专利名称：利用基因工程技术获得显性低芥酸油菜品种的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种利用RNAi方法构建载体转化油菜获得显性低芥酸性状的方法；其应用基于该方法产生显性低芥酸品种并保持品种种子的低芥酸特性不因窜粉杂交而改变。
背景技术：
油菜是我国主要油料作物之一。我国国民消费的植物油脂有三分之一来自油菜籽。菜籽油的品质好坏直接关系到我国国民的身体健康。
芥酸是十字花科植物种子中特有的脂肪酸(二十二碳一烯酸)，是菜籽油中的抗营养成分。降低菜籽油中芥酸含量是油菜育种的主要目标。经过近二十年的努力，我国已经培育出一大批低芥酸品种并在生产中推广种植。但芥酸含量超标问题依然非常突出，长江中下游芥酸普查结果表明我国油菜产区平均芥酸含量为16％，远远超过1％的国际低芥酸标准。
低芥酸油菜品种在推广过程中芥酸含量上升，甚至丧失低芥酸特性，主要原因是目前的低芥酸油菜品种的低芥酸特性属于隐性性状，低芥酸油菜品种在开花时一旦有高芥酸花粉授粉，种子的芥酸含量立即升高。我国农村采取一家一户的经营模式，插花种植、混种、混收现象严重，很容易造成有“双低(低芥酸、低硫代葡萄糖苷)”油菜的生产，而没有“双低”油菜产品达标的局面。传统育种无法解决这一问题。
芥酸(C221)的生物合成由细胞内微体膜上的油酰延长酶复合体催化。油酰延长酶复合体由四种酶3-酮酰基辅酶A合成酶(简称KCS)，3-酮酰基辅酶A还原酶，3-OH酰基辅酶A脱水酶，反式2，3-烯酰-辅酶A还原酶组成；分别催化4个连续反应缩合，还原，脱水，烯酰-辅酶A还原。作为反应的第一步，KCS是碳链延长的关键性限速酶。脂肪酸延长酶基因Fae1(脂肪酸延长酶1)负责编码KCS酶，阻断Fae1的表达即可打断芥酸合成，获得低芥酸特性。
种子发育过程中KCS酶的免疫学检测发现，Fae1基因编码一种57kDa的蛋白质，这种蛋白质只存在于高芥酸品种中。将提取的Fae1基因导入低芥酸油菜使低芥酸油菜恢复了芥酸合成，证明低芥酸突变体是由于KCS酶的结构基因或调节基因发生突变产生的。将来自拟南芥的Fae1基因导入烟草和酵母均获得长链脂肪酸表达，Fae1基因在拟南芥中过量表达使芥酸含量明显升高，证明Fae1基因是控制脂肪酸延长的关键基因。在拟南芥和油菜中，已证实Fae1基因是一种受特异启动子调控的种子特异性表达的基因，该基因的突变不会影响植株的营养体和花器组织中的脂肪酸构成。
1998年2月，美国麻省大学医学院的Mello等发现线虫的双链RNA(dsRNA)能够特异性地高效阻断目的基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰(简称RNAi)。随后，RNAi现象在从微生物到人类的各种生物种群中发现，证明是一种普遍存在的遗传机制。
双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面在RNA酶作用下使mRNA裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。与反义RNA技术相比，siRNA具有更高的抑制效力，抑制效果可达100％，阳性率可达80-100％。与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，RNAi技术具有明显的优点，它比反义RNA技术和同源共抑制技术更有效，更容易诱导功能丧失或功能降低。通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合，可以在发育的不同时期或不同器官有选择地抑制基因表达，可以非常有效地用于植物脂肪酸基因工程目的。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的上述缺点和不足，提供一种利用基因工程技术获得显性低芥酸油菜品种的方法及其应用；利用该方法获得的低芥酸油菜品种低芥酸特性不会因为外来高芥酸花粉的窜粉杂交而改变，而且，该品种作为杂交亲本与任何品系杂交都是低芥酸，使得选育高产组合的可能性大大增加。
本发明的目的是这样实现的1、利用基因工程技术获得显性低芥酸油菜品种的方法包括下列步骤(1)以油菜为材料，克隆其Fae1基因；(2)构建以Fae1基因为靶序列的RNAi载体(如图1)；(3)转化高芥酸或低芥酸油菜品种；(4)筛选转化株(如图2)；(5)检测转化株种子中脂肪酸的组成(如图3)；(6)转化株与非转基因植株杂交，检测子代种子脂肪酸的组成。
2、本方法的应用包括下列步骤(1)以油菜为材料，克隆其Fae1基因，构建以Fae1基因为靶序列的RNAi载体；(2)利用以Fae1基因为靶序列的RNAi载体转化高芥酸油菜获得低芥酸性状；(3)利用以Fae1基因为靶序列的RNAi载体转化低芥酸油菜获得低芥酸性状稳定的转基因品种；(4)以低芥酸油菜材料为亲本进行杂交育种。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下(1)本发明可以转化高芥酸油菜获得低芥酸性状；(2)本发明获得的转基因品种作亲本可以与任何亲本(包括高芥酸亲本)杂交获得低芥酸杂种；(3)本发明获得的转基因品种在外来花粉窜粉时不影响低芥酸特性。
图1-FAE1基因RNAi载体图，其中
Promoter为植物启动子；fae1为需要抑制的目标片段；Spacer为间隔序列；Terminater为终止子。
图2-转化株PCR结果检测图，其中1-15样为转基因植株；0为对照野生植株；M为分子量Marker。
结果显示全部转基因植株都成功导入了RNAi构建体。
图3-转化株种子气相色谱图；结果显示转化株种子脂肪酸中，无芥酸检测出。
具体实施方案本发明拟采取RNAi策略和农杆菌介导的转基因方法实现预期目标。具体方法如下1、Fae1基因序列克隆(1)根据已经在基因库发表的Fae1基因序列，在比对十字花科植物品种Fae1基因序列的基础上(BLASTN，CLUSTALX)，利用计算机软件PRIMER3进行引物设计。
(2)油菜基因组DNA的提取取0.5g幼嫩叶片，加2ml提取缓冲液研磨后静置30分钟，离心(10000rpm/min)取上清液加入600μl氯仿和异戊醇混合液(24∶1)，离心取上清液加入500μl异丙醇，使DNA沉淀，离心弃去上清，70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥后加入100μlTE缓冲液(含RnaseA酶)溶解。
(3)聚合酶链式反应(PCR)根据Taq聚合酶说明书从油菜基因组DNA中扩增出Fae1基因的同源序列，启动子，终止子，内含子。PCR反应体系为1μl植物DNA、2μl 10 x PCR buffer、1.5μl MgCl2、1.3μl dNTP(各2mM)、0.5μl F引物(10mM)、0.5μl R引物(10mM)、0.2μl Tap酶(5U/μl)，加灭菌双蒸水至20μl；用PE9700型扩增仪进行扩增，反应条件为94℃预变性4min一个循环；94℃30s，52℃30s，72℃ 1min30s，共30个循环。
(4)Fae1基因同源序列回收与纯化将上述PCR产物凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒QiAquick Gel Extractionkit对电泳产物进行回收纯化，即为Fae1基因同源序列的DNA。
2、测序(1)将Fae1基因的同源序列连接到测序载体将凝胶回收的DNA与克隆载体连接，连接反应体系为1.5μl 10x Fast-LinkLigation buffer、0.75μl 10mM ATP、1μl PGEM-T Vector、9μl回收纯化DNA、1μl Fast-Link DNA ligase、加灭菌双蒸水至15μl，16℃连接1h。
(2)转化大肠杆菌获得重组克隆制备E.coli DH10B电转化感受态细胞。将上述连接产物1μl与感受态细胞50μl在电激仪上进行电转化。加1ml SOC。取100μl电转化产物涂布于含Amp和Lac Z筛选的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。挑选培养基上白色菌落，进行细菌PCR筛选阳性重组克隆，对所选择到的克隆进行扩大培养，用质粒抽提试剂盒对单克隆培养物抽提质粒。
(3)Fae1基因的同源序列测序用SphI、PstI双酶切质粒，鉴定质粒有无嵌合现象，而后进行测序。
3、转化载体构建(1)利用计算机软件blastN与clustalX等对测序产生的序列进行比对分析，找出芥酸含量的高低与序列的关系，产生一套基于PCR反应的芥酸含量预测的分子标记；根据RNAi设计原则，确定一组500-1500bp DNA片段用于构建RNAi重组载体；(2)将上述同源片段按反向重复与启动子、内含子、终止子等相关必要组件相连接。该构件的转录物将形成以Fae1为靶标的双链RNA(如图1)。
4、转化与组织再生以油菜为受体，利用农杆菌介导法和基因枪法等方法进行遗传转化。
5、筛选转化子在选择培养基上筛选转化子。待生长至一定大小后取叶片，以上文所提供方法提取基因组DNA，根据转基因作物检测标准进行PCR筛选验证(如图2)。
6、转化子功能验证转化株种子脂肪酸组成、含量用气相色谱法进行(如图3)。
筛选芥酸含量为0的转化株，自交或者与高芥酸品种杂交。种植，检测子代种子脂肪酸组成。
7、应用方法(1)根据本发明的方法构建以Fae1基因为靶序列的RNAi载体。
(2)利用本发明转化高芥酸油菜获得低芥酸性状。
(3)利用本发明获得的转基因品种作亲本可以与任何亲本(包括高芥酸亲本)杂交获得低芥酸杂种。
(4)利用本发明获得的转基因品种外来花粉窜粉不影响芥酸含量。
权利要求
1.利用基因工程技术获得显性低芥酸油菜品种的方法，其特征在于包括下列步骤(1)以油菜为材料，克隆其Fael基因；(2)构建以Fael基因为靶序列的RNAi载体；(3)转化高芥酸或低芥酸油菜；(4)筛选转化株；(5)检测转化株种子中脂肪酸的组成；(6)转化株与非转基因植株杂交，检测子代种子脂肪酸的组成。
2.利用基因工程技术获得显性低芥酸油菜品种的方法的应用，其特征在于包括下列步骤(1)以油菜为材料，克隆其Fael基因，构建以Fael基因为靶序列的RNAi载体；(2)利用以Fael基因为靶序列的RNAi载体转化高芥酸油菜获得低芥酸性状；(3)利用以Fael基因为靶序列的RNAi载体转化低芥酸油菜获得低芥酸性状稳定的转基因品种；(4)以低芥酸油菜材料为亲本进行杂交育种。
全文摘要
本发明公开了一种利用基因工程技术获得显性低芥酸油菜品种的方法及其应用，涉及生物工程技术领域。本方法包括下列步骤(1)以油菜为材料，克隆其Fae1基因；(2)构建以Fae1基因为靶序列的RNAi载体；(3)转化高芥酸或低芥酸油菜；(4)筛选转化株；(5)检测转化株种子中脂肪酸的组成；(6)转化株与非转基因植株杂交，检测子代种子脂肪酸的组成。本发明可以转化高芥酸油菜获得低芥酸性状；获得的转基因品种作亲本可以与任何亲本杂交获得低芥酸杂种；获得的转基因品种在外来花粉窜粉时不影响低芥酸特性。
文档编号C12N15/29GK1888064SQ20061001969
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月25日 优先权日2006年7月25日
发明者卢长明, 肖玲, 武玉花, 吴刚 申请人:卢长明