫苗存在导致肌体自体免疫反应的潜在危险性；另外生产该类疫苗的条件要求高，生物安全性方面也存在隐患。因此研发新一代安全有效的SARS基因工程疫苗也是当务之急。
目前可供选择的疫苗类型包括下列几种传统疫苗(灭活疫苗和减毒活疫苗)、合成肽和蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗以及活载体疫苗。与其它类型疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。在针对SARS的活载体疫苗领域，目前使用的是非复制型载体。

发明内容
本发明的目的在于提供针对SARS-CoV感染的新的疫苗和免疫接种方法，以便为上面提到的现有技术中所存在的问题提供一种解决途径。
本发明的一个目的在于提供一种基于复制型痘苗病毒的针对SARS-CoV的疫苗，其包含复制型痘苗病毒作为载体，所述复制型痘苗病毒基因组的胸苷激酶(TK)区插入编码SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白的多核苷酸。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述复制型痘苗病毒是痘苗病毒天坛株，且优选地所述疫苗不含有选择标记基因。
在本发明的一个优选的实施方式中，插入所述痘苗病毒天坛株的TK区中的编码SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白的多核苷酸经密码子优化改造，适合在哺乳动物细胞中高效率表达。在一个具体的实施方式中，插入所述痘苗病毒天坛株的TK区中的所述编码SARS-CoV的核壳蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列和/或所述编码SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本发明的疫苗可进一步包含药用可接受的合适的佐剂和/或载体。
本发明的另一个目的在于提供针对SARS-CoV的DNA疫苗，其包含一种载体，所述一种载体包含可操纵地连接于启动子的编码SARS-CoV的核壳蛋白的多核苷酸和/或编码SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸。在本发明的DNA疫苗的一个具体实施方式
中，所述编码SARS-CoV的核壳蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而所述编码SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的在于提供一种针对SARS-CoV的免疫接种方法，其包括给个体施用免疫有效量的本发明的以复制型痘苗病毒、特别是痘苗病毒天坛株作为载体的针对SARS-CoV的疫苗。本发明的免疫接种方法还可包括在施用所述疫苗之前给个体施用一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗，例如在此所述的本发明的DNA疫苗。
本发明还提供了一种免疫接种试剂盒，其包括一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗，如在此所述的本发明的DNA疫苗，其还包括本发明的以复制型痘苗病毒作为载体的针对SARS-CoV的疫苗。任选地，所述试剂盒进一步包括指示用所述一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗进行初次免疫，然后用本发明的以复制型痘苗病毒作为载体的针对SARS-CoV的疫苗进行加强免疫的接种程序说明书。
此外，本发明还提供了一种痘苗病毒的通用转移载体pVTT1.0，其保藏号为CGMCC No.1458。


图1显示痘苗病毒通用转移载体pVTT1.0的构建路线。
图2显示转移质粒pVTT-NS的构建路线。
图3显示痘苗病毒通用转移载体pVTT1.0酶切分析鉴定结果。泳道M显示为分子量标记DL15000的DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；泳道1、2、3分别显示痘苗病毒通用转移载体pVTT1.0经KpnI、NdeI或EcoRV酶切的结果。
图4PCR扩增SARS-CoV核壳蛋白的编码序列以及PCR融合扩增启动子P E/L+P7.5和SARS-CoV核壳蛋白的编码序列。泳道M为分子量标记DL2000的DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；泳道1显示PCR扩增的SARS-CoV核壳蛋白的编码序列的条带；泳道2显示PCR融合扩增启动子P E/L+P7.5和SARS-CoV核壳蛋白的编码序列的条带。
图5显示T-NC质粒酶切分析鉴定结果。泳道1显示T-NC质粒经Spe I和Not I双酶切结果；泳道2显示T-NC质粒经Sal I单酶切结果。
图6显示T-NC+P+S质粒酶切分析鉴定结果。泳道M为分子量标记DL15000的DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；泳道1-4显示挑取的T-NC+P+S质粒(1-4号)经Sac I和Not I双酶切结果。
图7显示痘苗病毒通用转移载体pVTT1.0以及痘苗病毒转移载体pVTT-NS酶切分析鉴定结果。泳道M显示为分子量标记DL15000的DNAMarker(购自大连宝生物工程有限公司)；泳道1显示痘苗病毒通用转移载体pVTT1.0经Sac II和Spe I双酶切结果；泳道2显示痘苗病毒转移载体pVTT-NS经Sac II和Spe I双酶切结果。
图8显示从第五代rVTT-NS传代后随机挑取9个第六代白病毒克隆，提取病毒DNA模板，以NC引物1、NC引物2为引物，扩增SARS-CoV核壳蛋白编码序列的结果检验。其中泳道M显示为分子量标记DL15000的DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；泳道N显示野生型病毒阴性对照的PCR扩增结果；泳道1-9显示随机挑取9个第六代白病毒克隆基因组PCR扩增SARS-CoV的NC蛋白编码序列(1.2 Kb)结果。
图9显示从第五代rVTT-NS传代后随机挑取9个第六代白病毒克隆，提取病毒DNA模板，以S引物1、S引物2为引物，扩增SARS-CoV的S蛋白编码序列的结果检验。其中泳道M显示为分子量标记DL15000的DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；泳道P显示以质粒pSK-S为模板的阳性对照结果；泳道N显示野生型病毒阴性对照的PCR扩增结果；泳道1-9显示随机挑取9个第六代白病毒克隆基因组PCR扩增SARS-CoV的S蛋白编码序列(3.6 Kb)结果。
图10显示各代rVTT-NS感染CEF细胞，48小时后收获细胞和上清，以人多抗血清(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制中心提供)进行Western Blot分析结果。泳道N显示野生型病毒阴性对照的免疫杂交结果；泳道M显示预染蛋白Marker；泳道1、3、5、6分别显示第1、3、5、6代次的rVTT-NS感染CEF细胞的免疫杂交条带。
图11显示ELISPOT检测体外N抗原表位肽(A)和S抗原表位肽(B)刺激后分泌IFN-γ的T淋巴细胞反应。分别采用NC蛋白刺激肽和S蛋白刺激肽对每孔1×106个小鼠脾细胞进行刺激30小时，检测分泌IFN-γ的T淋巴细胞数。
图12表示实验组动物血清SARS-CoV的NC蛋白(A)和S蛋白(B)特异性抗体IgG的滴度水平。
图13SARS-CoV DNA疫苗pDRVISV1.0-S和pDRVISV1.0-N结构示意图。
保藏转移质粒pVTT 1.0，于2005年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.1458。
质粒pSC65，于2004年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是CGMCC No.1097。
质粒pSK-N，于2005年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是CGMCC No.1459。
质粒pSK-S，于2005年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是CGMCC No.1457。
具体实施例方式
本发明的针对SARS-CoV的疫苗是基于复制型痘苗病毒载体而构建的，这不同于目前常规使用的非复制型痘苗病毒载体，如MVA(Modifiedvirus Ankara)、NYVAC(New York Vaccinia)和ALVAC(avipoxviruscanarypox)(Paoletti E.Applications of poxvirus vectors to vaccinationAnupdate.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.93，pp.11349-11353)。在本发明的疫苗中，所述复制型痘苗病毒的TK区插入了编码SARS-CoV的核壳蛋白(NS)和突起蛋白(S)的多核苷酸，经施用后能够引发个体产生针对SARS-CoV的保护性免疫应答。
术语“复制型”是指可以在人体内复制的痘苗病毒载体。在本发明的一个优选的实施方式中，所述复制型痘苗病毒载体是痘苗病毒天坛株(vaccine virus TianTan strain，VTT)。痘苗病毒天坛株曾为中国消灭天花做出了巨大贡献，其在活载体疫苗研究中的应用也十分活跃，具有安全性好、接种方便，不需佐剂等优点。
优选地，可对插入复制型痘苗病毒基因组TK区中的编码SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白的多核苷酸进行密码子优化改造。术语“密码子优化改造”，是指根据人类遗传密码子偏爱性表中的遗传密码子使用频率，选择人类最偏爱的遗传密码子，将一种多肽的氨基酸序列反向翻译回核苷酸序列，以使得所述核苷酸序列适合在人类及哺乳动物细胞中高效表达。在本发明中，通过密码子优化策略，根据已知的SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白的氨基酸序列(参照Genebank公布的SARS-CoV香港株HKU-39849分离株氨基酸序列)，通过反向翻译可得到经过密码子优化改造的编码所述核壳蛋白和突起蛋白的核苷酸序列。可对获得的核苷酸序列进行小的调整和修饰，利用遗传密码子简并性消除多余的限制酶识别位点，并消除潜在的核酸二级结构等不利于基因合成的序列。在一个具体的实施方式中，所述编码SARS-CoV的核壳蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而所述编码SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
在本发明中，编码SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白的多核苷酸通过合适的方法例如同源重组而被插入至痘苗病毒基因组中的胸苷激酶(TK)基因中，以形成携带目的基因的重组的复制型痘苗病毒。优选地，本发明的疫苗，即所述重组的复制型痘苗病毒，不含有选择标记基因。
为此，本发明提供了一种痘苗病毒的通用转移载体，以便将目的基因重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区中。在一个具体的实施方式中，本发明的痘苗病毒通用转移载体是含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的转移质粒pVTT 1.0(CGMCC No.1458)。该转移质粒载体含有以下元件①三个筛选标记Amp抗性基因、lacZ基因和neo基因。由p7.5启动子启动的lacZ基因用于重组痘苗病毒的蓝白斑筛选，由PE6启动子启动的neo基因用于既带有筛选标记又带有目的基因的重组痘苗病毒的纯化(在G418的作用下痘苗病毒野毒株的增殖将被抑制)，为了使neo基因能够更好的发挥作用，neo基因的尾部带有200bp的poly(A)序列。②同源臂tkL和tkR序列tkL和tkR是痘苗病毒胸苷激酶(TK)的部分片段，是痘苗病毒和转移质粒发生分子间同源重组的同源序列。③lacZ’序列这一段200bp的序列与lacZ基因尾部的200bp的序列完全同源，使既带有筛选标记又带有目的基因的重组痘苗病毒发生分子内同源重组，从而丢掉筛选标记。④痘苗病毒的早晚期启动子pE/L。⑤多克隆位点，位于启动子pE/L的下游。
采用本发明的通用转移载体pVTT 1.0，可将目的基因重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区中，并使得痘苗病毒基因组中不含有选择标记基因。因此，本发明还提供了用于构建基于复制型痘苗病毒的针对SARS-CoV的疫苗的方法，所述方法包括使用转移质粒pVTT 1.0(CGMCC No.1458)将编码SARS-CoV核壳蛋白(NS)和突起蛋白(S)的多核苷酸置于pVTT 1.0的启动子pE/L下，构建重组质粒pVTT-NS；pVTT-NS在鸡胚细胞内与痘苗病毒天坛株发生同源重组，使SARS-CoV的目的基因与含neo基因和lacZ基因的双重筛选标记一同重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区中；在抗生素G418选择压力下，用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，挑取既含有目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒，共经过三轮单斑纯化；然后在无G418压力选择下，蓝色重组痘苗病毒自身会因为转移质粒中一小段约200bp的lacZ’片段与完整的lacZ基因发生分子内的同源重组，从而丢失neo基因和lacZ基因，由此得到只含有SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白的编码序列的重组痘苗病毒天坛株。
本发明的疫苗可进一步包含药用可接受的合适的佐剂、载体和/或赋形剂，合适的佐剂、载体和赋形剂是本领域已知的。
本发明还提供了针对SARS-CoV的DNA疫苗，所述DNA疫苗包含一种载体，所述一种载体包含可操纵地连接于启动子的编码SARS-CoV的核壳蛋白的多核苷酸和/或编码SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸。用于构建DNA疫苗的载体是本领域已知的，例如真核表达载体pcDNA3.1。在获得了目的基因之后，可通过已知的方法将目的基因的序列连接到合适的载体中构建DNA疫苗。在本发明的DNA疫苗的一个具体实施方式
中，所述编码SARS-CoV的核壳蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，而所述编码SARS-CoV的突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的在于提供一种针对SARS-CoV的免疫接种方法，其包括给个体施用免疫有效量的本发明的基于复制型痘苗病毒、特别是基于痘苗病毒天坛株的针对SARS-CoV的疫苗。术语“有效量”是指足以刺激个体产生针对病原体的细胞免疫和/或体液免疫的本发明的疫苗的量，具体的施用量以及施用速度和施用时间将依赖于个体的状况，并可由医生根据情况做出判断。本发明的免疫接种方法还可包括在施用所述疫苗之前给个体施用一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗，例如在此所述的本发明的DNA疫苗。本发明人发现，通过先采用含有SARS-CoV核壳蛋白和/或突起蛋白的编码序列的DNA疫苗进行初始免疫，再用SARS-CoV天坛株重组痘苗病毒疫苗进行加强免疫的免疫方案(即Prime-boost策略)，能够成功诱导肌体产生高水平的体液和细胞免疫反应及高滴度中和抗体。
本发明还提供了一种免疫接种试剂盒，其包括一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗，如在此所述的本发明的DNA疫苗，其还包括本发明的基于复制型痘苗病毒的针对SARS-CoV的疫苗。任选地，所述试剂盒进一步包括指示用所述一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗进行初次免疫，然后用本发明的基于复制型痘苗病毒的针对SARS-CoV的疫苗进行加强免疫的接种程序说明书。
以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例实施例1痘苗病毒通用转移载体pVTT 1.0的构建
1.重组质粒pSC-neo的构建质粒pIRESneo(购自Clontech公司)先用XhoI酶切，再用SmaI酶切(反应温度为25℃)，Klenow酶补平，回收1.2kb的目的片段neo-polyA；过渡载体质粒pSC65(保藏号CGMCC No.1 097)用BglII酶切，Klenow酶补平，去磷酸化酶(CIAP)处理，回收载体；二者16℃连接4h，转化大肠杆菌TOP10。挑取多个单菌落，小量提取质粒，用XbaI和PstI鉴定，正确重组克隆命名为pSC-neo。
2.人工合成痘苗病毒载体早期启动子PE6和lacZ融合片段。
采用重叠PCR(Overlaping PCR)的方法合成基因。首先把序列PE6和lacZ融合多核苷酸片段的正链和负链分别列出，然后根据基因长度把正链和负链序列分割成长度为50bp的寡核苷酸(两条链最5’端的一条长度为25bp左右)，除两端的序列外，每条正链和负链序列都与两条互补链的寡核苷酸有25bp左右的互补。8条寡核苷酸都与同样数目的互补寡核苷酸混合成一个退火体系，在PCR管中先升温再慢慢退火。以退火产物为模板，以配对的上下游引物进行PCR扩增，得到429bp的PE6和lacZ融合多核苷酸片段。合成的痘苗载体早期启动子PE6和lacZ融合片段连接到T-easy通用测序载体，得到质粒pT-lacZ’-PE6，测序结果符合预期设计(SEQ ID NO9)。
3.获得痘苗病毒转移载体pVTT 1.0。
如上制备的质粒pT-lacZ’-PE6经SmaI+HindIII消化，回收0.4kb的lacZ’-PE6片段；连接到质粒pSC-neo，得到痘苗病毒转移载体pVTT 1.0(构建过程见图1)。经KpnI、NdeI和EcoRV鉴定，结果见图3。
实施例2SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白编码序列的密码子优化以及构建DNA疫苗
1.遗传密码子优化。根据人类遗传密码子偏爱性表中的遗传密码子使用频率，选择最偏爱遗传密码子，根据SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白的氨基酸序列(参照Genebank公布的SARS-CoV香港株HKU-39849分离株氨基酸序列)，及其反向翻译回核苷酸序列。
2.基因序列修饰和调整。小的调整和修饰，利用遗传密码子简并性消除多余的限制酶识别位点，消除潜在的核酸二级结构等不利于基因合成的序列。
3.人工合成目的基因。采用重叠PCR的方法合成基因。首先把核壳蛋白和突起蛋白基因序列正链和负链分别列出，然后根据基因长度把正链和负链序列分割成长度为50bp的寡核苷酸(两条链最5’端的一条长度为25bp左右)，除两端的序列外，每条正链和负链序列都与两条互补链的寡核苷酸有25bp左右的互补。每10条左右的寡核苷酸都与同样数目的互补寡核苷酸混合成一个退火体系，在PCR管中先升温再慢慢退火。以退火产物为模板，以配对的上下游引物进行PCR扩增，得到500bp左右的基因片段。多个重叠的片段先混合，然后升温、退火，以退火体系为模板，以两端引物进行PCR扩增，可以得到更长的基因片段。超过1Kb以上的片段通过预先设定的酶切位点进行PCR拼接可得到全长的基因序列。
4.将合成的编码SARS-CoV的核壳蛋白(N)和突起蛋白(S)的目的基因连接到pSK通用测序载体，测序结果符合预期设计(经密码子优化的SARS-CoV的N和S目的基因序列分别示于SEQ ID NO1和SEQ IDNO2)。得到质粒pSK-S，于2005年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是CGMCC No.1457。质粒pSK-N，于2005年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是CGMCC No.1459。
然后SmaI+SalI双酶切质粒pSK-S和pSK-N，将得到的编码SARS-CoV的核壳蛋白(NC)和突起蛋白(S)的多核苷酸连接到SmaI+SalI双酶切处理的DNA疫苗载体pDRVISV1.0(中国专利申请200410028280.3)中，得到SARS-CoV的DNA疫苗pDRVISV1.0-S和pDRVISV1.0-N(图13)。
实施例3目的基因表达元件及痘苗病毒转移载体的构建1.PCR扩增融合启动子P E/L+P7.5序列设计引物P7.5引物15’-GAAGATCTGTCGACTTCGAGCTTATTT-3’(SEQ ID NO3)；PE/L引物25’-GAGAATTCGTTTAAACCGATGC-3’(SEQ ID NO4)pE/L+p7.5 PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，反应体系如下质粒pSC65(质粒pSC65的保藏号是CGMCC No.1097。)1μl，正、反向引物(P 7.5引物1、PE/L引物2)各1μl，10×Pyrobest缓冲液5μl，dNTP混合物(各2.5mM)5μl，Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml)0.5μl，ddH2O37.5μl。PCR反应条件94℃预变性2 min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃7min；4℃。
pE/L+p7.5PCR扩增反应延伸产物用Omega公司的E.Z.N.ACycle-Pure Kit进行纯化回收。
2.PCR扩增SARS-CoV的核壳蛋白(NC)编码序列设计引物NC引物15’-CATCGGTTTAAACGAATTCTCACCATGAGCGATAATGGCCC-3’(SEQID NO5)；NC引物25’CCGGATCCTTATCAGGCCTGTGTAGAATC-3’(SEQ ID NO6)SARS-CoV的NC基因PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，反应体系如下质粒pSK-N(质粒pSK-N的保藏号是CGMCC No.1459)1μl，正、反向引物(NC引物1、NC引物2)各1μl，10×Pyrobest缓冲液5μl，dNTP混合物(各2.5mM)5μl，Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml)0.5μl，ddH2O 37.5μl。
PCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃ 7min；4℃。
NC PCR扩增反应延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收(核壳蛋白编码序列见SEQ ID NO1)。
3.PCR融合扩增启动子PE/L+P7.5和SARS-CoV的核壳蛋白编码序列反应体系如下pE/L+p7.5 PCR反应回收模板5μl，SARS-CoV的核壳蛋白编码基因PCR反应回收模板5μl，正、反向引物(P 7.5引物1、NC引物2)各1μl，10×Pyrobest缓冲液5μl，dNTP混合物(各2.5mM)5μl，PyrobestDNA聚合酶(5U/ml)0.5μl，ddH2O 37.5μl。
PCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 30s，共30个循环；72℃7min；4℃。
P E/L+P7.5和SARS-CoV的核壳蛋白编码序列融合PCR扩增产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，结果见图4。产物连接Promega公司的T-easy通用载体得到T-NC质粒，测序结果正确。用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图5。
4.SARS-CoV的S、NC基因表达元件的获得采用SalI和SacI双酶切连接人工合成SARS-CoV的突起蛋白编码序列(SEQ ID NO2)的pSK-S(质粒pSK-S的保藏号是CGMCC No.1457)载体，将酶切得到的SARS-CoV的突起蛋白编码序列连接到SalI和SacI双酶切处理的T-NC质粒中，获得带有SARS-CoV的S、NC基因表达元件的质粒T-NC+P+S(构建过程见图2)。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图6。
5.SARS-CoV的S、NC基因痘苗病毒转移载体质粒pVTT-NS的构建将携带目的基因表达元件的质粒T-NC+P+S用SpeI酶切补平以及SacII酶切。采用Omega公司的胶回收试剂盒回收SARS-CoV的S、NC基因表达元件的酶切片段，然后连接到SmaI和SacII双酶切处理的痘苗病毒通用转移载体pVTT 1.0中，得到携带SARS-CoV的S、NC基因表达元件的痘苗病毒转移载体质粒pVTT-NS(构建过程见图2)。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图9。
实施例4含有编码SARS-CoV的核壳蛋白和突起蛋白的核苷酸序列的天坛株重组痘苗病毒疫苗rVTT-NS的构建和筛选痘苗病毒天坛株以0.1～0.01pfu/细胞病毒量感染80％成片鸡胚细胞CEF，细胞吸附1～1.5h后，采用脂质体转染技术(INVITROGEN公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒pVTT-NS转染CEF细胞中，使SARS-CoV的S、NC基因表达元件与neo基因和lacZ基因双重筛选标记同源重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区序列中。前三轮重组痘苗病毒挑选是在400ug/ml G 418加压筛选后，用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，这样就可以挑取既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒(未发生重组的野毒株因G418的存在而被抑制生长)。接着在无抗生素G418压力选择下，蓝色重组痘苗病毒自身会因为转移质粒的SARS-CoV的S、NC基因表达元件上游一小段约200bp的lacZ’片段与完整的lacZ基因发生分子内的同源重组，从而丢失neo基因和lacZ基因而得到了只含SARS-CoV的S、NC基因表达元件的重组痘苗病毒，用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，就能挑取只含目的基因的白色重组病毒。初筛得到的白斑病毒再经过五轮单斑纯化，可得到单一克隆的含有SARS-CoV的S、NC基因表达元件的重组痘苗病毒的疫苗rVTT-NS。
实施例5PCR、Western blot检测rVTT-NS传代稳定性rVTT-NS往下传代后随机挑取9个第六代白病毒，提取病毒DNA模板(杭州维特洁生物技术公司提取病毒基因组试剂盒)，分别以NC引物1，NC引物2扩增NC目的基因(引物序列和方法参照实施例3)；以S引物15’-CTCTACGTAGCGGCCGCTAACCATGTTTATCTTTCTGCTG-3’(SEQID NO7)；和S引物25’-TCCCCCGGGTTATCAGGTGTAG-3’(SEQ ID NO8)为引物扩增S目的基因，反应体系如下rVTT-NS DNA 5μl；正、反向引物(S引物1、S引物2)各1μl；10×Pyrobest缓冲液5μl；dNTP混合物(各2.5mM)5μl；LA DNA聚合酶(5U/ml)0.5μl；ddH2O 32.5μl。
PCR反应条件94℃预变性2min；94℃30s，58℃30s，72℃3min，共30个循环；72℃7min；4℃。
琼脂糖凝胶电泳显示，随机挑取的病毒基因组中都扩增出阳性目的条带，NC基因为1.2kb；S基因为3.6kb。如图6和7所示。
第五代rVTT-NS感染CEF细胞，48小时后收获细胞和上清，以人多抗血清(首都儿科研究所提供)进行Westerrn Blot分析，出现了特异的阳性反应条带，NC蛋白为4.4KDa；S蛋白为120KDa，说明所构建的rVTT-NS疫苗可以稳定的表达目的基因，如图10所示。
实施例6使用含有SARS-CoV的NC和S编码序列的DNA疫苗和天坛痘苗病毒疫苗rVTT-NS的Prime-Boost免疫实验1.含有SARS-CoV的NC和S编码序列的DNA疫苗和天坛痘苗病毒疫苗rVTT-NS的Prime-Boost免疫接种策略。
本实施例中使用6-8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠(体重19-25克，购自中国药品生物制品检定所)检测本发明疫苗的效力。将实施例2的含有SARS-CoV的NC和S目的基因的DNA疫苗用1×PBS制备成1mg/ml的注射液。重组痘苗病毒rVTT-NS1×108pfu/mL。免疫4组，每组6只小鼠。各免疫组接种策略见表1。DNA疫苗胫骨前肌注射100ug/鼠/次(每后肢50ug)。rVTT-NS重组痘苗病毒剂量为107pfu/鼠/次。第10周进行免疫检测。对照使用pCDNA空载体、不插入目的基因的痘苗病毒天坛株。
表1.针对SARS-CoV的DNA疫苗和天坛痘苗病毒疫苗rVTT-NS的Prime-Boost免疫接种方案

2.ELISPOT检测体外抗原表位肽刺激后分泌IFN-γ的T淋巴细胞反应。
检测IFN-γ的ELISPOT实验采用荷兰U-CyTech公司的试剂盒，具体规程参照U-CyTech公司的使用说明书。刺激多肽为S蛋白的16条肽(S1，VFNATKFPSVYAWERKKI；S2，SVYAWERKKISNCVADY；S3，STFFSTFKCYGVSATKL；S4，KCYGVSATKLNDLCFSNV；S5，NIDATSTGNYNYKYRYLR；S6，NYNYKYRYLRHGKLRPF；S7，RASANLAATKMSECVL；S8，AATKMSECVLGOSKRVDF；S9，LMSFPQAAPHGVVFLHV；S10，APHGVVFLHVTYVPSQER)和NC蛋白的1条肽(N1，QIGYYRRATRRVRGGDGK)。结果显示单针或双针SARS-CoV(NC和S基因)DNA疫苗初始免疫，然后以本发明的针对SARS-CoV的痘苗病毒疫苗加强免疫小鼠，能够诱导肌体产生高水平T淋巴细胞免疫反应，具体结果见图11。
3.检测免疫的小鼠血清中的特异性抗SARS-CoV核壳蛋白和突起蛋白的IgG结合抗体为检测SARS-CoV重组痘苗病毒单独免疫和加强免疫所诱导的特异性体液免疫水平，在第10周取小鼠血清，用SARS-CoV核壳蛋白和突起蛋白抗原(美国国立卫生研究院疫苗研究中心惠赠)包被酶标板，间接ELISA法检测SARS-CoV核壳蛋白和突起蛋白特异性IgG抗体的水平。各免疫组SARS-CoV核壳蛋白和突起蛋白特异性IgG抗体滴度列于图12。
4.免疫的小鼠的血清中SARS-CoV中和抗体滴度。
应用空斑减少中和试验对免疫小鼠血清进行中和抗体测定以评价其免疫效果。采用Vero-E6细胞接种2孔塑料细胞培养板，加两层含琼脂糖培养基。以中性红为染色剂建立空斑试验。以能减少50％的空斑为标准测定抗SARS-CoV BJ01株中和抗体。各组检测结果见表2。
表2实验组动物血清体外中和SARS-CoV抗体的滴度

以上实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域人员可以对本发明作出多种改动和变化，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
序列表<110>中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心<120>基于复制型痘苗病毒载体的SARS疫苗<130>I200501573CB<160>9<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1293<212>DNA<213>SARS-CoV N gene<400>1gccaccatga gcgataatgg cccccagagc aaccagagaa gcgcccccag aatcacattt 60ggcggcccta ccgacagcac cgacaacaat cagaacggcg gcagaaatgg cgccagaccc120aagcagagga gacctcaggg cctgcccaat aataccgcca gctggttcac agccctgaca180cagcacggaa aggaggagct gagattccct agaggccagg gcgtgcccat caataccaac240agcggccctg acgatcagat cggctactac cggagggcca ccagaagagt gagaggcggc300gacggcaaga tgaaggagct gagcccccgg tggtactttt actacctggg caccggacct360gaagccagcc tgccttacgg cgccaataag gagggcattg tgtgggtggc cacagagggc420gccctgaaca cccctaagga ccacatcggc accaggaacc ccaacaacaa tgccgccacc480gtgctgcagc tgcctcaggg aaccacactg cccaagggct tttacgccga gggcagcaga540ggaggatctc aggccagcag caggagcagc agcagaagca ggggcaacag cagaaatagc600acccccggca gcagcagagg aaatagcccc gccagaatgg cctctggcgg aggagagaca660gccctggccc tgctgctgct ggacagactg aatcagctgg agagcaaggt gagcggaaag720ggacagcagc agcagggaca gaccgtgaca aagaagtctg ccgccgaggc ctctaagaag780
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权利要求
1.一种基于复制型痘苗病毒的针对SARS-CoV的疫苗，其包含复制型痘苗病毒作为载体，其中所述痘苗病毒基因组的胸苷激酶(TK)区插入了编码SARS-CoV核壳蛋白和突起蛋白的多核苷酸。
2.权利要求1的疫苗，其中所述复制型痘苗病毒是痘苗病毒天坛株。
3.权利要求1或2的疫苗，其中所述疫苗不含有选择标记基因。
4.权利要求1-3中任一项的疫苗，其中所述多核苷酸经密码子优化改造，适合在哺乳动物细胞中高效率表达。
5.权利要求4的疫苗，其中所述编码SARS-CoV核壳蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列和/或所述编码SARS-CoV突起蛋白的多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
6.权利要求1-5中任一项的疫苗，其还包含药用可接受的佐剂和/或载体。
7.一种针对SARS-CoV的DNA疫苗，其包含一种载体，所述载体包含可操纵地连接于启动子的编码SARS-CoV核壳蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
8.一种针对SARS-CoV的DNA疫苗，其包含一种载体，所述载体包含可操纵地连接于启动子的编码SARS-CoV突起蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
9.一种针对SARS-CoV的免疫接种方法，其包括给个体施用免疫有效量的权利要求1-6中任一项的疫苗。
10.权利要求9的免疫接种方法，其还包括在施用所述疫苗之前给个体施用一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗。
11.权利要求10的免疫接种方法，其中所述一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗是权利要求7和/或权利要求8的DNA疫苗。
12.一种免疫接种试剂盒，其包括一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗，还包括权利要求1-6中任一项的疫苗，以及任选地包括指示用所述一或多种针对SARS-CoV的DNA疫苗进行初次免疫，然后用权利要求1-6中任一项的疫苗进行加强免疫的接种程序说明书。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述针对SARS-CoV的DNA疫苗是权利要求7和/或8的DNA疫苗。
14.一种痘苗病毒的通用转移质粒pVTT 1.0，其保藏号为1458。
全文摘要
本发明涉及表达SARS－CoV核壳蛋白和突起蛋白的重组SARS疫苗及其用途，所述SARS疫苗基于复制型痘苗病毒如痘苗病毒天坛株而构建。本发明提供了用于构建所述SARS疫苗的载体。本发明也提供了编码SARS核壳蛋白和突起蛋白的DNA疫苗。本发明还涉及使用所述DNA疫苗和所述SARS疫苗的免疫接种方案。
文档编号C12N15/63GK101020055SQ20061000756
公开日2007年8月22日 申请日期2006年2月16日 优先权日2006年2月16日
发明者邵一鸣, 刘颖, 刘勇, 孙萌, 刘建元, 王宁 申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心