专利名称：甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及甘蓝型油菜新型低芥酸基因的核酸序列、蛋白产物及其应用。
背景技术：
芥酸是芸薹属植物特有的脂肪酸(二十二碳一烯酸)，是当前国内外油菜品质育种的关键指标。芥酸含量极低的菜籽油是营养价值高的菜籽油；但芥酸含量极高的菜籽油有多种工业用途。目前世界各国的油菜育种都从这两个方面开展工作。
低芥酸育种始于二十世纪60年代初加拿大科学家的一个重要发现和开创性育种工作。他们从德国饲料用油菜品种LIHO中发现低芥酸单株，并培育成为世界上第一个无芥酸的春油菜品种ORO。60年代后，ORO品种先后引种到世界各国，引发了世界范围的低芥酸油菜育种，大大推动了油菜籽品质改良。迄今为止，国内外还没有第二个发现油菜低芥酸基因源的报道。
由于低芥酸基因来源单一，来自品种LIHO的低芥酸基因一直是我国低芥酸油菜育种的唯一基因源。我国油菜育种长期无法摆脱近亲繁殖带来的不良后果，产量与品质的矛盾以及优质与抗病性的矛盾日显突出。低芥酸基因源的单一化已经成为制约我国油菜产业可持续发展的一个重要因素。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的上述问题和不足，以我国低芥酸甘蓝型油菜品种中双9号为材料，提供一种甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸序列及其应用。
本发明的目的是这样实现的从我国的甘蓝型双低油菜中双9号中分离出两种FAE1基因一种在C基因组与来自LIHO的低芥酸品种基因序列特征不同，可能来自我国高芥酸品种的移码突变，我们将其命名为甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸；另一种在A基因组，同时具备LIHO品种的FAE1序列特征和与C基因组相同的移码突变。
上述两种FAE1基因是在世界上首次发现的不同以往报道的新基因，并开展了基于该基因的基因起源、分子标记以及基因功能的研究。
中双9号品种的FAE1基因显然是与LIHO来源不同的基因，也是在我国油菜品种中首次发现的不同于国外油菜低芥酸基因的基因源。
甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸的发现将为我国油菜育种走出困境提供重要的物质基础。该基因的发现在理论上说明油菜芥酸形成存在一种新的机制，从实践上可能对改良油菜的品质和提高产量发挥重要作用。
本发明以我国低芥酸甘蓝型油菜品种中双9号为材料，利用引物FAE1F5’ATGACGTCCATTAACGTAAAGCTCCTT 3’；FAE 1R5’TTAGGACCGACCGTTTTGGACA 3’以PCR技术(聚合酶链式反应)扩增获得C基因组新型低芥酸基因序列SEQ NO.1；该基因翻译获得蛋白，其氨基酸序列SEQ NO.2。
甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型的特征是(1)与以往报道的FAE1基因相比，T1366至G1369间存在4个碱基缺失；(2)其氨基酸序列第282位氨基酸残基为丝氨酸，不同于以往报道低芥酸基因中的苯丙氨酸；(3)由于基因序列碱基缺失导致翻译提前终止，其蛋白由466个氨基酸残基组成，分子量为52kDalton，小于以往报道中的506个氨基酸残基和56kDalton的分子量。
上述甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸的应用研究利用PCR技术，从不同品种甘蓝型油菜中扩增FAE1基因序列，并与本发明中的新型低芥酸基因序列进行比对，分析新型低芥酸基因的起源和传播，推断现有油菜品种的亲缘关系；根据本发明发现的序列特征，设计分子标记，检测新型低芥酸基因的存在；表达本发明中的新型低芥酸基因，获得抗体等，检测新型低芥酸基因的活性以及其在甘蓝型油菜中的存在与表达。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下1、本发明是在我国油菜品种中首次发现的不同于国外油菜低芥酸基因的基因源。
2、本发明发现我国油菜品种中存在的甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型是由于四个碱基缺失引起的缺失突变导致，不同于国外报道的单碱基突变。
3、利用本发明发现的序列特征，分析现有甘蓝型油菜品种的起源关系，并继而摆脱近亲繁殖带来的不良后果，对改良油菜的品质和提高产量发挥重要作用。
本发明适用于基因起源分析、基于该基因的分子标记和基因功能研究；适用于低芥酸油菜的育种和转基因研究等方面。
图1-与不同来源脂肪酸延长酶基因核苷酸的序列比较图；图2-与不同来源脂肪酸延长酶基因氨基酸的序列比较图；图3-酵母表达不同来源脂肪酸延长酶蛋白电泳图；图4-表达不同来源脂肪酸延长酶酵母脂肪酸气相色谱图。
具体实施例方式
1、甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸的PCR扩增取0.5g幼嫩叶片，加2ml提取缓冲液研磨后静置30min；10000g离心10min，取上清；加入600μl氯仿，混合均匀；离心取上清，加入500μl异丙醇；10000g离心10min，沉淀DNA；去尽上清，以70％乙醇洗涤沉淀；离心去尽上清，真空干燥；加入100μl含RNase的TE缓冲液溶解DNA备用。
根据已知FAE1基因序列，在其两侧设计能够扩增其全长的PCR引物。其序列如下FAE1F5’ATGACGTCCATTAACGTAAAGCTCCTT 3’和FAE1R5’TTAGGACCGACCGTT TTGGACA 3’。
以抽提出的油菜基因组DNA为模板，利用设计的FAE1F和FAE1R引物，在Biometra TGradient型PCR仪上进行基因扩增。并以1％琼脂糖，在1X TAE缓冲液中电泳分离PCR产物，以EB染色后于紫外线下观察结果。PCR反应体系为1μl基因组DNA模板；5μl 10×KOD Plus Buffer；2μl 25mM MgSO4；5μl 2mMdNTPs；1μl 25μM Forward Primer；1μl 25μM Reverse Primer；1μl 1μ/μlKOD Plus(Toyobo)or 1μl 1μ/μl Taq(Fermentas)；H2O add to 50μl。反应条件为94℃2min；94℃30sec，64℃30sec(-0.5℃per cycle)，68℃Nmin(1min/kb)，8cycles；94℃ 30sec，60℃30sec，68℃ Nmin(1min/kb)，25cycles；68℃ 2min。
以QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit纯化PCR产物。
将PCR产物与EcoRV酶切的pZero++Amp(GenBank Accession No.AY569776)载体连接。连接体系DNA mixture 22μl；2.5μl 10×T4DNA Ligase Bufferwith 1mM ATP；0.5μl T4DNA Ligase(NEB)。22℃连接至少1hr。
根据《分子克隆实验指南》提供的方法制备大肠杆菌TOP10(Invitrogen)感受态细胞，并以连接产物转化。挑取单克隆，以突变位点特异引物进行菌落PCR检测重组子。将筛选出的克隆扩大培养，小量制备质粒，酶切验证。
将筛选出的克隆送测序公司测序。
2、验证方法(1)利用酵母表达系统表达天然脂肪酸延长酶基因、传统脂肪酸延长酶突变型，和甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸；(2)提取酵母蛋白，分析酵母表达天然脂肪酸延长酶基因、传统脂肪酸延长酶突变型，和甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型分子量，甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型分子量相对较小；(3)提取酵母脂肪酸，分别分析表达天然脂肪酸延长酶基因、传统脂肪酸延长酶突变型，和甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸酵母菌株脂肪酸成分，传统脂肪酸延长酶突变型和甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型的表达都不能导致酵母生成芥酸。
3、应用方法1)利用本发明的新型低芥酸基因培育低芥酸油菜品种；2)根据本发明中提供的甘蓝型油菜新型低芥酸基因特征序列，设计分子标记，检测新型低芥酸基因的存在；3)根据本发明提供的新型低芥酸基因的引物和扩增条件克隆该基因；4)体外表达新型低芥酸基因，获得蛋白，并制备抗体检测新型低芥酸基因的存在。
4、与不同来源FAE1比较1)与不同来源FAE1基因核苷酸序列的比较如图1，821a中油821A基因组FAE1基因序列；821c中油821C基因组FAE1基因序列；zs6a中双6号A基因组FAE1基因序列；zs9a中双9号A基因组FAE1基因序列；zs9c中双9号C基因组FAE1基因序列；其他GenBank下载序列。甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型存在于中双9号C基因组，其序列存在4个碱基的缺失突变。
2)与不同来源FAE1基因氨基酸序列的比较如图2，U29142GenBank下载拟南芥FAE1基因序列；821a中油821A基因组FAE1蛋白氨基酸序列；821c中油821C基因组FAE1蛋白氨基酸序列；zs6a中双6号A基因组FAE1蛋白氨基酸序列；zs9a中双9号A基因组FAE1蛋白氨基酸序列；zs9c中双9号C基因组FAE1蛋白氨基酸序列。甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸存在于中双9号C基因组，其序列第282位为Ser，不同于其他低芥酸基因的Phe，同时甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸蛋白序列相对较短。
3)与不同来源重组FAE1蛋白分子量比较如图3，Marker分子量Marker；821a中油821A基因组FAE1蛋白；821c中油821C基因组FAE1蛋白；zs6a中双6号A基因组FAE1蛋白；zs9a中双9号A基因组FAE1蛋白；zs9c中双9号C基因组FAE1蛋白；pYES2空载体对照。相对于其他基因表达的蛋白，甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸具有较小的分子量。
4)与不同来源重组FAE1蛋白活性比较如图4，821a表达中油821A基因组FAE1蛋白的酵母脂肪酸气相色谱；821c表达中油821C基因组FAE1蛋白的酵母脂肪酸气相色谱；zs6a表达中双6号A基因组FAE1蛋白的酵母脂肪酸气相色谱；zs9a表达中双9号A基因组FAE1蛋白的酵母脂肪酸气相色谱；zs9c表达中双9号C基因组FAE1蛋白的酵母脂肪酸气相色谱；pYES2表达空载体对照的酵母脂肪酸气相色谱。甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸与其他低芥酸基因相同，不具有合成芥酸的能力。
序列表<110>卢长明<120>甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸序列及其应用<160>2<210>1<211>1517<212>DNA<213>油菜(Brassica napus cv.Zhongshuang No.9)<400>
atgacgtcca ttaacgtaaa gctcctttac cattacgtca taaccaacct tttcaacctt 60tgtttctttc cattaacggc gatcgtcgcc ggaaaagcct atcggcttac catagacgat 120cttcaccact tatactattc ctatctccaa cacaacctca taaccattgc tccactcttt 180gccttcaccg ttttcggttc ggttctctac atcgcaaccc ggcccaaacc ggtttacctc 240gttgagtact catgctacct tccaccaacg cattgtagat caagtatctc caaggtcatg 300gatatctttt accaagtaag aaaagctgat ccttctcgga acggcacgtg cgatgactcg 360tcctggcttg acttcttgag gaagattcaa gaacgttcag gtctaggcga tgaaacccac 420gggcccgagg ggctgcttca ggtccctccc cggaagactt ttgcggcggc gcgtgaagag 480acggagcaag ttatcattgg tgcgctagaa aatctattca agaataccaa tgttaatcct 540aaagatatag gtatacttgt ggtgaactca agcatgttta atccaactcc ttcgctctcc 600gcgatggtcg ttaacacttt caagctccga agcaacgtaa gaagctttaa ccttggtggc 660atgggttgta gtgccggcgt tatagccatt gatctagcaa aggacttgtt gcatgtccat 720aaaaatacgt atgctcttgt ggtgagcaca gagaacatca cttataacat ttacgctggt 780gataataggt ccatgatggt ttcaaattgc ttgttccgtg ttggtggggc cgctattttg 840ctctccaaca agcctagaga tcgtagacgg tccaagtacg agctagttca cacggttcga 900
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Met Thr Ser Ile Asn Val Lys Leu Leu Tyr His Tyr Val Ile Thr Asn 16Leu Phe Asn Leu Cys Phe Phe Pro Leu Thr Ala Ile Val Ala Gly Lys 32Ala Tyr Arg Leu Thr Ile Asp Asp Leu His His Leu Tyr Tyr Ser Tyr 48Leu Gln His Asn Leu Ile Thr Ile Ala Pro Leu Phe Ala Phe Thr Val 64Phe Gly Ser Val Leu Tyr Ile Ala Thr Arg Pro Lys Pro Val Tyr Leu 80Val Glu Tyr Ser Cys Tyr Leu Pro Pro Thr His Cys Arg Ser Ser Ile 96Ser Lys Val Met Asp Ile Phe Tyr Gln Val Arg Lys Ala Asp Pro Ser112Arg Asn Gly Thr Cys Asp Asp Ser Ser Trp Leu Asp Phe Leu Arg Lys128Ile Gln Glu Arg Ser Gly Leu Gly Asp Glu Thr His Gly Pro Glu Gly144Leu Leu Gln Val Pro Pro Arg Lys Thr Phe Ala Ala Ala Arg Glu Glu160Thr Glu Gln Val Ile Ile Gly Ala Leu Glu Asn Leu Phe Lys Asn Thr176Asn Val Asn Pro Lys Asp Ile Gly Ile Leu Val Val Asn Ser Ser Met192
Phe Asn Pro Thr Pro Ser Leu Ser Ala Met Val Val Asn Thr Phe Lys208Leu Arg Ser Asn Val Arg Ser Phe Asn Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser224Ala Gly Val Ile Ala Ile Asp Leu Ala Lys Asp Leu Leu His Val His240Lys Asn Thr Tyr Ala Leu Val Val Ser Thr Glu Asn Ile Thr Tyr Asn256Ile Tyr Ala Gly Asp Asn Arg Ser Met Met Val Ser Asn Cys Leu Phe272Arg Val Gly Gly Ala Ala Ile Leu Leu Ser Asn Lys Pro Arg Asp Arg288Arg Arg Ser Lys Tyr Glu Leu Val His Thr Val Arg Thr His Thr Gly304Ala Asp Asp Lys Ser Phe Arg Cys Val Gln Gln Gly Asp Asp Glu Asn320Gly Lys Thr Gly Val Ser Leu Ser Lys Asp Ile Thr Asp Val Ala Gly336Arg Thr Val Lys Lys Asn Ile Ala Thr Leu Gly Pro Leu Ile Leu Pro352Leu Ser Glu Lys Leu Leu Phe Phe Val Thr Phe Met Gly Lys Lys Leu368Phe Lys Asp Lys Ile Lys His Tyr Tyr Val Pro Asp Phe Lys Leu Ala384Ile Asp His Phe Cys Ile His Ala Gly Gly Lys Ala Val Ile Asp Val400Leu Glu Lys Asn Leu Gly Leu Ala Pro Ile Asp Val Glu Ala Ser Arg416Ser Thr Leu His Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser Ile Trp Tyr432Glu Leu Ala Tyr Ile Glu Ala Lys Gly Arg Met Lys Lys Gly Asn Lys448Val Trp Gln Ile Ala Leu Gly Ala Leu Ser Val Thr Val Gln Phe Gly464Trp Leu46权利要求
1.一种甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸，其特征是(1)T1366至G1369间存在4个碱基缺失，SEQ NO.1；(2)其编码蛋白序列由466个氨基酸残基组成，SEQ NO.2；(3)其编码蛋白序列第282位氨基酸残基为丝氨酸，SEQ NO.2。
2.甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸的应用，其特征是(1)以该基因为低芥酸基因源进行杂交育种；(2)以该基因的特征设计分子标记，进行低芥酸分子标记育种；(3)利用该基因构建载体，通过转基因方法培育低芥酸油菜品种；(4)新型低芥酸基因体外表达获得蛋白，并制备抗体检测新型低芥酸基因的存在。
全文摘要
本发明公开了一种甘蓝型油菜脂肪酸延长酶基因缺失突变型核酸序列及其应用，涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及甘蓝型油菜新型低芥酸基因的核酸序列、蛋白产物及其应用。本发明以我国低芥酸甘蓝型油菜品种中双9号为材料，利用引物对FAE1F5’ATGACGTCCATTAA CGTAAAGCTCCTT 3’和FAE1R5’TTAGGACCGACCGTT TTGGACA 3’进行PCR扩增，获得该品种C基因组新型低芥酸基因，序列为SEQ NO.1；该基因翻译获得蛋白，其氨基酸序列为SEQ NO.2。本发明适用于低芥酸油菜的杂交育种、分子标记育种和转基因育种研究。
文档编号C12N15/82GK1888068SQ20061001969
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月25日 优先权日2006年7月25日
发明者卢长明, 武玉花, 吴刚, 肖玲 申请人:卢长明