专利名称：液体深层发酵法生产番茄红素的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用发酵法生产番茄红素的方法，更具体地说它是一种液体深层发酵法生产番茄红素的方法。番茄红素主要用于食品添加剂和保健品行业。
背景技术：
番茄中所含有的番茄红素为天然色素，对人体安全，且由于其对人体具有诸多的生理活性作用，在食品、医药、化妆品、等领域中广泛的应用前景，因此番茄红素的提取生产及应用受到极大的关注。
现有生产番茄红素的方法一般是从蕃茄、蕃茄皮、番茄酱、番茄糊或西瓜中提取生产。
主要方法如下1，溶剂法，一般步骤如下a.原料的预处理原料预处理对于番茄红素的提取非常重要，一般预处理工艺是原料经水处理后，将大部分杂质去除，干燥，用95％的酒精处理，有时还可加入BHT等抗氧化剂，再进行提取。b.提取溶剂的选择正己烷、环己烷、石油醚、丙酮、乙酸乙酯一般为常用的提取剂c.最佳提取工艺的确定通过正交实验的设计，确定最佳的提取条件，如最佳提取剂，提取温度，提取时间，pH值，物料比，提取剂的用量及复合溶剂的比例等。
经溶剂法提取得到的粗品称为番茄红素，是一种油溶性的混合物，其中除含有番茄红素外，还含有一定数量油脂及脂肪酸、维生素E，甾醇、磷脂等类脂性成分。该方法的缺点比较明显，即油树脂中番茄红素的含量比较低，如何将低含量的番茄红素处理得到符合市场需求的高纯度番茄红素，需要进一步的实验来解决。同时油树脂中溶剂残留比较高，需要脱除溶剂残留，才能得到品质优良的番茄红素。
相关文献新疆生命红科技投资开发有限责任公司，番茄酱制取结晶番茄红素及/或番茄红素的方法，专利申请号00128226.32，酶法，步骤如下新鲜番茄→去皮→捣碎→加酶→恒温保存→有机溶剂浸提→提取液→过滤→浓缩→粗产品→精制产品。
一般选用纤维素酶、果胶酶，采用正交实验，确定单一酶及复合酶的最佳工艺条件如酶的用量及比例，作用时间，提取时间等。
该方法相对于传统溶剂法缩短了提取时间，但同时也存在着成本较高，酶的作用不稳定，出品率低等缺点，不易进行工业化生产的不足。
相关文献北京普瑞孚天然药物现代纯化和分离研究所有限公司《用生物酶法从番茄酱中提取高纯度番茄红素的方法》，专利号02145914.23，超临界CO2萃取法，步骤如下原料→打浆→压榨过滤→真空冷冻干燥→粉碎→过筛→称重→装萃取槽、密封→控制适宜的工作参数→静态、动态萃取→降压分离→由分离柱获得番茄红素→纯度测定一般通过单因素实验，正交实验及验证实验，确定最佳工艺条件如夹带剂、原料颗粒度、萃取压力、萃取温度、萃取时间、溶剂流速等。
该方法有着传统萃取法所无法比拟的优越性，其最大优点是不会造成化学溶剂的消耗和残留，没有污染，萃取条件温和，从而避免了活性物质在高温下发生氧化降解，但由于该方法对实验设备要求很高，操作复杂，成本较高，故很难广泛应用于工业化生产。
4，皂化法，步骤如下新鲜番茄→破碎→离心→加碱皂化→水洗→乙醇脱水→干燥→粉碎→石油醚浸提→浸提液真空旋转浓缩→番茄红素皂化提取物。
通过单因素实验和正交实验，确定了皂化的最佳工艺条件如皂化剂、皂化温度、皂化时间等。研究表明皂化可有效除去番茄中大部分脂肪酸甘油酯及各种游离脂肪酸，释放出其中的番茄红素，可明显提高番茄红素的结晶度和纯度，但皂化法的缺点也很明显，成本增加，工艺复杂化，同时也存在着溶剂残留不易去除的问题。
5，微波浸提法，步骤如下新鲜番茄→捣碎→微波→有机溶剂浸提→提取液→过滤→滤液→浓缩→粗产品→精制产品。
通过对各因素的考察，确定最佳工艺条件如微波功率、提取剂、提取时间、pH、液固比等。
微波浸提是一种新的提取技术，有耗能低、操作时间短、溶剂耗量少、选择性高、目标组分得率高等优点，但同样也存在着明显的缺点，即设备要求高，不易应用于工业化，安全性差等。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，而提供一种液体深层发酵法生产番茄红素的方法。本发明方法适合于工业发酵生产、并且生产成本低、操作安全方便、产率高。
本发明的目的是通过如下措施来达到的液体深层发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于它包括如下步骤
a)、将编号为14059(+)、14060(-)的三孢布拉氏霉菌菌株接到活化培养基活化，活化培养基为斜面培养基；b)、将a)项培养到孢子萌发时进行紫外线诱变或亚硝基胍诱变；c)、将b)项通过筛选得到高产的优良菌株，接种于活化培养基；d)、在无菌条件下，从已培养6d的(+)(-)斜面培养基上分别挑取两环孢子接入种子培养基中；在27℃，150rpm的条件下，培养28h；e)、将d)项生长正负菌在无菌的条件下1∶10混合，再以10％的接种量接入发酵培养基，装液量45ml/250ml，pH 6.5；在28℃，250rpm的条件下，培养120h；f)、将e)项发酵培养48h时，加入前体物β-紫罗酮，异烟肼和琥珀酰亚胺，三者添加量分别为1ml/L，1g/L，5g/L；同时加入抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚，添加量为1g/L；g)、培养完成后，对发酵后的菌液采用4-6层纱布过滤，得到深红色菌体；再将所得菌体真空干燥，温度45℃，0.1Mpa，真空干燥24h，称量菌体干重，将菌体粉碎成60-80目的菌粉备用；h)、用丙酮作为萃取剂进行多次萃取，料液比为1∶3，萃取温度为30-40℃，萃取时间为1.5-3h，pH为5.5-8.0，萃取过程中添加0.5％抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚；分次萃取后，收集萃取液，通过柱层析法分离番茄红素与其他色素，吸附剂为100-200目层析硅胶，洗脱剂为丙酮，番茄红素与丙酮比例为1∶10，洗脱温度为室温，流速为3.5ml/min；i)、所得洗脱液加热，浓缩，即得目标产物6％番茄红素。
在上述技术方案中，所述活化培养基成分为土豆浸提汁1L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，琼脂15g/L，VB1微量。
在上述技术方案中，所述紫外线诱变方法为制备菌悬液，离心出去培养基，用生理盐水制备菌悬液，加入玻璃珠震荡分散，以无菌滤纸或脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90％-95％，菌悬液浓度约为106-107ml-1；再进行紫外线照射，取以上制备好的菌悬液5ml于直径9cm平皿，紫外灯打开预热20min，以稳定光波；将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上，打开皿盖，暴露紫外光下照射5-10min，边搅拌边照射，使细胞均匀吸收紫外线光波；将照射后的菌体转入无菌试管内，并浸入冰水中1-2h；照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h，并在增殖培养基中加入异烟肼等；后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照皿，培养后，挑去菌落，以待筛选。
在上述技术方案中，所述亚硝基胍诱变经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107ml-1；配制亚硝基胍母液(1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)，加助溶剂甲酰胺或丙酮10-50μl/ml，然后加缓冲溶液，其比例为9∶1，亚硝基胍母液浓度配成10mg/ml，处理浓度为1-3mg/ml；将以上菌悬液和亚硝基胍溶液盛于一试管内，置28℃处理约90-120min；用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成稀释度为103-106ml-1，分离于平皿；将亚硝基胍、琼脂和菌体混合制成平板，亚硝基胍浓度为10-50μg/ml；或将琼脂培养基制成平板，然后将亚硝基胍和菌体混合涂抹平板，此时亚硝基胍浓度为10-20μg/ml。
在上述技术方案中，所述种子培养基成分为葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆60g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.25g/L，VB10.5mg/L。
在上述技术方案中，所述发酵培养基成分为玉米淀粉40g/L，玉米浆20g/L，黄豆饼粉20g/L，棉籽油50ml/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，VB0.5mg/L。
在上述技术方案中，在h)项中，所述萃取温度为35℃，萃取时间为2h，pH为6.5。
本发明液体深层发酵法生产番茄红素的方法具有如下优点①本发明为三孢布拉氏霉菌液体深层发酵法生产番茄红素，与传统的从农作物等原材料里提取番茄红素相比，具有成本低廉，产量高，操作简单，易于工业化等优点；②本发明先是对出发菌株做了物理化学诱变，得到了高产的优良菌株，进一步地提高了番茄红素的产率，为产品的工业化生产打下了坚实的基础；③本发明所采用的发酵中添加前提物(β-紫罗酮，异烟肼和琥珀酰亚胺，三者添加量分别为1ml/L，1g/L，5g/L)和抗氧化剂(BHT，1g/L)，大大提高了目标产物的产量，并且有效防止了番茄红素的降解；④本发明采用的阻断剂为烟草废弃物(烟草废弃物中含有0.5％-12％的3-吡啶基的衍生物，其中烟碱占95％)，传统的阻断剂毒性大，成本高，而阻断率并不理想，而烟草废弃物来源广泛，成本低廉，应用方便，安全性高，并且能有效增加菌体内部的物质传氧，提高了番茄红素的产率；⑤本发明采用的丙酮萃取-硅胶柱分离纯化方法，有效地解决了传统溶剂法提取率低(传统方法提取率＜85％，而本方法提取率≥95％)、溶剂残留(传统方法多采用石油醚或环乙烷萃取，溶剂残留不易去除，本方法采用丙酮作为萃取剂，提取率高，挥发性小，自身性质稳定，易于回收，加热后无溶剂残留，溶解色素能力强)及其他色素干扰的问题(硅胶柱能有效分离番茄红素和其他胡萝卜素)，并且方便易行，成本较低；⑥本发明采用的以苏丹I代替番茄红素标准品的测定方法，简单方便，准确率高，回收率高，重复性好，并且有效避免了标准品快速降解的难题，大大降低了成本；⑦本发明所得的目标产物为6％的番茄红素，与市场上现有的同类产品相比，具有番茄红素含量较高，杂质含量少，生产成本低等优点。
图1为本发明液体深层发酵法生产番茄红素的方法的工艺流程图。
具体实施例方式
下面结合附图详细说明本发明液体深层发酵法生产番茄红素的方法的实施情况实施例1本发明液体深层发酵法生产番茄红素的方法的工艺流程为①、将CCTCC的三孢布拉氏霉菌菌株(自ATCC引进，编号分别为14059(+)、14060(-)接到活化培养基活化，活化培养基为斜面培养基土豆浸提汁1L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·H2O 1.5g/L，琼脂15g/L，VB1微量；②、培养到绝大部分孢子刚刚萌发时进行物理化学诱变。
紫外线诱变方法为制备菌悬液，离心出去培养基，用生理盐水制备菌悬液，加入玻璃珠震荡分散，以无菌滤纸或脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90％-95％，菌悬液浓度约为106-107ml-1；再进行紫外线照射，取以上制备好的菌悬液5ml于直径9cm平皿，紫外灯打开预热20min，以稳定光波；将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上，打开皿盖，暴露紫外光下照射5-10min，边搅拌边照射，使细胞均匀吸收紫外线光波；将照射后的菌体转入无菌试管内，并浸入冰水中1-2h；照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h，并在增殖培养基中加入异烟肼等；后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照皿，培养后，挑去菌落，以待筛选。
③、通过筛选得到高产的优良菌株，接种于活化培养基，培养基成分不变；④、在无菌条件下，从已培养6d的(+)(-)斜面培养基上分别挑取两环孢子接入种子培养中。在27℃，150rpm的条件下，培养28h。种子培养基为葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆60g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.25g/L，VB10.5mg/L；⑤、将生长旺盛的正负菌在无菌的条件下1∶10混合，再以10％的接种量接入发酵培养基，装液量45ml/250ml，pH 6.5。在28℃，250rpm的条件下，培养120h；发酵培养基玉米淀粉40g/L，玉米浆20g/L，黄豆饼粉20g/L，棉籽油50ml/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，VB，0.5mg/L。
⑥、在发酵培养48h时，加入前体物β-紫罗酮，异烟肼和琥珀酰亚胺，三者添加量分别为1ml/L，1g/L，5g/L。
⑦、同时加入抗氧化剂BHT，添加量为1g/L。
⑧、培养完成后，对发酵后的菌液采用4-6层纱布过滤，得到深红色菌体；再将所得菌体真空干燥(45℃，0.1Mp真空下)，真空干燥24h，称量菌体干重，将菌体粉碎成60-80目的菌粉备用。
⑨、用丙酮作为萃取剂进行多次萃取，料液比为1∶3，萃取温度为30℃，萃取时间为1.5h，pH为5.5。萃取过程中添加0.5％抗氧化剂BHT(2，6-二叔丁基对甲酚)，提取率可达96％。
分次萃取后，收集萃取液，通过柱层析法分离番茄红素与其他色素，具体参数如下吸附剂为100-200目层析硅胶，洗脱剂为丙酮，番茄红素与丙酮比例为1∶10，洗脱温度为室温，流速为3.5ml/min。
⑩、所得洗脱液加热，浓缩，即得目标产物6％番茄红素。
实施例2其它步骤同实施例1。
②、培养到绝大部分孢子刚刚萌发时进行物理化学诱变。
亚硝基胍诱变方法为经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107ml-1；配制亚硝基胍母液(1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)，加助溶剂甲酰胺或丙酮10-50μl/ml，然后加缓冲溶液，其比例为9∶1，亚硝基胍母液浓度配成10mg/ml，处理浓度为1-3mg/ml；将以上菌悬液和亚硝基胍溶液盛于一试管内，置28℃处理约90-120min；用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成稀释度为103-106ml-1，分离于平皿；将亚硝基胍、琼脂和菌体混合制成平板，亚硝基胍浓度为10-50μg/ml；或将琼脂培养基制成平板，然后将亚硝基胍和菌体混合涂抹平板，此时亚硝基胍浓度为10-20μg/ml。
⑨、用丙酮作为萃取剂进行多次萃取，料液比为1∶3，萃取温度为40℃，萃取时间为3h，pH为8.0。萃取过程中添加0.5％抗氧化剂BHT(2，6-二叔丁基对甲酚)，提取率可达96％。
实施例3其它步骤同实施例1。
⑨、用丙酮作为萃取剂进行多次萃取，料液比为1∶3，萃取温度为温度为35℃，时间为2h，pH为6.5。萃取过程中添加0.5％抗氧化剂BHT(2，6-二叔丁基对甲酚)，提取率可达96％。
需要说明的是对于本专业普通的技术人员来说，在不改变本发明原理的情况下，还可以对本发明做出适当的改变和变形，这同样属于本发明的保护范围。
权利要求
1.液体深层发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于它包括如下步骤a)、将CCTCC编号为14059(+)、14060(-)的三孢布拉氏霉菌菌株接到活化培养基活化，活化培养基为斜面培养基；b)、将a)项培养到孢子萌发时进行紫外线诱变或亚硝基胍诱变；c)、将b)项通过筛选得到高产的优良菌株，接种于活化培养基；d)、在无菌条件下，从己培养6d的(+)(-)斜面培养基上分别挑取两环孢子接入种子培养基中；在27℃，150rpm的条件下，培养28h；e)、将d)项生长正负菌在无菌的条件下1∶10混合，再以10％的按种量接入发酵培养基，装液量45ml/250ml，pH 6.5；在28℃，250rpm的条件下，培养120h；f)、将e)项发酵培养48h时，加入前体物β-紫罗酮，异烟肼和琥珀酰亚胺，三者添加量分别为1ml/L，1g/L，5g/L；同时加入抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚，添加量为1g/L；g)、培养完成后，对发酵后的菌液采用4-6层纱布过滤，得到深红色菌体；再将所得菌体真空干燥，温度45℃，0.1Mpa，真空干燥24h，称量菌体干重，将菌体粉碎成60-80目的菌粉备用；h)、用丙酮作为萃取剂进行多次萃取，料液比为1∶3，萃取温度为30-40℃，萃取时间为1.5-3h，pH为5.5-8.0，萃取过程中添加0.5％抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚；分次萃取后，收集萃取液，通过柱层析法分离番茄红素与其他色素，吸附剂为100-200目层析硅胶，洗脱剂为丙酮，番茄红素油树脂与丙酮比例为1∶10，洗脱温度为室温，流速为3.5ml/min；i)、所得洗脱液加热，浓缩，即得目标产物6％番茄红素油树脂。
2.根据权利要求1所述的液体深层发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于所述活化培养基成分为土豆浸提汁1L，葡萄糖20g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，琼脂15g/L，VB1微量。
3.根据权利要求1所述的液体深层发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于所述紫外线诱变方法为制备菌悬液，离心出去培养基，用生理盐水制备菌悬液，加入玻璃珠震荡分散，以无菌滤纸或脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90％-95％，菌悬液浓度约为106-107ml-1；再进行紫外线照射，取以上制备好的菌悬液5ml于直径9cm平皿，紫外灯打开预热20min，以稳定光波；将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上，打开皿盖，暴露紫外光下照射5-10min，边搅拌边照射，使细胞均匀吸收紫外线光波；将照射后的菌体转入无菌试管内，并立即浸入冰水中1-2h；照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h，并在增殖培养基中加入异烟肼等；后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照皿，培养后，挑去菌落，以待筛选。
4.根据权利要求1所述的液体深层发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于所述亚硝基胍诱变经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107ml-1；配制亚硝基胍母液，加助溶剂甲酰胺或丙酮10-50μl/ml，然后加缓冲溶液，其比例为9∶1，亚硝基胍母液浓度配成10mg/ml，处理浓度为1-3mg/ml；将以上菌悬液和亚硝基胍溶液盛于一试管内，置28℃处理约90-120min；用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成稀释度为103-106ml-1，分离于平皿；将亚硝基胍、琼脂和菌体混合制成平板，亚硝基胍浓度为10-50μg/ml；或将琼脂培养基制成平板，然后将亚硝基胍和菌体混合涂抹平板，此时亚硝基胍浓度为10-20μg/ml。
5.根据权利要求1所述的液体深层发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于所述种子培养基成分为葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆60g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.25g/L，VB10.5mg/L。
6.根据权利要求1所述的液体深层发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于所述发酵培养基成分为玉米淀粉40g/L，玉米浆20g/L，黄豆饼粉20g/L，棉籽油50ml/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.25g/L，VB0.5mg/L。
7.根据权利要求1所述的液体深层发酵法生产番茄红素的方法，其特征在于在h)项中，所述萃取温度为35℃，萃取时间为2h，pH为6.5。
全文摘要
液体深层发酵法生产番茄红素的方法，它包括菌株培养基、物理化学诱变、高产菌株形成、种子培养、发酵培养、添加前提物及抗氧化剂、添加阻断剂、过滤、真空干燥、粉粹、丙酮萃取、硅胶柱分离、浓缩、目标产物的形成。本发明克服了现有番茄红素油树脂生产中产率低、设备要求高、不适合工业化生产等不足；具有适合于工业发酵生产、并且生产成本低、操作安全方便、产率高等优点。
文档编号C12R1/645GK1896250SQ200610019370
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月15日 优先权日2006年6月15日
发明者邹国林, 钱卫国, 郑忠亮, 杨荆树, 张霖 申请人:武汉华珍药业有限公司