专利名称：一种靶向壳聚糖基因载体及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种靶向于含有透明质酸受体细胞的非病毒型基因载体。本发明还涉及此非病毒型基因载体的制备方法及用途。
背景技术：
著名遗传学家谈家桢教授曾高瞻远瞩地指出“21世纪的医疗革命将取决于基因治疗研究的成功。”基因治疗，是指将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。它由三个基本要素组成目的基因、基因运送载体及靶细胞。随着更为精确的人类基因组图的完成和各种新基因的发现，目的基因的获得将具备更加坚实的科学基础；而细胞生物学、分子生物学及遗传学的发展及相关细胞分离、培养技术的日趋成熟，为靶细胞的获得提供了强有力的保证；而如何获得高效、无毒、可生物降解的基因运送载体，成为当前基因治疗领域的技术瓶颈。目前应用于基因治疗的载体可分为病毒型基因载体和非病毒型基因载体两大类。病毒型基因载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒等，其优点是转染效率高，应用较早，研究比较深入，但缺点是安全性不高，存在免疫原性和潜在的致癌性，对运载基因的大小有严格限制且价格昂贵；非病毒型基因载体包括裸脱氧核糖酸核(DNA)、阳离子脂质体，阳离子聚合物、复合载体等，其优点是安全性好，基因装载容量大，载体设计方法多样、原料选择范围广、价格低廉，易产业化，但由于研究起步晚，存在着转染效率低、有效表达时间短，结果重现性差等缺点。为增强非病毒型基因载体的转染效率，达到靶向性和精确调控的目的，人们做了大量的研究和改进工作。如利用受体—配体或抗原—抗体介导的靶向基因转移，就是其中一种有代表性的方法。
壳聚糖(chitosan，CS)，是天然甲壳素的脱乙酰产物，为不多见的无生物毒性的碱性多糖，具有优良的生物相容性和生物可降解性，无免疫原性，能与DNA形成聚电解质复合物，保护DNA免遭核酸酶解，成为当今最具潜力、安全而有效的非病毒性基因载体之一。但目前普遍存在的问题是基因转染效率不高，且转染效率具有细胞类型依赖性。如何在利用壳聚糖良好生物相容性的同时，进一步增强载体/基因复合物的稳定性，提高基因转染效率，是制备高性能壳聚糖基因载体的关键。
透明质酸(hyaluronic acid，HA)，是一种广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中，具备独特结构的线性大分子酸性粘多糖。与其它天然粘多糖不同，HA分子内不含硫酸基团，也不与蛋白质共价结合，能以自由链形式在体内游离存在。HA因其高度的粘弹性、优良的生物相容性和可降解性，已被广泛应用于临床医学和药学。比如，用于关节疾病的治疗、眼科手术、预防术后粘连、治疗烫伤以及作为药物载体和助剂等。此外，HA还具备同细胞表面受体CD44和细胞蛋白，如连接蛋白(link protein)，聚集蛋白聚糖(aggrecan)等特异结合的能力。因此，本发明以具有良好生物相容性的透明质酸作为靶向配体，经过适当剪切后通过共价键偶联到壳聚糖分子上，制备新型的靶向壳聚糖基非病毒基因载体。载体与基因复合物通过透明质酸特异性地与细胞表面的透明质酸受体结合，经受体介导的细胞内吞途径进入细胞，有效进行基因转染。壳聚糖和透明质酸都是具有良好相容性和可生物降解的天然高分子，这些特性赋予载体高度安全性，而靶向配体能促进细胞对载体与基因复合物的吸收，进而提高基因的转染效率。另外，研究表明，作为透明质酸受体之一的CD44可被许多肿瘤细胞超量表达，因此，将透明质酸接枝到壳聚糖上，还可使该基因载体靶向于肿瘤细胞，未来应用于癌症的基因治疗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的壳聚糖基因载体转染效率低的缺点，提供一种转染效率高，生物相容性好，性能稳定且廉价的非病毒型基因载体，以及该非病毒型基因载体的制备方法和应用。
本发明的一种用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物，由壳聚糖(CS)和靶向分子透明质酸(HA)组成，其中所述的壳聚糖至少一个游离的氨基官能团被所述的透明质酸接枝，并且所述接枝的壳聚糖含有至少50％未接枝的游离氨基官能团。
其中，所述的壳聚糖分子量为1-500千道尔顿；所述的透明质酸分子量为0.5-100千道尔顿。
本发明的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物的制备方法步骤为步骤1、称取天然透明质酸溶于新配制的pH 6.5磷酸盐缓冲液中，电磁搅拌6-8小时，形成均一透明的水凝胶后，按透明质酸与透明质酸酶质量比10～50∶1加入透明质酸酶，于37℃搅拌反应20～40小时；将反应后的溶液置于沸水中煮5-10分钟，终止反应，将溶液冷却至室温后，用孔径0.45微米滤膜过滤，除去透明质酸酶，所得滤液用截止分子量6000±200透析膜在纯水中透析纯化；产物冷冻干燥后得到所需长度的透明质酸固体粉末；步骤2、称取壳聚糖，加醋酸搅拌至完全溶解，将溶液pH值调到4.5～5.5，用一次性针头式孔径0.22微米的过滤器将溶液过滤后备用；称取步骤1制备的透明质酸固体粉末，溶于浓度为1.0摩尔/升的NaCl溶液中，调溶液pH至4.5～5.5，向溶液中加入碳二亚胺(EDC)，透明质酸与碳二亚胺质量比1∶1.0～3.0，搅拌溶解，用HCl或NaOH溶液调节pH值，使pH稳定在4.5～5.5，然后向其中缓慢加入预先制备好的壳聚糖溶液，在37℃搅拌反应5-7天；调节pH值到9.0使反应终止，将反应产物用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液透析3天，然后用超纯水透析3-4天，除去未反应完全的反应物；将透析纯化后的产物冷冻干燥，得到用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物产品，于干燥器内保存。
本发明的阳离子聚合物用于和核酸或质粒DNA组成复合物，所述的核酸含有编码遗传标记的DNA序列，所述的遗传标记选自荧光蛋白基因。
本发明的阳离子聚合物转染细胞的方法步骤为步骤1、将权利要求1所述的阳离子聚合物用5毫摩尔/升pH5.5醋酸—醋酸钠缓冲溶液溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液，用孔径0.22微米滤膜将溶液过滤后作载体；质粒DNA用4.3毫摩尔/升硫酸钠溶液溶解(浓度经紫外测定)；先将载体和质粒DNA溶液分别预热至55℃，然后按载体与质粒DNA体积比1∶1在涡旋混合仪上混合1分钟，室温静置0.5～1小时，载体和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物颗粒溶液；步骤2、将步骤1所得的纳米复合物颗粒溶液与带有透明质酸受体的细胞接触，靶向分子透明质酸同受体识别并结合，使所说的复合物以受体介导的内吞作用进入细胞，释放出所说复合物的核酸并最终使目的基因有效表达。
本发明的阳离子聚合物转染活体家蚕细胞的方法步骤为步骤1、将权利要求1所述的阳离子聚合物用5毫摩尔/升pH 5.5醋酸—醋酸钠缓冲溶液溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液，用孔径0.22微米滤膜将溶液过滤后作载体；质粒DNA用4.3毫摩尔/升硫酸钠溶液溶解(浓度经紫外测定)；先将载体和质粒DNA溶液分别预热至55℃，然后按载体与质粒DNA体积比1∶1在涡旋混合仪上混合1分钟，室温静置0.5～1小时，载体和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物颗粒溶液；步骤2、培养家蚕至五龄幼虫的第一天，将步骤1所得的纳米复合物颗粒溶液与无血清的Grace’s培养基以体积比1∶0.5～2混合，形成均一混合液；然后用带26号斜口针的微量注射器向每条蚕的背测注入20微升上述混合液；培养5～7天后，在蓝光激发下观察转染结果，若家蚕发出红色荧光或绿色荧光，即为转染成功。
本发明中靶向分子透明质酸用天然的透明质酸合成。天然透明质酸分子链较长，依据组织来源不同，分子量变化于105-107道尔顿之间，其聚阴离子特性使其易与壳聚糖聚阳离子通过静电吸附作用而沉降，因而不能直接用作靶向分子，必须在保持透明质酸生物学性能前提下，通过剪裁赋予壳聚糖载体靶向性，为此，选用催化效率高、专一性好且反应条件温和的酶法降解天然透明质酸分子，其间用凝胶渗透色谱(GPC)监测透明质酸分子量随酶解时间的变化，获得所需长度的透明质酸分子片段，以此作为靶向分子用于下一步靶向壳聚糖基因载体的制备。合成步骤及纯化方法见实施例1。
本发明中靶向壳聚糖基因载体的合成方法。因壳聚糖基因载体的转染效率会受到壳聚糖分子量的影响，为使壳聚糖基因载体的转染效率最优化，选用四种不同分子量的壳聚糖进行比较筛选。但壳聚糖和透明质酸的分子量对透明质酸分子的羧基与壳聚糖分子的氨基间的缩合反应没有本质影响，故壳聚糖和透明质酸的分子量不应局限于本发明列举的分子量范围，而应具有更广阔的选择范围。壳聚糖的分子量经粘度法测定，脱乙酰度用酸碱滴定法测定。选用水溶性碳二亚胺为催化剂，使透明质酸分子的羧基与壳聚糖分子的氨基发生缩合反应，从而将靶向分子透明质酸接枝到四种不同分子量的壳聚糖上。透明质酸的羧基与壳聚糖氨基的反应摩尔比为10％～15％。详细的合成步骤见实施例2。壳聚糖衍生物或透明质酸衍生物，在不影响该反应本质的前提下，也可用本发明所阐述的方法制备基因载体，这是对本发明方法应用范围的延伸。
本发明的载体与外源DNA复合物的制备方法。将合成的四种不同分子量的壳聚糖靶向基因载体用醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，每种分子量的基因载体均配成不同浓度的溶液，然后和相当浓度的质粒DNA按体积比1∶1进行复合，形成不同尺寸的复合物纳米颗粒。具体步骤见实施例3。
本发明通过凝胶阻滞实验验证载体对质粒DNA的包覆效果，并通过DNA酶抗性实验考察载体与质粒DNA复合物抗核酸酶解的能力，从而进一步验证该复合物在转染条件下的稳定性。具体实验步骤见实施例4和实施例5。
本发明是通过透射电镜表征载体与DNA复合物的形态，考察其尺寸能否满足被细胞内吞的要求。具体步骤见实施例6。
本发明用合成的四种不同分子量的靶向基因载体进行体外转染实验，验证基因载体的转染效果。通过和未加靶向分子的四种分子量的壳聚糖对比，说明靶向分子对提高基因转染效率的有效性。具体实验步骤见实施例7。
本发明测试了载体的细胞毒性。壳聚糖基因载体同其他阳离子聚合物基因载体相比，最明显的优势之一在于其对细胞没有毒性。为考查经过改性的靶向壳聚糖基因载体的细胞毒性，采用MTT实验测试，其检测原理为黄色的四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-3，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)能被活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶转化成蓝紫色的结晶物，二甲基亚砜能溶解该蓝紫色的结晶物，用酶标仪检测在570纳米波长处测定吸光度值，吸光度值的大小与活细胞数量呈正相关。而死细胞无此功能，故可用此方法间接反应细胞活性。具体实验步骤见实施例8。
本发明用该靶向基因载体进行体内转染实验。为验证制得的靶向基因载体在活体内转染的有效性，确定靶向载体最优化分子量及载体与质粒DNA的最佳质量配比，选用家蚕作为模型动物，测试活体转染效果。选用家蚕作为模型动物有以下三个原因一是家蚕蛋白质含量高，以绿色荧光蛋白基因(或红色荧光蛋白基因)作为报告基因，其表达产物绿色荧光蛋白(或红色荧光蛋白)能在蓝光激发下发出肉眼可见的绿光(或红光)，可直接观察转染结果，不需对基因表达的产物作进一步纯化鉴定；二是转染效率可以通过统计发光蚕的数目与参与转染实验蚕的总数之比计算，蚕的数目统计比较方便；三是家蚕价格低廉，培养简便，可以大大节约实验成本。具体的实验方案见实施例9。
本发明的优点(1)用高效专一的酶降解法获得了所需长度的靶向分子透明质酸，并采用水相合成法制备了一系列不同分子量的靶向壳聚糖基因载体，整个合成过程中未使用任何有机溶剂，最大限度的降低了载体制备过程中因残留溶剂等因素造成的细胞毒性。(2)选用生物相容性好，无毒且廉价的壳聚糖作为基因载体的母体，并以同样具备良好的生物相容性和可生物降解的透明质酸为靶向分子，从而最大限度的保证了最终得到的靶向基因载体是无毒的。(3)用所获得的靶向壳聚糖基因载体运载质粒DNA，细胞转染效率高，能达到甚至超过商品化转染试剂阳离子脂质体水平，克服了壳聚糖载体转染效率低的缺点。(4)所运载DNA的大小可从几千碱基对(kb)到几百kb，装载容量较大。(5)建立了以家蚕为代表的体内转染动物模型，用该动物模型鉴定体内转染效果，简便、快速、结果易于统计，实验成本低。(6)通过控制酶解时间，可获得不同长度的靶向分子透明质酸，而采用化学降解法、超声降解法或酶解法等又可获得不同分子量的壳聚糖，两者组合可制备出一系列带靶向分子透明质酸的壳聚糖基因载体，且可对壳聚糖或透明质酸作进一步化学修饰，制备出可以适应不同的转染对象和转染条件性能优良的基因载体。(7)本发明所获得的靶向壳聚糖基因载体使用方法相对简单，保存方便，成本低廉，具竞争力。
图1为凝胶阻滞实验电泳图片；图2为核酸酶抗性实验电泳图片；图3为7号样品与DNA形成的复合物的透射电镜照片图4(A1)～(D1)分别为5～8号样品体外转染实验结果示意图(A2)～(D2)分别为1～4号样品体外转染实验结果示意图；(E)和(F)分别为用阳离子脂质体(Cellfectin Reagent)和纯质粒DNA的体外转染实验结果示意图；图5为细胞毒性实验结果示意图；图6为体内转染实验结果示意图。
具体实施例方式
应当了解的是，本发明所描述的并不仅仅局限于下文所描述的具体的步骤和物质，而是或多或少可以发生一些变化，不应理解为是对权利要求的限制。例如，本文所描述的壳聚糖也可以是壳聚糖的衍生物，其分子量不应局限于所采用的四种分子量。而作为靶向分子的透明质酸，分子量范围也不局限于实施例中采用的范围，应具备更广阔的选择尺度范围，甚至可以是在剪裁成所需片段长度的透明质酸后再进一步作化学修饰得到的透明质酸衍生物，所有这些都不应成为对权利要求的限制。
实施例1靶向分子HA的合成方法称取1.0克HA(山东正大福瑞达公司，中国)溶于新配制的100毫升pH6.5磷酸盐缓冲液中，电磁搅拌6-8小时，形成均一透明的水凝胶后，加入31.25毫克透明质酸酶(EC3.2.1.35type I-S，sigma公司)，37℃搅拌反应30小时。将反应后的溶液置于沸水中煮5-10分钟，终止反应。溶液冷却至室温后，用0.45微米滤膜过滤，除去透明质酸酶。所得滤液用透析膜(截止分子量6000左右)在纯水中透析纯化。产物冷冻干燥后得到所需长度的HA固体粉末。HA的分子量随酶切时间的变化如下表所示，结果经GPC测定。
表1 HA的分子量随酶切时间的变化趋势
注Mw代表HA的重均分子量，Mn代表HA的数均分子量，Mw/Mn为多分散系数。
实施例2靶向壳聚糖基因载体的合成方法四种壳聚糖按分子量由小到大的顺序依次编号1，2，3，4，其分子量和脱乙酰度测定结果如下表表2 四种壳聚糖的分子量和脱乙酰度
具体合成方法为准确称取1.0克壳聚糖样品，加醋酸搅拌至完全溶解，将溶液pH值调到4.5-5.5，用一次性针头式过滤器(孔径0.22微米)将溶液过滤后备用。称取0.24克HA，溶于50毫升1.0摩尔/升NaCl溶液中，调溶液pH至4.5-5.5，向HA溶液中加入0.23克EDC，搅拌溶解，用HCl或NaOH溶液调节溶液的pH值，使其稳定在pH4.5-5.5，然后向其中缓慢加入预先制备好的壳聚糖溶液，于37℃搅拌反应5-7天；调节pH值到9.0使反应终止，将反应产物用pH值为7.4的PBS缓冲溶液透析3天，然后用超纯水透析3-4天，除去未反应完全的反应物。将透析纯化后的产物冷冻干燥，于干燥器内保存。纯化后的产物按照分子量量由小到大的顺序依次编号5，6，7，8。
实施例3载体与质粒DNA复合物纳米颗粒的制备将上述精制过的壳聚糖接枝透明质酸靶向基因载体用5毫摩尔/升pH5.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液，用一次性针头式过滤器(0.22微米)将溶液过滤后备用。质粒DNA(大小约为130千碱基对)用4.3毫摩尔/升硫酸钠溶液溶解，浓度经紫外测定为100微克/毫升。复合前，先将载体和DNA溶液分别预热至55℃，然后按载体与质粒DNA体积比1∶1在涡旋混合仪上混合1分钟，室温静置0.5～1小时，载体和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物颗粒。
实施例4凝胶阻滞实验以6号样品为例，说明该实验具体步骤。按实施例3的方法，制得一系列不同质量比的载体与质粒DNA纳米复合物的溶液。分别取每种配比的样品10微升，并用纯质粒作参照，0.8％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，经凝胶成像系统(UVP公司Bioimaging Systems)拍摄，观察结果。其结果如图1所示。
图1中第一电泳带为分子量标记，第二电泳带为纯质粒对照，第三到第八电泳带分别对应载体与质粒DNA质量比为3/1，5/1，8/1，10/1，12/1，15/1。由于载体中带正电的氨基通过静电作用同DNA中带负电的磷酸基团结合，从而将DNA包裹在纳米复合物颗粒内部，有效的屏蔽了DNA的负电荷，表现为图中第三到第八电泳带样品均被阻滞在电样孔处，未见质粒DNA的条带，说明载体对质粒DNA的包覆效果良好，这对防止DNA被核酸酶降解至关重要。
实施例5核酸酶抗性实验为进一步验证经过包覆的DNA抗核酸酶降解能力，仍以6号样品为例，说明该实验具体步骤。向实施例4中制得的一系列不同质量比的载体与质粒DNA纳米复合物颗粒溶液及纯质粒DNA中分别加入0.5微升溶解于Mg2+缓冲液中的(缓冲液组成为50毫摩尔/升Tris-HCl，pH7.5，10毫摩尔/升MgCl2)脱氧核糖核酸酶(DNase I)(5活力单位/微升)。于37℃酶切30分钟，沸水浴终止反应。分别取每种配比的样品及经酶切的纯质粒10微升，并用未酶切的纯质粒作参照，0.8％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，经凝胶成像系统(UVP公司Bioimaging Systems)拍摄，观察结果。其结果如图2所示。
图2中第一电泳带为分子量标记，第二电泳带为纯质粒对照，第三电泳带为经酶切后的质粒，第四到第九电泳带分别对应载体/质粒DNA质量比为3/1，5/1，8/1，10/1，12/1，15/1。
从图可以看出，用经载体包覆的质粒DNA经DNase I处理后的电泳带(第四条到第九条电泳带)与用DNase I处理前基本相同，仍然被阻滞在点样孔处，没有DNA被降解后的梯带出现，说明载体/DNA形成的复合物对核酸酶有很好的抗性，而没有用载体包覆的DNA则完全降解了(第3条带)。这说明所制得的载体可以有效地将DNA保护起来，使DNA不会在转染过程中被降解。
实施例6载体与DNA复合物的电镜分析以7号样品为例，说明测试样品的制备及测试方法。参照实施例三中载体/质粒DNA复合物纳米颗粒的制备方法，按载体/质粒DNA＝10∶1(质量比)制备载体/质粒DNA复合物纳米颗粒。制样时，先在铜网上敷一层富尔膜，再在膜上喷涂碳膜，轻轻滴一滴样品溶液，迅速吸干，真空干燥后，采用H-7000FA(HITACH)型透射电子显微镜(TEM)进行测试，加速电压为80千伏。(本实验样品用质量分数为2.0％，pH4.5的醋酸铀染色2～3分钟)。在透射电子显微镜下观察其形态，图3即为7号样品与DNA形成的复合物的透射电镜照片，从图中可以看出，聚离子复合物主要呈球形，尺寸分布比较均一，直径大约为在50～75纳米之间，满足了穿越细胞屏障进入细胞的要求(一般以小于100纳米为宜)。
实施例7体外转染实验以昆虫细胞系Sf9(Spodoptera frugiperda 9，即草地夜蛾卵巢组织细胞)为测试细胞系。
细胞培养方法1.取对数生长期的细胞，当25平方厘米细胞瓶中细胞汇合度达到90％时，按照1∶3的体积比加入一定量的含有10％胎牛血清的新鲜Grace’s昆虫细胞培养基。
2.用移液管上下吹培养液，轻柔地将细胞从瓶壁上吹落，分散细胞团块。
3.将细胞悬液分装到培养瓶中，放置于27℃培养箱中培养。
转染复合物颗粒的制备参照实施例3的方法分别制备一系列不同质量比(3/1，5/1，8/1，10/1，12/1，15/1)的1～8号样品与质粒DNA的复合物溶液。保证每种配比中被包覆质粒DNA质量相同。
转染方法转染前24小时，以1×106个细胞/毫升的密度接种于24孔板，使细胞汇合度达到80％。每孔加入1毫升含血清的Grace’s昆虫细胞培养基。转染当天，吸去原培养基，并用不含血清的Grace’s昆虫细胞培养基洗涤细胞一次，然后将200微升上述载体/质粒DNA复合物与800微升无血清培养基混匀，并均匀地加入每孔中，27℃培养4-6小时，吸去原培养基后加入1毫升含血清的Grace’s昆虫细胞培养基培养5-7天，然后用激光共聚焦显微镜(LEICA公司TCS SP2型)观察并拍照。
图4中(A1)，(B1)，(C1)，(D1)分别为5，6，7，8号样品最优化配比转染结果图片，分别对应于载体/质粒DNA质量比为15/1，12/1，5/1，3/1。(E)为商品化转染试剂阳离子脂质体(商品名Cellfectin Reagent，Cat.No.10362-010，购自invitrogen公司)的转染效果图。(F)为未加任何载体，仅用纯质粒转染的效果图。图中的绿色亮斑为转染成功的细胞，因为转染的质粒DNA中含有绿色荧光蛋白报告基因，它的表达产物绿色荧光蛋白质使细胞在荧光照射下发出绿光。从图中可以看出，5，6，7，8号样品均能运载DNA对细胞进行有效转染。而纯质粒并不能转染成功，可能是纯质粒被细胞内核酸酶降解所致。这说明经过接枝的靶向壳聚糖载体能有效保护质粒DNA，并成功运送至细胞核，使目的基因有效表达。通过对比还发现，6号样品转染效果最好，转染效果比商品化转染试剂Cellfectin Reagent的转染效果(图4中(E))更优。
图4中(A2)，(B2)，(C2)，(D2)分别为与5，6，7，8号样品最优化配比相对应的1，2，3，4号样品的转染结果图片。对比图4(A1)，(B1)，(C1)，(D1)和(A2)，(B2)，(C2)，(D2)可以发现，仅用壳聚糖作基因载体，对于昆虫细胞系Sf9而言，很少或几乎没有细胞被转染成功。而接枝靶向分子HA后，每种分子量的壳聚糖转染效率均大幅提高，6号样品提高幅度最为显著。说明靶向分子对提高细胞转染效率起到了决定性作用。
实施例8细胞毒性实验向细胞培养板中加入相同浓度的1-8号样品150微升，然后补加培养基850微升，以纯质粒和阳离子脂质体(Cellfectin reagent)为对照。细胞培养5～7天后，向每孔加入1毫升含有100微升5毫克/毫升MTT溶液的培养基，37℃培养4小时，然后吸净培养基，加入500微升DMSO，室温静置30分钟，用酶标仪测定570纳米处的吸收值，以未经处理的细胞为空白参照组(control)，定义其吸收值为100％。细胞活性(％)＝OD570(sample)/OD570(control)×100.其结果如图5所示。
从图中可以看出，经靶向基因载体(5-8号样品)处理过的细胞，570纳米处的吸收值相对未经处理的细胞对照组，吸收值不仅没有降低，反而有一定幅度提高，说明载体对细胞没有毒性，吸收值增加的原因可能是制得的靶向载体生物相容性良好，能促进细胞黏附和增殖，这和经壳聚糖处理(1-4号样品)过的细胞570纳米处吸收值增加的趋势是一致的。经质粒处理过的细胞，570纳米处的吸收值基本没有改变。而用商品化转染试剂阳离子脂质体处理过的细胞，其活性有一定程度下降(为对照组的78％)，说明存在一定细胞毒性。
实施例9体内转染实验转染复合物颗粒的制备参照实施例3的方法，用1～8号样品分别制备一系列不同质量比3/1，5/1，8/1，10/1，12/1，15/1的聚合物与质粒DNA的复合物溶液。保证每种配比中质粒DNA质量相同。
转染方法在家蚕五龄幼虫的第一天，将200微升载体/质粒DNA复合物用100微升无血清的Grace’s昆虫细胞培养基稀释，混合均匀，总体积300微升。然后用带26号斜口针的微量注射器向每条蚕的背测注入20微升上述混合液。培养5～7天后，在蓝光激发下观察转染结果。
实验结果如图6所示。图表示以绿色荧光蛋白基因和红色荧光蛋白基因为报告基因，以6号样品为载体转染后的实验结果。从图中绿色荧光和红色荧光清晰可见，证明报告基因均有效表达，载体对目的基因在活体内的运送是成功的。而以2号样品为载体转染，没有任何蚕能发出荧光(由于没发光，这里没有给出图片)，说明以纯壳聚糖作载体不能携带目的基因在家蚕体内表达。通过对比6号样品和2号样品的转染效果，说明靶向分子对提高活体转染效率起了关键作用，这和体外转染实验的结论是一致的。
四种分子量靶向基因载体分别以绿色荧光蛋白基因和红色荧光蛋白基因为报告基因，转染效率如下表所示表3 四种分子量靶向基因载体活体转染效率
结果显示，各种分子量的基因载体，绿色荧光蛋白基因表达的效率均高于红色荧光蛋白基因。对比发现，转染效率最高的为6号样品，超过50％。通过优化6号载体的分子量，其转染效率有望进一步提高。
权利要求
1.一种用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物，其特征是，该阳离子聚合物由壳聚糖和靶向分子透明质酸组成，其中所述的壳聚糖至少一个游离的氨基官能团被所述的透明质酸接枝，并且所述的接枝的壳聚糖含有至少50％未接枝的游离氨基官能团。
2.如权利要求1所述的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物，其特征是，其中所述的壳聚糖分子量为1-500千道尔顿。
3.如权利要求1所述的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物，其特征是，其中所述的透明质酸分子量为0.5-100千道尔顿。
4.权利要求1所述的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物制备方法，其特征包括以下步骤步骤1、称取天然透明质酸溶于新配制的pH 6.5磷酸盐缓冲液中，电磁搅拌6-8小时，形成均一透明的水凝胶后，按透明质酸与透明质酸酶质量比10～50∶1加入透明质酸酶，于37℃搅拌反应20～40小时；将反应后的溶液置于沸水中煮5-10分钟，终止反应，将溶液冷却至室温后，用孔径0.45微米滤膜过滤，除去透明质酸酶，所得滤液用截止分子量6000±200透析膜在纯水中透析纯化；产物冷冻干燥后得到所需长度的透明质酸固体粉末；步骤2、称取壳聚糖，加醋酸搅拌至完全溶解，将溶液pH值调到4.5～5.5，用一次性针头式孔径0.22微米的过滤器将溶液过滤后备用；称取步骤1制备的透明质酸固体粉末，溶于浓度为1.0摩尔/升的NaCl溶液中，调溶液pH至4.5～5.5，向溶液中加入碳二亚胺，透明质酸与碳二亚胺质量比1∶1.0～3.0，搅拌溶解，用HCl或NaOH溶液调节pH值，使pH值稳定在4.5～5.5，然后向其中缓慢加入预先制备好的壳聚糖溶液，在37℃搅拌反应5-7天；调节pH值到9.0使反应终止，将反应产物用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液透析3天，然后用超纯水透析3-4天，除去未反应完全的反应物；将透析纯化后的产物冷冻干燥，得到用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物产品。
5.权利要求1所述的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物的应用，其特征是，用所述的阳离子聚合物与核酸组成复合物，所述的核酸含有编码遗传标记的DNA序列，所述的遗传标记选自荧光蛋白基因。
6.权利要求1所述的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物转染细胞的应用，其特征是应用方法步骤为步骤1、将权利要求1所述的阳离子聚合物用5毫摩尔/升pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液，用孔径0.22微米滤膜将溶液过滤后作载体；质粒DNA用4.3毫摩尔/升硫酸钠溶液溶解；先将载体和质粒DNA溶液分别预热至55℃，然后按载体与质粒DNA体积比1∶1在涡旋混合仪上混合1分钟，室温静置0.5～1小时，载体和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物颗粒溶液；步骤2、将步骤1所得的纳米复合物颗粒溶液与带有识别透明质酸的受体的细胞接触，靶向分子透明质酸同受体识别并结合，使所说的复合物以受体介导的内吞作用进入细胞，释放出所说复合物的核酸并最终使目的基因有效表达。
7.权利要求1所述的用作非病毒型基因载体的阳离子聚合物转染活体家蚕细胞的应用，其特征是应用方法步骤为步骤1、将权利要求1所述的阳离子聚合物用5毫摩尔/升pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液，用孔径0.22微米滤膜将溶液过滤后作载体；质粒DNA用4.3毫摩尔/升硫酸钠溶液溶解；先将载体和质粒DNA溶液分别预热至55℃，然后按载体与质粒DNA体积比1∶1在涡旋混合仪上混合1分钟，室温静置0.5～1小时，载体和质粒DNA通过静电自组装成纳米复合物颗粒溶液；步骤2、在培养家蚕至五龄幼虫的第一天，将步骤1所得的纳米复合物颗粒溶液与无血清的Grace’s培养基以体积比1∶0.5～2混合，形成均一混合液；然后用带26号斜口针的微量注射器向每条蚕的背测注入20微升上述混合液；培养5～7天后，在蓝光激发下观察转染结果，若家蚕发出红色荧光或绿色荧光，即为转染成功。
全文摘要
本发明提出一种以壳聚糖为母体，以透明质酸为靶向分子的基因载体的制备方法。该方法为用透明质酸酶37℃降解天然透明质酸至所需长度，透析纯化后冷冻干燥。然后按一定质量配比，37℃经EDC催化与四种不同分子量的壳聚糖偶联，形成四种不同分子量的靶向壳聚糖基因载体。将所得基因载体用5毫摩尔/升pH 5.5醋酸－醋酸钠缓冲液溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液，0.22微米滤膜过滤后，同带荧光蛋白报告基因的质粒DNA复合，形成一系列质量配比的载体与质粒DNA复合物。以此转染昆虫细胞系Sf9，可获得同商品化转染试剂脂质体相当甚至更高的转染效率。用该载体转染家蚕，效果良好，最优转染效率超过50％。该载体安全无毒，价格低廉，使用过程简单，保存方便。
文档编号C12N15/87GK1884551SQ20061001960
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月11日 优先权日2006年7月11日
发明者张伟, 李静, 周芬, 付铜权, 袁建军, 程时远, 闫翠娥 申请人:湖北大学